CN113238040A - 一种基于纳米复合材料的laps传感器检测gpc3方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于纳米复合材料的LAPS传感器检测GPC3的方法，通过一步还原法设计合成H‑rGO‑Pt@Pd NPs纳米复合材料；用NaOH和APTES对LAPS芯片进行活化，戊二醛作为偶联剂，分别将复合纳米材料和GPC3Apt偶联在活化的LAPS芯片，形成LAPS敏感单元，将GPC3溶液置于LAPS敏感单元上，得到LAPS传感器。利用GPC3Apt与GPC3之间的特异性识别作用引起LAPS敏感单元中的电势之间的变化，实现对GPC3的检测，最低检测限达0.212 ng/mL。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种基于LAPS传感器检测GPC3的方法。
背景技术
目前，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（GPC3）的检测方法主要有酶联免疫吸附法、放射免疫分析、电化学分析方法、时间分辨荧光免疫分析法等。公开号CN112210018A的发明专利，公开了一种靶向GPC3的嵌合抗原受体及其应用；所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域和信号转导结构域，但该方法操作手段和技术要求高。公开号为CN112014577A的发明专利，公开了一种提高GPC3检测灵敏度的试剂盒及其制备方法；但方法操作繁琐复杂，且试剂盒费用昂贵。需要建立成本低、高灵敏度检测GPC3的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种血红素/还原型氧化石墨烯/铂@钯（H-rGO-Pt@Pd NPs）纳米复合材料、构建LAPS传感器、实现最低检测限为0.212 ng/mL 的GPC3检测方法。
为解决该技术问题，采用LAPS 芯片、光源驱动电路、信号放大电路和 LabVIEW 平台组成了LAPS 实时测试系统。通过一步还原法设计合成 H-rGO-Pt@Pd NPs纳米复合材料；用NaOH溶液和APTES溶液对LAPS芯片进行活化，采用戊二醛为偶联剂，分别将H-rGO-Pt@PdNPs复合纳米材料和GPC3Apt偶联在活化的LAPS芯片，形成LAPS敏感单元，然后将GPC3溶液置于至LAPS敏感单元上，得到LAPS传感器。在外加偏置电压作用下，由于GPC3Apt与GPC3之间的特异性识别作用引起LAPS敏感单元中的电势之间的变化，使得LAPS传感器的（I-V）曲线产生相应的偏移，采用LabVIEW 平台记录不同GPC3浓度的LAPS传感器的电压偏移值，该偏移量与 GPC3 浓度在 0.0001-3.0μg/mL表现出良好的线性关系，实现对GPC3的检测。本发明按照以下步骤进行：
步骤1：H-rGO-Pt@Pd NPs材料的制备
（1）还原性氧化石墨烯（rGO）的制备：氧化石墨烯（GO）倒入蒸馏水中，超声破碎溶解，加入抗坏血酸（AA）还原，得rGO；
（2）血红素/还原性氧化石墨烯（H-rGO）的制备：在固体血红素（Hemin）中加入氨水和超纯水中溶解后，与rGO溶液搅拌混合，得H-rGO溶液；
（3）血红素/还原型氧化石墨烯/铂@钯 （H-rGO-Pt@Pd NPs）复合材料的制备：将邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯（PDDA）和氯化钠（NaCl）加入到H-rGO溶液中，搅拌反应，将氯铂酸钠（Na2PtCl6）和四氯钯酸钠（Na2PdCl4）加入到PDDA修饰的H-rGO溶液中反应，加入乙二醇（EG）溶液进行混合，用氢氧化钠（NaOH）调节混合溶液的pH值，回流反应，离心得到H-rGO-Pt@Pd NPs复合纳米材料。
步骤2：LAPS敏感单元的构建
（1）将LAPS芯片放置乙醇、丙酮、超纯水溶液中各超声洗涤，吹干备用；
（2）将上述LAPS芯片表面滴加NaOH溶液，然后滴加氨基硅烷化试剂（APTES）溶液活化，静置12-24小时；然后滴加戊二醛溶液至芯片表面，偶联30min；
