CN114813875A

CN114813875A - 一种基于光寻址电位传感器检测1,5-脱水葡萄糖醇的方法

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Publication number: CN114813875A
Application number: CN202210427717.9A
Authority: CN
Inventors: 梁晋涛; 严凯腾; 李桂银; 刘雨桐; 周治德
Original assignee: Guilin University of Electronic Technology
Current assignee: Guilin University of Electronic Technology
Priority date: 2022-04-22
Filing date: 2022-04-22
Publication date: 2022-07-29
Anticipated expiration: 2042-04-22
Also published as: CN114813875B

Abstract

一种基于光寻址电位传感器检测1,5‑脱水葡萄糖醇（1,5‑AG）的方法，以1,5‑AG作为目标物，以吡喃糖氧化酶（PROD）作为特异性识别物，并制备具有良好的电子传递效应的纳米复合材料还原氧化石墨烯‑聚丙烯酰胺‑二茂铁/金纳米粒子（rGO‑PAM‑Fc/AuNPs）作为特异性识别物质的载体，构建基于纳米复合材料改性LAPS芯片特异性检测1,5‑AG的高性能生物传感器。该方法操作简便、耗时短、检测费用低，最低检测限为21.74μg/mL。

Description

一种基于光寻址电位传感器检测1,5-脱水葡萄糖醇的方法

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种基于纳米复合材料和光寻址电位传感器检测的1,5-脱水葡萄糖醇的方法。

背景技术

1,5-脱水葡萄糖醇（1,5-AG）是一种近年来在临床上使用较好的血糖监测指标。国内对1,5-AG进行检测的方法主要有电化学检测法、全酶法、液质联分析技术（LC/MS）等。公开号为CN112611814A的发明专利，采用液相色谱-串联质谱对洗脱溶液进行分析，用MRM扫描方式，实现对干血片中1,5-AG浓度的测定，该方法有较高的灵敏度和特异性，但需要制作干血片，费时费力。公开号为CN110702676A的发明专利，提供了一种检测1,5-AG的试剂盒及方法；采用适宜的方法和稳定剂使试剂R1和试剂R2保持稳定，并通过吡喃糖氧化酶法测定人体血清样本中的1,5-AG含量，该法稳定性良好，但操作步骤复杂，需要专业人员进行测量。这些方法费时且技术要求高，需要一种快速、操作简便的1,5-AG检测方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种基于还原氧化石墨烯-聚丙烯酰胺-二茂铁/金纳米粒子纳米复合材料（rGO-PAM-Fc/AuNPs），并利用该复合材料和吡喃糖氧化酶（PROD）构建一种基于光寻址电位传感检测系统，实现1,5-AG的便携式检测。

为了解决该技术问题，通过Au-S键、Au-N键和静电吸附等作用，成功使用rGO-PAM-Fc/AuNPs和PROD酶对LAPS芯片表面进行改性和固定，构成基于PROD/rGO-PAM-Fc/AuNPs的LAPS芯片敏感单元界面，用于1,5-AG的检测。其中，1,5-AG在PROD的催化作用下，生成产物H₂O₂；AuNPs具有良好的催化氧化性，使得H₂O₂与复合物rGO-PAM-Fc（Fe²⁺）发生氧化还原反应变成rGO-PAM-Fc（Fe³⁺），从而打破LAPS生物传感器表面原有的电位平衡，引起电位的偏移。不同的1,5-AG浓度会在LAPS生物传感器表面引起不同的电位偏移，导致光电流-偏置电压曲线发生偏移。通过数据采集卡和LabVIEW上位机程序对LAPS生物传感器的偏置电压和光电流数据进行采集，实现了1,5-AG浓度准确检测。与现有的方法相比，操作相对较简单，特异性高，实现了便携式检测，能达到21.74 μg/mL的检测限。

本发明按照以下步骤进行

步骤1： rGO-PAM-Fc/AuNPs纳米复合材料的制备

（1）纳米金（AuNPs）的制备：将氯金酸（HAuCl₄）溶液加热搅拌直至沸腾，后将柠檬酸钠（C₆H₅Na₃O₇）溶液加入其中，继续搅拌直至溶液从淡黄色变为酒红色，搅拌后的溶液自然冷却，得到AuNPs溶液。

