CN116593693A - 一种磁性适配体探针、其制备方法和应用及迁移体富集方法 - Google Patents
一种磁性适配体探针、其制备方法和应用及迁移体富集方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种磁性适配体探针、其制备方法和应用及迁移体富集方法，属于生物医药技术领域，本发明提供的磁性适配体探针，包括骨架和修饰在骨架表面的适配体Apt_B3，所述骨架为Fe3O4纳米粒子，所述适配体Apt_B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该磁性适配体探针能够克服现有技术中未能实现迁移体高效富集的问题。本发明提供的磁性适配体探针具有优异的特异性，为富集检测方法的准确性提供了保障，在成分复杂的临床血浆样本中的表现依然十分优异，即便有多种杂质干扰，依然显示出良好的特异性，能够比离心法富集到更多的蛋白，还能够富集到一些离心法无法获得的蛋白组分，为生物标志物的寻找带来更多可能。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种磁性适配体探针、其制备方法和应用及迁移体富集方法。
背景技术
迁移体是细胞定向移动过程中，细胞尾部收缩丝交汇处和尖端部位产生的单层膜囊泡结构。顾名思义，迁移体的形成依赖于细胞的迁移，由于形成机制的差异，迁移体在大小、分子组成和生物学功能等方面也有别于外泌体、微泡等细胞外囊泡。迁移体涉及多种生理和病理过程，能够在肿瘤细胞之间以及肿瘤细胞与肿瘤微环境之间进行功能性转运，从而影响癌症的发生、发展和转移。现有的研究结果显示，肿瘤来源的迁移体可以释放进入循环系统，其携带内容物能够反映肿瘤细胞特征，具有代替肿瘤细胞本身作为液体活检的生物标志物的潜力。因此，富集和检测迁移体及其内容物对肿瘤的精准诊断、早期治疗和改善预后具有重要意义。
迁移体的富集主要依靠物理特性（尺寸大小和密度），利用逐渐增大的离心力和梯度蔗糖溶液的密度差异，依次经超速离心法和密度梯度离心法将迁移体与其他EVs成分进行分离。然而，这些方法对样本量需求较大，且存在操作繁琐、耗时长、成本高昂、回收率低且没有标准化等问题。此外，血液中迁移体含量相对较少，且存在大量细胞、蛋白质、无机离子等物质，这些物质在传统离心富集的过程中会与迁移体共同沉淀，影响富集迁移体的纯度和后续检测结果的准确性。因此，迁移体的高效富集仍是目前限制其相关研究和应用的一大问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种磁性适配体探针、其制备方法和应用及迁移体富集方法，以解决现有技术中未能实现迁移体高效富集的问题。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种磁性适配体探针，包括骨架和修饰在骨架表面的适配体Apt_B3，所述骨架为Fe3O4纳米粒子，所述适配体Apt_B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了上述磁性适配体探针的制备方法，包括以下步骤：
在Fe3O4纳米粒子表面修饰SiO2层、氨基层和中性亲和素蛋白，得到Fe3O4@SiO2-NA纳米粒子；
在适配体Apt_B3的5’端修饰生物素，得到Biotin-Apt_B3，所述适配体Apt_B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
将Biotin-Apt_B3粉末与水混合，然后依次进行热处理和低温处理，得到Biotin-Apt_B3水溶液；
