CN104483310A - 一种可视化自供能葡萄糖生物传感器的构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种操作简单、低成本、自供能、可视化便携式三维中空通道微流控纸芯片传感器并成功用于现场检测。该传感器成功将生物燃料电池引入到三维中空通道微流控纸芯片上，利用生物燃料电池阴阳极对底物的催化效果自行产生电信号，摆脱对供能设备的限制。该传感器的构建过程如下：批量打印疏水图案，熔蜡成型，利用激光切割机制备中空通道，然后丝网印刷电极，通过长金制备生物燃料电池的电极；制备合成三维石墨烯修饰电极；将葡萄糖氧化酶和漆酶分别修饰到生物燃料电池阳极和阴极；合成电致变色材料并均匀涂在ITO上，通过自制电路板将各个纸芯片单元夹住，连接到涂有电致变色材料的ITO上，加入葡萄糖溶液引发反应，通过观察电致变色材料颜色变化确定葡萄糖浓度范围。

Description

一种可视化自供能葡萄糖生物传感器的构建方法
技术领域
本发明涉及葡萄糖半定量分析检测领域，构建了一种便携式可视化自供能葡萄糖生物传感器，采用中空通道微流控纸芯片为基底构建生物燃料电池，以葡萄糖作为生物燃料电池的燃料，结合电致变色技术实现对葡萄糖的可视化检测。
背景技术
葡萄糖是生命活动中不可缺少的物质，它在人体内能直接参与新陈代谢过程。葡萄糖是生命体的重要物质，其在体液中的含量是反映身体状况的重要指标。尤其是对于糖尿病患者，其血糖浓度的测定是控制病情的重要手段，因此准确、快速地测定血中葡萄糖的含量极为重要。长期以来，在研究人员不断的努力下，产生各式各样的检测原理。在已有检测原理的基础之上，人们又不断寻求反应时间更快，检测时间更短，灵敏度更高的方法。
目前测定葡萄糖的方法主要有分光光度法、电化学法、旋光度法、高效液相色谱法及毛细管电泳法等。但是上述方法一起仪器比较昂贵、操作复杂，同时对能源有很强的依赖性，不利于随时随地的现场检测，限制了其在当前的应用和发展。因此迫切需要开发一种特异性强、灵敏度高、速度快、成本低、检测范围广的便携式分析检测方法来适应形势的发展。
发明内容
鉴于现有技术中存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题是提供了一种操作简单、检测速度快、成本低廉的自供能可视化检测葡萄糖的方法。
为了解决上述技术问题，本发明是通过构建一种新型的三维中空通道微流控纸芯片结合生物燃料电池来实现的葡萄糖生物传感器，该葡萄糖生物传感器的制备方法为：
（1）在计算机上设计三维中空通道微流控纸芯片的疏水蜡批量打印图案，式样如附图1和2所示，该三维中空通道微流控纸芯片包括四个蜡打印疏水区域分别为A、B、C和D，A为阳极单元，B为中空通道单元，C为半亲水通道单元，D为阴极单元，然后利用激光切割机对蜡批量打印图案A、B和C进行打孔切割，制备溶液入口、中空通道，并在设计的纸阳极区域和纸阴极区域分别印刷碳电极，式样如附图3所示；
（2）通过长金制备生物燃料电池纸电极；
（3）制备合成三维石墨烯修饰生物燃料电池阴极和阳极，用于在阳极上固定葡萄糖氧化酶，在阴极上固定漆酶，将制备好的生物燃料电池阴阳极保存在4℃备用；
（4）合成电致变色材料，均匀旋涂在氧化铟锡导电玻璃（ITO）上；
