CN110346426A - 基于MoS2-AuNPs和离子液体的CPO生物传感器及其检测NO2-的应用 - Google Patents

基于MoS2-AuNPs和离子液体的CPO生物传感器及其检测NO2-的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于MoS2‑AuNPs和离子液体的CPO生物传感器及其检测NO2 ‑的应用，所述生物传感器是在玻碳电极上修饰由MoS2‑AuNPs复合纳米材料、离子液体、氯过氧化物酶组成的复合膜，其中离子液体为溴化1‑乙基‑3‑甲基咪唑离子液体等。本发明生物传感器采用的MoS2‑AuNPs复合纳米材料比表面积大，提高了CPO的固载量，且AuNPs具有良好的电子传导性能，提高了生物传感器的反应速度；采用的离子液体具有较好的生物相容性及粘附性，使CPO在最小活性损失下稳定的固定在电极表面。本发明生物传感器用于电化学检测NO2 ‑具有良好的选择性、重现性和稳定性，且具有较宽的检测范围，较低的检测限，抗干扰能力强，可用于腌制白菜等中NO2 ‑的检测，具有良好的应用前景。

Description

基于MoS2-AuNPs和离子液体的CPO生物传感器及其检测NO2-的 应用
技术领域
本发明属于酶的固定化技术领域，具体涉及一种基于MoS2-AuNPs和离子液体的CPO生物传感器，以及该生物传感器在电化学检测NO2 -中的应用。
背景技术
亚硝酸盐是氮循环系统中的重要组成部分。它广泛用于食品防腐剂，肥料和其他缓蚀剂。但是较高浓度的亚硝酸盐对人类是有害的，因为亚硝酸盐可以与人体内的胺反应，然后转化为致癌的N-亚硝胺，导致癌症。此外，它还可以与血红蛋白不可逆地反应生成高铁血红蛋白，这种化合物会降低血液的氧运输能力。因此，需要准确、灵敏和选择性地测定亚硝酸盐。
迄今为止，已经开发了诸如气相色谱-质谱、化学发光、光谱和毛细管电泳的方法来检测亚硝酸盐。但是这些方法需要昂贵的设备和繁琐的处理程序，极大地妨碍了它们的实际应用。相比之下，电化学技术具有操作简单、响应快、成本低等优点，使其成为亚硝酸盐检测的良好选择。亚硝酸盐的电化学检测基于电极表面上亚硝酸盐的还原或氧化信号。阴极还原过程很容易受到一氧化氮或分子氧的干扰，而阳极氧化可以避免这些干扰。因此，亚硝酸盐的测定通常基于其阳极氧化。但不满意的选择性和灵敏度使得有必要有效地修饰电极。
电化学生物传感器是一种将电化学分析技术与酶生物技术相结合的生物传感器，它既具有酶的分子识别和选择性催化功能，又有电化学传感器灵敏、响应快以及操作方便的特点，在工业、农业、环境监测以及医学检测等领域受到了广泛的关注。构筑低检测限、高灵敏度以及快速响应的传感器始终是电化学分析领域的一个挑战，尤其是基于电极与酶活中心的直接电子转移(DET)的第三代电化学生物传感器因其组成简单、操作方便、响应速度快、专一性强和检测物质多样等优点成为当今电化学生物传感器研究的主要方向。
氯过氧化物酶(CPO)是一种从海洋真菌Caldariomyces fumago中提取出来的血红素糖蛋白酶。CPO分子的活性中心具有独特的结构，使得CPO同时具备过氧化物酶、过氧化氢酶和细胞色素P450等多种酶的催化活性，目前被认为是过氧化物酶家族中催化活性最广泛的酶。但是氯过氧化物酶的活性中心深埋于酶分子的内部，所以难以实现CPO与电极之间的直接电子转移，且酶较为敏感，极易失活，不易固定在电极表面。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于MoS2-AuNPs和离子液体的CPO生物传感器，并为该生物传感器提供一种新的应用。
针对上述目的，本发明所采用的生物传感器是在玻碳电极上修饰由MoS2-AuNPs复合纳米材料、离子液体、CPO组成的复合膜，其中所述的离子液体为溴化1-乙基 -3-甲基咪唑离子液体、溴化1-丁基-3-甲基咪唑离子液体、溴化1-辛基-3-甲基咪唑离子液体、溴化1-丁基-2,3-二甲基咪唑离子液体、氯化1-辛基-3-甲基咪唑离子液体中任意一种。
本发明生物传感器的制备方法为：将离子液体溶解于pH为7.4的PBS缓冲溶液中，然后加入MoS2-AuNPs复合纳米材料，超声分散均匀，得到MoS2-AuNPs/离子液体复合材料分散液；然后将MoS2-AuNPs/离子液体复合材料分散液滴于预处理的玻碳电极表面，在室温下晾干，再滴加CPO溶液，在室温下晾干，得到基于MoS2-AuNPs 和离子液体的CPO生物传感器。