（2）还原氧化石墨烯（rGO）的制备

称取氧化石墨烯（GO）置于超纯水中，用细胞破碎仪进行超声破碎，得到GO原液，并在其中加入抗坏血酸（AA）放在磁力搅拌器上搅拌，得到rGO悬浮液。

（3）聚丙烯酰胺-二茂铁（PAM-Fc）的制备

将聚丙烯酰胺（PAM）加入到超纯水中，水浴加热搅拌，得到PAM溶液。将叔丁醇钾（C₄H₉OK）加入到PAM溶液中并搅拌。再将二茂铁甲酸（Fc）加入其中，升温加热搅拌，得到PAM-Fc溶液。

（4）还原氧化石墨烯-聚丙烯酰胺-二茂铁（rGO-PAM-Fc）的制备

将rGO悬浮液和PAM-Fc溶液等比例混合，持续加热搅拌，搅拌结束后离心并重溶于超纯水，得到rGO-PAM-Fc溶液。

步骤2：LAPS传感器敏感单元的修饰

（1）将LAPS芯片依次置于乙醇和丙酮溶液中，使用超声清洗仪超声清洗，然后用超纯水冲洗干净，干燥LAPS芯片表面。

（2）在预处理的芯片表面滴加NaOH溶液进行活化，静置一段时间用纯水冲洗干净，然后在芯片上滴加巯丙基三乙氧基硅烷（MPTES）溶液，静置，对芯片进行疏基硅烷化处理。

（3）使用自然沉积法，将AuNPs滴加硅烷化后的LAPS芯片上，待其自然沉积在芯片上。

（4）在沉积了AuNPs的LAPS芯片上，滴加rGO-PAM-Fc悬液，室温放置，待芯片自然干燥。

（5）滴加吡喃糖氧化酶（PROD）溶液到上述LAPS芯片表面，得到具有PROD/rGO-PAM-Fc/AuNPs结构的LAPS芯片敏感单元界面。

步骤3：1,5-AG标准曲线的绘制

（1）在步骤2得到的LAPS芯片敏感单元界面滴加不同浓度的1,5-AG溶液，孵育，制成LAPS生物传感器。

（2）将上述的LAPS传感器浸入到牛血清蛋白缓冲液（BSA）池中，再将玻璃电极浸入PBS中，在外加偏置电压作用下，通过LabVIEW平台记录LAPS传感器的I-V曲线偏移量；分别对不同浓度的1,5-AG标准溶液进行检测，绘制标准曲线，并计算出该方法的最低检测限。

步骤4：待测样品中1,5-AG的检测

（1）在步骤2的得到的LAPS芯片敏感单元滴加待测样品溶液，孵育后取出，制成LAPS传感器；然后将LAPS传感器浸入到PBS中，再将玻璃电极浸入到PBS中，在外加偏置电压作用下，LAPS传感器的I-V曲线产生相应的偏移，采用LabVIEW平台记录LAPS传感器的电压偏移值，

（2）根据步骤3所得到标准曲线，计算所述待测样品中1,5-AG的浓度。

进一步，所述步骤1中氯金酸浓度为0.01%，所述柠檬酸钠为0.1%。

进一步，所述步骤1中所述还原氧化石墨烯为30 mg，抗坏血酸为300 mg。

进一步，所述步骤1中PAM为50 mg，所述叔丁醇钾为80 mg。

进一步，所述步骤2中NaOH浓度为1 mol/L，所述MPTES浓度为1%。

优选步骤2中AuNPs的用量为25 μL。

优选步骤2中rGO-PAM-Fc的用量为25 μL。

优选步骤3中PROD浓度为1.5 mg/mL。

优选步骤3中1,5-AG与PROD的最佳孵育温度为25℃，最佳孵育时间为30min。

优选步骤3和步骤4中PBS的pH值为7.4，浓度为0.2 mol/L。

其中，步骤1为步骤2提供一种高导电率，高比表面积和良好的生物相容性的纳米复合材料。步骤2使用步骤1制备的纳米复合材料对LAPS芯片表面进行改性，提高芯片电导率和酶结合位点。并且酶成功附着在改性后的芯片上构建能特异性检测1,5-AG的生物传感界面。步骤2中生物传感界面的构建是步骤3和步骤4中1,5-AG的电化学检测中不可或缺的关键步骤。步骤3的1,5-AG的工作曲线为步骤4的待测血清样本中1,5-AG浓度的测定提供计算依据。可见步骤1-4相互支撑，才能利用PROD/rGO-PAM-Fc/AuNPs为识别探针来实现对1,5-AG的检测。

