CN110146580B - 一种基于柿单宁复合纳米材料检测l,5-脱水葡萄糖醇的方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于柿单宁复合纳米材料检测1,5‑AG的方法，包含复合纳米材料的制备，丝网印刷电极的活化、修饰及生物传感界面的构建。运用RGO/PT/Pt‑Pd NPs的信号放大和优良的电子传递效应，以及PROD特异催化1,5‑AG的作用生成H2O2。H2O2被RGO/PT/Pt‑Pd NPs催化分解，产生的电子经RGO/PT/Pt‑Pd NPs复合纳米膜传递到电极表面，采用DPV测定该电流响应信号，然后根据1,5‑AG浓度和传感器的响应电流关系绘制出工作曲线，实现对1,5‑AG的检测。
Description
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种复合纳米材料修饰丝网印刷电极检测l,5-脱水葡萄糖醇的方法。
背景技术
l,5-脱水葡萄糖醇( 1,5-Anhydroglucitol，1,5-AG)是吡喃3糖环状结构第一位碳脱氧所形成的多元醇。1,5-AG可作为近期3到7 天的血糖控制监测的指标。早期1,5-AG主要气相色谱、液相色谱法，该类方法专用仪器昂贵，且操作十分繁琐、费时，不适合用于临床常规检验。目前，血清1,5-AG的检测方法主要有全酶法、液质联用分析技术（LC/MS）法等。全酶法通过酶促反应、显色反应、分光光度法实现对1,5-AG的检测。而LC/MS是一种具有更高检测限的定量分析技术，它以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统，实现高选择性、高灵敏度的检测。公开号为CN102175670A的发明专利，公开了一种通过吡喃糖氧化酶催化1,5-脱水葡萄糖醇生成1,5-脱水果糖和H2O2，4-氨基安替比琳(4-AAP) ，3-羟基-2,4,6-三轻基苯甲酸(HTIB)和H2O2在辣根过氧化物酶的催化作用下生成酮类化合物，利用比色分析原理确定血液中1,5-脱水葡萄糖醇水平。全酶法、液质联用分析技术等测定1,5-AG具有灵敏、准确、特异性高等特点，但这些方法操作繁琐、复杂，试剂费用昂贵，需用专用仪器检测。因此，需要建立一种快速、价廉、便携化的1,5-AG检测方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种还原氧化石墨烯/柿单宁/铂-钯复合纳米材（RGO/PT/Pt-Pd NPs）以及用该材料修饰丝网印刷电极方法来检测l,5-脱水葡萄糖醇的方法，该方法可靠，灵敏度高，成本低。
本发明设计了一种以吡喃糖氧化酶 (PROD)为识别分子，将PROD固定在RGO/PT/Pt-Pd NPs修饰的丝网印刷电极表面，设计了一种能特异性检测血清中1,5-AG水平的电化学生物传感器。
本发明的检测原理：运用RGO/PT/Pt-Pd NPs的信号放大和优良的电子传递效应，以及PROD特异催化1,5-AG的作用生成H2O2。H2O2被RGO/PT/Pt-Pd NPs催化分解，产生的电子经RGO/PT/Pt-Pd NPs复合纳米膜传递到电极表面，产生一明显的电流响应信号，采用差分脉冲伏安法（DPV）测定该电流响应信号，然后根据1,5-AG浓度和传感器的响应电流关系绘制出工作曲线，实现对1,5-AG的检测。本发明按照以下步骤进行：
步骤1：RGO/PT/Pt-Pd NPs复合材料的制备
（1） 称好氧化石墨烯溶于一定的纯水中，超声溶解，得到氧化石墨烯溶液；
