CN107677719A

CN107677719A - 一种基于石墨烯、硫堇和核酸适配体检测甲胎蛋白的方法

Info

Publication number: CN107677719A
Application number: CN201710798849.1A
Authority: CN
Inventors: 李桂银; 李珊珊; 薛叶薇; 黄勇; 梁晋涛; 王志宏; 董辰杨; 周治德
Original assignee: Guilin University of Electronic Technology
Current assignee: Guilin University of Electronic Technology
Priority date: 2017-09-07
Filing date: 2017-09-07
Publication date: 2018-02-09
Anticipated expiration: 2037-09-07
Also published as: CN107677719B

Abstract

一种基于石墨烯、硫堇和核酸适配体检测甲胎蛋白的方法，采用电沉积技术在丝网印刷电极表面沉积纳米金，通过静电吸附作用将滴在电极表面的石墨烯和硫堇吸附到丝网印刷电极表面，利用硫堇作为桥分子捕获核酸适配体到修饰电极表面。利用石墨烯巨大的比表面积和信号放大作用，利用硫堇对适配体的高负载能力以及适配体对甲胎蛋白的特异性识别作用，建立能特异性检测甲胎蛋白水平的纳米适配体生物传感器。通过差分脉冲伏安法检测出峰值电流，并描绘出该电流与甲胎蛋白浓度的关系曲线，实现对甲胎蛋白的检测，达到时间短，成本低，特异性高。

Description

一种基于石墨烯、硫堇和核酸适配体检测甲胎蛋白的方法

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测甲胎蛋白的方法。

背景技术

甲胎蛋白（Alpha-fetoprotein, AFP）是白蛋白家族的一种糖蛋白，它是由590多个氨基酸残基形成的单多肽链，甲胎蛋白在正常成人体内的含量很少，而在肝癌患者体内甲胎蛋白的含量和肝细胞癌的分化程度有关。AFP检测方法主要有酶联免疫吸附法、荧光免疫分析法、电化学发光法和电化学免疫传感器。然而，常规的免疫测定具有其固有的缺点，例如酶联免疫法存在放射性污染，免疫分析中使用的酶和抗体的活性易受外界温度、pH值的影响，在电极表面不稳定，且价格昂贵。SU等人2010年构建了一种基于硫堇/纳米金自组装膜的电化学免疫传感器来检测人体血清中AFP的含量（SU B, TANG J, CHEN H, et al.Thionine/nanogold multilayer film for alpha-fetoprotein in electrochemicalimmunoassay of humanrerun using biofunctional double-codified goldnanoparticles[J]. Analytical Methods, 2010, 2(11):1702-1709）。 Zhai等人2016年将碳化钼纳米管用做纳米载体来固定硫堇分子以构成电化学免疫传感器检测AFP（Zhai Q,Zhang X, Li J, et al. Molybdenum carbide nanotubes: a novel multifunctionalmaterial for label-free electrochemical immunosensing[J]. Nanoscale, 2016, 8(33):153-158）。 Ni Hui等人2016年将AFP抗体固定在聚乙二醇/纳米金/聚苯胺修饰的金电极上构建了一种用于检测AFP的电化学免疫传感器（Hui N, Sun X, Song Z, Niu S,Luo X. Gold nanoparticles and polyethylene glycols functionalized conductingpolyaniline nanowires for ultrasensitive and low fouling immunosensing ofalpha-fetoprotein. Biosens Bioelectron. 2016, 86:143-149）。这些方法操作复杂、成本高且技术要求高，因此需要建立一种快速、灵敏、操作简便的AFP检测方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种基于石墨烯、硫堇和核酸适配体检测AFP的方法，解决传统AFP检测方法费用昂贵、操作复杂且技术要求高的问题。

为了解决上述技术问题，本发明使用核酸适配体代替抗体，利用适配体对AFP的高特异性来捕获AFP，通过石墨烯巨大的比表面积和信号放大作用，利用硫堇做信号指示剂来实现AFP的检测。与现有的方法相比，操作相对简单，而且时间和费用的消耗更少。

本发明的检测原理为：采用电沉积技术（Elctrodeposition）在丝网印刷电极(SPE)表面沉积一层纳米金(Au NPs)，通过静电吸附作用将石墨烯（GO）和硫堇(TH)吸附到电极表面。利用TH分子作为桥分子捕获核酸适配体（Aptamer）到修饰电极表面，Aptamer能特异性识别检测溶液中的AFP。利用修饰好的电极在电化学工作站（Electrochemicalworkstation）上通过差分脉冲伏安法（DPV）检测溶液中的AFP，并描绘出峰值电流与AFP浓度的关系曲线，实现对AFP的检测。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

