CN103033549A - 一种基于石墨烯的双酶葡萄糖传感器的制备方法 - Google Patents

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本发明涉及一种基于石墨烯的双酶葡萄糖传感器的制备方法，属于材料制备技术领域。本发明主要是将离子液体功能化修饰石墨烯改善其分散性，再将其与铂纳米粒子联用，以促进电子的传递，运用层层自组装法修饰到玻碳电极上，再利用生物信号增敏放大效应，结合葡萄糖氧化酶和辣根过氧化氢酶两种酶，在4℃下干燥24小时，使电极表面形成一层均匀的复合膜，制备双酶葡萄糖传感器，用于葡萄糖的快速电化学测定。本发明制备的纳米复合材料生物相容性好，利于生物酶的固定且制备方法成本低，简单快捷。本发明制作的生物传感器灵敏度高，稳定性好，线性范围宽，具有一定的抗干扰能力，可广泛应用到糖尿病诊断和食品工艺监测等方面。

Description

一种基于石墨烯的双酶葡萄糖传感器的制备方法
技术领域
本发明涉及一种基于石墨烯的双酶葡萄糖传感器的制备方法，属于材料制备技术领域。
背景技术
生物传感器的研究经历了三个发展阶段即第一代生物传感器以氧为中继体的电催化，第二代生物传感器基于人造媒介体的电催化和第三代生物传感器的直接电催化。
要实现H2O2在电极上直接氧化往往需要较高的工作电位（大于0.6V vs. SCE）。在这样的高工作电位下，共存于实际生物样品中的许多物质（如尿酸、抗坏血酸等）在电极表面也同时被氧化，从而导致了干扰信号的产生。而构建双酶体系的葡萄糖生物传感器是一种抑制干扰的有效办法。 在传感器制备中，将葡萄糖氧化酶（GOx）与辣根过氧化物酶（HRP）共同组装到电极上，这样，酶促反应生成的H2O2就可以直接被HRP还原。检测的机理由H2O2在电极表面的氧化反应转变为还原反应，从而降低工作电位，消除干扰电流的产生，提高传感器的选择性。
石墨烯具有良好的生物相容性、独特的电学性能、明显的量子效应、大的比表面积、高稳定性以及强吸附特性，近年来引起世界各国化学、物理、材料学界人士的广泛关注，在科学基础研究及应用研究中倍受青睐。本发明利用石墨烯复合材料的优异性能，结合双酶体系的信号增敏放大效应，制备出一种选择性好并且具有优良稳定性的葡萄糖酶传感器，可广泛应用到糖尿病诊断和食品工艺监测等方面。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于石墨烯的双酶葡萄糖传感器的制备方法。
本发明提出的一种基于石墨烯的双酶葡萄糖传感器的制备方法，是将离子液体功能化修饰石墨烯改善其分散性，再将其与铂纳米粒子联用，以促进电子的传递，运用层层自组装法修饰到玻碳电极上，再利用生物双放大效应，结合葡萄糖氧化酶和辣根过氧化氢酶两种酶，在4℃下干燥24小时，使电极表面形成一层均匀的复合膜，制备双酶葡萄糖传感器。具体步骤如下：
（1）功能化石墨烯的制备：将10mg的离子液体加入到0.5mg/mL的氧化石墨水溶液中超声50-70分钟，得到均匀分散的混合物；而后加入10 mg KOH，超声20-40分钟，得到透明均一的溶液；在60~80℃温度下，回流反应24~48小时，得到功能化石墨烯，所得产物离心，用乙醇、水洗至中性，真空干燥；
（2）Pt纳米粒子的制备：将1wt% H2PtCl6的水溶液1ml加入到100ml水中，加热至沸点温度；再加入1wt%的柠檬酸钠水溶液3ml，保持沸点温度反应1~3小时，得到Pt纳米粒子；
（3）双酶葡萄糖传感器的制备： 
a．玻碳电极的预处理：首先将玻碳电极（φ=3mm）用金相砂纸抛光，再依次用1.0μm、0.3μm和0.05μm的Al2O3悬浮液在麂皮上抛光至镜面，最后分别用体积比为1:1的HNO3溶液、无水乙醇和二次蒸馏水超声清洗干净，备用；
