CN113203780A - 一种无标记适配体传感器检测gpc3的方法 - Google Patents
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Abstract
一种无标记适配体传感器检测GPC3的方法,采用电沉积技术将rGO‑Au NPs修饰在SPE表面,通过π‑π共轭和静电吸附作用将H‑rGO‑Pt NPs负载在rGO‑Au NPs/SPE表面,通过非共价结合作用将GPC3适配体H‑rGO‑Pt NPs/rGO‑Au NPs/SPE表面,在生物传感界面上加入GPC3后,形成蛋白‑适配体复合物。利用H‑rGO‑Pt NPs对GPC3apt的高负载能力和良好的电子传递效应,rGO‑Au NPs的高导电性以及GPC3适配体对GPC3的特异性识别作用,采用电化学工作站的DPV,实现对GPC3的定量检测。
Description
技术领域
本发明属于生物检测领域,具体涉及一种基于纳米复合材料结合适配体检测GPC3的方法。
背景技术
磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)是一种新型肝癌标志物,检测方法主要有放射免疫分析法、荧光免疫分析法、酶联免疫吸附法、化学发光免疫分析法、流式免疫分析法、电化学免疫传感器、压电免疫传感器等。公开号CN 105717104 B的发明专利,涉及一种利用膜过滤装置分离获取无法获得组织标本的肝癌患者外周血中的CTC,运用细胞蜡块技术制作薄层切片,进而检测肝细胞癌患者外周血GPC3表达情况的方法,该方法历时较长且需专业人员阅片。公开号CN 105759051 B的发明专利,涉及一种以吖啶酯为发光标记物的GPC3纳米磁球的定量分析试剂盒,该法所需GPC3抗体价格昂贵且不易获得。需要一种快速、灵敏、操作简便的GPC3检测方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种基于血红素-还原性氧化石墨烯-铂(H-rGO-Pt NPs)的无标记适配体传感器检测GPC3的方法,提高GPC3的检测效率和灵敏度,最低检测限为0.3407 ng/mL。
本发明的检测原理为:采用电沉积技术将rGO-Au NPs修饰在丝网印刷电极(SPE)表面;通过π-π共轭和静电吸附作用将H-rGO-Pt NPs负载在rGO-Au NPs/SPE表面,通过非共价结合作用将GPC3适配体(GPC3apt)固定在H-rGO-Pt NPs/rGO-Au NPs/SPE表面,形成生物传感界面。在生物传感界面上加入GPC3后,GPC3适配体会特异性结合GPC3蛋白,形成蛋白-适配体复合物而呈稳定的空间结构有序排列在电极表面。利用H-rGO-Pt NPs对GPC3apt的高负载能力和良好的电子传递效应,rGO-Au NPs的高导电性以及GPC3适配体对GPC3的特异性识别作用,采用电化学工作站的微分脉冲伏安法 (DPV),记录H-rGO-Pt NPs中的血红色的氧化还原峰电流变化值。绘制传感器的电流值和GPC3浓度的关系曲线,实现对GPC3的定量检测。
本发明按照以下步骤进行:
步骤1:H-rGO-Pt NPs复合材料的制备
(1)还原性氧化石墨烯(rGO)的制备:单层氧化石墨烯(GO)加水超声破碎,然后加入抗坏血酸(AA)搅拌还原,得到rGO溶液。
(2)血红素-还原性氧化石墨烯(H-rGO)的制备:制备血红素溶液,将血红素溶液与rGO溶液混合,滴加水合肼水浴,离心,得到H-rGO溶液。
(3)血红素-还原性氧化石墨烯-纳米铂(H-rGO-Pt NPs)的制备:在H-rGO溶液中加入PDDA和NaCl,搅拌反应,再加入Na2PtCl6溶液和乙二醇(EG,还原剂),用NaOH调节混合溶液的pH值,离心,得到H-rGO-Pt NPs溶液。
步骤2:电极的修饰与生物传感界面的构建
(1)将丝网印刷电极(SPE)置于H2SO4溶液中活化,活化的电极置入rGO-HAuCl4溶液中,进行恒电位沉积,得到rGO-Au NPs/SPE。
(2)选用戊二醛溶液浸泡rGO-Au NPs/SPE,滴加H-rGO-Pt NPs溶液,孵育,洗涤晾干,得到H-rGO-Pt NPs/rGO-Au NPs/SPE。