将Biotin-Apt_B3水溶液和Fe3O4@SiO2-NA纳米粒子混合，孵育20~40分钟，得到磁性适配体探针。
优选的，所述热处理的温度为90~100℃，所述热处理的时间为3~8分钟。
优选的，所述低温处理的温度为-5~5℃，所述低温处理的时间为5~15分钟。
优选的，所述Biotin-Apt_B3水溶液的浓度为300~800nM；
所述Fe3O4@SiO2-NA纳米粒子和Biotin-Apt_B3水溶液混合时，Fe3O4@SiO2-NA纳米粒子和Biotin-Apt_B3水溶液的质量体积比为0.5~1.5mg:1mL。
优选的，所述孵育的温度为2~6℃；
所述孵育伴随振荡，所述振荡的转速为800-1200rpm。
优选的，所述孵育之后还包括将磁性适配体探针进行洗涤；
所述洗涤的次数为1~3次。
本发明还提供了上述磁性适配体探针在制备肿瘤诊断试剂盒和/或肿瘤治疗药物中的应用。
本发明还提供了一种迁移体富集方法，包括以下步骤：
将样品进行第一次离心，得到第一上清和第一沉淀；
将第一上清进行第二次离心，得到第二上清和第二沉淀；
将第二上清与上述磁性适配体探针混合，孵育20~40分钟，得到混合液；
将混合液进行磁分离，即实现迁移体富集。
优选的，所述第一次离心的转速为800~1200g；
所述第一次离心的时间为5~15分钟；
所述第二次离心的转速为3800~4200g；
所述第二次离心的时间为15~25分钟；
所述第一次离心和第二次离心的温度独立的为2~6℃；
所述样品的体积与磁性适配体探针的质量的添加比例为1~30mL:0.05~1mg。
本发明的技术效果和优点：
本发明提供的磁性适配体探针具有优异的特异性，为富集检测方法的准确性提供了保障，在成分复杂的临床血浆样本中的表现依然十分优异，即便有多种杂质干扰，依然显示出良好的特异性，能够比离心法富集到更多的蛋白，还能够富集到一些离心法无法获得的蛋白组分，为生物标志物的寻找带来更多可能。
本发明提供的迁移体富集方法结合了适配体的特异性以及磁性功能材料的快速磁响应特性，具有快速简便、特异性高、富集成本低、可以批量操作的优点，突破了当前方法学上的瓶颈，为临床样本迁移体的富集提供了新的选择，也为更深入的迁移体检测方法提供了技术支持。相较于现有技术中需要大量实验耗材的离心法或需要昂贵抗体参与的蛋白免疫亲和法而言，本发明提供的方法更加节约成本，仅通过短时间孵育就能完成样本中迁移体的高效富集，与长达数小时的离心法相比，具有明显的速度提升，更适合临床应用。
附图说明
图1为磁性适配体探针对迁移体的捕获原理图；
图2为Fe3O4@SiO2-NA纳米粒子的粒径分布图；
图3为磁性适配体探针的粒径分布图；
图4为Fe3O4@SiO2-NA纳米粒子和磁性适配体探针的表面电位检测结果图；
图5为激光共聚焦显微镜检测适配体的修饰情况结果图，图中A为Fe3O4@SiO2-NH2纳米粒子与5’Biotin, 3’Fam-Apt_B3孵育后进行检测的结果图，B为Fe3O4@SiO2-NA纳米粒子与5’Biotin, 3’Fam-Apt_B3孵育后进行检测的结果图，激发态波长均为488nm；
图6为激光共聚焦显微镜观察L929细胞收缩丝上的迁移体情况图；
图7为迁移体的扫描电镜图；
图8为迁移体的透射电镜图，其中A为2μm标尺下的投射电镜图，B为0.5μm标尺下的投射电镜图；
图9为蛋白免疫印迹法分析密度梯度离心后各组分Integrin α5、NDST1、PIGK、Tsg101和Alix的表达情况结果图；
