CN103954660A - 一种检测胆固醇的酶生物传感器及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于电化学生物传感器技术领域，具体涉及一种检测胆固醇的酶生物传感器及其制备方法与应用。所述酶生物传感器采用经典的三电极体系，其中工作电极上固化特定的物质识别酶膜，所述物质识别酶膜主要由石墨烯、硫堇、胆固醇氧化酶、辣根过氧化物酶及壳聚糖混合制备而成。所述酶生物传感器的制备方法为首先将硫堇溶液、石墨烯的壳聚糖溶液、辣根过氧化物酶溶液和胆固醇氧化酶溶液混合均匀，然后滴加到已处理过的工作电极上，再与参比电极及对电极组成三电极体系，得到所述酶生物传感器。本发明所述酶生物传感器具有经济、简单、快速、灵敏等优点，且制备简单，可用于胆固醇的定量检测。
Description
技术领域
本发明属于电化学生物传感器技术领域，具体涉及一种检测胆固醇的酶生物传感器及其制备方法与应用。
背景技术
胆固醇是动物组织细胞所不可缺少的重要物质，它不仅参与形成细胞膜，而且是合成胆汁酸、维生素D以及甾体激素的原料。但随着发展水平的提高，胆固醇异常的发病率呈增长趋势。现代研究已经发现，心脏病、糖尿病、动脉粥样硬化、静脉血栓、胆石症等与高胆固醇血症有密切的关系。因此胆固醇的快速测定方法具有重要意义。目前，临床检验中普遍采用的是以分光光度计为基础的酶比色法。但该方法用酶量大，所用仪器复杂，检测时间长，干扰因素多，不适合患者家中自测。因此，研发一种简单、方便、快速、准确、经济地测定胆固醇含量的方法是所趋之势。
近几十年来，酶生物传感器是有关研究人员研究的热点，也得到了迅速发展。但由于大多数酶的活性中心深埋在酶蛋白内部，再加上酶本身比较脆弱，易失活变性，电子隧道的距离等原因，都不易实现酶氧化还原中心与电极之间的电子传递。因此，目前发展的重心是寻找合适的载体、介体与酶的固定方法。研究人员已经尝试了各类修饰电极的载体、介体和酶的固定方法。胆固醇生物传感器的载体用的最多的是碳纳米管。［参考：（a）Yu-Chen Tsai，Siao-YunChen，Chen-An Lee.Sensors and Actuators B135（2008）96-101.（b）G.Li，J.M.Liao，G.Q.Hu，N.Z.Ma，P.J.Wu.Biosensors and Bioelectronics20（2005）2140-2144.（c）Xiaojun Cai,Xia Gao,Lisha Wang,Qi Wu,Xianfu Lin.Sensors and Actuators B181（2013）575-583.］。胆固醇生物传感器的介体为用普鲁士蓝和聚合物（比如聚苯胺），它们具有良好的导电能力，能提高酶与电极间的电子传递速率。［参考：（d）Xuecai Tan，Minjian Li，Peixiang Cai，Lijun Luo，Xiaoyong Zou.AnalyticalBiochemistry337（2005）111-120.（e）Suman Singh，Pratima R.Solanki，M.K.Pandey，B.D.Malhotra.Sensors and Actuators B115（2006）534-541.］。酶的固定多用具有良好成膜性和生物相容性的壳聚糖［参考：（f）Changzhi Zhao，Li Wan，Li Jiang，Qin Wang，Kui Jiao.Analytical Biochemistry383（2008）25-30.）］。除此之外，物理、化学性能优良的碳纳米材料石墨烯，有较大的比表面积，优良的导电性和载体特性，硫堇是被广泛应用的电子传介体，具有快速传递电子能力，都有被应用于葡萄糖、过氧化氢生物传感器的制备，但胆固醇生物传感方面的应用还尚未报道。
发明内容
为克服目前技术的不足及缺点，本发明的首要目的在于提供一种具有良好的选择性、灵敏度和稳定性的用于检测胆固醇的酶生物传感器；
本发明的另一目的在于提供上述酶生物传感器的制备方法；
本发明的再一目的在于提供上述酶生物传感器的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种检测胆固醇的酶生物传感器，由参比电极、对电极及修饰后的工作电极组成，所述修饰后的工作电极由工作电极及固化在工作电极表面的物质识别酶膜组成，其中，所述物质识别酶膜主要由石墨烯、硫堇、胆固醇氧化酶、辣根过氧化物酶及壳聚糖混合制备而成；
