CN104280441A - 一种Au@Ag-PPY复合纳米材料和L-半胱氨酸双层膜固定葡萄糖氧化酶修饰电极的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种AuAg-PPY复合纳米材料和L-半胱氨酸双层膜固定葡萄糖氧化酶修饰电极的制备方法,其通过纳米金颗粒制备、AuAg-PPY复合纳米材料的制备、电极的处理、L-半胱氨酸双层膜的形成、AuAg-PPY复合纳米材料的固定、酶的吸附、修饰电极后处理步骤,得到酶修饰电极。本发明通过AuAg-PPY复合纳米材料/L-半胱氨酸双层膜实现了酶与电极之间的直接电子传递,成功构建了一种高灵敏度的第三代生物传感器。
Description
技术领域
本发明涉及生物电化学传感器领域,具体地涉及一种固定葡萄糖氧化酶修饰电极的制备方法。
背景技术
电化学生物传感器是指由生物体成分(酶、抗原、抗体、激素等)或生物体本身(细胞、细胞器、组织等)作为敏感元件,电极(固体电极、离子选择性电极、气敏电极等)作为转换元件,以电势或电流为特征检测信号进行传感检测的一种的传感器。由于它响应快,灵敏度高,制作简单而被广泛研究和应用。利用酶在电极上的直接发生氧化或还原反应而构造成的生物传感器称为第三代生物传感器。在这类生物传感器中,电子传输与氧和其它电子受体无关,也无需任何媒介体的加入,克服了使用介体存在的测量电位偏正、电活性物质干扰多、电极制作复杂、介体污染等缺点。
葡萄糖传感器在生物和医学上有极其重要的研究与应用价值,不仅能用于医学上的疾病控制,而且能用到化工、食品工业的检测之中,用途广泛。但是,在葡萄糖生物传感器的研制中,灵敏度、稳定性及重现性始终是葡萄糖传感器发展需要提高的重要因素。发展新型固定材料、选择合适的酶固定化方法是解决这些问题的有效方法。
近年来,随着纳米科学的发展和纳米材料制备技术的不断发展,纳米材料以其独特的物理化学特性而被广泛的应用于生物传感器的研制,人们一直致力于寻找具有良好生物相容性的新型纳米材料以提高生物传感器的电化学性能。贵金属纳米粒子由于具有较大的比表面积,较高的表面反应活性和催化效率以及较强的吸附能力,在生物传感器中表现出较好的催化活性;而双金属纳米材料的性能更为优越。
发明内容
本发明的再一个目的在于提供一种AuAg-PPY复合纳米材料和L-半胱氨酸双层膜固定葡萄糖氧化酶修饰电极的制备方法。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案是:一种AuAg-PPY复合纳米材料和L-半胱氨酸双层膜固定葡萄糖氧化酶修饰电极的制备方法,包括如下步骤:
a.AuAg-PPY复合纳米材料由纳米金和银及聚吡咯复合而成,制备过程如下:
(1)取纳米金颗粒的悬浮液,纳米金颗粒离心后取沉淀,得到物质A;
(2)向物质A中加入吡咯和十二烷基磺酸钠的混合液,充分振荡后,加入硝酸银溶液,再振荡后,于室温下陈化,得物质B;
(3)将物质B离心,取沉淀,并用十二烷基磺酸钠分散,得到AuAg-PPY纳米复合材料;
b.电极的处理:将金电极先用三氧化二铝悬浊液处理,再用三氧化二铝悬浊液在打磨布上抛光成镜面,最后用乙醇、二次水超声清洗;
c. 制备双层L-半胱氨酸膜修饰的金电极:将处理好的金电极浸泡在L-半胱氨酸溶液中,然后取出用二次蒸馏水冲洗干净即得;
d.AuAg-PPY复合纳米材料的固定:在L-半胱氨酸双层膜修饰的金电极上滴涂AuAg-PPY复合纳米材料的分散液,室温下放置;
e. 酶的吸附:在AuAg-PPY/L-半胱氨酸双层膜修饰的金电极上滴涂葡萄糖氧化酶溶液,在4℃冰箱中放置;