图10为迁移体模型表征结果图，图10中Aa为密度梯度离心法富集迁移体的扫描电镜图，Ab为磁性适配体探针所富集迁移体的扫描电镜图；Ba为密度梯度离心法富集迁移体的透射电镜图，Bb为磁性适配体探针所富集迁移体的透射电镜图；
图11为免疫印迹法分析细胞外囊泡标志蛋白的表达情况结果图；
图12为记录MCP磁分离过程的情况图；
图13为磁回收效率曲线图；
图14为磁性适配体探针的使用量选择结果图；
图15为磁性适配体探针与迁移体的孵育时间选择结果图；
图16为蛋白免疫印迹法验证捕获特异性结果图；
图17为所得迁移体蛋白组成差异情况示意图，图17中条带1~4为磁性适配体探针捕获法的富集结果，条带5~8为超速离心法的富集结果，M为蛋白质分子量标记。
具体实施方式
本发明提供了一种磁性适配体探针，包括骨架和修饰在骨架表面的适配体Apt_B3，所述骨架为Fe3O4纳米粒子，所述适配体Apt_B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：5’-TCAAGTCACAGGTTCCAGGTGGCGGCACGGTTTCCCGGATTTCCGCGTTCGAGCTCCGGCATAGGCACTGACACGACACT-3’，所述适配体Apt_B3优选通过生物素-中性亲和素结合方式修饰于Fe3O4纳米粒子表面，所述磁性适配体探针对迁移体的捕获原理如图1所示。
本发明还提供了上述磁性适配体探针的制备方法，包括以下步骤：在Fe3O4纳米粒子表面修饰SiO2层、氨基层和中性亲和素蛋白，得到Fe3O4@SiO2-NA纳米粒子，所述Fe3O4@SiO2-NA纳米粒子的制备方法优选包括以下步骤：（1）超顺磁性 Fe3O4纳米粒子的制备：采用经典的高温水热法制备 Fe3O4纳米粒子。量取 60 mL乙二醇，加入到100 mL 聚四氟乙烯反应釜中，加入 2.43 g FeCl3·6H2O、0.45 g Na3CT 和 3.6 g NaOAc，将反应釜置于磁力搅拌器上剧烈搅拌1小时。搅拌完毕后移除磁子， 将反应釜置于不锈钢套中加热至 200℃反应12小时。冷却后采用磁分离的方式收集沉黑褐色积物，并依次用无水乙醇、去离子水清洗产物3~5次。最后，将清洗好的 Fe3O4纳米粒子真空干燥；（2）Fe3O4@SiO2-NH2纳米粒子的制备：首先，称量100 mg上述 Fe3O4纳米粒子，加入到 20 mL HCl（0.1 M）中， 将容器置于超声波清洗器中超声处理 30 分钟，再用去离子水清洗3遍。接着，向Fe3O4纳米粒子中加入8mL去离子水和32mL无水乙醇，再依次加入0.5mL 氨水（28%）和 0.5 mL TEOS，将得到的混合物继续超声10分钟，并在室温下剧烈搅拌反应4小时。反应结束后将获得的 Fe3O4@SiO2纳米粒子分别用无水乙醇和去离子水清洗数次。然后将Fe3O4@SiO2纳米粒子加入至含36 mL无水乙醇和4 mL去离子水的混合溶剂中。将0.4 mL APTES溶解至上述混合溶液中，并持续搅拌反应6小时。紧接着加入0.4 mL TEA，继续搅拌18小时。最后，磁分离Fe3O4@SiO2-NH2纳米粒子，用无水乙醇和去离子水将其清洗数次以备后续使用；（3）Fe3O4@SiO2-NA纳米粒子 的制备：取上述 Fe3O4@SiO2-NH2纳米粒子5mg分散于1mL DMF中，超声处理3分钟，加入1 mL 吡啶和5mL DMF。另称取1mg PDITC，溶解于3mL DMF中，再缓慢滴加至上述混合溶液中，室温条件下磁力搅拌1小时。依次用DMF、无水乙醇、去离子水彻底清洗反应所得磁性纳米粒子。然后称取大约625μg中性亲和素蛋白，溶解在去离子水中，并与上一步所得磁性纳米粒子在 37℃条件下振荡反应1小时，接着加入1% BSA 继续反应 30 分钟以封闭剩余位点。随后用PBS清洗 Fe3O4@SiO2-NA纳米粒子2次，并取1 mg产物分散在PBS中以备后续使用。