所述物质识别酶膜为将1～5mg/mL的石墨烯-壳聚糖溶液、5～10mmol/L的硫堇水溶液、20～30mg/mL的胆固醇氧化酶水溶液及10～20mg/mL的辣根过氧化物酶水溶液混合后干燥制得；
优选的，所述的石墨烯-壳聚糖溶液、硫堇水溶液、胆固醇氧化酶水溶液、辣根过氧化物酶水溶液的体积比为1：1：1：1；
优选的，所述工作电极为玻碳电极，所述参比电极为饱和甘汞电极或Ag/AgCl参比电极，所述对电极为铂电极。
上述检测胆固醇的酶生物传感器的制备方法，包括如下步骤：首先将石墨烯-壳聚糖溶液、硫堇水溶液、胆固醇氧化酶水溶液及辣根过氧化物酶水溶液混合均匀，得复合酶溶液；然后取复合酶溶液滴加到经表面预处理的工作电极的表面，晾干后得到修饰后的工作电极；将所述修饰后的工作电极、参比电极及对电极组成三电极体系，得到所述检测胆固醇的酶生物传感器。
上述检测胆固醇的酶生物传感器的制备方法，其具体步骤为：
（1）在1mL质量分数为0.5%～2%的壳聚糖醋酸溶液中加入1～5mg石墨烯，超声分散1～2h，得到石墨烯含量为1～5mg/mL的石墨烯-壳聚糖溶液；
（2）分别配制5～10mmol/L的硫堇水溶液、20～30mg/mL的胆固醇氧化酶水溶液及10～20mg/mL的辣根过氧化物酶水溶液；
（3）对工作电极进行表面预处理；
（4）将步骤（1）与步骤（2）中所述的石墨烯-壳聚糖溶液、硫堇水溶液、胆固醇氧化酶水溶液及辣根过氧化物酶水溶液按比例混合均匀得复合酶溶液，取复合酶溶液3～5μL滴加到步骤（3）所述表面预处理后的工作电极的表面，室温晾干，得到修饰后的工作电极；
（5）将所述修饰后的工作电极与参比电极和对电极组成三电极体系，得到所述检测胆固醇的酶生物传感器。
优选的，步骤（1）所述的石墨烯的制备方法如下：取5g鳞片石墨和2g NaNO3进行混合，加入120mL浓硫酸，置于4℃的冰水浴中搅拌30min；然后加入20gKMnO4，磁力搅拌反应60min，再移入40℃温水浴中继续反应30min；然后加入230mL蒸馏水，于95℃的温度条件搅拌5min，再加入质量分数为5%的双氧水，至不产生气泡，趁热过滤，并用去离子水和质量分数为5%的盐酸进行洗涤；然后透析一周，再在60℃真空干燥箱中干燥，得氧化石墨；称取0.1g所述氧化石墨溶解于50g蒸馏水中，超声60min，得到石墨分散液；加热所述石墨分散液至80℃并滴加2mL水合肼，反应4h后过滤，并用甲醇和蒸馏水冲洗，然后在60℃真空干燥箱中充分干燥，即得到石墨烯。
优选的，步骤（3）所述的表面预处理的具体操作为：首先将工作电极的表面依次用直径为0.3μm和0.05μm的Al2O3粉末抛光成镜面，再用水冲洗；然后依次在无水乙醇和水中分别超声清洗1min，取出用水洗净，晾干；然后将晾干的工作电极置于0.5mol/L的H2SO4溶液中进行电极活化。
优选的，步骤（4）中所述的石墨烯-壳聚糖溶液、硫堇水溶液、胆固醇氧化酶水溶液、辣根过氧化物酶水溶液的体积比为1：1：1：1；步骤（4）及步骤（5）中所述工作电极为玻碳电极，所述参比电极为饱和甘汞电极或Ag/AgCl参比电极，所述对电极为铂电极。
上述检测胆固醇的酶生物传感器在胆固醇定量检测中的应用。
本发明的原理：
本发明首先是将石墨烯-壳聚糖溶液、硫堇水溶液、胆固醇氧化酶水溶液及辣根过氧化物酶水溶液混合均匀；然后，利用壳聚糖的包埋作用，将辣根过氧化物酶和胆固醇氧化酶包埋起来，并利用石墨烯的载体特性，负载更多的酶，
以利于对底物的催化；最后，取适量混合液滴于已表面预处理的工作电极上，
得到修饰后的工作电极；再利用所述的修饰后的工作电极，配合参比电极与对电极组成三电极体系，制得一种新型的检测胆固醇的酶生物传感器。硫堇是一种良好的电子传递体，经电聚合后形成聚合膜稳定性好，不易流失，且具有快速传递电子的能力，能够实现电子的间接转移。
本发明将石墨烯纳米材料和硫堇介体结合，制备得到的检测胆固醇的酶生物传感器生物，检测性能好，检测线性范围为y=2.91498+5.93126x，检测限6×10-7mol/L。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
（1）本发明所述的检测胆固醇的酶生物传感器具有良好的电子传递性，能将反应产生的电子进行良好的转移，能实现酶与电极之间的电子传递，提高所述酶生物传感器的反应速度。
（2）本发明所述的检测胆固醇的酶生物传感器具有良好的包埋效果，将识别作用的酶很好的包埋在电极上，不易脱落，延长所述酶生物传感器的使用寿命。