本发明与现有技术相比具有如下优点：

1、目前国内一般采用全酶法测定血清1,5-AG水平，因其试剂昂贵，操作复杂而较难实现，而光寻址传感器具有优异的灵敏度，快速响应的特点，可以实现便携式、高灵敏1,5-AG的检测。

2、本专利形成的PROD/rGO-PAM-Fc/Au NPs识别探针具有创新性，rGO-PAM-Fc/AuNPs复合物具有比表面积大，吸附能力强，导电性强等特点，可有效的提高检测速率，且PROD与1,5-AG的反应产物H₂O₂，能够将二茂铁中二价铁离子氧化成三价铁离子，从而改变LAPS芯片表面的膜电位，通过监测LAPS 芯片表面膜电位的偏移量实现对1,5-AG的灵敏检测，该方法的最低检测限为21.74μg/mL。

附图说明

图1 基于光寻址电位传感器检测1,5-AG的原理图；

图2 rGO-PAM-Fc复合纳米材料的透射电镜图（TEM）；

图3 LAPS芯片表面不同修饰过程的扫描电镜图（SEM）；

图4 基于光寻址电位传感器检测1,5-AG的工作曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

图1是LAPS传感器检测系统的构建及检测原理：在经过NaOH预处理的LAPS芯片表面，使用MPTES对芯片进行疏基硅烷化。将AuNPs通过Au-S键沉积在硅烷化后的LAPS芯片表面。通过物理吸附将复合材料rGO-PAM-Fc固定到LAPS芯片表面，再将PROD酶自然吸附在芯片表面附着，形成PROD/rGO-PAM-Fc/AuNPs生物传感界面。当用LAPS生物传感器检测1,5-AG时，1,5-AG能与复合物中PROD发生催化氧化反应，生成H₂O₂与1，5-脱水果糖（1，5-AF）。复合物AuNPs具有良好的催化氧化性，使得H₂O₂与复合物rGO-PAM-Fc中的Fe²⁺发生氧化还原反应变成Fe³⁺，反应方程为：

由上述反应方程式可知，在LAPS生物传感器表面发生的氧化还原反应，会打破LAPS生物传感器表面原有的电位平衡，引起电位的偏移。不同的1,5-AG浓度会在LAPS生物传感器表面引起不同的电位偏移，导致光电流-偏置电压曲线发生偏移。采用数据采集卡和LabVIEW设计的数据采集软件，对LAPS检测系统输出的光电流和偏置电压数据进行采集、处理和分析。因此，LAPS芯片表面的复合物既是反应物又是催化剂，集催化、氧化、电位反应于一体，构建一种便携式、高灵敏检测1,5-AG的新型检测方法。

实施步骤如下：

步骤1：rGO-PAM-Fc/Au NPs复合材料的制备

1、rGO-PAM-Fc的制备：

（1）取30 mg的氧化石墨烯（GO），并将其置于30 mL超纯水中，用细胞破碎仪超声破碎120 min，得到GO悬浮液。在GO悬浮液中加入300 mg抗坏血酸（AA）进行还原，并在磁力搅拌器上持续搅拌12小时以上，得到还原氧化石墨烯（rGO）悬浮液。将rGO悬浮液在4000转/分离心5min，并重溶于纯水。再次在4000转/分离心5min，取其沉淀可得到较为纯净的rGO。

（2）取50 mg PAM溶于超纯水中，80℃下加热搅拌，得到PAM溶液。待溶液冷却后加入80 mg叔丁醇钾搅拌1 h。再加入50 mg二茂铁甲酸（Fc）到溶液中并缓慢升温至65℃搅拌24h，得到PAM-Fc溶液。

（3）取10 mL rGO悬浮液与10 ml PAM-Fc溶液等比例混合，以叔丁醇钾（C₄H₉OK）为催化剂，60℃下持续水域加热搅拌12h后以12000转/分高速离心，取下层重新溶于超纯水可得rGO-PAM-Fc悬浮液。