b．修饰玻碳电极的制备：将预处理好的玻碳电极在步骤（1）得到的0.05M功能化石墨烯分散液中浸泡20-40分钟，用二次蒸馏水洗去未吸附上的功能化石墨烯；再在步骤(2)中所述的Pt纳米粒子中浸泡20-40分钟，用二次蒸馏水洗去未吸附上的Pt纳米粒子，如此反复2-5次，氮气气氛中，自然晾干；最后在由葡萄糖氧化酶和辣根过氧化氢酶组成的壳聚糖分散液中，在3-5℃温度下，浸泡10-14小时。再用pH=7.4的PBS磷酸盐缓冲液洗涤，在该温度下，氮气气氛中，干燥，得到基于石墨烯的双酶葡萄糖传感器, 然后在电化学工作站上测试传感器的分析性能。
本发明中，步骤(1)中所述石墨烯是指单层石墨片、多层石墨片或它们的混合物中任一种。
本发明中，步骤(1)中所述离子液体是指1-辛基-3-甲基咪唑溴化物离子液体，[BMIM]PF6 或[BMIM]BF4等中的任一种。
本发明中，步骤(3)中所述葡萄糖氧化酶和辣根过氧化氢酶的质量比为1:1-1:3。
本发明中，步骤(3)中所述功能化石墨烯和Pt纳米粒子的层数为1、2、3、4、5等中的任一种。
本发明提供的层层自组装制备方法简单易行，结合了双酶生物信号增敏放大效应和石墨烯具有良好的生物相容性、独特的电学性能等特点，制备的纳米复合材料生物相容性好，利于生物酶的固定且制备方法成本低，简单快捷。因此，本发明具有重要的科学技术价值和实际应用价值。
附图说明
图l为实施例1中基于石墨烯的双酶葡萄糖传感器的工艺流程及传感器结构示意图。
图2为实施例1中在含有葡萄糖（2mM）的0.05M、pH=7.4的磷酸盐PBS缓冲溶液中葡萄糖传感器的循环伏安曲线图。图中，测试操作电压为-1.0~1.0V，扫描速率为50mv/s。
图3为实施例2中在0.05M、pH=7.4的磷酸盐PBS缓冲溶液中依次加入5mM葡萄糖溶液的葡萄糖传感器的电流-时间曲线图。图中，酶电极电位为-0.6v，传感器的检测下限为2mM。
具体实施方式
下面的实施例是对本发明的进一步说明，而不是限制本发明的范围。
下述实施例中，所用的工作电极是玻碳电极（φ=3mm）。电化学测试所用的对电极是铂电极，参比电极为Ag/AgCl标准电极。电化学测试采用循环伏安法，操作电压为-1.0~1.0V，扫描速率为50mv/s，测试底液为0.05M、pH=7.4的磷酸盐PBS缓冲溶液。
实施例l：
（1）功能化石墨烯的制备：将10mg的离子液体[BMIM]PF6加入到0.5mg/mL的氧化石墨水溶液中超声一小时，得到均匀分散的混合物。而后加入KOH (10 mg)，超声30分钟，得到透明均一的溶液。在60℃温度下，回流反应24小时，得到功能化石墨烯，所得产物离心，用乙醇、水洗至中性，真空60℃干燥。
（2）Pt纳米粒子的制备：将1wt% H2PtCl6的水溶液（1ml）加入到100ml水中，加热至沸点温度。再快速加入1wt%的柠檬酸钠水溶液3ml，保持沸点温度1小时。
（3）双酶葡萄糖传感器的制备： 
a．玻碳电极的预处理：首先将玻碳电极（φ=3mm）用金相砂纸抛光，再依次用1.0μm和0.3μm和0.05μm的Al2O3悬浮液在麂皮上抛光至镜面，最后分别用1:1的HNO3溶液、无水乙醇和二次蒸馏水超声清洗干净，备用。
b．修饰玻碳电极的制备：将预处理好的玻碳电极在步骤（1）得到的0.05M功能化石墨烯分散液中浸泡30分钟，用二次蒸馏水洗去未吸附上的功能化石墨烯；再在Pt分散液中浸泡30分钟，用二次蒸馏水洗去未吸附上的Pt纳米粒子，如此反复3次，氮气气氛中，自然晾干。最后在葡萄糖氧化酶和辣根过氧化氢酶质量比为1:1的壳聚糖分散液中，在4℃温度下，浸泡12小时。再用PBS磷酸盐缓冲液（pH=7.4）洗，在4℃、氮气气氛中，干燥，得到基于石墨烯的双酶葡萄糖传感器。该传感器是以玻碳电极为基底，中间层是功能化石墨烯和铂纳米粒子交替形成的3层混合物，其中铂纳米粒子以静电吸附的形式固定在功能化石墨烯上，最外层为酶的修饰电极（图1）。
然后在电化学工作站上测试传感器的分析性能：1）在含有葡萄糖（2mM）的0.05M、pH=7.4的磷酸盐PBS缓冲溶液中葡萄糖传感器的循环伏安曲线（图2）。其中，测试操作电压为-1.0~1.0V，扫描速率为50mv/s。2）在最佳测试条件下，在0.05M、pH=7.4的磷酸盐PBS缓冲溶液中依次加入5mM葡萄糖溶液，测试葡萄糖传感器的电流-时间曲线（图3）。其中酶电极电位为-0.6v。