（3）本发明所述的检测胆固醇的酶生物传感器具有良好的负载效果，将更多的酶负载到工作电极上，可利于反应的发生，提高所述酶生物传感器的灵敏度。
（4）本发明所述的检测胆固醇的酶生物传感器具有良好的选择性，可对胆固醇进行准确检测，抗干扰能力强。
（5）本发明所述的检测胆固醇的酶生物传感器的制备方法所用原料少、成本较低，且反应可在室温中性环境中进行，制备工艺简单、安全。
附图说明
图1为所述酶生物传感器的整体结构示意图，其中1为修饰后的工作电极，2为参比电极，3为对电极，4为待测液。
图2为所述修饰后的工作电极的剖面示意图，其中1-1为工作电极，1-2为物质识别酶膜。
图3为所述酶生物传感器不同浓度胆固醇的磷酸盐缓冲溶液中的循环伏安曲线图，图中方框内为磷酸盐缓冲溶液中胆固醇的添加浓度。
图4为所述酶生物传感器对不同浓度胆固醇的响应电流的标准曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
一种检测胆固醇的酶生物传感器，整体结构示意图如图1所示，由参比电极2、对电极3及修饰后的工作电极1组成；修饰后的工作电极1的剖面示意图如图2所示，所述修饰后的工作电极1由工作电极1-1及固化在工作电极表面的物质识别酶膜1-2组成，其中，所述物质识别酶膜1-2主要由石墨烯、硫堇、胆固醇氧化酶、辣根过氧化物酶及壳聚糖混合制备而成；
所述物质识别酶膜1-2为取1～5mg/mL的石墨烯-壳聚糖溶液、5～10mmol/L的硫堇水溶液、20～30mg/mL的胆固醇氧化酶水溶液及10～20mg/mL的辣根过氧化物酶水溶液混合后干燥制得；
优选的，所述的石墨烯-壳聚糖溶液、硫堇水溶液、胆固醇氧化酶水溶液、辣根过氧化物酶水溶液的体积比为1：1：1：1；
优选的，所述工作电极1为玻碳电极，所述参比电极2为饱和甘汞电极或Ag/AgCl参比电极，所述对电极3为铂电极。
将所述检测胆固醇的酶生物传感器放入待测液4中，可检测待测液4中胆固醇的含量。
实施例2
一种用于检测胆固醇的酶生物传感器，其制备方法如下：
（1）取5g鳞片石墨和2g NaNO3进行混合，加入120mL浓硫酸，置于4℃的冰水浴中搅拌30min；然后加入20gKMnO4，磁力搅拌反应60min，再移入40℃温水浴中继续反应30min；然后加入230mL蒸馏水，于95℃的温度条件搅拌5min，再加入质量分数为5%的双氧水，至不产生气泡，趁热过滤，并用去离子水和质量分数为5%的盐酸进行多次洗涤；然后透析一周，再在60℃真空干燥箱中干燥，得氧化石墨；称取0.1g所述氧化石墨溶解于50g蒸馏水中，超声60min，得到稳定的石墨分散液；加热所述石墨分散液至80℃并滴加2mL水合肼，反应4h后过滤，并用甲醇和蒸馏水冲洗，然后在60℃真空干燥箱中充分干燥，即得到石墨烯；
（2）称取0.03g壳聚糖（T0060，DAC≥95％）加入到3mL浓度为0.1mol/L的醋酸溶液中，得质量分数为1%的壳聚糖醋酸溶液；取1mL所述质量分数为1%的壳聚糖醋酸溶液，加入1mg石墨烯，超声分散2h，得到石墨烯含量为1mg∕mL的石墨烯-壳聚糖溶液。
（3）称取8.6mg硫堇，加入3mL蒸馏水，配制成10mmol∕L的硫堇水溶液；称取胆固醇氧化酶（Sigma）127.2U(21.2U/mg)，加入0.2mL蒸馏水，配制成30mg∕mL的胆固醇氧化酶水溶液；称取辣根过氧化物酶（Roche M0040）1000U（250U/mg），加入0.2mL蒸馏水，配制成20mg∕mL的辣根过氧化氢酶水溶液。
（4）将直径为3mm的玻碳电极依次用直径为0.3μm和0.05μm的Al2O3粉末抛光成镜面，用蒸馏水冲洗，然后依次在无水乙醇和蒸馏水中超声清洗1min，再将玻碳电极置于0.5mol/L的H2SO4溶液中进行电极活化，取出用蒸馏水冲洗，晾干。
（5）将所述的石墨烯-壳聚糖溶液、硫堇水溶液、胆固醇氧化酶水溶液及辣根过氧化物酶水溶液按1:1:1:1的体积比混合均匀得复合酶溶液，取复合酶溶液5μL滴加到步骤（3）所述表面预处理后的工作电极的表面，室温晾干，得到修饰后的工作电极；
（6）将所述修饰后的工作电极与参比电极和对电极组成三电极体系，得到所述检测胆固醇的酶生物传感器。
所述检测胆固醇的酶生物传感器响应时间短，反应速度快，检出限较低，灵敏度高，检测范围宽，可检测较大范围的胆固醇的含量。