f. 修饰电极后处理:将吸附有葡萄糖氧化酶的电极从酶溶液中取出,用pH值为7.0的磷酸缓冲溶液冲洗干净后即得到酶修饰电极。
优选的,步骤a的(1)中纳米金颗粒采用柠檬酸钠还原法制备:将100ml 0.01%的氯金酸溶液在三口烧瓶内加热煮沸后,迅速加入3.5ml质量分数为1%的柠檬酸三钠,并搅拌;在搅拌状态下继续煮沸6分钟,溶液从浅黄色变成无色、灰色,最后变成酒红色,移去热源,停止搅拌冷却至室温即得。
优选的,制备的纳米金颗粒粒径约为17nm。
优选的,步骤a的具体操作过程如下,
(1)取9ml制备好的纳米金颗粒,平均装在3支容量为5ml的离心管中,在14000rpm的转速下离心5min,取沉淀,并将三份沉淀混合,得到物质A;
(2)向物质A中加入3ml新蒸好的吡咯和0.5ml的40毫摩尔的十二烷基磺酸钠混合液,充分振荡5s后加入3ml 5毫摩尔的硝酸银溶液,再振荡10s后,于室温下陈化12h,得物质B;
(3)将物质B在12000rpm转速下离心12min,取沉淀,并用3.6毫摩尔的十二烷基磺酸钠分散。
优选的,所述步骤c中采用的L-半胱氨酸溶液物质的量浓度为0.03 M。
优选的,所述步骤c中金电极在L-半胱氨酸溶液中浸泡的时间为4h。本发明以双贵金属纳米粒子与聚合物材料复合,产生很强的界面作用,使纳米粒子的刚性、热稳定性与聚合物材料的韧性、介电性相结合,从而得到性能优良的复合材料。将该类复合材料应用到酶固定化技术中,可提高酶活性中心和基底电极之间的电子传递能力,提高生物传感器的灵敏度。本发明采用的酶固定方法是通过在金电极上修饰L-半胱氨酸双层膜、吸附AuAg-PPY纳米颗粒、吸附葡萄糖氧化酶完成的,本方法提高了修饰电极对酶的相容性,有效保持了酶的活性。利用这种方法制得的酶修饰电极不仅实现了酶与电极之间的直接电子转移,而且提高了修饰电极的生物相容性和检测灵敏度。
本发明的优点:
1、 本发明中设计的L-半胱氨酸双层膜在pH值大于5.0的环境中表面带大量负电荷,可有效吸附AuAg-PPY纳米颗粒;
2、本发明在电极修饰过程中加入Au、Ag双金属纳米颗粒,它能够促进实现酶与电极之间的直接电子转移,成功构建了第三代生物传感器;
3、本发明在电极修饰过程中加入聚吡咯,使修饰电极具有更好的生物相容性。采用的导电聚合物吡咯虽可引起检测过程中电位过高的现象,但是聚吡咯与双金属纳米材料复合,会显著降低修饰电极对葡萄糖的检测电位。
4、本发明采用的酶固定方法将足够量的高活性酶尽可能牢固地固定在电极表面,制备的酶修饰电极灵敏度高,响应时间短,使用寿命长。本发明制备的葡萄糖氧化酶酶修饰电极对葡萄糖的检测范围为2.5×10-7~1.2×10-4 mol/L。
附图说明
图1是裸电极和双层L-半胱氨酸膜修饰的电极在0.025 mol/ L PBS (pH=7.0) 中的循环伏安扫描图;
图2是双层L-半胱氨酸膜、AuAg-PPY修饰的电极和双层L-半胱氨酸膜、AuAg-PPY、葡萄糖氧化酶修饰的电极在0.025 mol/ L PBS (pH=7.0) 中的循环伏安扫描图;
图3是双层L-半胱氨酸膜、AuAg-PPY、葡萄糖氧化酶修饰电极在0.02 M PBS + 0.1 M KCl (pH = 7)溶液中的差分脉冲曲线图;
图4是电极电流响应与葡萄糖浓度的线性关系图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明的内容,下面结合附图和具体的实施例对本发明再作进一步的说明:
实验过程中使用的水均为二次蒸馏水,实验所用的试剂均为分析纯。实验均在室温下进行。
实施例1
(1)、本实施例所使用的仪器与试剂