（2） 将一定量的抗坏血酸（AA），加入氧化石墨烯溶液中，搅拌一段时间，离心分离，干燥，即得还原氧化石墨烯（RGO）；
（3）将一定量的柿单宁（PT）加入RGO溶液中，超声，制成RGO/PT悬浮液。而后加入HPtCl4 和Pd(NO3)2溶液，并加入一定量的AA，搅拌一段时间。离心分离，去除上清液；将下面的黑色沉淀用纯水洗涤，即得RGO/PT/Pt-Pd复合纳米材料。
步骤2：丝网印刷电极的修饰与生物传感界面的构建
（1）将丝网印刷电极置于H2SO4溶液中进行循环伏安扫描活化电极表面后得到活化后的丝网印刷电极，用纯水冲洗干净；
（2）将活化后的电极浸入氯金酸（HAuCl4）溶液中进行恒电位沉积，用纯水冲洗晾干备用；
（3）取RGO/PT/Pt-Pd纳米复合材料于蒸馏水中，形成RGO/PT/Pt-Pd纳米复合材料分散液。将制备好的复合纳米材料滴加到丝网印刷电极表面，纯水冲洗晾干备用；
（4）将吡喃糖氧化酶（PROD）滴加到（3）的电极表面上，将PROD吸附到电极表面，构建1,5-AG电化学生物传感界面，即为工作电极。
步骤3：1,5-AG的工作曲线绘制
（1）在步骤2得到的工作电极滴加一定数量和浓度1,5-AG溶液，进行孵育一段时间；而后将电极浸入到PBS溶液（作为支持电解质）里面，用电化学工作站，采用差分脉冲伏安法（DPV）进行扫描，记录传感器的响应电流值；
（2）根据传感器的电流响应值与1,5-AG浓度的关系，绘制工作曲线。并计算出该方法的最低检测限。
步骤4：待测样品中1,5-AG的检测
（1）在步骤2得到的工作电极表面滴加一定量的待测样品，进行孵育一段时间；而后将电极浸入到PBS溶液（作为支持电解质）里面，用电化学工作站，采用差分脉冲伏安法（DPV）进行扫描，记录响应电流值；
（2）根据步骤3所得到的1,5-AG的工作曲线，计算待测样品中1,5-AG的浓度。
进一步，所述步骤1中RGO溶液浓度为0.1mg/mL。
进一步，所述步骤1中HPtCl4溶液浓度为0.01mg/mL。
进一步，所述步骤1中Pd(NO3)2溶液浓度为0.01mg/mL。
进一步，所述步骤2中H2SO4溶液浓度为0.5 mol/L。
进一步，所述步骤2中扫描电压为-0.2 V ~ 1.0 V，扫描圈数为10。
进一步，所述步骤2中将电极置于H2SO4中进行循环伏安扫描后，用纯水冲洗干净后，然后将电极放到装有0.01%的HAuCl4溶液的小烧杯中进行恒电位沉积金处理，用蒸馏水冲洗晾干备用。
进一步，所述步骤2中，使用的HAuCl4浓度为0.01%，沉积条件为-0.5 V,沉积时间120 s。
进一步，步骤3中PROD 酶液溶度为0.5 mg/mL。
进一步，步骤3中电极的孵育温度为37°C，孵育时间为30分钟。
进一步，所述步骤3和步骤4的PBS支持电解液的浓度为0.1M，pH为7.4。
进一步，所述步骤3和步骤4中的线性扫描范围-0.1 V ~ 0.6 V，扫描速率为100mV/s。
其中，步骤1提供了一种相对比表面积大且易与生物物质结合的柿单宁纳米复合材料（RGO/PT/Pt-Pd），为步骤2提供一个新鲜的电极表面。步骤2利用RGO/PT/Pt-Pd纳米复合材料来修饰丝网印刷电极，使电极表面能够结合大量的PROD酶粒。利用RGO/PT/Pt-Pd的信号放大和电子传递效应，结合PROD特异催化作用，构成特异性识别1,5-AG的生物传感界面，并有利于电信号的传递。步骤2中生物传感界面的构建为步骤3和步骤4中1,5-AG的电化学检测中必不可少的关键步骤。步骤3的1,5-AG的工作曲线为步骤4的实际样本中1,5-AG浓度的测定提供计算依据。可见步骤1-4相互支撑，共同作用，才能实现电化学检测1,5-AG。