得到Fe3O4@SiO2-NA纳米粒子后，在适配体Apt_B3的5’端修饰生物素，得到Biotin-Apt_B3，所述适配体Apt_B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；将Biotin-Apt_B3粉末与水混合，然后依次进行热处理和低温处理，得到Biotin-Apt_B3水溶液；所述热处理的温度优选为90~100℃，进一步优选为93~97℃，所述热处理的时间优选为3~8分钟，进一步优选为4~6分钟；所述低温处理优选为放置于冰上，所述低温处理的温度优选为-5~5℃，进一步优选为-3~3℃，所述低温处理的时间优选为5~15分钟，进一步优选为8~12分钟，所述水优选为ddH2O，所述Biotin-Apt_B3水溶液的浓度优选为300~800nM，进一步优选为400~600nM；将Biotin-Apt_B3水溶液和Fe3O4@SiO2-NA纳米粒子混合，孵育20~40分钟，得到磁性适配体探针，所述Biotin-Apt_B3水溶液和Fe3O4@SiO2-NA纳米粒子混合时，Fe3O4@SiO2-NA纳米粒子和Biotin-Apt_B3水溶液的质量体积比优选为0.5~1.5mg:1mL，进一步优选为0.8~1.2mg:1mL，所述Biotin-Apt_B3水溶液的浓度优选为400~600nM；所述孵育的温度优选为2~6℃，所述孵育的时间进一步优选为25~35分钟；所述孵育优选伴随振荡，所述振荡的转速优选为500-1500rpm；所述孵育之后还优选包括将磁性适配体探针进行洗涤；所述洗涤的次数优选为1~3次。
本发明还提供了上述磁性适配体探针在制备肿瘤诊断试剂盒和/或肿瘤治疗药物中的应用。
本发明还提供了一种迁移体富集方法，包括以下步骤：将样品进行第一次离心，得到第一上清和第一沉淀；将第一上清进行第二次离心，得到第二上清和第二沉淀；在本发明中，所述样品优选为细胞悬液或血浆样本；所述第一次离心的转速优选为800~1200g，进一步优选为900~1100g；所述第一次离心的时间优选为5~15分钟，进一步优选为8~12分钟，所述第一次离心的温度优选为2~6℃，进一步优选为3~5℃，所述第一次离心的目的是为了去除多数细胞胞体成分；所述第二次离心的转速优选为3800~4200g，进一步优选为3900~4100g；所述第二次离心的时间优选为15~25分钟，进一步优选为18~22分钟，所述第二次离心的目的是为了去除残留的细胞碎片；所述第二次离心的温度优选为2~6℃，进一步优选为3~5℃；然后将第二上清与上述磁性适配体探针混合，孵育20~40分钟，得到混合液；将混合液进行磁分离，即实现迁移体富集，所述样品的体积与磁性适配体探针的质量的添加比例优选为1~30mL:0.05~1mg，进一步优选为根据样品来源的不同设置不同的添加比例：当样品为细胞悬液时，每30ml细胞悬液中优选添加1mg磁性适配体探针；当样品为临床血浆样本时，每3ml血浆中优选添加150μg磁性适配体探针，所述孵育的时间进一步优选为25~35分钟，所述孵育的温度优选为2~6℃，进一步优选为3~5℃。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1 磁性适配体探针制备