步骤1：丝网印刷电极预处理

将电极置于H₂SO₄溶液中进行循环伏安扫描活化电极表面后得到活化后的丝网印刷电极，用蒸馏水冲洗干净；

步骤2：电极的修饰与生物传感界面的构建

（1）将活化后的丝网印刷电极置入HAuCl4溶液中，进行恒电位沉积，沉积结束后用蒸馏水冲洗干净；

（2）取制备好的氧化还原石墨烯（RGO）溶液修饰到电极表面，用红外灯烘干，得到石墨烯修饰电极。滴加硫堇溶液到石墨烯修饰电极上，室温条件下自然晾干，得到硫堇/石墨烯修饰电极。

（3）移取甲胎蛋白适配体滴加于硫堇/石墨烯修饰电极表面上，放置于恒温箱中孵育，用PBS缓冲液冲洗掉未能固定到电极上的适配体，滴加BSA溶液封闭电极，置于4℃冰箱中备用，该纳米适配体传感器制备完成。

步骤3：AFP标准曲线绘制

（1）在步骤2得到制备好的纳米适配体传感器，在其上滴加AFP溶液，把电极放置在恒温箱中孵育，反应时间为60分钟，用缓冲液将电极表面冲洗干净；

（2）将电极放入PBS溶液中，进行差分脉冲伏安法（DPV）扫描，记录峰值电流；

（3）根据峰值电流的大小，绘制AFP的标准曲线，计算灵敏度和检测限。

步骤4：待测样品的检测

（1）在步骤2得到的制备好的纳米适配体传感器表面，滴加待测样品把电极放置在恒温箱中，恒定温度和湿度，反应时间为60分钟，用缓冲液将电极表面冲洗干净；

（2）将电极放入PBS溶液中，进行DPV扫描，记录峰值电流；

（3）根据步骤3所述标准曲线，得到所述待测样品溶液中AFP的浓度。

进一步，所述步骤1中H₂SO₄溶液浓度为0.5mol/L。

进一步，所述步骤1中扫描电压为-0.2V~1.0V，扫描圈数为10。

进一步，所述步骤2中，使用的HAuCl₄浓度为0.01%，沉积条件为-0.5 V,沉积时间120 s。

进一步，所述步骤2中，氧化还原石墨烯浓度为0.1mg/mL。

进一步，所述步骤2中，硫堇浓度为10mmol/L。

进一步，所述步骤2中，甲胎蛋白适配体浓度为5umol/L。

进一步，所述步骤2中，BSA浓度为0.05%。

进一步，所述步骤2和步骤3中，缓冲液为pH7.0，0.1 mol/L PBS溶液。

进一步，所述步骤3中，PBS溶液为pH6.5，0.2 mol/L。

优选，所述步骤3和步骤4中的扫描范围-0.8 V ~ 0.1 V。

其中，步骤1为步骤2提供一个新鲜的电极表面。步骤2中纳米金、氧化还原石墨烯、硫堇和甲胎蛋白适配体，构成特异性识别AFP的生物传感界面，并有利于电子的传递。步骤2中生物传感界面的构建为步骤3中AFP的电化学检测中必不可少的关键步骤。可见步骤1-3相互支撑，共同作用，才能利用石墨烯、硫堇和核酸适配体实现电化学检测胆AFP。

本发明与现有技术相比具有如下优点：

1.核酸适配体是一类新的具有高特异性的功能识别分子，与抗体相比合成简单，成本低，性能稳定，不受温度、PH值等条件的影响。

石墨烯作为纳米材料具有巨大的比表面积，高负载能力，且对生物分子有信号放大作用。硫堇可为适配体的固定提供位点，更有效的固定适配体，且硫堇还可以作检测AFP的信号指示器。

附图说明

图1基于石墨烯、硫堇和核酸适配体检测AFP的电化学方法原理图；

图2电极表面不同修饰过程的循环伏安表征图；

图3电极表面不同修饰过程的扫描电子显微镜表征图；

图4传感器在不同浓度甲胎蛋白下的响应电流；

图5传感器的工作曲线

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

一种基于石墨烯、硫堇和核酸适配体检测AFP的方法，检测原理见图1，

实施步骤如下：

1.电极的预处理：丝网印刷电极在使用之前首先将其置于0.5mol/LH₂SO₄溶液中，使用循环伏安扫描法进行扫描，扫描电压为 -0.2 V ~ 1.0 V，在该范围内扫描10圈；扫描结束后用蒸馏水将电极洗净，晾干备用；