(3)将GPC3apt溶液滴加在H-rGO-Pt NPs /rGO-Au NPs/SPE界面上,孵育,洗涤晾干,随后滴加BSA溶液进行封闭,晾干,得到GPC3apt/H-rGO-Pt NPs /rGO-Au NPs/SPE传感界面。
步骤3:GPC3工作曲线的绘制
(1)将GPC3标准溶液滴加到步骤2得到的GPC3apt/H-rGO-Pt NPs/rGO-Au NPs/SPE传感界面,孵育,洗涤晾干,得到工作电极(GPC3/GPC3apt/H-rGO-Pt NPs/rGO-Au NPs/SPE)。然后将工作电极浸入PBS溶液中,采用电化学工作站的DPV扫描,记录H-rGO-Pt NPs中的血红色的氧化峰电流值。
(2)分别对不同浓度的GPC3进行检测,记录峰电流;根据传感器的电流响应值与GPC3浓度的关系,绘制GPC3的工作曲线,计算出该方法的最低检测限。
步骤4:实际样品中GPC3的检测
(1)在步骤2得到的GPC3apt/H-rGO-Pt /rGO-Au NPs/SPE传感界面,滴加待测实际样品,孵育,洗涤晾干,得到工作电极。将制备成功的工作电极浸入PBS溶液中,采用电化学工作站的DPV扫描,记录H-rGO-Pt NPs中的血红色的氧化峰电流值。
(2)根据步骤3所得到的GPC3的工作曲线,计算所述待测实际样品中GPC3的浓度。
其中,步骤1为步骤2提供一种高导电率的H-rGO-Pt NPs纳米复合材料以引起传感界面快速响应。步骤2构成特异性识别GPC3的生物传感界面,并有利于电子的传递。步骤2中生物传感界面的构建是步骤3和步骤4中GPC3的电化学检测中必不可少的关键步骤。步骤3的GPC3的工作曲线为步骤4的实际样本中GPC3浓度的测定提供计算依据。可见步骤1-4相互支撑,共同作用,才能利用以H-rGO-Pt NPs复合材料和GPC3适配体为识别探针实现GPC3的检测。
本发明与现有技术相比具有如下优点:
(1)本方法首先制备了具有独特形貌H-rGO-Pt NPs复合材料;利用Pt NPs增强电子传递及rGO的有效放大电流信号作用和优异负载能力,结合GPC3适配体的高亲和力,成功制备了基于H-rGO-Pt NPs的无标记GPC3适配体传感器,为血清中GPC3的检测提供了新的方法。
(2)采用rGO-Au NPs和H-rGO-Pt NPs 两种纳米材料修饰电极表面,极大增强电子的传递效率,有效放大电流信号。
(3)以H-rGO-Pt NPs复合材料中的血红素作为电活性物质,构建基于H-rGO-PtNPs的无标记适配体传感器,该方法操作简单,精度高且稳定性良好,最低检测限为0.3407ng/mL。
附图说明
图1 基于H-rGO-Pt NPs纳米复合材料的无标记适配体传感器检测GPC3的原理图;
图2 H-rGO NPs(A)和H-rGO-Pt NPs(B)的透射电镜图(TEM);
图3 电极表面不同修饰过程的扫描电子显微镜表征图(SEM);
图4 不同GPC3浓度的DPV曲线。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
一种基于H-rGO-Pt NPs纳米复合材料的无标记适配体传感器检测GPC3的原理见图1。首先,采用电沉积技术将rGO-Au NPs修饰在活化后的丝网印刷电极表面。通过π-π共轭和静电吸附作用将H-rGO-Pt NPs负载在rGO-Au NPs/SPE表面,通过非共价结合作用将GPC3适配体(GPC3apt)固定在H-rGO-Pt NPs/rGO-Au NPs/SPE表面,形成生物传感界面。在生物传感界面上加入GPC3后,GPC3适配体会特异性结合GPC3蛋白,形成蛋白-适配体复合物而呈稳定的空间结构有序排列在电极表面。利用H-rGO-Pt NPs对GPC3apt的高负载能力和良好的电子传递效应,rGO-Au NPs的高导电性以及GPC3适配体对GPC3的特异性识别作用,采用电化学工作站的微分脉冲伏安法 (DPV),记录H-rGO-Pt NPs中的血红色的氧化还原峰电流变化值。绘制传感器的电流值和GPC3浓度的关系曲线,实现对GPC3的定量检测。
具体实施步骤如下:
1.H-rGO-Pt NPs复合材料的制备
(1)称量20 mg GO与20 mL纯水进行配制,用超声波破碎仪进行破碎1 h,使其溶解均匀,然后加入10 mg 抗坏血酸(AA),在恒温磁力搅拌器下搅拌12 h,得到1 mg/mL的rGO溶液。