（5）如附图4所示将构建的葡萄糖生物传感器A、B、C和D四个单元依次折叠，并用电路板夹住连接涂有电致变色材料的ITO导电玻璃上，然后加入葡萄糖溶液引发反应，通过观察涂在ITO上电致变色材料颜色变化，即可确定葡萄糖浓度范围。
本发明所述的纸材料为普通滤纸、吸水纸或者色谱纸。
本发明所述三维中空通道微流控纸芯片制备过程如下：在计算机上设计三维中空通道微流控纸芯片的疏水蜡批量打印图案，式样如附图1和2所示，该三维中空通道微流控纸芯片包括四个蜡打印疏水区域分别为A、B、C和D，A为阳极单元，B为中空通道单元，C为半亲水通道单元，D为阴极单元，其中单个单元尺寸范围为15mm-35mm，溶液入口尺寸范围为3mm-5mm，通道宽度范围为1.5mm-2.5mm，通道长度范围为10mm-30mm，纸阳极和纸阴极直径尺寸范围为5mm-8mm，然后利用激光切割机对蜡批量打印图案A、B和C进行打孔切割，制备溶液入口、中空通道，并在设计的纸阳极区域和纸阴极区域分别印刷碳电极。
本发明所述通过长金制备生物燃料电池纸电极，包括以下步骤：金纳米粒子的制备，将160mL水加热到90℃，加入质量浓度为1%的氯金酸1.6mL，升温到96℃，保持1分钟，加入质量浓度为1%的柠檬酸钠5.6mL，搅拌15分钟，溶液变成酒红色，室温冷却，制备得到金纳米；长金制备生物燃料电池纸电极，将20 μL金纳米粒子滴加在纸阳极上，室温条件下晾干，然后加入质量浓度为1%的氯金酸和0.2M盐酸羟胺混合溶液50 μL滴加在纸电极上，在室温条件下反应10分钟，然后用二次水冲洗，得到长金修饰的生物燃料电池长金纸电极。
本发明所述三维石墨烯制备过程包括以下步骤：三维石墨烯的合成利用732-型硫酸阳离子交换树脂作为碳源，通过Ni2+-氢氧化钾交换活化重组方法制备，首先将732-型硫酸阳离子交换树脂浸泡在100mL 0.05M的醋酸镍溶液中8h，用二次水冲洗交换树脂60℃真空干燥，10g含有Ni2+的交换树脂加入含有40g氢氧化钾400mL乙醇溶液中在80℃搅拌直至溶液变成絮状，然后室温浸泡6h，随后将混合液在70℃下干燥60h用粉碎机粉碎，最后将混合物在氮气保护条件下，850℃加热2h，升温速率为2℃/min，然后用1M的盐酸腐蚀，离心二次水洗，最后60℃干燥制备得到三维石墨烯。
本发明所述纸基生物燃料电池阴极和阳极构建包括以下步骤：首先将20 mg制备得到的三维石墨烯溶解到含有40 mg的3,4,9,10-苝四羧酸100 mL乙醇溶液中，超声1h，然后继续室温搅拌12h，然后过滤依次用乙醇、二次水洗涤，最终60℃下真空干燥。然后将10mg二环己基碳二亚胺在氮气保护下溶解到60mL二甲基甲酰胺溶液中，然后将含有10mg修饰过的三维石墨烯的40mL二甲基甲酰胺溶液加入到上述溶液中，加热至40℃氮气保护反应48h，然后过滤，依次用二甲基甲酰胺、乙醇和二次水洗涤，60℃真空干燥。将1mg制备得到的上述修饰过的三维石墨烯超声溶于1mL乙醇中，取10μL上述溶液分别加入到长金的燃料电池阴极和阳极反应30min，然后分别加入10μL 2mg/mL葡萄糖氧化酶溶液和1m/mL漆酶溶液到阳极和阴极上反应2h，将制备得到的电极保存在4℃冰箱中备用。