采用循环伏安法对实施例2制备的酶生物传感器进行测试，具体步骤为：室温下，将所述检测胆固醇的酶生物传感器的三个电极浸入浓度为0.02mol/L、pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液中，往所述磷酸盐缓冲溶液中不断加入胆固醇，加入浓度为5.0×10-6mol/L到3.4×10-4mol/L，采用循环伏安法进行电化学测试，采用循环伏安时的扫速为50mV/s，扫描电位范围为-0.4～0.2V。
循环伏安法测试结果：
图3是在0.02mol/L、pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液中，不断加入胆固醇得到的循环伏安曲线。从图3可以看出，所述检测胆固醇的酶生物传感器在含胆固醇的磷酸盐缓冲溶液中的循环伏安曲线的还原峰明显大于不含胆固醇的磷酸盐缓冲溶液中的还原峰。氧化峰减小，表明由于本发明所述酶生物传感器中的胆固醇氧化酶、辣根过氧化物酶的催化，所述酶生物传感器可对溶液中的胆固醇产生灵敏的电流响应。从图3中可见，随着胆固醇浓度的增加，电流响应也在不断增大，电极表面实现了快速的电子转移。
图4所示的是本发明所述酶生物传感器对不同浓度胆固醇的响应电流的标准曲线。胆固醇浓度在5.0×10-6～3.4×10-4mol/L内，响应电流与胆固醇浓度成线性关系。线性回归方程为：y=2.91498+5.93126x，R2=0.99880，检出限为6×10-7mol/L（信噪比为3）。因此，本发明所述酶生物传感器可用于胆固醇的定量检测。
实施例3
一种用于检测胆固醇的酶生物传感器，其制备方法如下：
（1）取5g鳞片石墨和2g NaNO3进行混合，加入120mL浓硫酸，置于4℃的冰水浴中搅拌30min；然后加入20gKMnO4，磁力搅拌反应60min，再移入40℃温水浴中继续反应30min；然后加入230mL蒸馏水，于95℃的温度条件搅拌5min，再加入质量分数为5%的双氧水，至不产生气泡，趁热过滤，并用去离子水和质量分数为5%的盐酸进行多次洗涤；然后透析一周，再在60℃真空干燥箱中干燥，得氧化石墨；称取0.1g所述氧化石墨溶解于50g蒸馏水中，超声60min，得到稳定的石墨分散液；加热所述石墨分散液至80℃并滴加2mL水合肼，反应4h后过滤，并用甲醇和蒸馏水冲洗，然后在60℃真空干燥箱中充分干燥，即得到石墨烯；
（2）称取0.005g壳聚糖（T0060，DAC≥95％）加入到3mL浓度为0.1mol/L的醋酸溶液中，得质量分数为0.5%的壳聚糖醋酸溶液；取1mL所述质量分数为0.5%的壳聚糖醋酸溶液，加入1mg石墨烯，超声分散2h，得到石墨烯含量为1mg∕mL的石墨烯-壳聚糖溶液。
（3）称取8.6mg硫堇，加入3mL蒸馏水，配制成10mmol∕L的硫堇水溶液；称取胆固醇氧化酶（Sigma）127.2U(21.2U/mg)，加入0.2mL蒸馏水，配制成30mg∕mL的胆固醇氧化酶水溶液；称取辣根过氧化物酶（Roche M0040）1000U（250U/mg），加入0.2mL蒸馏水，配制成20mg∕mL的辣根过氧化氢酶水溶液。
（4）将直径为3mm的玻碳电极依次用直径为0.3μm和0.05μm的Al2O3粉末抛光成镜面，用蒸馏水冲洗，然后依次在无水乙醇和蒸馏水中超声清洗1min，再将玻碳电极置于0.5mol/L的H2SO4溶液中进行电极活化，取出用蒸馏水冲洗，晾干。
（5）将所述的石墨烯-壳聚糖溶液、硫堇水溶液、胆固醇氧化酶水溶液及辣根过氧化物酶水溶液按1:1:1:1的体积比混合均匀得复合酶溶液，取复合酶溶液5μL滴加到步骤（3）所述表面预处理后的工作电极的表面，室温晾干，得到修饰后的工作电极；
（6）将所述修饰后的工作电极与参比电极和对电极组成三电极体系，得到所述检测胆固醇的酶生物传感器。
所述检测胆固醇的酶生物传感器响应时间短，反应速度快，检出限较低，灵敏度高，检测范围宽，可检测较大范围的胆固醇的含量。
实施例4
一种用于检测胆固醇的酶生物传感器，其制备方法如下：
（1）取5g鳞片石墨和2g NaNO3进行混合，加入120mL浓硫酸，置于4℃的冰水浴中搅拌30min；然后加入20gKMnO4，磁力搅拌反应60min，再移入40℃温水浴中继续反应30min；然后加入230mL蒸馏水，于95℃的温度条件搅拌5min，再加入质量分数为5%的双氧水，至不产生气泡，趁热过滤，并用去离子水和质量分数为5%的盐酸进行多次洗涤；然后透析一周，再在60℃真空干燥箱中干燥，得氧化石墨；称取0.1g所述氧化石墨溶解于50g蒸馏水中，超声60min，得到稳定的石墨分散液；加热所述石墨分散液至80℃并滴加2mL水合肼，反应4h后过滤，并用甲醇和蒸馏水冲洗，然后在60℃真空干燥箱中充分干燥，即得到石墨烯；