(2)取20 mg血红素放入烧杯,加入10 μL氨水、20 mL纯水,搅拌使其溶解均匀,得到1 mg/mL的血红素溶液,然后取2.0 mL血红素溶液和2.0 mL rGO溶液进行混合,加入8 μL水合肼,放置在恒温60 °C水浴锅下反应4 h,然后离心,转速为10000 r/min,去掉上清液,得到H-rGO。
(3)取10 mL H-rGO溶液倒入烧杯,加入2.0 mL的 0.2% PDDA和5.0 mL 的0.2mol/L NaCl,并在恒温磁力搅拌器下搅拌12 h,再加入2.0 mL 的20 mmol/L Na2PtCl6溶液,搅拌反应12小时。接着加入10 mL乙二醇,用1.0 mol/L NaOH调节混合溶液的pH值到12.0,12000 r/min离心去掉上清液,洗涤两次,即得到H-rGO-Pt NPs纳米材料。
采用JEM-1200EX型透射电子显微镜(TEM)对纳米材料进行表征,如图2所示。图2A为H-rGO NPs的TEM图,表面比较光滑,边上有少许皱褶,说明H-rGO NPs的结合是成功的,图2B为H-rGO-Pt NPs的TEM图,表面有许多颗粒,表明Pt NPs与H-rGO NPs成功结合在一起。
电极的修饰与生物传感界面的构建
(1)将电极置于0.5 mol/L H2SO4中进行循环伏安扫描20段,电压范围为0.4 V ~1.0 V。而后将已活化的SPE电极浸泡在5mL 含有0.01% HAuCl4溶液和1.0 mg/mL RGO溶液的混合溶液中,并置于磁力搅拌器下进行搅拌,在0.4 V恒电位沉积120 s,沉积完成后用纯水洗涤3次,吹干得到rGO-Au NPs/SPE电极。
(2)将rGO-Au NPs/SPE电极用2.5%戊二醛浸泡15 min,然后用pH为7.0的 PBS溶液洗涤,吹干,随后滴加6 μL的H-rGO-Pt NPs溶液孵育30 min,用PBS溶液和纯水洗涤3次,晾干,得到H-rGO-Pt NPs/rGO-Au NPs/SPE。
(3)取2.0 μL 0.5μmol/L 氨基化的GPC3适配体(5’-NH2-TAA CGC TGA CCT TAGCTG CAT GGC TTT ACA TGT TCC A-3’) 溶液滴加于H-rGO-Pt NPs /rGO-Au NPs/SPE传感界面上,置于震荡培养箱中孵育2 h,滴加6 μL的 1% BSA溶液进行封闭,自然晾干,得到GPC3apt /H-rGO-Pt /rGO-Au NPs/SPE。
采用扫描电镜(SEM)对电极表面各个修饰阶段进行表征分析,如图3所示。图3A中裸SPE表面光滑;图3B为rGO-Au NPs/SPE的SEM图,表面有明显颗粒感,还分散着闪亮的颗粒,表示rGO-Au NPs已成功通过电沉积修饰到电极表面;图3C为H-rGO-Pt NPs/rGO-AuNPs/SPE的SEM图,表面被附上一层物质,变得比较暗淡,这表明H-rGO-Pt NPs已固定到电极上;图3D为GPC3apt /H-rGO-Pt NPs/rGO-Au NPs/SPE的SEM图,显示电极表面被附上一层分子状的物质,这表示GPC3apt已被修饰到电极表面。
标准曲线的绘制
(1)将2.0 µL 不同浓度GPC3溶液滴加在GPC3apt/H-rGO-Pt NPs/rGO-Au NPs/SPE传感界面,25 °C温度下孵育20 min,用pH 7.0 的PBS溶液和纯水交替清洗2次,吹干,得到工作电极(GPC3/GPC3apt/H-rGO-Pt NPs/rGO-Au NPs/SPE)。图3E为工作电极的SEM图,对比图3D,图3E上有明显可见的白色球状,这表示GPC3成功吸附到电极表面。
(2)将上述所得的工作电极置于PBS溶液(0.2 mol/L,pH 7.0),采用CHI660E电化学工作站的DPV扫描,记录其峰电流。不同GPC3浓度的DPV曲线图如图4所示。GPC3浓度在0.001 µg/mL~10 µg/mL范围内,传感器电流响应值(Y)与GPC3浓度(X)之间的呈线性关系,工作曲线方程为Y=0.4449X+0.1745,相关系数为0.9874。将空白对照的三倍标准差定义为检测下限,通过公式CLOD=3Sb/b计算得到该方法的最低检测限0.3407 ng/mL。
4.实际血清样本中GPC3的检测