本发明所述电致变色材料合成包括以下步骤，反应过程如附图5所示：首先将0.462g 4,4-二氨基-4-甲氧基三苯胺（A）、1.224g异氰尿酸三缩水甘油酯（B）溶于1mL N,N-二甲基乙酰胺（DMAc）中，加热至80℃氮气保护下反应2h，随后将溶液通过匀胶机均匀悬涂在ITO导电玻璃上，然后在氮气保护下120℃加热12h除去多余溶剂，然后分别在40℃、130℃和180℃下真空干燥3h、2h和3h，即制备得到电致变色材料。
本发明所述葡萄糖测定过程，首先将构建的葡萄糖生物传感器按照附图4折叠并用自制导电夹夹住，连接到涂有电致变色材料的ITO上，通过A单元上的溶液入口加入葡萄糖溶液，葡萄糖溶液在纸纤维的毛细作用和大气压双重作用下在C单元的半亲水蜡/纸通道上沿着B单元设计的中空通道流动，溶液流动至纸阳极和纸阴极区域引发反应产生电子，电子通过外电路传出，引起电致变色材料颜色变化，通过观察电致变色材料颜色变化即可得到葡萄糖溶液浓度范围。
本发明的有益效果：
（1）在微流控纸芯片实验室中引入中空通道，极大地缩短了试验时间，减少实验过程中溶液的挥发以及纸纤维对分子的吸附；
（2）将生物燃料电池技术和中空通道微流控纸芯片，降低了检测成本；
（3）生物燃料电池可以自行产生电信号，无需外加能量激发反应，摆脱了对能源要求的限制，有利于随时随地的现场检测；
（4）结合电致变色可以通过肉眼确定葡萄糖浓度范围，有利于推广应用。
说明书附图
下面结合附图和具体实施方案对本发明作进一步详细描述
图1三维中空通道微流控芯片的疏水蜡批量打印图案，1为溶液入口，2为纸阳极区域，3-5为中空通道区域，6、7为半亲水蜡通道，8为中空区域，9为纸阴极区域；
图2三维中空通道微流控芯片的疏水蜡批量打印图案反面，10、11为半亲水纸通道；
图3三维中空通道微流控芯片的疏水蜡批量打印图案反面，利用激光切割机切割制备中空通道和在阴极和阳极印刷碳电极后图案；
图4折叠后的三维中空通道微流控芯片图案，a为三维中空通道微流控芯片折叠方法，b、c为自制导电夹，d为三维中空通道微流控芯片被导电夹夹住图案；
图5电致变色材料合成路线图，A为4,4-二氨基-4-甲氧基三苯胺B为异氰尿酸三缩水甘油酯。
具体实施方式
实施例1：血清中葡萄糖的检测
（1）在计算机上利用Adobe Illustrator CS4软件设计三维中空通道微流控纸芯片，式样如附图1和2所示，该三维中空通道微流控纸芯片包括四个蜡打印疏水区域分别为A、B、C和D，单个单元大小为15×15mm，A为阳极单元，B为中空通道单元，C为半亲水通道单元，D为阴极单元，其中1区域为溶液入口，2为纸阳极区域，3-5为中空通道区域，6、7为半亲水蜡通道，10、11为半亲水纸通道，8为中空区域，9为纸阴极区域，溶液入口1直径为5mm，纸阳极区域2直径为6mm，中空通道区域两个圆形区域3和5直径分别为5mm和6mm，通道4宽度为2mm，长度为10mm，半亲水蜡/纸通道6和10宽度为2mm，长度为10mm，半亲水蜡/纸通道圆形区域7和11直径为5mm，中空区域8直径为6mm，纸阴极区域9直径为6mm；
（2）利用激光切割机对1、3-5和8区域进行切割制备溶液入口、中空通道，并在设计的纸阳极区域2和纸阴极区域9分别印刷碳电极，式样如附图3所示；
（3）将制备的20 μL金纳米滴加在纸阳极上，晾干，然后将质量浓度为1%氯金酸和0.2M盐酸羟胺混合溶液50 μL滴加在纸阳极上，在室温条件下反应10分钟，然后用二次水冲洗制备得到金-纸电极；