上述制备方法中，所述MoS2-AuNPs/离子液体复合材料分散液中，MoS2-AuNPs 复合纳米材料的浓度为1.0～5.0mg·mL-1，离子液体的体积浓度为5％～30％；优选 MoS2-AuNPs复合纳米材料的浓度为2.0～3.0mg·mL-1，离子液体的体积浓度为10％～ 20％。
上述制备方法中，所述CPO溶液中氯过氧化物酶的浓度为0.1～0.5mmol·L-1，所述CPO溶液采用pH为3.0～5.5的PBS缓冲溶液配制。
上述制备方法中，所述预处理的玻碳电极的制备方法为：将玻碳电极依次用直径为0.3μm和0.05μm的Al2O3粉末抛光成镜面，再依次用超纯水、乙醇、超纯水各超声清洗3～5min，用N2吹干，再将玻碳电极置于含有0.1mol·L-1KCl的2mmol·L-1 K3Fe(CN)6水溶液中，在0～0.8V下采用循环伏安法扫描至氧化峰与还原峰电位差值小于80mV，取出用蒸馏水冲洗，室温晾干，得到预处理的玻碳电极。
本发明基于MoS2-AuNPs和离子液体的CPO生物传感器在电化学检测NO2 -中的应用，具体检测方法为：以所述生物传感器为工作电极、甘汞电极为参比电极、铂片电极为对电极组成三电极体系，采用循环伏安法检测电压随NaNO2标准品浓度变化的标准曲线或采用Amperometric i-t法检测电流随NaNO2标准品浓度变化的标准曲线，然后采用相同的方法测试NO2 -待测样品，根据待测样品对应的电压或电流，结合标准曲线的线性方程，即可实现待测样品中NO2 -的定量检测。
本发明以MoS2-AuNPs复合纳米材料为载体，采用离子液体作为分散剂和粘结剂，使MoS2-AuNPs复合纳米材料均匀分散在该离子液体中并牢固的粘附在玻碳电极上，从而使MoS2-AuNPs复合纳米材料能够有效地将CPO固定在玻碳电极表面，得到一种新型的电化学检测NO2 -的生物传感器。与现有技术相比，本发明生物传感器具有如下有益效果：
1、本发明生物传感器所采用的MoS2-AuNPs复合纳米材料比表面积大，提高了 CPO的固载量，且AuNPs具有良好的电子传导性能，能将反应产生的电子进行良好的转移，提高了生物传感器的反应速度；所采用的离子液体具有较好的生物相容性及较高的粘附性，从而能够使CPO在最小活性损失的情况下，稳定的固定在玻碳电极表面。
2、本发明生物传感器用于电化学检测NO2 -，具有良好的选择性、重现性和稳定性，且具有较宽的检测范围，较低的检测限，性能稳定，抗干扰能力强，可用于实际样品腌制白菜等中NO2 -的准确检测，具有良好的应用前景。
附图说明
图1是分别以Au-MoS2/IL-GC(曲线a)、MoS2/IL-GC(曲线b)、GC(曲线c)、实施例1制备的CPO/AuNPs@MoS2/IL-GC(曲线d)、CPO/MoS2/IL-GC(曲线e)、 CPO-GC(曲线f)作为工作电极在PBS缓冲溶液中的循环伏安图。
图2是实施例1制备的CPO/MoS2-AuNPs/IL-GC在扫描速度范围为40～ 500mV·s-1(pH＝5)的电位(EP)对logν的关系图。
图3是实施例1制备的CPO/MoS2-AuNPs/IL-GC在含不同浓度NO2 -的PBS缓冲溶液中的循环伏安图。
图4是实施例1制备的CPO/MoS2-AuNPs/IL-GC对不同浓度NO2 -的响应电流的标准曲线图。
图5是实施例1制备的CPO/MoS2-AuNPs/IL-GC对Glu、AA、DA、UA、AgNO3、CuSO4、FeCl3和Na2CO3的抗干扰性实验的电流-时间曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