本发明建立的检测1,5-AG的方法有益效果在于操作简单、快速，易于微型化。
本发明与现有技术相比具有如下优点：
1、利用RGO/PT/Pt-Pd纳米材料的比表面积大、吸附能力强的特性可以有效地将PROD酶固定到丝网印刷电极的表面，以保证传感器的稳定性，使酶能够更好的与电极接触并对1,5-AG产生催化作用。
2、运用RGO/PT/Pt-Pd NPs的信号放大和优良的电子传递效应，以及PROD特异催化1,5-AG的作用生成H2O2。H2O2被RGO/PT/Pt-Pd NPs催化分解，产生的电子经RGO/PT/Pt-PdNPs复合纳米膜传递到电极表面，利用电化学中的差分脉冲伏安法（DPV）实现对1,5-AG的定量检测，最低检测限能达到0.03 mg/mL。
附图说明
图1 一种基于柿单宁复合纳米材料检测1,5-AG的原理图；
图2 RGO/PT/Pt-Pd复合纳米材料扫描电镜图；
图3 电极表面不同修饰过程的循环伏安表征图；
图4 1,5-AG的工作曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。该实施例仅是对本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
图1为一种基于柿单宁复合纳米材料检测1,5-AG的原理图。首先，采用抗坏血酸将氧化石墨烯还原为还原性氧化石墨烯（RGO），而后以柿单宁为原料，利用一步还原法直接制备成RGO/PT/Pt-Pd NPs。其次采用电沉积技术在丝网印刷电极表面沉积纳米金（Au NPs/SPE），通过静电吸附作用将滴在电极表面的RGO/PT/Pt-Pd NPs吸附到Au NPs/SPE表面。而后将能特异性识别1,5-AG的吡喃糖氧化酶(PROD)负载在纳米复合材料上，构建1,5-AG电化学传感器。在RGO/PT/Pt-Pd NPs复合纳米材料里面，柿单宁对金属离子的吸附和石墨烯大的比表面积以及Pt-Pd NPs的高效催化协同增强对H2O2的催化分解作用。结合RGO/PT/Pt-PdNPs的信号放大和优良的电子传递效应，以及PROD特异催化1,5-AG的作用生成H2O2。H2O2被RGO/PT/Pt-Pd NPs催化分解，产生的电子经RGO/PT/Pt-Pd NPs复合纳米膜传递到电极表面，利用电化学工作站中的差分脉冲伏安法（DPV）扫描，记录响应电流值，根据1,5-AG浓度和传感器的响应电流关系绘制出工作曲线，实现对1,5-AG的检测。
实施步骤如下：
1. RGO/PT/Pt-Pd复合纳米材料的制备
（1）在50 mL超纯水中放入称量好的5mg氧化石墨烯，用细胞破碎仪进行两个小时的超声溶解，得到氧化石墨烯溶液，其浓度为0.1mg/mL。
（2）取一个50mL的烧杯加入10 mL的上述溶液，称量10mg的抗坏血酸（AA），加入到烧杯中，搅拌12h后，进行离心，取上清液，进行干燥处理，即为还原氧化石墨烯（RGO）。
（3）称量20mg的柿单宁（PT）加入10mL 0.1mg/mL RGO溶液中，超声30min，使其均匀，制成RGO/PT悬浮液。
（4）制成的溶液中加入4mL 0.01mg/mL的 HPtCl4 和4mL 0.01mg/mL的Pd(NO3)2，并加入10mg的AA，搅拌20h。将得到的溶液在10000r/min的条件下离心15min，去除上清液。将下面的黑色沉淀用纯水洗涤，干燥即得RGO/PT/Pt-Pd复合纳米材料。