（2）称取0.06g壳聚糖（T0060，DAC≥95％）加入到3mL浓度为0.1mol/L的醋酸溶液中，得质量分数为2%的壳聚糖醋酸溶液；取1mL所述质量分数为2%的壳聚糖醋酸溶液，加入1mg石墨烯，超声分散2h，得到石墨烯含量为1mg∕mL的石墨烯-壳聚糖溶液。
（3）称取8.6mg硫堇，加入3mL蒸馏水，配制成10mmol∕L的硫堇水溶液；称取胆固醇氧化酶（Sigma）127.2U(21.2U/mg)，加入0.2mL蒸馏水，配制成30mg∕mL的胆固醇氧化酶水溶液；称取辣根过氧化物酶（Roche M0040）1000U（250U/mg），加入0.2mL蒸馏水，配制成20mg∕mL的辣根过氧化氢酶水溶液。
（4）将直径为3mm的玻碳电极依次用直径为0.3μm和0.05μm的Al2O3粉末抛光成镜面，用蒸馏水冲洗，然后依次在无水乙醇和蒸馏水中超声清洗1min，再将玻碳电极置于0.5mol/L的H2SO4溶液中进行电极活化，取出用蒸馏水冲洗，晾干。
（5）将所述的石墨烯-壳聚糖溶液、硫堇水溶液、胆固醇氧化酶水溶液及辣根过氧化物酶水溶液按1:1:1:1的体积比混合均匀得复合酶溶液，取复合酶溶液5μL滴加到步骤（3）所述表面预处理后的工作电极的表面，室温晾干，得到修饰后的工作电极；
（6）将所述修饰后的工作电极与参比电极和对电极组成三电极体系，得到所述检测胆固醇的酶生物传感器。
所述检测胆固醇的酶生物传感器响应时间短，反应速度快，检出限较低，灵敏度高，检测范围宽，可检测较大范围的胆固醇的含量。
实施例5
一种用于检测胆固醇的酶生物传感器，其制备方法如下：
（1）取5g鳞片石墨和2g NaNO3进行混合，加入120mL浓硫酸，置于4℃的冰水浴中搅拌30min；然后加入20gKMnO4，磁力搅拌反应60min，再移入40℃温水浴中继续反应30min；然后加入230mL蒸馏水，于95℃的温度条件搅拌5min，再加入质量分数为5%的双氧水，至不产生气泡，趁热过滤，并用去离子水和质量分数为5%的盐酸进行多次洗涤；然后透析一周，再在60℃真空干燥箱中干燥，得氧化墨称取01所述氧化墨溶解于0蒸馏水中超声60i得到稳定的石墨分散液；加热所述石墨分散液至80℃并滴加2mL水合肼，反应4h后过滤，并用甲醇和蒸馏水冲洗，然后在60℃真空干燥箱中充分干燥，即得到石墨烯；
（2）称取0.03g壳聚糖（T0060，DAC≥95％）加入到3mL浓度为0.1mol/L的醋酸溶液中，得质量分数为1%的壳聚糖醋酸溶液；取1mL所述质量分数为1%的壳聚糖醋酸溶液，加入5mg石墨烯，超声分散2h，得到石墨烯含量为5mg∕mL的石墨烯-壳聚糖溶液。
（3）称取8.6mg硫堇，加入3mL蒸馏水，配制成10mmol∕L的硫堇水溶液；称取胆固醇氧化酶（Sigma）127.2U(21.2U/mg)，加入0.2mL蒸馏水，配制成30mg∕mL的胆固醇氧化酶水溶液；称取辣根过氧化物酶（Roche M0040）1000U（250U/mg），加入0.2mL蒸馏水，配制成20mg∕mL的辣根过氧化氢酶水溶液。
（4）将直径为3mm的玻碳电极依次用直径为0.3μm和0.05μm的Al2O3粉末抛光成镜面，用蒸馏水冲洗，然后依次在无水乙醇和蒸馏水中超声清洗1min，再将玻碳电极置于0.5mol/L的H2SO4溶液中进行电极活化，取出用蒸馏水冲洗，晾干。
（5）将所述的石墨烯-壳聚糖溶液、硫堇水溶液、胆固醇氧化酶水溶液及辣根过氧化物酶水溶液按1:1:1:1的体积比混合均匀得复合酶溶液，取复合酶溶液5μL滴加到步骤（3）所述表面预处理后的工作电极的表面，室温晾干，得到修饰后的工作电极；
（6）将所述修饰后的工作电极与参比电极和对电极组成三电极体系，得到所述检测胆固醇的酶生物传感器。
所述检测胆固醇的酶生物传感器响应时间短，反应速度快，检出限较低，灵敏度高，检测范围宽，可检测较大范围的胆固醇的含量。
实施例6
一种用于检测胆固醇的酶生物传感器，其制备方法如下：