采用JEM-1200EX型钨灯丝透射电子显微镜对纳米材料进行表征，见如图2所示。图2A为rGO的TEM图，可以观察到明显的片状结构说明rGO的合成是成功的，图2B为rGO-PAM-Fc的TEM图，表面明显出现絮状物，表明Fc成功附着在PAM聚合物骨架上，rGO-PAM-Fc的合成是成功的。

2、AuNPs的制备

取50 ml的0.01%的氯金酸溶液置于干净的烧杯中，水浴100℃持续加热搅拌。而后向氯金酸溶液中缓慢加入2.5 mL的0.1%的柠檬酸钠溶液。在100℃条件下持续搅拌，直至溶液由淡黄色变为酒红色。自然冷却至室温，得到AuNPs，存放在4℃的冰箱中备用。

步骤2：LAPS生物传感器敏感单元的修饰

1、使用前将LAPS芯片分别置于乙醇和丙酮溶液中，使用超声清洗仪超声清洗15分钟。然后使用超纯水冲洗干净，干燥。如图3A所示，为裸LAPS芯片的扫描电子显微镜表征图，其表面光滑平整。

2、滴加20 μL NaOH（1 mol/ L）到清洗干净的LAPS芯片表面，静置活化30min，而后使用纯水清洗干净并干燥。

3、对LAPS芯片表面进行疏基硅烷化，即在活化后的LAPS芯片上滴加20 μL MPTES，在4℃的冰箱中放置12h以上。图3B为疏基硅烷化处理后的LAPS芯片的扫描电子显微镜表征图，其为硅烷化试剂在LAPS芯片表面水解反应产物的表面形貌。

4、使用自然沉积法，在硅烷化后的LAPS芯片上滴加25 μL的AuNPs溶液，静置8h后用纯水清洗，得到AuNPs修饰的LAPS芯片；其扫描电子显微镜表征结果如图3C所示，此时可以看到明显的发光的颗粒物。

5、在沉降了AuNPs的LAPS芯片上，滴加25 uL的rGO-PAM-Fc悬液，至自然干燥。可得到特异性识别分子负载界面rGO-PAM-Fc/AuNPs/LAPS，其扫面电子显微镜表征图见图3D，可以看到很明显的rGO-CS-Fc片状物，以及闪亮的的AuNPs粒子。

6、而后滴加20 μL 1 mg/mL的PROD，在25℃条件下孵育30 min后，清洗干净。此时基于LAPS芯片的生物传感界面构建完成，如图3E所示为生物传感界面的扫面电子显微镜表征图，可以看到独特的PROD/rGO-CS-Fc/AuNPs复合物结构，表明PROD酶已经牢固的结合在了LAPS芯片表面。

步骤3：1,5-AG标准曲线的绘制

1、在LAPS生物传感界面滴加20 μL的1,5-AG溶液，25℃温度下孵育30min，用pH7.4的PBS和蒸馏水清洗，吹干，得到LAPS生物传感器；LAPS生物传感器的扫面电子显微镜表征图，如图3F所示，其显示了1,5-AG与PROD酶反应后产物的LAPS芯片形貌图。

2、在LAPS生物传感器上放置装有PBS（pH为7.4）的电解池，通过LabVIEW平台对LAPS生物传感器的偏置电压和光电流数据进行记录。

如图4所示，1,5-AG的浓度在100 μg/ml到1000 μg内，传感器的电压偏移量与1,5-AG的浓度呈线性关系。线性方程为ΔY=0.12519X+151.86341 (ΔY是不同1,5-AG浓度的归一化电流0.5处的光电流-偏置电压曲线的电影偏移量，X是1,5-AG的浓度)，相关系数R²=0.9992。传感器的检测限为21.74 μg/mL。