图2为制备好RGO/PT/Pt-Pd的复合材料的扫描电镜表征图。图中呈片状结构的可能是RGO/PT，而呈球状的白色结构，就是金属Pt和Pd，分布较为均匀，平均粒径大约为100nm。课件形成了一种新的RGO/PT/Pt-Pd复合纳米材料。
2. 丝网印刷电极的修饰与生物传感界面的构建
（1）将丝网印刷电极（SPCE）浸入5 mL浓度为0.5 M的H2SO4溶液中，通过电化学以100 mV/s的扫描速度在为0.2 V至1 V的电压范围循环扫描活化10圈，结束后用蒸馏水冲洗干净。
（2）将活化后的SPCE电极浸入持续搅拌的5 mL质量分数为0.01%的HAuCl4溶液中，通过电化学在-0.5 V电位下进行恒电位电沉积120s，在活化的SPCE表面沉积Au NPs，得到SPCE/ Au NPs 电极。用蒸馏水冲洗晾干备用。
（3）在5mL的超纯水中加入5mg制备好的RGO/PT/Pt-Pd复合纳米材料，超声分散90min，制成1.0 mg/mL的RGO/PT/Pt-Pd悬浮液。
（4）取6 µL浓度为1.0 mg/mL的RGO/PT/Pt-Pd溶液滴在SPCE/Au NPs的电极表面，在25℃恒温条件下孵育30分钟，使用超纯水洗去未牢固结合的RGO/PT/Pt-Pd纳米复合材料，晾干。此操作重复进行三次，即得到SPCE/ Au NPs / RGO/PT/Pt-Pd工作电极。
（5）在SPCE/ Au NPs / RGO/PT/Pt-Pd电极表面滴加PROD（1mg/mL）3μL，置于空气中孵育3h，将PROD吸附到电极表面。使用超纯水洗去残留的PROD溶液，晾干备用。构建了1,5-AG的电化学生物传感界面。
图3为不同修饰电极在0.1M的PBS溶液中进行循环伏安扫描的CV表征图。SPCE电极（曲线a）是没有峰值的。SPCE/ Au NPs（曲线b）有一对氧化还原峰，而且相比对于SPCE电极的正电位峰显著增加，这是因为Au粒子具有导电性有利于电子的转移。SPCE/Au NPs/ RGO/PT/Pt-Pd（曲线c），正电位峰比SPCE/ Au NPs（曲线b）有所下降，这是RGO/PT/Pt-Pd有一定的导电性，但是含有柿单宁这个高分子物质，导电性比单纯的Au NPs弱。SPCE/Au NPs/RGO/PT/Pt-Pd/PROD（曲线d），由于PROD的存在，使得电极的导电性减弱，因此正电位峰值的有所下降。
3. 1,5-AG工作曲线的绘制
（1）在步骤2构建的1,5-AG电化学生物传感界面滴加3μL 1,5-AG标准溶液，放到25℃孵育箱中孵育1h，得到1,5-AG电化学生物传感器（工作电极）。图3中的曲线e 为SPCE/AuNPs/ RGO/PT/Pt-Pd/PROD/1,5-AG的CV图，由于PROD与1,5-AG催化反应生产H2O2，增加导电性，因此正电位峰值增加非常明显。这也说明1,5-AG电化学生物传感器已经成功构建。
（2）将上述的工作电极浸入到PBS溶液（作为支持电解质）里面，用电化学工作站，采用差分脉冲伏安法（DPV）进行扫描，记录传感器的响应电流值；根据传感器的电流响应值与1,5-AG浓度的关系，绘制工作曲线，见图4所示。由图4可知，在0.1~2.0mg/mL范围内1,5-AG浓度和相应电流值呈良好的线性关系。线性回归方程Y=39.99+6.83X（Y为μA，X为mg/mL），相关系数为0.99962。将空白对照的三倍标准差定义为检测下限，计算甲胎蛋白的最低检测限为0.03mg/mL。
4. 实际样本中1,5-AG的检测