（1）取5g鳞片石墨和2g NaNO3进行混合，加入120mL浓硫酸，置于4℃的冰水浴中搅拌30min；然后加入20gKMnO4，磁力搅拌反应60min，再移入40℃温水浴中继续反应30min；然后加入230mL蒸馏水，于95℃的温度条件搅拌5min，再加入质量分数为5%的双氧水，至不产生气泡，趁热过滤，并用去离子水和质量分数为5%的盐酸进行多次洗涤；然后透析一周，再在60℃真空干燥箱中干燥，得氧化石墨；称取0.1g所述氧化石墨溶解于50g蒸馏水中，超声60min，得到稳定的石墨分散液；加热所述石墨分散液至80℃并滴加2mL水合肼，反应4h后过滤，并用甲醇和蒸馏水冲洗，然后在60℃真空干燥箱中充分干燥，即得到石墨烯；
（2）称取0.03g壳聚糖（T0060，DAC≥95％）加入到3mL浓度为0.1mol/L的醋酸溶液中，得质量分数为1%的壳聚糖醋酸溶液；取1mL所述质量分数为1%的壳聚糖醋酸溶液，加入3mg石墨烯，超声分散2h，得到石墨烯含量为3mg∕mL的石墨烯-壳聚糖溶液。
（3）称取8.6mg硫堇，加入3mL蒸馏水，配制成10mmol∕L的硫堇水溶液；称取胆固醇氧化酶（Sigma）127.2U(21.2U/mg)，加入0.2mL蒸馏水，配制成30mg∕mL的胆固醇氧化酶水溶液；称取辣根过氧化物酶（Roche M0040）1000U（250U/mg），加入0.2mL蒸馏水，配制成20mg∕mL的辣根过氧化氢酶水溶液。
（4）将直径为3mm的玻碳电极依次用直径为0.3μm和0.05μm的Al2O3粉末抛光成镜面，用蒸馏水冲洗，然后依次在无水乙醇和蒸馏水中超声清洗1min，再将玻碳电极置于0.5mol/L的H2SO4溶液中进行电极活化，取出用蒸馏水冲洗，晾干。
（5）将所述的石墨烯-壳聚糖溶液、硫堇水溶液、胆固醇氧化酶水溶液及辣根过氧化物酶水溶液按1:1:1:1的体积比混合均匀得复合酶溶液，取复合酶溶液5μL滴加到步骤（3）所述表面预处理后的工作电极的表面，室温晾干，得到修饰后的工作电极；
（6）将所述修饰后的工作电极与参比电极和对电极组成三电极体系，得到所述检测胆固醇的酶生物传感器。
所述检测胆固醇的酶生物传感器响应时间短，反应速度快，检出限较低，灵敏度高，检测范围宽，可检测较大范围的胆固醇的含量。
实施例7
一种用于检测胆固醇的酶生物传感器，其制备方法如下：
（1）取5g鳞片石墨和2g NaNO3进行混合，加入120mL浓硫酸，置于4℃的冰水浴中搅拌30min；然后加入20gKMnO4，磁力搅拌反应60min，再移入40℃温水浴中继续反应30min；然后加入230mL蒸馏水，于95℃的温度条件搅拌5min，再加入质量分数为5%的双氧水，至不产生气泡，趁热过滤，并用去离子水和质量分数为5%的盐酸进行多次洗涤；然后透析一周，再在60℃真空干燥箱中干燥，得氧化石墨；称取0.1g所述氧化石墨溶解于50g蒸馏水中，超声60min，得到稳定的石墨分散液；加热所述石墨分散液至80℃并滴加2mL水合肼，反应4h后过滤，并用甲醇和蒸馏水冲洗，然后在60℃真空干燥箱中充分干燥，即得到石墨烯；
（2）称取0.03g壳聚糖（T0060，DAC≥95％）加入到3mL浓度为0.1mol/L的醋酸溶液中，得质量分数为1%的壳聚糖醋酸溶液；取1mL所述质量分数为1%的壳聚糖醋酸溶液，加入1mg石墨烯，超声分散2h，得到石墨烯含量为1mg∕mL的石墨烯-壳聚糖溶液。
（3）称取4.3mg硫堇，加入3mL蒸馏水，配制成5mmol∕L的硫堇水溶液；称取胆固醇氧化酶（Sigma）127.2U(21.2U/mg)，加入0.2mL蒸馏水，配制成30mg∕mL的胆固醇氧化酶水溶液；称取辣根过氧化物酶（Roche M0040）1000U（250U/mg），加入0.2mL蒸馏水，配制成20mg∕mL的辣根过氧化氢酶水溶液。
（4）将直径为3mm的玻碳电极依次用直径为0.3μm和0.05μm的Al2O3粉末抛光成镜面，用蒸馏水冲洗，然后依次在无水乙醇和蒸馏水中超声清洗1min，再将玻碳电极置于0.5mol/L的H2SO4溶液中进行电极活化，取出用蒸馏水冲洗，晾干。
（5）将所述的石墨烯-壳聚糖溶液、硫堇水溶液、胆固醇氧化酶水溶液及辣根过氧化物酶水溶液按1:1:1:1的体积比混合均匀得复合酶溶液，取复合酶溶液5μL滴加到步骤（3）所述表面预处理后的工作电极的表面，室温晾干，得到修饰后的工作电极；
（6）将所述修饰后的工作电极与参比电极和对电极组成三电极体系，得到所述检测胆固醇的酶生物传感器。
所述检测胆固醇的酶生物传感器响应时间短，反应速度快，检出限较低，灵敏度高，检测范围宽，可检测较大范围的胆固醇的含量。
实施例8
一种用于检测胆固醇的酶生物传感器，其制备方法如下：