实施例2：
（1）功能化石墨烯的制备：将10mg的离子液体[BMIM]BF4加入到0.5mg/mL的氧化石墨水溶液中超声一小时，得到均匀分散的混合物。而后加入KOH (10 mg)，超声30分钟，得到透明均一的溶液。在80℃温度下，回流反应48小时，得到功能化石墨烯，所得产物离心，用乙醇、水洗至中性，真空60℃干燥。
（2）Pt纳米粒子的制备：将1wt% H2PtCl6的水溶液（1ml）加入到100ml水中，加热至沸点温度。再快速加入1wt%的柠檬酸钠水溶液3ml，保持沸点温度1小时。
（3）双酶葡萄糖传感器的制备： 
a．玻碳电极的预处理：首先将玻碳电极（φ=3mm）用金相砂纸抛光，再依次用1.0μm和0.3μm和0.05μm的Al2O3悬浮液在麂皮上抛光至镜面，最后分别用1:1的HNO3溶液、无水乙醇和二次蒸馏水超声清洗干净，备用。
b．修饰玻碳电极的制备：将预处理好的玻碳电极在步骤（1）得到的0.05M功能化石墨烯分散液中浸泡30分钟，用二次蒸馏水洗去未吸附上的功能化石墨烯；再在Pt分散液中浸泡30分钟，用二次蒸馏水洗去未吸附上的Pt纳米粒子，如此反复3次，氮气气氛中，自然晾干。最后在葡萄糖氧化酶和辣根过氧化氢酶质量比为1:2的壳聚糖分散液中，在4℃温度下，浸泡12小时。再用PBS磷酸盐缓冲液（pH=7.4）洗，在4℃、氮气气氛中，干燥，得到基于石墨烯的双酶葡萄糖传感器。该传感器是以玻碳电极为基底，中间层是功能化石墨烯和铂纳米粒子交替形成的3层混合物，其中铂纳米粒子以静电吸附的形式固定在功能化石墨烯上，最外层为酶的修饰电极。
实施例3：
（1）功能化石墨烯的制备：将10mg的离子液体1-辛基-3-甲基咪唑溴化物加入到0.5mg/mL的氧化石墨水溶液中超声一小时，得到均匀分散的混合物。而后加入KOH (10 mg)，超声30分钟，得到透明均一的溶液。在70℃温度下，回流反应48小时，得到功能化石墨烯，所得产物离心，用乙醇、水洗至中性，真空60℃干燥。
（2）Pt纳米粒子的制备：将1 wt % H2PtCl6的水溶液（1ml）加入到100ml水中，加热至沸点温度。再快速加入1 wt %的柠檬酸钠水溶液3ml，保持沸点温度3小时。
（3）双酶葡萄糖传感器的制备： 
a．玻碳电极的预处理：首先将玻碳电极（φ=3mm）用金相砂纸抛光，再依次用1.0μm和0.3μm和0.05μm的Al2O3悬浮液在麂皮上抛光至镜面，最后分别用1:1的HNO3溶液、无水乙醇和二次蒸馏水超声清洗干净，备用。
b．修饰玻碳电极的制备：将预处理好的玻碳电极在步骤（1）得到的0.05M功能化石墨烯分散液中浸泡30分钟，用二次蒸馏水洗去未吸附上的功能化石墨烯；再在Pt分散液中浸泡30分钟，用二次蒸馏水洗去未吸附上的Pt纳米粒子，如此反复4次，氮气气氛中，自然晾干。最后在葡萄糖氧化酶和辣根过氧化氢酶质量比为1:1.5的壳聚糖分散液中，在4℃温度下，浸泡12小时。再用PBS磷酸盐缓冲液（pH=7.4）洗，在4℃、氮气气氛中，干燥，得到基于石墨烯的双酶葡萄糖传感器。该传感器是以玻碳电极为基底，中间层是功能化石墨烯和铂纳米粒子交替形成的4层混合物，其中铂纳米粒子以静电吸附的形式固定在功能化石墨烯上，最外层为酶的修饰电极。
实施例4：
（1）功能化石墨烯的制备：将10mg的离子液体[BMIM]BF4加入到0.5mg/mL的氧化石墨水溶液中超声一小时，得到均匀分散的混合物。而后加入KOH (10 mg)，超声30分钟，得到透明均一的溶液。在80℃温度下，回流反应36小时，得到功能化石墨烯，所得产物离心，用乙醇、水洗至中性，真空60℃干燥。
（2）Pt纳米粒子的制备：将1 wt % H2PtCl6的水溶液（1ml）加入到100ml水中，加热至沸点温度。再快速加入1 wt %的柠檬酸钠水溶液3ml，保持沸点温度2小时。