分别取三种正常人血清样本与已知浓度的GPC3溶液(4.0 μg/mL,10.0 μg/mL,20.0 μg/mL)进行等比例混合,制成混合液。在步骤2构建的GPC3生物传感界面滴加2.0 µL混合液,25 °C温度下孵育20 min,得到GPC3的工作电极。按照步骤3所述,将工作电极置于PBS溶液(0.2 mol/L,pH 7.0)中进行DPV扫描,记录电流值。通过步骤3所得到的GPC3工作曲线,计算人血清样品中GPC3的浓度,结果见表1所示, 其回收率在96.3-117.3%范围内,RSD值为1.78-6.92%。结果表明,所开发的基于H-rGO-Pt NPs纳米复合材料的无标记适配体传感器具有良好的应用前景。
表1 实际血清样本中GPC3的检测结果
(注:血清样本由中国人民解放军联勤保障部队第九二四医院提供)。
Claims (1)
1.一种无标记适配体传感器检测GPC3的方法,按以下步骤进行:
步骤一:H-rGO-Pt NPs复合材料的制备
(1)称量20 mg GO与20 mL纯水进行配制,用超声波破碎仪进行破碎1 h,加入10 mg 抗坏血酸,在恒温磁力搅拌器下搅拌12 h,得到1 mg/mL的rGO溶液;
(2)取20 mg血红素放入烧杯,加入10 μL氨水、20 mL纯水,搅拌,得到1 mg/mL的血红素溶液;然后取2.0 mL血红素溶液和2.0 mL rGO溶液进行混合,加入8 μL水合肼,放置在恒温60 °C水浴锅下反应4 h,然后在转速为10000 r/min离心,去掉上清液,得到H-rGO;
(3)取10 mL H-rGO溶液倒入烧杯,加入2.0 mL的 0.2% PDDA和5.0 mL 的0.2 mol/L的NaCl,并在恒温磁力搅拌器下搅拌12 h;再加入2.0 mL 的20 mmol/L Na2PtCl6溶液,搅拌反应12小时;接着加入10 mL乙二醇,用1.0 mol/L NaOH调节混合溶液的pH值到12.0;12000r/min离心去掉上清液,洗涤两次,即得到H-rGO-Pt NPs纳米材料;
步骤二:电极的修饰与生物传感界面的构建
(1)将电极置于0.5 mol/L H2SO4中进行循环伏安扫描20段,电压范围为0.4 V~1.0 V;将已活化的SPE电极浸泡在5mL 含有0.01% HAuCl4溶液和1.0 mg/mL RGO溶液的混合溶液中,置于磁力搅拌器下进行搅拌,在0.4 V恒电位沉积120 s,沉积完成后用纯水洗涤3次,吹干得到rGO-Au NPs/SPE电极;
(2)将rGO-Au NPs/SPE电极用2.5%戊二醛浸泡15 min,然后用pH为7.0的 PBS溶液洗涤,吹干,随后滴加6 μL的H-rGO-Pt NPs溶液孵育30 min,用PBS溶液和纯水洗涤3次,晾干,得到H-rGO-Pt NPs/rGO-Au NPs/SPE;
(3)取2.0 μL 0.5μmol/L 氨基化的GPC3适配体溶液滴加于H-rGO-Pt NPs /rGO-AuNPs/SPE传感界面上,置于震荡培养箱中孵育2 h,滴加6 μL的 1% BSA溶液进行封闭,自然晾干,得到GPC3apt /H-rGO-Pt /rGO-Au NPs/SPE;
步骤三:GPC3标准曲线的绘制
(1)将2.0 µL 不同浓度GPC3溶液滴加在GPC3apt/H-rGO-Pt NPs/rGO-Au NPs/SPE传感界面,25 °C温度下孵育20 min,用pH 7.0 的PBS溶液和纯水交替清洗2次,吹干,得到工作电极;
(2)将上述所得的工作电极置于浓度为0.2 mol/L、pH 为7.0的PBS溶液,采用CHI660E电化学工作站的DPV扫描,记录其峰电流;GPC3浓度在0.001 µg/mL~10 µg/mL范围内,传感器电流响应值(Y)与GPC3浓度(X)之间的呈线性关系,工作曲线方程为Y=0.4449X+0.1745,相关系数为0.9874;
步骤四:实际血清样本中GPC3的检测
分别取正常人血清样本,在步骤二构建的GPC3生物传感界面滴加2.0 µL混合液,25°C温度下孵育20 min,得到GPC3的工作电极;将工作电极置于PBS溶液中进行DPV扫描,记录电流值;通过步骤三所得到的GPC3工作曲线,计算人血清样品中GPC3的浓度。
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