下面实施例中的MoS2-AuNPs复合纳米材料根据文献“Structuring Aunanoparticles on two-dimensional MoS2 nanosheets for electrochemical glucosebiosensors[J].Biosens.Bioelectron.,2017,89:545-550.”中公开的方法制备而成，其中所用的二维MoS2纳米片根据文献“Covalent immobilization ofβ-amylase ontofunctionalized molybdenum sulfide nanosheets,its kinetics and stabilitystudies:A gateway to boost enzyme application[J].Chem.Eng.J.,2017,328:215-227.”中公开的方法制备而成。
实施例1
将直径为3mm的玻碳电极(GC)依次用直径为0.3μm和0.05μm的Al2O3粉末抛光成镜面，再将电极依次用超纯水、乙醇、超纯水各超声清洗5min，用N2吹干，然后将电极置于10mL含有0.1mol·L-1 KCl的2mmol·L-1 K3Fe(CN)6水溶液中，在0～ 0.8V下采用循环伏安法扫描至氧化峰与还原峰电位差值小于80mV，取出用蒸馏水冲洗，室温晾干，得到预处理的玻碳电极。
将1mL溴化1-乙基-3-甲基咪唑离子液体(IL)溶解于9mL pH为7.4的PBS缓冲溶液中，然后加入25mg MoS2-AuNPs复合纳米材料，超声使MoS2-AuNPs复合纳米材料分散均匀，得到MoS2-AuNPs/IL复合材料分散液。取10μL MoS2-AuNPs/IL复合材料分散液滴于预处理的玻碳电极表面，在室温下晾干，得到MoS2-AuNPs/IL修饰的玻碳电极。然后取5μL 0.3mmol·L- 1CPO溶液(由pH＝5.0的PBS缓冲溶液配制) 滴于MoS2-AuNPs/IL修饰的玻碳电极表面，在室温下晾干，得到CPO/MoS2-AuNPs/IL 修饰的玻碳电极，即生物传感器(记为CPO/MoS2-AuNPs/IL-GC)。该生物传感器上 CPO的固载量为1.36×10-10mol·cm-2。
以所得CPO/MoS2-AuNPs/IL-GC作为工作电极、铂片电极作为对电极、甘汞电极作为参比电极，在室温下于10mL 0.1mol/LpH＝2.75的PBS缓冲溶液中进行循环伏安法测试。同时分别以未修饰的玻碳电极(GC)、CPO修饰的玻碳电极(CPO-GC)、 MoS2/IL修饰的玻碳电极(MoS2/IL-GC)、CPO-MoS2/IL修饰的玻碳电极(CPO-MoS2/IL-GC)、MoS2-AuNPs/IL修饰的玻碳电极(MoS2-AuNPs/IL-GC)作为工作电极做对比试验，结果见图1。从图1结果可知，CPO修饰的玻碳电极(CPO-GC) 无氧化还原峰，在此基础上修饰MoS2纳米片及离子液体(CPO-MoS2/IL-GC)后出现了一对可逆的氧化还原峰，修饰CPO、MoS2纳米片、AuNPs及离子液体 (CPO/MoS2-AuNPs/IL-GC)后氧化还原峰更为明显，说明电极表面修饰 MoS2-AuNPs/IL后CPO在电极表面能够实现良好的直接电子转移。
所得CPO/MoS2-AuNPs/IL-GC在扫描速度范围为40～500mV·s-1(pH＝5)的电位(EP)对logν的关系如图2所示。根据Laviron理论：
Epc＝E0'-2.303RT/αnFlgν (1)
Epa＝E0'+2.303RT/(1-α)nFlgν (2)
可以算出电子转移系数α值和速率常数ks分别是0.87和2.03s-1，说明 CPO/MoS2-AuNPs/IL-GC具有良好的电子传导性能。
实施例2
按照实施例1的方法制备预处理的玻碳电极。将3mL溴化1-乙基-3-甲基咪唑离子液体(IL)溶解于9mL pH为7.4的PBS缓冲溶液中，然后加入20mg MoS2-AuNPs 复合纳米材料，超声使MoS2-AuNPs复合纳米材料分散均匀，得到MoS2-AuNPs/IL 复合材料分散液。取10μL MoS2-AuNPs/IL复合材料分散液滴于预处理的玻碳电极表面，在室温下晾干，得到MoS2-AuNPs/IL修饰的玻碳电极。然后取5μL 0.1mmol·L-1 CPO溶液(由pH＝5.0的PBS缓冲溶液配制)滴于MoS2-AuNPs/IL修饰的玻碳电极表面，在室温下晾干，得到CPO/MoS2-AuNPs/IL修饰的玻碳电极，即生物传感器。
实施例3