（4）将20 mg制备得到的三维石墨烯溶解到含有40 mg的3,4,9,10-苝四羧酸100 mL乙醇溶液中，超声1h，然后继续室温搅拌12h，然后过滤依次用乙醇、二次水洗涤，最终60℃下真空干燥。然后将10mg二环己基碳二亚胺在氮气保护下溶解到60mL二甲基甲酰胺溶液中，然后将含有10mg修饰过的三维石墨烯的40mL二甲基甲酰胺溶液加入到上述溶液中，加热至40℃氮气保护反应48h，然后过滤，依次用二甲基甲酰胺、乙醇和二次水洗涤，60℃真空干燥。将1mg制备得到的上述修饰过的三维石墨烯超声溶于1mL乙醇中，取10μL上述溶液分别加入到长金的燃料电池阴极和阳极反应30min，然后分别加入10μL葡萄糖氧化酶溶液和漆酶溶液到阳极和阴极上反应2h，将制备得到的电极保存在4℃冰箱中备用；
（5）将A、B、C和D四个单元依次堆叠，式样如附图4所示，随后用电路板夹住，连接至涂有电致变色材料的ITO上，从入口加入不同浓度的葡萄糖标准溶液，通过观察电致变色材料的颜色变化，得到葡萄糖的浓度范围，本发明对葡萄糖测定的线性范围为50μM-100mM，可以用于实际样品的测定。

Claims (8)

1.一种可视化自供能葡萄糖生物传感器的构建方法，其特征是包括以下步骤：
（1）在计算机上设计三维中空通道微流控纸芯片的疏水蜡批量打印图案，式样如附图1和2所示，该三维中空通道微流控纸芯片包括四个蜡打印疏水区域分别为A、B、C和D，A为阳极单元，B为中空通道单元，C为半亲水通道单元，D为阴极单元，然后利用打孔器和激光切割机对蜡批量打印图案A、B和C进行打孔切割，制备溶液入口、中空通道，并在设计的纸阳极区域和纸阴极区域分别印刷碳电极，式样如附图3所示；
（2）通过长金制备生物燃料电池纸电极；
（3）制备合成三维石墨烯修饰生物燃料电池阴极和阳极，用于在阳极上固定葡萄糖氧化酶，在阴极上固定漆酶，将制备好的生物燃料电池阴阳极保存在4℃备用；
（4）合成电致变色材料，均匀旋涂在氧化铟锡导电玻璃（ITO）上；
（5）如附图4所示将构建的葡萄糖生物传感器A、B、C和D四个单元依次折叠，并用电路板夹住连接涂有电致变色材料的ITO导电玻璃上，然后加入葡萄糖溶液引发反应，通过观察涂在ITO上电致变色材料颜色变化，即可确定葡萄糖浓度范围。
2.根据权利要求1所述一种可视化自供能葡萄糖生物传感器的构建方法，所用的纸材料为普通滤纸、吸水纸或者色谱纸。
3.根据权利要求1所述一种可视化自供能葡萄糖生物传感器的构建方法，其特征是：在计算机上设计三维中空通道微流控纸芯片的疏水蜡批量打印图案，式样如附图1和2所示，该三维中空通道微流控纸芯片包括四个蜡打印疏水区域分别为A、B、C和D，A为阳极单元，B为中空通道单元，C为半亲水通道单元，D为阴极单元，其中单个单元尺寸范围为15mm-35mm，溶液入口尺寸范围为3mm-5mm，通道宽度范围为1.5mm-2.5mm，通道长度范围为10mm-30mm，纸阳极和纸阴极直径尺寸范围为5mm-8mm，然后利用激光切割机对蜡批量打印图案A、B和C进行打孔切割，制备溶液入口、中空通道，并在设计的纸阳极区域和纸阴极区域分别印刷碳电极。