将序列为5’-TCAAGTCACAGGTTCCAGGTGGCGGCACGGTTTCCCGGATTTCCGCGTTCGAGCTCCGGCATAGGCACTGACACGACACT-3’，如SEQ ID NO.1所示的适配体Apt_B3的5’端修饰生物素Biotin，得到Biotin-Apt_B3；
制备Fe3O4@SiO2-NA纳米粒子：
（1）超顺磁性 Fe3O4纳米粒子的制备
采用经典的高温水热法制备 Fe3O4纳米粒子。量取 60 mL乙二醇，加入到100 mL聚四氟乙烯反应釜中，加入 2.43 g FeCl3·6H2O、0.45 g Na3CT 和 3.6 g NaOAc，将反应釜置于磁力搅拌器上剧烈搅拌1小时。搅拌完毕后移除磁子， 将反应釜置于不锈钢套中加热至 200℃反应12小时。冷却后采用磁分离的方式收集沉黑褐色积物，并依次用无水乙醇、去离子水清洗产物3~5次。最后，将清洗好的 Fe3O4纳米粒子真空干燥，以备后续使用。
（2）Fe3O4@SiO2-NH2纳米粒子的制备
首先，称量100 mg上述 Fe3O4纳米粒子，加入到 20 mL HCl（0.1 M）中， 将容器置于超声波清洗器中超声处理 30 分钟，再用去离子水清洗3遍。接着，向Fe3O4纳米粒子中加入8mL去离子水和32mL无水乙醇，再依次加入0.5mL 氨水（28%）和 0.5 mL TEOS，将得到的混合物继续超声10分钟，并在室温下剧烈搅拌反应4小时。反应结束后将获得的 Fe3O4@SiO2纳米粒子分别用无水乙醇和去离子水清洗数次。然后将Fe3O4@SiO2纳米粒子加入至含36 mL无水乙醇和4 mL去离子水的混合溶剂中。将0.4 mL APTES溶解至上述混合溶液中，并持续搅拌反应6小时。紧接着加入0.4 mL TEA，继续搅拌18小时。最后，磁分离Fe3O4@SiO2-NH2纳米粒子，用无水乙醇和去离子水将其清洗数次以备后续使用。
（3）Fe3O4@SiO2-NA纳米粒子 的制备
取上述 Fe3O4@SiO2-NH2纳米粒子5mg分散于1mL DMF中，超声处理3分钟，加入1 mL吡啶和5 mL DMF。另称取1mg PDITC，溶解于3mL DMF中，再缓慢滴加至上述混合溶液中，室温条件下磁力搅拌1小时。依次用DMF、无水乙醇、去离子水彻底清洗反应所得磁性纳米粒子。然后称取大约625μg中性亲和素蛋白，溶解在去离子水中，并与上一步所得磁性纳米粒子在 37℃条件下振荡反应1小时，接着加入1% BSA 继续反应 30 分钟以封闭剩余位点。随后用PBS清洗 Fe3O4@SiO2-NA纳米粒子2次，并取1 mg产物分散在PBS中以备后续使用。
将Biotin-Apt_B3粉末与ddH2O混合，置于95℃金属浴中加热5分钟，然后置于冰上降温10分钟，恢复适配体的天然构象，所述冰上温度为0℃。然后将其用ddH2O稀释至500nM浓度后，取1mLBiotin-Apt_B3溶液，加入1mg Fe3O4@SiO2-NA纳米粒子，置于摇床上，4℃条件下1000rpm振荡孵育30分钟使适配体通过生物素-中性亲和素的结合而修饰于磁珠表面，通过磁分离的方式，用去离子水将磁珠清洗2遍以去除未结合和非特异性结合的物质，得到磁性适配体探针，记为MAP。
实施例2 迁移体捕获与富集
将L929细胞铺在提前预处理过Fn（浓度为10μg/mL）的150mm培养皿中，加入DMEM完全培养基培养15小时至细胞汇合度约50%，用胰蛋白酶消化细胞。将消化下来的细胞悬液先通过4℃ 1000g离心10分钟去除细胞成分（弃沉淀），再4℃ 4000g离心20分钟去除细胞碎片（弃沉淀），然后将30mL上清与1mg实施例1制备得到的磁性适配体探针MAP在4℃摇床上以1000rpm 的转速共同孵育30分钟，最后通过磁分离的方式去除上清液，实现细胞来源的迁移体捕获和富集。