将3μL已知浓度的1,5-AG溶液（0.25mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL）滴加在步骤2的生物传感界面上，同时将100μL健康人血清样品加入到 5 mL PBS 支持溶液中。按照步骤3所述，将工作电极置于上述PBS支持溶液中进行DPV扫描，记录电流值。根据步骤3的标准曲线Y=39.99+6.83X，计算可得到对应的实际样本中1,5-AG溶液的浓度，检测结果见表1。结果表明该传感器的回收率范围为99.80-106.80%。
表1 实际血清样本中1,5-AG的检测结果
Claims (1)
1.一种基于柿单宁复合纳米材料检测l ,5-脱水葡萄糖醇1,5-AG的方法，包含以下步骤：
步骤一：复合纳米材料的制备
（1）在50 mL超纯水中放入称量好的5mg氧化石墨烯，用细胞破碎仪进行2h的超声溶解，得到0.1mg/mL氧化石墨烯溶液；
（2）取10 mL上述溶液，称量10mg的抗坏血酸加入，搅拌12h后，进行离心，取上清液，干燥，即为还原氧化石墨烯；
（3）称量20mg的柿单宁加入10mL 0.1mg/mL RGO溶液中，超声均匀，制成RGO/PT悬浮液；
（4） 加入4mL 0.01mg/mL的 HPtCl4 和4mL 0.01mg/mL的Pd(NO3)2，并加入10mg的抗坏血酸AA，搅拌20h；将得到的溶液10000r/min离心15min，去除上清液；将下面的黑色沉淀用纯水洗涤，干燥，即得RGO/PT/Pt-Pd复合纳米材料；
步骤二：丝网印刷电极的活化
将丝网印刷电极浸入5 mL浓度为0.5 M的H2SO4溶液中，通过电化学以100mV/s的扫描速度在为0.2V至1V的电压范围循环扫描活化10圈，用蒸馏水冲洗干净；
步骤三：电极的修饰与生物传感界面的构建
（1）将活化后的SPCE电极浸入持续搅拌的5mL质量分数为0.01%的HAuCl4溶液中，通过电化学在-0.5 V电位下进行恒电位电沉积120s，在活化的SPCE表面沉积Au NPs，得到SPCE/AuNPs 电极，用蒸馏水冲洗，晾干备用；
（2）在5mL的超纯水中加入5mg制备好的RGO/PT/Pt-Pd复合纳米材料，超声分散90min，制成1.0 mg/mL的RGO/PT/Pt-Pd悬浮液；
（3）取6μL浓度为1.0 mg/mL的RGO/PT/Pt-Pd溶液滴在SPCE/Au NPs的电极表面，在25℃恒温条件下孵育30分钟，使用超纯水洗去未牢固结合的RGO/PT/Pt-Pd纳米复合材料，晾干；此操作重复进行三次，即得到SPCE/Au NPs/RGO/PT/Pt-Pd工作电极；
（4）在SPCE/Au NPs/RGO/PT/Pt-Pd电极表面滴加1mg/mL 吡喃糖氧化酶PROD 3μL，置于空气中孵育3h，将吡喃糖氧化酶PROD吸附到电极表面；使用超纯水洗去残留的PROD溶液，晾干备用；
步骤四：1,5-AG的工作曲线绘制
（1）在步骤三构建的1,5-AG电化学生物传感界面滴加1,5-AG标准溶液，放到孵育箱中孵育，得到工作电极；
（2）将上述的工作电极浸入到PBS溶液里面，用电化学工作站，采用DPV法进行扫描，记录传感器的响应电流值；
（3）根据传感器的电流响应值与1,5-AG浓度的关系，绘制工作曲线，计算出该方法的最低检测限；
步骤五：待测样品中1,5-AG的检测
（1）在步骤三构建的1,5-AG电化学生物传感界面滴加一定量的待测实际样品，放到孵育箱中孵育，用PBS溶液清洗，得到工作电极，晾干备用；
（2）将工作电极放入PBS溶液中，采用电化学工作站的DPV扫描，记录其峰电流；
（3）根据步骤四所述工作曲线，得到所述待测实际样品中1,5-AG的浓度。
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