按照实施例1的方法制备预处理的玻碳电极。将2mL溴化1-乙基-3-甲基咪唑离子液体(IL)溶解于9mL pH为7.4的PBS缓冲溶液中，然后加入30mg MoS2-AuNPs 复合纳米材料，超声使MoS2-AuNPs复合纳米材料分散均匀，得到MoS2-AuNPs/IL 复合材料分散液。取10μL MoS2-AuNPs/IL复合材料分散液滴于预处理的玻碳电极表面，在室温下晾干，得到MoS2-AuNPs/IL修饰的玻碳电极。然后取5μL 0.5mmol·L-1 CPO溶液(由pH＝5.0的PBS缓冲溶液配制)滴于MoS2-AuNPs/IL修饰的玻碳电极表面，在室温下晾干，得到CPO/MoS2-AuNPs/IL修饰的玻碳电极，即生物传感器。
实施例4
实施例1制备的CPO/MoS2-AuNPs/IL-GC在电化学检测NO2 -中的应用
将实施例1制备的CPO/MoS2-AuNPs/IL-GC作为工作电极、铂片电极作为对电极、甘汞电极作为参比电极，在室温下，分别于10mL含不同浓度NaNO2的PBS缓冲溶液(0.1mol/LpH＝2.75)中进行循环伏安法测试。同时以未滴加NaNO2溶液做空白对照。
由图3可见，CPO/MoS2-AuNPs/IL-GC对不同浓度的NO2 -具有良好的电化学响应。以CPO/MoS2-AuNPs/IL-GC在PBS缓冲溶液中对不同浓度NO2 -的响应电流绘制标准曲线，如图4所示。由图可见，CPO/MoS2-AuNPs/IL-GC检测NO2 -的性能良好，检测范围为0.1～208.5μmol·L-1，线性方程为：
其中的单位为mol·L-1，相关系数为R2＝0.9973，检测限为0.06μmol·L-1(S/N＝3)。
发明人进一步对实施例1制备的CPO/MoS2-AuNPs/IL-GC电化学检测NO2 -的稳定性和抗干扰性进行了测试，具体试验如下：
(1)稳定性
将CPO/AuNPs@MoS2/IL-GC置于含有10μmol·L-1NaNO2的PBS缓冲溶液(0.1mol/LpH＝2.75)中，以0.1V·s-1的速度连续扫描150圈后，其电流的变化值为 3.9％，说明该生物传感器具有较好的操作稳定性；另外，将该生物传感器在4℃的冰箱中放置30天，期间每隔5天取出于含10μmol·L-1NaNO2的PBS缓冲溶液 (0.1mol/L pH＝2.75)中测其对NO2 -响应电流值，其电流响应值变化为4.9％，说明该生物传感器具有较好的稳定性和较长的使用寿命。
(2)抗干扰性
向含有2μmol·L-1NaNO2的PBS缓冲溶液(0.1mol/L pH＝2.75)中依次加入 20μmol·L-1的干扰物葡萄糖(Glu)、抗坏血酸(AA)、尿酸(DA)和多巴胺(UA) 以及常见的无机干扰离子AgNO3、CuSO4、FeCl3和Na2CO3，使用Amperometric i-t 法对其检测，结果如图5所示。由图可见，加入不同的干扰性物质后，响应电流值无明显变化，说明CPO/MoS2-AuNPs/IL-GC检测NO2 -的抗干扰性能较好。
将实施例1制备的CPO/MoS2-AuNPs/IL-GC电化学检测NO2 -的性能与文献报道的Au/GO-SH/GC(Fabrication of gold nanoparticles/l-cysteine functionalized grapheneoxide nanocomposites and application for nitrite detection[J].J.Alloys.Comp.,2018,744: 51-56.)、Co3O4/RGO(An enzyme-free electrochemical sensor based onreduced graphene oxide/Co3O4nanospindle composite for sensitive detection ofnitrite[J].Sens.Actuat. B-Chem.,2016,227:92-99.)、ZnO@ZIF-8/IL/Mb-CPEE(Thestrategy of nitrite and immunoassay human IgG biosensors based on ZnO@ZIF-8and ionic liquid composite film[J].Sens.Actuat.B-Chem.,2017,251:650-657.)