（3）在上述条件下活化的芯片上滴加H-rGO-Pt@Pd NPs溶液孵育，控制温度为20-30℃，时间为30-90 min；
（4）在上述芯片基础上滴加GPC3Apt溶液（序列为5'-TAACGCTGACCTTAGCTGCATGGCTTTACATGTTCCA-NH2-3'），孵育一定时间之后，清洗，然后滴加质量分数为1%的BSA溶液，30min后清洗，得到LAPS 敏感单元，晾干备用。
步骤3：GPC3的工作曲线绘制
（1）在LAPS 敏感单元滴加GPC3标准溶液，在孵育温度为4-35℃，时间为40-120min的条件下孵育，孵育结束后形成 LAPS 传感器；将LAPS 传感器浸入到PBS 缓冲液里面，在外加偏置电压作用下，LAPS传感器的（I-V）曲线产生相应的偏移，采用LabVIEW 平台记录LAPS传感器的偏移电压值；
（2）根据LAPS传感器的偏移电压值与GPC3浓度的关系，绘制工作曲线。并计算出该方法的最低检测限。
步骤4：待测样品中GPC3的检测
（1）在步骤2得到的在LAPS 芯片敏感单元滴加用待测样品，在孵育温度为4-35℃，时间为40-120min的条件下孵育，孵育结束后制备LAPS传感器；将LAPS 传感器浸入到PBS缓冲液里面，在外加偏置电压作用下，LAPS传感器的（I-V）曲线产生相应的偏移，采用LabVIEW 平台记录LAPS传感器的电压偏移值；
（2）根据步骤3所得到的GPC3的工作曲线，计算待测样品中GPC3的浓度。
作为优选：
步骤1中所述H-rGO-Pt@Pd NPs溶液浓度为1.0 mg/mL；
步骤1中所述的PDDA溶液的质量分数为0.2%；
步骤1中所述的NaCl溶液浓度为0.2 mol/L；
步骤1中所述Na2PtCl6溶液和Na2PdCl4溶液的浓度均为20 mmol/L；
步骤2中所述NaOH溶液浓度为1.0 mol/L；
步骤2中所述APTES溶液质量分数为1.0 %；
步骤2中所述戊二醛溶液质量分数为2.5%；
步骤2中所述的GPC3Apt溶液浓度为5.0 μmol/L；孵育时间为2h；
步骤3和步骤4中所述的孵育温度为25℃，孵育时间为60 min；
步骤3和步骤4中所述的PBS溶液的pH值为6.5，浓度为2.0 mol/L。
其中，步骤1通过一步还原法合成了 H-rGO-Pt@Pd NPs纳米复合材料，为步骤2提供了一个良好的载体，提高GPC3Apt 的负载量和电子传递效率。步骤2中构建了 LAPS敏感单元，通过GPC3与GPC3Apt之间的特异性识别作用来引起LAPS敏感单元的电势变化，GPC3浓度的变化由LAPS传感器的I-V曲线的偏移量来表示，实现GPC3的检测。步骤2中LAPS 敏感单元的构建为步骤3和步骤4中GPC3的检测中必不可少的关键步骤。步骤3的GPC3的工作曲线为步骤4的实际样本中GPC3浓度的测定提供计算依据。可见步骤1-4相互支撑，共同作用，才能实现GPC3的检测。
本发明与现有技术相比具有如下优点：
1、H-rGO-Pt@Pd NPs纳米复合材料的纳米结构能够提高比表面积和质量传输，促进电子传递，增加被固定的生物分子的负载量， 提高生物传感器的响应速度和检测灵敏度。
2、GPC3Apt作为识别分子，与GPC3之间的特异性识别能够在外加偏置电压作用下，引起LAPS敏感单元电势之间的变化，通过监测GPC3与GPC3Apt的特异性反应引起的电压偏移量实现对GPC3的检测，最低检测限（LOD）能达到0.212 ng/mL。
附图说明
图1 基于LAPS传感器检测GPC3的原理图；
图2 H-rGO-Pt@Pd NPs复合纳米材料的透射电镜图（TEM）；
图3 LAPS芯片表面不同修饰过程的扫描电子显微镜表征图（SEM）；
图4 不同GPC3浓度下的LAPS传感器的I-V曲线。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