（1）取5g鳞片石墨和2g NaNO3进行混合，加入120mL浓硫酸，置于4℃的冰水浴中搅拌30min；然后加入20gKMnO4，磁力搅拌反应60min，再移入40℃温水浴中继续反应30min；然后加入230mL蒸馏水，于95℃的温度条件搅拌5min，再加入质量分数为5%的双氧水，至不产生气泡，趁热过滤，并用去离子水和质量分数为5%的盐酸进行多次洗涤；然后透析一周，再在60℃真空干燥箱中干燥，得氧化石墨；称取0.1g所述氧化石墨溶解于50g蒸馏水中，超声60min，得到稳定的石墨分散液；加热所述石墨分散液至80℃并滴加2mL水合肼，反应4h后过滤，并用甲醇和蒸馏水冲洗，然后在60℃真空干燥箱中充分干燥，即得到石墨烯；
（2）称取0.03g壳聚糖（T0060，DAC≥95％）加入到3mL浓度为0.1mol/L的醋酸溶液中，得质量分数为1%的壳聚糖醋酸溶液；取1mL所述质量分数为1%的壳聚糖醋酸溶液，加入1mg石墨烯，超声分散2h，得到石墨烯含量为1mg∕mL的石墨烯-壳聚糖溶液。
（3）称取8.6mg硫堇，加入3mL蒸馏水，配制成10mmol∕L的硫堇水溶液；称取胆固醇氧化酶（Sigma）84.8U(21.2U/mg)，加入0.2mL蒸馏水，配制成20mg∕mL的胆固醇氧化酶水溶液；称取辣根过氧化物酶（Roche M0040）500U（250U/mg），加入0.2mL蒸馏水，配制成10mg∕mL的辣根过氧化氢酶水溶液。
（4）将直径为3mm的玻碳电极依次用直径为0.3μm和0.05μm的Al2O3粉末抛光成镜面，用蒸馏水冲洗，然后依次在无水乙醇和蒸馏水中超声清洗1min，再将玻碳电极置于0.5mol/L的H2SO4溶液中进行电极活化，取出用蒸馏水冲洗，晾干。
（5）将所述的石墨烯-壳聚糖溶液、硫堇水溶液、胆固醇氧化酶水溶液及辣根过氧化物酶水溶液按1:1:1:1的体积比混合均匀得复合酶溶液，取复合酶溶液5μL滴加到步骤（3）所述表面预处理后的工作电极的表面，室温晾干，得到修饰后的工作电极；
（6）将所述修饰后的工作电极与参比电极和对电极组成三电极体系，得到所述检测胆固醇的酶生物传感器。
所述检测胆固醇的酶生物传感器响应时间短，反应速度快，检出限较低，灵敏度高，检测范围宽，可检测较大范围的胆固醇的含量。
实施例9
一种用于检测胆固醇的酶生物传感器，其制备方法如下：
（1）取5g鳞片石墨和2g NaNO3进行混合，加入120mL浓硫酸，置于4℃的冰水浴中搅拌30min；然后加入20gKMnO4，磁力搅拌反应60min，再移入40℃温水浴中继续反应30min；然后加入230mL蒸馏水，于95℃的温度条件搅拌5min，再加入质量分数为5%的双氧水，至不产生气泡，趁热过滤，并用去离子水和质量分数为5%的盐酸进行多次洗涤；然后透析一周，再在60℃真空干燥箱中干燥，得氧化石墨；称取0.1g所述氧化石墨溶解于50g蒸馏水中，超声60min，得到稳定的石墨分散液；加热所述石墨分散液至80℃并滴加2mL水合肼，反应4h后过滤，并用甲醇和蒸馏水冲洗，然后在60℃真空干燥箱中充分干燥，即得到石墨烯；
（2）称取0.03g壳聚糖（T0060，DAC≥95％）加入到3mL浓度为0.1mol/L的醋酸溶液中，得质量分数为1%的壳聚糖醋酸溶液；取1mL所述质量分数为1%的壳聚糖醋酸溶液，加入1mg石墨烯，超声分散2h，得到石墨烯含量为1mg∕mL的石墨烯-壳聚糖溶液。
（3）称取8.6mg硫堇，加入3mL蒸馏水，配制成10mmol∕L的硫堇水溶液；称取胆固醇氧化酶（Sigma）127.2U(21.2U/mg)，加入0.2mL蒸馏水，配制成30mg∕mL的胆固醇氧化酶水溶液；称取辣根过氧化物酶（Roche M0040）1000U（250U/mg），加入0.2mL蒸馏水，配制成20mg∕mL的辣根过氧化氢酶水溶液。
（4）将直径为3mm的玻碳电极依次用直径为0.3μm和0.05μm的Al2O3粉末抛光成镜面，用蒸馏水冲洗，然后依次在无水乙醇和蒸馏水中超声清洗1min，再将玻碳电极置于0.5mol/L的H2SO4溶液中进行电极活化，取出用蒸馏水冲洗，晾干。
（5）将所述的石墨烯-壳聚糖溶液、硫堇水溶液、胆固醇氧化酶水溶液及辣根过氧化物酶水溶液按1:1:1:1的体积比混合均匀得复合酶溶液，取复合酶溶液3μL滴加到步骤（3）所述表面预处理后的工作电极的表面，室温晾干，得到修饰后的工作电极；
（6）将所述修饰后的工作电极与参比电极和对电极组成三电极体系，得到所述检测胆固醇的酶生物传感器。