、Co3O4-HRP/rGO/GCE(A novel nitrite biosensor based on the directelectrochemistry of horseradish peroxidase immobilized on porous Co3O4nanosheets and reduced graphene oxide composite modified electrode[J].Sens.Actuat.B-Chem.,2017,238:249-256.)、Hb-ZnO-nafion/GC(MWCNT-cysteamine -Nafion modified gold electrode based on myoglobin for determination ofhydrogen peroxide and nitrite[J].2015，Bioelectrochemistry,2015,101:126-131.)、Au-CA/Mb/MWCNT-nafion(Porous nanosheet-based ZnO microspheres for theconstruction of direct electrochemical biosensors[J].Biosens.Bioelectron.,2008,24: 93-98.)进行比较，结果如表1所示。
表1 不同生物传感器检测NO2 -性能比较

Claims (9)

1.一种基于MoS2-AuNPs和离子液体的CPO生物传感器，其特征在于：所述生物传感器是在玻碳电极上修饰由MoS2-AuNPs复合纳米材料、离子液体、氯过氧化物酶组成的复合膜。
2.根据权利要求1所述的MoS2-AuNPs和离子液体的CPO生物传感器，其特征在于：所述的离子液体为溴化1-乙基-3-甲基咪唑离子液体、溴化1-丁基-3-甲基咪唑离子液体、溴化1-辛基-3-甲基咪唑离子液体、溴化1-丁基-2,3-二甲基咪唑离子液体、氯化1-辛基-3-甲基咪唑离子液体中任意一种。
3.根据权利要求1或2所述的基于MoS2-AuNPs和离子液体的CPO生物传感器，其特征在于所述生物传感器由下述方法制备得到：
将离子液体溶解于pH为7.4的PBS缓冲溶液中，然后加入MoS2-AuNPs复合纳米材料，超声分散均匀，得到MoS2-AuNPs/离子液体复合材料分散液；然后将MoS2-AuNPs/离子液体复合材料分散液滴于预处理的玻碳电极表面，在室温下晾干，再滴加氯过氧化物酶溶液，在室温下晾干，得到基于MoS2-AuNPs和离子液体的CPO生物传感器。
4.根据权利要求3所述的基于MoS2-AuNPs和离子液体的CPO生物传感器，其特征在于：所述MoS2-AuNPs/离子液体复合材料分散液中，MoS2-AuNPs复合纳米材料的浓度为1.0～5.0mg·mL-1，离子液体的体积浓度为5％～30％。
5.根据权利要求4所述的基于MoS2-AuNPs和离子液体的CPO生物传感器，其特征在于：所述MoS2-AuNPs/离子液体复合材料分散液中，MoS2-AuNPs复合纳米材料的浓度为2.0～3.0mg·mL-1，离子液体的体积浓度为10％～20％。
6.根据权利要求3所述的基于MoS2-AuNPs和离子液体的CPO生物传感器，其特征在于：所述氯过氧化物酶溶液中氯过氧化物酶的浓度为0.1～0.5mmol·L-1。
7.根据权利要求6所述的基于MoS2-AuNPs和离子液体的CPO生物传感器，其特征在于：所述氯过氧化物酶溶液采用pH为3.0～5.5的PBS缓冲溶液配制。
8.根据权利要求3所述的基于MoS2-AuNPs和离子液体的CPO生物传感器，其特征在于所述预处理的玻碳电极的制备方法为：将玻碳电极依次用直径为0.3μm和0.05μm的Al2O3粉末抛光成镜面，再依次用超纯水、乙醇、超纯水各超声清洗3～5min，用N2吹干，再将玻碳电极置于含有0.1mol·L-1 KCl的2mmol·L-1 K3Fe(CN)6水溶液中，在0～0.8V下采用循环伏安法扫描至氧化峰与还原峰电位差值小于80mV，取出用蒸馏水冲洗，室温晾干，得到预处理的玻碳电极。
9.权利要求1所述的基于MoS2-AuNPs和离子液体的CPO生物传感器在电化学检测NO2 -中的应用。
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