仪器:AUTOLAB PGSTAT 128N模块式电化学综合测试系统(瑞士万通公司), 电化学测量采用三电极体系: 酶电极为工作电极,铂丝电极作辅助电极,饱和甘汞(SCE)电极为参比电极。所有电化学实验均在室温下进行。
试剂:氯金酸(HClO4,上海试剂一厂)、十二烷基磺酸钠(SDS,Sigma)、硝酸银(AgNO3,西安化学试剂厂)、吡咯(Py,上海试剂一厂)、L-半胱氨酸(Sigma)、磷酸氢二钠(Na2HPO4,Aldrich)、磷酸二氢钠(NaH2PO4,Aldrich)、铁氰化钾(K3Fe(CN)6, Aldrich)、氯化钠(NaCl,Aldrich)、高纯氮气(N2,中国科学院兰州化物所特种气体中心)、葡萄糖氧化酶(GOD,Sigma)、葡萄糖(上海试剂一厂)。所有试剂均为分析纯。除特殊说明外,所有试剂均用二次蒸馏水配制。葡萄糖溶液需在使用前提前配制,放置隔夜后使用。
(2)、酶修饰电极的制备
a. 柠檬酸钠还原法制备纳米金颗粒:将100ml 0.01%的氯金酸溶液在三口烧瓶内加热煮沸后,迅速加入3.5ml 质量份数为1%的柠檬酸三钠,并搅拌。在搅拌状态下继续煮沸6分钟,溶液从浅黄色变成无色、灰色,最后变成酒红色,移去热源,停止搅拌冷却至室温,得到纳米金颗粒(AuNP);
b. AuAg-PPY复合纳米材料的制备:(1)取9ml制备好的纳米金颗粒,平均装在3支容量为5ml的离心管中,在14000rpm的转速下离心5min,取沉淀,并将三份沉淀混合,得到物质A。(2)向物质A中加入3ml新蒸的吡咯和0.5ml 40毫摩尔 十二烷基磺酸钠(SDS)的混合液,充分振荡5s后加入3ml 5毫摩尔的硝酸银溶液,再振荡10s后,于室温下陈化12h,得物质B。此过程中溶液颜色由酒红色逐渐变为棕色。(3)将物质B在12000rpm转速下离心12min,取沉淀,并用3.6毫摩尔 SDS分散,得到实验所需的AuAg-PPY纳米复合材料;
c. 电极的处理:将金电极先用0.3 μm的三氧化二铝悬浊液在打磨布上处理,再用0.05 μm的三氧化二铝悬浊液在打磨布上抛光成镜面,最后用乙醇、二次水超声清洗;
d. L-半胱氨酸双层膜的形成:将处理好的金电极浸泡在0.03 M 的L-半胱氨酸溶液中4 h后取出,并用二次蒸馏水冲洗干净。此方法制备出双层L-半胱氨酸膜修饰的金电极;
e.AuAg-PPY复合纳米材料的固定:在L-半胱氨酸双层膜修饰的金电极上滴涂3mL的AuAg-PPY分散液,室温下放置12h;
f. 酶的吸附:在AuAg-PPY/L-半胱氨酸双层膜修饰的金电极上滴涂3mL 2000U/mL的葡萄糖氧化酶溶液,在4℃冰箱中放置12h;
g. 修饰电极后处理:将吸附有葡萄糖氧化酶的电极从酶溶液中取出,用pH值为7.0的磷酸缓冲溶液冲洗干净后即得到酶修饰电极。将酶修饰电极放置在4 ℃的冰箱中待用。
步骤a所述的方法制备的纳米金颗粒粒径约为17nm。
步骤d所述的方法制备L-半胱氨酸双层膜时,采用的L-半胱氨酸溶液物质的量浓度为0.03 M;金电极在L-半胱氨酸溶液中浸泡的时间为4h。
对比试验:
(1)采用循环伏安法将不同修饰电极与裸电极做了对比,如图1、图2所示,图1和图2是不同修饰电极在0.025 mol/ L PBS (pH=7.0) 中的循环伏安扫描图,扫速为50 mVs-1。图1 中a为裸金电极,b为双层L-半胱氨酸修饰的金电极;图2中a为L-半胱氨酸/AuAg-PPY修饰的金电极, b为L半胱氨酸/AuAg-PPY/GOD修饰的金电极。
对比可知修饰膜有效地提高了电极的比表面积,本发明提供的固载酶的方法可有效地将葡萄糖氧化酶固定到电极表面。