对比例1 超速离心法富集迁移体
将L929细胞铺在提前预处理过Fn（浓度为10μg/mL）的150mm培养皿中，加入DMEM完全培养基培养15小时至细胞汇合度约50%，用胰蛋白酶消化细胞。将消化下来的细胞悬液先通过4℃ 1000g离心10分钟去除细胞成分（弃沉淀），再4℃ 4000g离心20分钟去除细胞碎片（弃沉淀），然后继续4℃，18000g离心30分钟获得粗提迁移体（弃上清）。然后将粗提迁移体制备成蔗糖密度梯度为19%的样品梯度液，继续4℃，15000g离心4小时进行密度梯度离心。离心好的样本，用移液枪获取第六层密度梯度液成分0.5 mL至1.5 mL离心管中，补充PBS 1mL，4℃条件下，18000g离心30分钟，所得沉淀即精提迁移体。实现细胞来源迁移体的富集。
实验例1 磁性适配体探针的表征
对实施例1制备的磁性适配体探针进行测试：
1.1 采用动态光散射粒度仪（Dynamic light scattering，DLS）测试粒子的水动力学直径，Fe3O4@SiO2-NA纳米粒子的粒径分布图如图2所示，磁性适配体探针的粒径分布图如图3所示，Fe3O4@SiO2-NA纳米粒子和磁性适配体探针的表面电位检测结果如图4所示。结果显示：适配体的修饰并没有使纳米粒子的粒径大小发生明显改变，但Zeta电位却由修饰前的-8.78±0.52 mV（Fe3O4@SiO2-NA纳米粒子）改变为-20.1±0.56 mV（磁性适配体探针），表明磁性适配体探针MAP已成功组装完成。
1.2 在Apt_B3的5’端修饰上Biotin基团，并在3’端修饰上Fam荧光基团，得到5’Biotin, 3’Fam-Apt_B3，然后将其分别与Fe3O4@SiO2-NH2纳米粒子和Fe3O4@SiO2-NA纳米粒子进行反应，通过激光共聚焦显微镜进行观察，结果如图5所示（图中A：Fe3O4@SiO2-NH2纳米粒子与5’Biotin, 3’Fam-Apt_B3孵育后进行检测；B：Fe3O4@SiO2-NA纳米粒子与5’Biotin,3’Fam-Apt_B3孵育后进行检测，激发态波长均为488nm），可见，Fe3O4@SiO2-NA纳米粒子与5’Biotin, 3’Fam-Apt_B3孵育后得到的磁性适配体探针MAP表面有较强的绿色荧光信号，而Fe3O4@SiO2-NH2纳米粒子表面没有明显绿色荧光信号。
实验例2 磁性适配体探针的捕获性能
2.1 细胞来源迁移体的获得：
将稳定表达TSPAN4-GFP的L929细胞置于预处理了Fn的细胞培养皿中，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基培养15小时至细胞密度到达50%左右。将细胞用胰蛋白酶进行消化后，收集细胞悬液至50 mL无菌离心管中。首先4℃下1000 g离心10分钟，排除多数细胞胞体成分，转移上清液至新的50 mL离心管。然后4℃，4000 g离心20分钟，去除残留的细胞碎片，将上清转移到新的50 mL离心管。继续4℃，18000 g离心30分钟，此时所得沉淀即为粗提迁移体。然后将粗提迁移体制备成蔗糖密度梯度为19%的样品梯度液，然后继续4℃，15000g离心4小时进行密度梯度离心。离心好的样本，用移液枪获取第六层密度梯度液成分0.5 mL至1.5 mL离心管中，补充PBS 1 mL，4℃条件下，18000g离心30分钟，所得沉淀即精提迁移体。鉴定结果如图6~9所示，图6为激光共聚焦显微镜观察L929细胞收缩丝上的迁移体情况图，图7为迁移体的扫描电镜图，图8为迁移体的透射电镜图，其中A为2μm标尺下的投射电镜图，B为0.5μm标尺下的投射电镜图，图9为蛋白免疫印迹法分析密度梯度离心后各组分Integrin α5、NDST1、PIGK、Tsg 101和Alix的表达情况结果图，呈0.5-3μm典型“石榴样”形貌特征，且仅表达迁移体特异性蛋白而几乎不表达外泌体特异性蛋白。