所述检测胆固醇的酶生物传感器响应时间短，反应速度快，检出限较低，灵敏度高，检测范围宽，可检测较大范围的胆固醇的含量。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种检测胆固醇的酶生物传感器，由参比电极、对电极及修饰后的工作电极组成，所述修饰后的工作电极由工作电极及固化在工作电极表面的物质识别酶膜组成，其特征在于：所述物质识别酶膜主要由石墨烯、硫堇、胆固醇氧化酶、辣根过氧化物酶及壳聚糖混合制备而成。
2.根据权利要求1所述的检测胆固醇的酶生物传感器，其特征在于：所述物质识别酶膜为将1～5mg/mL的石墨烯-壳聚糖溶液、5～10mmol/L的硫堇水溶液、20～30mg/mL的胆固醇氧化酶水溶液及10～20mg/mL的辣根过氧化物酶水溶液混合后干燥制得。
3.根据权利要求2所述的检测胆固醇的酶生物传感器，其特征在于：所述的石墨烯-壳聚糖溶液、硫堇水溶液、胆固醇氧化酶水溶液、辣根过氧化物酶水溶液的体积比为1：1：1：1。
4.根据权利要求1所述的检测胆固醇的酶生物传感器，其特征在于：所述工作电极为玻碳电极，所述参比电极为饱和甘汞电极或Ag/AgCl参比电极，所述对电极为铂电极。
5.一种根据权利要求1～4任一项所述的检测胆固醇的酶生物传感器的制备方法，其特征在于包括如下步骤：首先将石墨烯-壳聚糖溶液、硫堇水溶液、胆固醇氧化酶水溶液及辣根过氧化物酶水溶液混合均匀，得复合酶溶液；然后取复合酶溶液滴加到经表面预处理的工作电极的表面，晾干后得到修饰后的工作电极；将所述修饰后的工作电极、参比电极及对电极组成三电极体系，得到所述检测胆固醇的酶生物传感器。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于具体步骤为：
（1）在1mL质量分数为0.5%～2%的壳聚糖醋酸溶液中加入1～5mg石墨烯，超声分散1～2h，得到石墨烯含量为1～5mg/mL的石墨烯-壳聚糖溶液；
（2）分别配制5～10mmol/L的硫堇水溶液、20～30mg/mL的胆固醇氧化酶水溶液及10～20mg/mL的辣根过氧化物酶水溶液；
（3）对工作电极进行表面预处理；
（4）将步骤（1）与步骤（2）中所述的石墨烯-壳聚糖溶液、硫堇水溶液、胆固醇氧化酶水溶液及辣根过氧化物酶水溶液按比例混合均匀得复合酶溶液，取复合酶溶液3～5μL滴加到步骤（3）所述表面预处理后的工作电极的表面，室温晾干，得到修饰后的工作电极；
（5）将所述修饰后的工作电极与参比电极和对电极组成三电极体系，得到所述检测胆固醇的酶生物传感器。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于步骤（1）所述的石墨烯的制备方法为：取5g鳞片石墨和2g NaNO3进行混合，加入120mL浓硫酸，置于4℃的冰水浴中搅拌30min；然后加入20gKMnO4，磁力搅拌反应60min，再移入40℃温水浴中继续反应30min；然后加入230mL蒸馏水，于95℃的温度条件搅拌5min，再加入质量分数为5%的双氧水，至不产生气泡，趁热过滤，并用去离子水和质量分数为5%的盐酸进行洗涤；然后透析一周，再在60℃真空干燥箱中干燥，得氧化石墨；称取0.1g所述氧化石墨溶解于50g蒸馏水中，超声60min，得到石墨分散液；加热所述石墨分散液至80℃并滴加2mL水合肼，反应4h后过滤，再用甲醇和蒸馏水冲洗，然后在60℃真空干燥箱中干燥，即得到石墨烯。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）所述的表面预处理的具体操作为：首先将工作电极的表面依次用直径为0.3μm和0.05μm的Al2O3粉末抛光成镜面，再用水冲洗；然后依次在无水乙醇和水中分别超声清洗1min，取出用水洗净，晾干；然后将晾干的工作电极置于0.5mol/L的H2SO4溶液中进行电极活化。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：步骤（4）中所述的石墨烯-壳聚糖溶液、硫堇水溶液、胆固醇氧化酶水溶液、辣根过氧化物酶水溶液的体积比为1：1：1：1；步骤（4）及步骤（5）中所述工作电极为玻碳电极，所述参比电极为饱和甘汞电极或Ag/AgCl参比电极，所述对电极为铂电极。
10.根据权利要求1～4任一项所述的检测胆固醇的酶生物传感器在胆固醇定量检测中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20160622 |