（3）双酶葡萄糖传感器的制备： 
a．玻碳电极的预处理：首先将玻碳电极（φ=3mm）用金相砂纸抛光，再依次用1.0μm和0.3μm和0.05μm的Al2O3悬浮液在麂皮上抛光至镜面，最后分别用1:1的HNO3溶液、无水乙醇和二次蒸馏水超声清洗干净，备用。
b．修饰玻碳电极的制备：将预处理好的玻碳电极在步骤（1）得到的0.05M功能化石墨烯分散液中浸泡30分钟，用二次蒸馏水洗去未吸附上的功能化石墨烯；再在Pt分散液中浸泡30分钟，用二次蒸馏水洗去未吸附上的Pt纳米粒子，如此反复5次，氮气气氛中，自然晾干。最后在一定比例的葡萄糖氧化酶和辣根过氧化氢酶质量比为1:3的壳聚糖分散液中，在4℃温度下，浸泡12小时。再用PBS磷酸盐缓冲液（pH=7.4）洗，在4℃、氮气气氛中，干燥，得到基于石墨烯的双酶葡萄糖传感器。该传感器是以玻碳电极为基底，中间层是功能化石墨烯和铂纳米粒子交替形成的5层混合物，其中铂纳米粒子以静电吸附的形式固定在功能化石墨烯上，最外层为酶的修饰电极。
上述的对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员理解和应用苯发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于这里的实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，对本发明做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种基于石墨烯的双酶葡萄糖传感器的制备方法，其特征在于具体步骤如下：
（1）功能化石墨烯的制备：将10mg的离子液体加入到0.5mg/mL的氧化石墨水溶液中超声50-70分钟，得到均匀分散的混合物；而后加入10 mg KOH，超声20-40分钟，得到透明均一的溶液；在60~80℃温度下，回流反应24~48小时，得到功能化石墨烯，所得产物离心，用乙醇、水洗至中性，真空干燥；
（2）Pt纳米粒子的制备：将1wt% H2PtCl6的水溶液1ml加入到100ml水中，加热至沸点温度；再加入1wt%的柠檬酸钠水溶液3ml，保持沸点温度反应1~3小时，得到Pt纳米粒子；
（3）双酶葡萄糖传感器的制备： 
a．玻碳电极的预处理：首先将玻碳电极用金相砂纸抛光，再依次用1.0μm、0.3μm和0.05μm的Al2O3悬浮液在麂皮上抛光至镜面，最后分别用体积比为1:1的HNO3溶液、无水乙醇和二次蒸馏水超声清洗干净，备用；
b．修饰玻碳电极的制备：将预处理好的玻碳电极在步骤（1）得到的0.05M功能化石墨烯分散液中浸泡20-40分钟，用二次蒸馏水洗去未吸附上的功能化石墨烯；再在步骤(2)中所述的Pt纳米粒子中浸泡20-40分钟，用二次蒸馏水洗去未吸附上的Pt纳米粒子，如此反复2-5次，氮气气氛中，自然晾干；最后在由葡萄糖氧化酶和辣根过氧化氢酶组成的壳聚糖分散液中，在3-5℃温度下，浸泡10-14小时；再用pH=7.4的PBS磷酸盐缓冲液洗涤，在该温度下，氮气气氛中，干燥，得到基于石墨烯的双酶葡萄糖传感器。
2.根据权利要求1所述的基于石墨烯的双酶葡萄糖传感器的制备方法，其特征是步骤(1)中所述石墨烯是指单层石墨片、多层石墨片或它们的混合物中任一种。
3.根据权利要求1所述的基于石墨烯的双酶葡萄糖传感器的制备方法，其特征是步骤(1)中所述离子液体是指1-辛基-3-甲基咪唑溴化物离子液体、[BMIM]PF6 或 [BMIM]BF4中的任一种。
4.根据权利要求1所述的基于石墨烯的双酶葡萄糖传感器的制备方法，其特征是步骤(3)中所述葡萄糖氧化酶和辣根过氧化氢酶的质量比为1:1-1:3。
5.根据权利要求1所述的基于石墨烯的双酶葡萄糖传感器的制备方法，其特征是步骤(3)中所述功能化石墨烯和Pt纳米粒子的层数为1、2、3、4或5中的任一种。
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