步骤4：实际血清样本中1,5-AG的检测

1、将正常人血清样本以1:1的比例分别与250μg/mL，500 μg/mL，750 μg/mL的1,5-AG溶液充分混合，制成混合液。

2、在步骤2构建的生物传感界面滴加20μL混合液，放到25℃孵育箱中孵育30min，得到所需要的LAPS芯片。

3、按照步骤3所述，将LAPS芯片通过LABVIEW平台进行检测，记录I-V曲线的变化。

4、通过步骤3所得到的1,5-AG工作曲线，计算人血清样品中1,5-AG的浓度。

结果见表1所示，其回收率在88.78%-113.21%范围内。结果表明，所开发的光寻址电位传感器具有良好的应用前景。

表1 实际血清样本中1,5-AG的检测结果

。

（注：此血清样本由中国人民解放军联勤保障部队第九二四医院提供）。

Claims

1.一种非诊断目的基于光寻址电位传感器检测1,5-脱水葡萄糖醇1,5-AG的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：还原氧化石墨烯-聚丙烯酰胺-二茂铁/金纳米粒子纳米复合材料rGO-PAM-Fc/AuNPs的制备

（1）AuNPs的制备

将氯金酸加热搅拌至沸腾，加入柠檬酸钠溶液，搅拌至溶液从淡黄色变为酒红色；冷却，得到AuNPs；

（2）rGO的制备

将氧化石墨烯GO置于超纯水中，超声破碎，得到GO原液；使用抗坏血酸AA进行还原，得到rGO悬浮液；

（3）PAM-Fc的制备

称取聚丙烯酰胺PAM置于超纯水中，加热搅拌得到PAM溶液；添加叔丁醇钾搅拌；再将二茂铁甲酸加入持续加热搅拌，得到PAM-Fc溶液；

（4）rGO-PAM-Fc的制备

将rGO和PAM-Fc溶液混合，用叔丁醇钾进行催化，加热搅拌，离心并重溶于超纯水，得到rGO-PAM-Fc溶液；

步骤2：LAPS传感器敏感单元的修饰

（1）将LAPS芯片依次置于乙醇和丙酮溶液中，使用超声清洗仪超声清洗；再用纯水清洗干净，吹干；

（2）在预处理的芯片表面滴加NaOH活化，静置、用纯水冲洗；然后滴加MPTES溶液，静置，进行疏基硅烷化处理；

（3）使用自然沉积法，将纳米金沉积在疏基硅烷化后的LAPS芯片上；

（4）在沉积AuNPs的芯片上滴加rGO-PAM-Fc悬浮液，室温下干燥；

（5）滴加PROD溶液到上述LAPS芯片表面，得到具有PROD/rGO-PAM-Fc/AuNPs结构的LAPS芯片敏感单元界面；

步骤3：1,5-AG标准曲线的绘制

（1）在LAPS芯片敏感单元界面滴加1,5-AG溶液，孵育，制成LAPS生物传感器；

（2）将所得LAPS传感器浸入到PBS池中，再将玻璃电极浸入PBS中，在外加偏置电压作用下，通过LabVIEW平台记录LAPS传感器的电压偏移量；分别对不同浓度的1,5-AG标准溶液进行检测，绘制标准曲线，并计算出该方法的最低检测限；

步骤4：待测样品中1,5-AG的检测

（1）在步骤2的得到的LAPS芯片敏感单元滴加待测样品溶液，孵育，取出，制成LAPS传感器；然后将LAPS传感器浸入到PBS中，再将玻璃电极浸入到PBS中，在外加偏置电压作用下，LAPS传感器的I-V曲线产生相应的偏移，采用LabVIEW平台记录LAPS传感器的电压偏移值；

（2）根据步骤2所得到标准曲线，计算所述待测样品中1,5-AG的浓度。

2.根据权利要求1所述的方法，步骤1中所述氯金酸浓度为0.01%，所述柠檬酸钠为0.1%。

3.根据权利要求1所述的方法，步骤1中所述rGO为30 mg，所述AA为300 mg。

4.根据权利要求1所述的方法，步骤1中所述PAM为50 mg，所述叔丁醇钾为80 mg。

5.根据权利要求1所述的方法，步骤2中所述NaOH浓度为1 mol/L，所述MPTES浓度为1%。

6.根据权利要求1所述的方法，步骤2中所述AuNPs的用量为25 μL。

7.根据权利要求1所述的方法，步骤2中所述rGO-PAM-Fc的用量为10 μL。

8.根据权利要求1所述的方法，步骤3中所述PBS的pH值为7.4，浓度为0.2 mol/L。

9.根据权利要求1所述的方法，步骤4中所述的1,5-AG与PROD的孵育温度为25℃，孵育时间为30 min。