图4是电极电流响应与葡萄糖浓度的线性关系图。随着葡萄糖浓度的增加峰电流值逐渐增大(如图3所示),拟合得到峰电流与葡萄糖浓度线性关系(图4所示),该修饰电极对葡萄糖的线性检测范围为2.5×10-7~1.2×10-4M。
最后应说明的是:以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种AuAg-PPY复合纳米材料和L-半胱氨酸双层膜固定葡萄糖氧化酶修饰电极的制备方法,其特征在于它包括如下步骤:
a.AuAg-PPY复合纳米材料由纳米金和银及聚吡咯复合而成,制备过程如下:
(1)取纳米金颗粒的悬浮液,纳米金颗粒离心后取沉淀,得到物质A;
(2)向物质A中加入吡咯和十二烷基磺酸钠的混合液,充分振荡后,加入硝酸银溶液,再振荡后,于室温下陈化,得物质B;
(3)将物质B离心,取沉淀,并用十二烷基磺酸钠分散,得到AuAg-PPY纳米复合材料;
b.电极的处理:将金电极先用三氧化二铝悬浊液处理,再用三氧化二铝悬浊液在打磨布上抛光成镜面,最后用乙醇、二次水超声清洗;
c. 制备双层L-半胱氨酸膜修饰的金电极:将处理好的金电极浸泡在L-半胱氨酸溶液中,然后取出用二次蒸馏水冲洗干净即得;
d.AuAg-PPY复合纳米材料的固定:在L-半胱氨酸双层膜修饰的金电极上滴涂AuAg-PPY复合纳米材料的分散液,室温下放置;
e. 酶的吸附:在AuAg-PPY/L-半胱氨酸双层膜修饰的金电极上滴涂葡萄糖氧化酶溶液,在4℃冰箱中放置;
f. 修饰电极后处理:将吸附有葡萄糖氧化酶的电极从酶溶液中取出,用pH值为7.0的磷酸缓冲溶液冲洗干净后即得到酶修饰电极。
2.根据权利要求1所述的一种AuAg-PPY复合纳米材料和L-半胱氨酸双层膜固定葡萄糖氧化酶修饰电极的制备方法,其特征在于:步骤a的(1)中纳米金颗粒采用柠檬酸钠还原法制备:将100ml 0.01%的氯金酸溶液在三口烧瓶内加热煮沸后,迅速加入3.5ml质量分数为1%的柠檬酸三钠,并搅拌;在搅拌状态下继续煮沸6分钟,溶液从浅黄色变成无色、灰色,最后变成酒红色,移去热源,停止搅拌冷却至室温即得。
3.根据权利要求2所述的一种AuAg-PPY复合纳米材料和L-半胱氨酸双层膜固定葡萄糖氧化酶修饰电极的制备方法,其特征在于:制备的纳米金颗粒粒径约为17nm。
4.根据权利要求1所述的一种AuAg-PPY复合纳米材料和L-半胱氨酸双层膜固定葡萄糖氧化酶修饰电极的制备方法,其特征在于:步骤a的具体操作过程如下,
(1)取9ml制备好的纳米金颗粒,平均装在3支容量为5ml的离心管中,在14000rpm的转速下离心5min,取沉淀,并将三份沉淀混合,得到物质A;
(2)向物质A中加入3ml新蒸好的吡咯和0.5ml的40毫摩尔的十二烷基磺酸钠混合液,充分振荡5s后加入3ml 5毫摩尔的硝酸银溶液,再振荡10s后,于室温下陈化12h,得物质B;
(3)将物质B在12000rpm转速下离心12min,取沉淀,并用3.6毫摩尔的十二烷基磺酸钠分散。
5.根据权利要求1所述的一种AuAg-PPY复合纳米材料和L-半胱氨酸双层膜固定葡萄糖氧化酶修饰电极的制备方法,其特征在于:所述步骤c中采用的L-半胱氨酸溶液物质的量浓度为0.03M。
6.根据权利要求1所述的一种AuAg-PPY复合纳米材料和L-半胱氨酸双层膜固定葡萄糖氧化酶修饰电极的制备方法,其特征在于:所述步骤c中金电极在L-半胱氨酸溶液中浸泡的时间为4h。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20150114 |