2.2 捕获迁移体
用PBS将实施例1获得的磁性适配体探针MAP重新分散后加入模型迁移体分散液中，置于摇床上，4℃条件下孵育1小时。磁分离后用PBS将捕获到迁移体的磁珠清洗2遍。加入适量PBS重新分散磁性适配体探针MAP-迁移体复合物进行表征分析，结果如图10所示，图10中Aa为密度梯度离心法富集迁移体的扫描电镜图，Ab为磁性适配体探针所富集迁移体的扫描电镜图；Ba为密度梯度离心法富集迁移体的透射电镜图，Bb为磁性适配体探针所富集迁移体的透射电镜图：
图10显示：通过扫描电子显微镜表征观察到离心法富集到的迁移体模型呈球形，其直径大小大约1μm（图10Aa），磁性适配体探针MAP捕获后的迁移体表面具有明显磁性纳米粒子分布，且由于重力作用，固定于硅片表面的迁移体结构形成了部分塌陷和凹痕（图10Ab）。迁移体模型在透射电镜下呈0.5~3μm大小范围的空泡状结构，部分迁移体还表现出典型的“石榴样”形貌特征（图10Ba），而经磁性适配体探针MAP捕获的迁移体在透射电镜下，仍可以透过磁性纳米粒子观察到膜结构和部分内部结构特征（图10Bb）。
2.3 迁移体捕获方法对比
分别采用实施例2和对比例1的方法捕获迁移体，通过Western Blot对超速离心法和磁性适配体探针MAP捕获法富集到的迁移体进行分析，如图11所示：
结果显示：超速离心法获得的囊泡蛋白不仅可以表达NDST1、PIGK，也同样能够表达微泡和外泌体的特征蛋白，说明超速离心法虽然能够富集到一定量的迁移体，但仍无法排除体积与密度相当的其他囊泡成分。而将适配体作为识别探针的磁性适配体探针MAP系统捕获到的囊泡成分仅表达Integrin α5和迁移体特异性蛋白NDST1、PIGK，而几乎不表达其他类型囊泡的标志蛋白，说明通过本发明提供的磁性适配体探针MAP捕获到的囊泡蛋白纯度有很大程度的提高。
将两种方法的性能进行对比，如下表1所示：
表1 超速离心法和本发明捕获方法比较结果
2.4 磁性适配体探针MAP的磁回收效率分析
磁性适配体探针MAP的高效回收可以有效避免迁移体的损失，因此探针的磁分离效率相当重要。
取100 μg 磁性适配体探针MAP分散在PBS中，在外加磁场作用下，在不同时间点取样本的上清液，紫外分光光度计测试各样本的紫外吸收强度。通过Fe3O4-NPs浓度-紫外吸收强度标准曲线测定各样本中磁性适配体探针MAP的含量，进而计算得到各时间点的磁回收效率。另外，在初试分离时刻（0秒）和达到最大磁回收效率时间点拍照记录。
结果如图12~13所示，磁性适配体探针MAP的磁响应性能良好，磁回收率在20秒内达到81.75%，在1分钟内几乎达到100%的纳米粒子被外磁场有效收集。这一结果展示了磁性适配体探针MAP快速的磁响应能力，保证了对富集到的迁移体的快速回收。
实验例3 捕获条件的选择
3.1 将组装好的磁性适配体探针MAP分成50 μg、150 μg、300 μg、450 μg、600 μg和750 μg六个组，向各组投入等量的迁移体模型（迁移体总蛋白浓度约250ng/mL），用PBS将各组液体体积补充一致，然后置于4℃条件下振荡孵育30分钟，磁分离后用PBS清洗磁珠1次。用2.5% SDS裂解捕获到的迁移体蛋白，并通过微量BCA法进行蛋白定量分析。另取投放量等量的迁移体，直接用等体积的2.5% SDS裂解蛋白，同样进行蛋白定量分析，通过公式1计算捕获效率：