4.根据权利要求1所述一种可视化自供能葡萄糖生物传感器的构建方法，通过长金制备生物燃料电池纸电极，其特征是：金纳米粒子的制备，将160mL水加热到90℃，加入质量浓度为1%的氯金酸1.6mL，升温到96℃，保持1分钟，加入质量浓度为1%的柠檬酸钠5.6mL，搅拌15分钟，溶液变成酒红色，室温冷却，制备得到金纳米；长金制备生物燃料电池纸电极，将20 μL金纳米粒子滴加在纸阳极上，室温条件下晾干，然后加入质量浓度为1%的氯金酸和0.2M盐酸羟胺混合溶液50 μL滴加在纸电极上，在室温条件下反应10分钟，然后用二次水冲洗，得到长金修饰的生物燃料电池长金纸电极。
5.根据权利要求1所述一种可视化自供能葡萄糖生物传感器的构建方法，三维石墨烯材料的制备方法，其特征是：利用732-型硫酸阳离子交换树脂作为碳源，通过Ni2+-氢氧化钾交换活化重组方法制备，首先将732-型硫酸阳离子交换树脂浸泡在100mL 0.05M的醋酸镍溶液中8h，用二次水冲洗交换树脂60℃真空干燥，10g含有Ni2+的交换树脂加入含有40g氢氧化钾400mL乙醇溶液中在80℃搅拌直至溶液变成絮状，然后室温浸泡6h，随后将混合液在70℃下干燥60h用粉碎机粉碎，最后将混合物在氮气保护条件下，850℃加热2h，升温速率为2℃/min，然后用1M的盐酸腐蚀，离心二次水洗，最后60℃干燥制备得到三维石墨烯。
6.根据权利要求1所述一种可视化自供能葡萄糖生物传感器的构建方法，生物燃料电池阴极和阳极构建，其特征是：首先将20 mg制备得到的三维石墨烯溶解到含有40 mg的3,4,9,10-苝四羧酸100 mL乙醇溶液中，超声1h，然后继续室温搅拌12h，然后过滤依次用乙醇、二次水洗涤，最终60℃下真空干燥；然后将10mg二环己基碳二亚胺在氮气保护下溶解到60mL二甲基甲酰胺溶液中，然后将含有10mg修饰过的三维石墨烯的40mL二甲基甲酰胺溶液加入到上述溶液中，加热至40℃氮气保护反应48h，然后过滤，依次用二甲基甲酰胺、乙醇和二次水洗涤，60℃真空干燥；将1mg制备得到的上述修饰过的三维石墨烯超声溶于1mL乙醇中，取10μL上述溶液分别加入到长金的燃料电池阴极和阳极反应30min，然后分别加入10μL 2mg/mL葡萄糖氧化酶溶液和1m/mL漆酶溶液到阳极和阴极上反应2h，将制备得到的电极保存在4℃冰箱中备用。
7.根据权利要求1所述一种可视化自供能葡萄糖生物传感器的构建方法，电致变色材料的制备方法，其特征是：首先将0.462g 4,4-二氨基-4-甲氧基三苯胺（A）、1.224g异氰尿酸三缩水甘油酯（B）溶于1mL N,N-二甲基乙酰胺（DMAc）中，加热至80℃氮气保护下反应2h，随后将溶液通过匀胶机均匀悬涂在ITO导电玻璃上，然后在氮气保护下120℃加热12h除去多余溶剂，然后分别在40℃、130℃和180℃下真空干燥3h、2h和3h，即制备得到电致变色材料。
8.根据权利要求1所述一种可视化自供能葡萄糖生物传感器的构建方法，本发明所述葡萄糖测定过程，其特征是：首先将构建的葡萄糖生物传感器按照附图4折叠并用自制导电夹夹住，连接到涂有电致变色材料的ITO上，通过A单元上的溶液入口加入葡萄糖溶液，葡萄糖溶液在纸纤维的毛细作用和大气压双重作用下在C单元的半亲水蜡/纸通道上沿着B单元设计的中空通道流动，溶液流动至纸阳极和纸阴极区域引发反应产生电子，电子通过外电路传出，引起电致变色材料颜色变化，通过观察电致变色材料颜色变化即可得到葡萄糖溶液浓度范围。
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