图1为一种基于LAPS传感器检测GPC3的原理图：通过一步还原法合成 H-rGO-Pt@Pd NPs纳米复合材料；用NaOH溶液和APTES溶液进行活化，采用戊二醛作为偶联剂，分别将H-rGO-Pt@Pd NPs复合纳米材料和GPC3Apt偶联在LAPS芯片，形成LAPS敏感单元，然后将GPC3溶液置于至LAPS敏感单元上，得到LAPS传感器。在外加偏置电压作用下，由于GPC3Apt与GPC3之间的特异性识别作用引起LAPS敏感单元中的电势之间的变化，使得LAPS传感器的（I-V）曲线产生相应的偏移，采用LabVIEW 平台记录不同GPC3浓度的LAPS传感器的电压偏移值，从而实现GPC3的检测。
具体实施步骤如下：
步骤一：H-rGO-Pt@Pd NPs纳米材料的制备
（1）称取30mg GO置于烧杯中，加入30mL的超纯水，超声破碎使其充分溶解均匀，得到浓度为1.0 mg/mL的溶液，然后加入10 mg AA，搅拌12h，即可得到rGO；
（2）将30mg Hemin溶解于10μL氨水中，再加入30mL超纯水，得到浓度为1.0 mg/mL的溶液；将Hemin溶液和rGO溶液按照1:1的体积比混合，加入8μL的水合肼溶液，涡旋10min；将混合溶液在60 °C的水浴锅中水浴4h，然后以12000 r/min的转速离心10min，去掉上清液，洗涤烘干，得到H-rGO复合纳米材料。图2（A）为H-rGO材料的透射电镜图（TEM），呈随机褶皱的薄膜结构。
（3）将2mL 0.2% 的PDDA溶液和5mL 0.2M 的NaCl溶液加入到10mL 0.5mg/mL 的H-rGO溶液中，搅拌反应12h，离心、清洗，得到PDDA修饰的H-rGO溶液。将2mL 20 mM的 Na2PtCl6溶液和2mL 20 mM 的Na2PdCl4溶液加入到PDDA修饰的0.5 mg/mL 的H-rGO溶液中，搅拌反应12h；然后向溶液中加入10mL EG溶液进行混合，用1M 的NaOH溶液调节混合溶液的pH值到12，140℃回流反应4h。离心、清洗，即可得到H-rGO-Pt@Pd NPs复合纳米材料。图2（B）为H-rGO-Pt@Pd NPs材料的TEM图，在褶皱的平面上出现褐色和黑色的均匀颗粒，证明Pt、Pd NPs已成功的附着在H-rGO材料上。
步骤二：LAPS敏感单元的构建
（1）将LAPS芯片放置乙醇溶液中洗涤10min，然后放置在丙酮溶液中超声洗涤10min，再放置超纯水中超声洗涤10min，用洗耳球吹干，保鲜膜密封放置冰箱备用。
（2）将预处理后的芯片表面滴加6μL 1.0 mol/L 的NaOH溶液，30min中后用纯水清洗干净，然后滴加6μL质量分数为1%的APTES溶液，在4°C冰箱放置过夜，用纯水洗涤三次。然后滴加6μL质量分数为2.5%戊二醛溶液至芯片表面，偶联30min。
（3）在上述条件下制备的芯片上滴加6μL H-rGO-Pt@Pd NPs溶液，在25°C孵育箱中孵育3h，用纯水清洗干净。
（4）在上述芯片上滴加6μL 浓度为5.0 μmol/L GPC3Apt溶液，在25°C孵育箱孵育2h后清洗干净，然后滴加6μL质量分数为1%的BSA溶液，30min后清洗，晾干备用。
步骤三：GPC3工作曲线的绘制
（1）在步骤二构建的LAPS 芯片敏感单元界面分别滴加6μL 不同浓度的GPC3溶液，在25°C孵育箱孵育1h后取出，制备成LAPS传感器。通过扫描电镜（SEM）表征来观察LAPS传感器构建过程的变化，如图3所示。图3A为裸芯片，光滑平整。图3B为氨基硅烷化修饰后的芯片，表面呈条行线状结构。图3C为H-rGO-Pt@Pd NPs修饰的芯片，有不同的颗粒状物质分布在条形线状结构上。图3D为GPC3Apt修饰形成的LAPS敏感单元，可以看到有一层模糊的膜状结构覆盖在均匀分布的颗粒表面。图E为加入GPC3之后形成LAPS传感器，可以看到有花状结构出现在表面，归因于GPC3和GPC3Apt特异性结合形成一个稳定的结构。
（2）将上述的LAPS传感器浸入到pH值为6.5的PBS缓冲液里面，在外加偏置电压作用下，由于GPC3Apt与GPC3之间的特异性识别作用引起LAPS敏感单元中的电势之间的变化，使得LAPS传感器的（I-V）曲线产生相应的偏移，采用LabVIEW 平台记录不同GPC3浓度的LAPS传感器的电压偏移量。该电位位移与 GPC3 浓度在 0.0001-3.0 μg/mL表现出良好的线性关系，工作曲线为Y=32.6562X+115.1579 (Y为电压偏移量，X为GPC3浓度)，相关系数为0.9881，LOD为0.212 ng/mL。