2.电极的修饰和适配体的固定：将活化后的丝网印刷电极置入5mL0.01%HAuCl₄溶液中，在磁力搅拌器搅拌的同时进行电沉积，沉积时间120 s，沉积电位为-0.5 V，沉积结束后用蒸馏水将电极冲洗干净；电极晾干后，在电极表面滴加3 µL 0.1mg/mL氧化还原石墨烯（RGO）溶液，用红外灯烘干30min，将氧化还原石墨烯固定在电极表面；滴加3 µL 10mmol/L的硫堇溶液室温下放置两个小时晾干，得到硫堇/石墨烯修饰电极；取3 µL 5umol/L甲胎蛋白适配体滴加于硫堇/石墨烯修饰电极表面，放置于恒温箱中孵育6个小时，温度26℃，湿度恒定；用pH为7.0浓度为 0.1 mol/L PBS缓冲液冲洗掉没有固定到电极上的适配体；滴加3µL 0.05% BSA溶液封闭电极，置于4℃冰箱中备用，纳米适配体传感器制备完成。图2为电极表面不同修饰过程的循环伏安表征图；图3为电极表面不同修饰过程的扫描电子显微镜表征图。

3.AFP标准曲线的绘制：在制备好的纳米适配体传感器表面滴加3µLAFP溶液，把电极放置在恒温箱（温度26℃，湿度恒定）中，反应时间为60分钟，然后将电极取出，用pH为7.0、浓度为0.1 mol/L PBS缓冲液将电极表面清洗干净，将电极置于5uL pH 6.5，0.2 mol/L PBS溶液中进行差分脉冲伏安扫描（DPV），扫描范围为-0.8 V ~ 0.1 V，记录峰值电流。AFP浓度在0.1~100 µg/mL范围内时，电流值（Y）与AFP浓度（X）之间的关系呈线性，标准曲线见图4和图5，其线性回归方程为Y=47.956+0.3466X，相关系数为0.9975。

实际样本中AFP的检测：在制备好的纳米适配体传感器表面滴加3 µL待测溶液，把电极放置在恒温箱（温度26℃，湿度恒定）中，反应时间为60分钟，然后将电极取出，用pH7.0，0.1 mol/L PBS缓冲液将电极表面清洗干净，将电极置于5uL pH 6.5，0.2 mol/LPBS溶液中进行差分脉冲伏安扫描（DPV），扫描范围为-0.8 V ~ 0.1 V，记录峰值电流，根据步骤3的标准曲线Y=47.956+0.3466X，可得到对应的实际样本溶液中AFP的浓度。对四种不同浓度的标准AFP溶液（90 μg/mL，60 μg/mL，40 μg/mL， 20 μg/mL）进行了三次测试，测试结果代入标准曲线得到实际浓度分别为85.59μg/mL，59.68 μg/mL，35.59 μg/mL，18.93μg/mL，回收率分别为95.1%，99.47%，88.98%，95.65%，具体结果见表1。

表1

以上所述仅是对本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

Claims

1. 一种基于石墨烯、硫堇和核酸适配体检测甲胎蛋白的方法，包括以下步骤进行：

步骤1：丝网印刷电极预处理

将丝网印刷电极置于H₂SO₄溶液中进行循环伏安扫描活化电极表面后得到活化后的丝网印刷电极，用蒸馏水冲洗干净；

其特征在于，还包括：

步骤2：电极的修饰与生物传感界面的构建

将活化后的丝网印刷电极置入HAuCl4溶液中，进行恒电位沉积，沉积结束后用蒸馏水冲洗干净；

取制备好的氧化还原石墨烯（RGO）溶液修饰到电极表面，烘干，得到石墨烯修饰电极；滴加硫堇溶液到石墨烯修饰电极上，晾干，得到硫堇/石墨烯修饰电极；

移取甲胎蛋白适配体滴加于硫堇/石墨烯修饰电极表面上，放置于恒温箱中孵育，用PBS缓冲液冲洗掉未能固定到电极上的适配体，滴加BSA溶液封闭电极，置于4℃冰箱中备用，该纳米适配体传感器制备完成；

步骤3：AFP标准曲线的绘制

在步骤2得到制备好的纳米适配体传感器，在其上滴加AFP溶液，把电极放置在恒温箱中孵育，反应时间为30-90分钟，用缓冲液将电极表面冲洗干净；

将电极放入PBS溶液中，进行差分脉冲伏安法扫描，记录峰值电流；

根据峰值电流的大小，绘制AFP的标准曲线，计算灵敏度和检测限；

步骤4：待测样品的检测

在步骤2得到的制备好的纳米适配体传感器表面，滴加待测样品把电极放置在恒温箱中，反应时间为30-90分钟，用缓冲液将电极表面冲洗干净；

将电极放入PBS溶液中，进行DPV扫描，记录峰值电流；

根据步骤3所述标准曲线，得到所述待测样品溶液中AFP的浓度。

2. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述缓冲液为pH 7.0，浓度为0.1 mol/LPBS溶液。

3. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1中扫描电压为-0.2 V ~ 1.0V，扫描圈数为10。

4. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤2中使用的HAuCl₄浓度为0.01%，沉积条件为-0.5 V，沉积时间120 s。

5. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤3和步骤4中的线性扫描范围-0.8 V ~ 0.1 V。

6. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤3和步骤4中PBS为pH为6.5，浓度为0.2 mol/L。