步骤四：实际样本中GPC3的检测
采取加标法对三种不同浓度的正常人血清样本（样品1, 样品2和样品3）中GPC3进行检测。将三种不同浓度(0.1 µg/mL，0.5 µg/mL，2.0 µg/mL)的GPC3溶液与血清样品按照1:1的比例混合，形成混合待测液。然后将6μL混合待测液滴加在步骤二构建的LAPS 芯片敏感单元界面上，在25°C孵育箱孵育1h后取出，制备成LAPS传感器，按照步骤三进行GPC3检测，而后按照步骤3所得的工作曲线计算实际样品中的GPC3浓度，结果记录在表1中，LAPS传感器的回收率在 92.06% ~ 118.30%之间，相对标准偏差在0.73% ~ 3.04%，表明所提出的方法适用于实际血清样品的检测。
表1 实际血清样本中GPC3的检测结果
（注：血清样本由中国人民解放军联勤保障部队第九二四医院提供）。
Claims (1)
1.一种基于纳米复合材料的LAPS传感器检测GPC3的方法，其特征在于，按以下步骤进行：
步骤一：H-rGO-Pt@Pd NPs纳米材料的制备
（1）称取30mg GO，加入30mL超纯水，超声破碎；然后加入10 mg AA，搅拌12h，得到rGO；
（2）将30mg Hemin溶解于10μL氨水，加入30mL超纯水；将Hemin溶液和rGO溶液混合，然后加入8μL水合肼溶液，涡旋10min；将混合溶液在60℃水浴4h，然后以12000 r/min离心10min，去掉上清液，洗涤、烘干，得到H-rGO复合纳米材料；
（3） 将2mL 0.2% 的PDD溶液和5mL 0.2mol/L 的NaCl溶液加入到10mL 0.5mg/mL的 H-rGO溶液中，搅拌反应12h，离心、清洗，得到PDDA修饰的H-rGO溶液；将2mL 20 mmol/L的Na2PtCl6溶液和2mL 20 mmol/L 的Na2PdCl4溶液加入到PDDA修饰的0.5 mg/mL的H-rGO溶液中，搅拌反应12h；然后向溶液中加入10mL EG溶液进行混合，用1mol/L 的NaOH溶液调节混合溶液的pH值到12，140℃回流反应4h；离心、清洗，得到H-rGO-Pt@Pd NPs复合纳米材料；
步骤二：LAPS敏感单元的构建
（1）将LAPS芯片放置乙醇溶液中洗涤10min，放置在丙酮溶液中超声洗涤10min，再放置超纯水中超声洗涤10min，吹干；
（2）将预处理后的芯片表面滴加6μL 1.0 mol/L 的NaOH溶液，30min后用纯水清洗；然后滴加6μL质量分数为1%的APTES溶液，在4°C冰箱放置12-24h，用纯水洗涤三次；然后滴加6μL质量分数为2.5%戊二醛溶液至芯片表面，偶联30min；
（3）在上述条件下制备的芯片上滴加6μL H-rGO-Pt@Pd NPs溶液，25°C孵育3h，用纯水清洗干净；
（4）在上述芯片上滴加6μL 浓度为5.0 μmol/L GPC3Apt溶液，25°C孵育2h后清洗干净，然后滴加6μL质量分数为1%的BSA溶液，30min后清洗，晾干，得到LAPS 芯片敏感单元界面；
步骤三：GPC3工作曲线的绘制
（1）在LAPS 芯片敏感单元界面滴加6μL GPC3溶液，25°C孵育1h后取出，制成LAPS传感器；
（2）将上述的LAPS传感器浸入到pH值为6.5，浓度为2.0mol/L的PBS缓冲液里面，在外加偏置电压作用下，由于GPC3Apt与GPC3之间的特异性识别作用引起LAPS敏感单元中的电势之间的变化，使得LAPS传感器的I-V曲线产生相应的偏移，采用LabVIEW 平台记录不同GPC3浓度的LAPS传感器的电压偏移量，绘制工作曲线；
步骤四：待测样本中GPC3的检测
（1）在步骤二得到的LAPS 芯片敏感单元滴加6μL待测样品溶液，25°C孵育1h后取出，制成LAPS传感器；然后将LAPS传感器浸入到pH值为6.5，浓度为2.0mol/L的PBS缓冲液，在外加偏置电压作用下，LAPS传感器的I-V曲线产生相应的偏移，采用LabVIEW 平台记录LAPS传感器的电压偏移值；
（2）根据步骤三所得到的GPC3的工作曲线，计算待测样品中GPC3的浓度。
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