捕获效率（%）=C1/C0×100% （公式1）
其中，C1代表捕获到的迁移体总蛋白浓度，C0代表投放的迁移体原总蛋白浓度。
如图14所示，在使用150μg 磁性适配体探针MAP时捕获效率最高，可达64.18%。
3.2 向迁移体模型（迁移体总蛋白浓度约250ng/mL）中投放150 μg提前组装好的磁性适配体探针MAP，用PBS分散后涡旋振荡均匀，然后置于4℃摇床上，分别振荡孵育5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟和60分钟。磁分离，用PBS清洗磁珠1次，再用2.5% SDS裂解捕获到的迁移体蛋白，通过微量BCA法进行蛋白定量分析。另取同等投放量的迁移体，直接用等体积的2.5% SDS裂解蛋白，进行蛋白定量分析，通过3.1中的公式1计算捕获效率，如图15所示。
结果显示，随着孵育时间的延长，磁性适配体探针MAP系统对迁移体的捕获效率也在逐渐增加，15分钟时可达62.8%；但随着孵育时间的进一步延长，其捕获效率并未得到显著增大，30分钟时捕获效率为63.89%。此结果表明，磁性适配体探针MAP系统的最佳反应速度在15分钟左右。
实验例4 临床应用效能验证
4.1 蛋白免疫印迹法验证方法学特异性
利用实施例1制备的磁性适配体探针MAP对9例临床血浆样本（来源于四川大学华西医院，志愿者已签署知情同意书，同意其血液样本、临床基本信息用于本课题研究）进行迁移体捕获，向每份（3mL）血浆样本中投入150μg 磁性适配体探针MAP，涡旋振荡均匀后，置于4℃摇床上孵育15分钟，磁分离后用PBS清洗磁珠2次。50℃加热5分钟，通过温度的变化改变适配体的构象，从而释放捕获住的迁移体，再用2.5%SDS裂解捕获到的迁移体蛋白。富集到的迁移体通过Western Blot验证纯度，如图16所示。
结果显示，即便是成分复杂的临床样本，磁性适配体探针MAP仍然表现出良好的特异性捕获性能，除了迁移体标志蛋白PIGK和整合素α5，微泡和外泌体标志蛋白均没有明显表达。
4.2 血浆样本采用不同方法检测
将4例临床血浆样本（来源于四川大学华西医院，志愿者已签署知情同意书，同意其血液样本、临床基本信息用于本课题研究）每例样本平均分为两份，分别采用对比例1中的超速离心法（UC）和本发明实施例1得到的磁性适配体探针，采用磁性适配体探针捕获法对迁移体进行富集，磁性适配体探针捕获法：向每份（3mL）血浆样本中投入150μg 实施例1制备得到的磁性适配体探针MAP，涡旋振荡均匀后，置于4℃摇床上孵育15分钟，磁分离后用PBS清洗磁珠2次。50℃加热5分钟，通过温度的变化改变适配体的构象，从而释放捕获住的迁移体，再用2.5%SDS裂解捕获到的迁移体蛋白；超速离心法：将血浆样本制备成蔗糖密度梯度为19%的样品梯度液，继续4℃，15000g离心4小时进行密度梯度离心。离心好的样本，用移液枪获取第六层密度梯度液成分0.5 mL至1.5 mL离心管中，补充PBS 1 mL，4℃条件下，18000g离心30分钟，所得沉淀即迁移体用2.5% SDS裂解捕获到的迁移体蛋白。分别将两种方法得到的迁移体蛋白通过微量BCA法定量蛋白浓度，接着取等量蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）和银染显色，分析两种方法富集所得迁移体蛋白在组成上的差异情况，如图17所示，其中条带1~4为磁性适配体探针捕获法的富集结果，条带5~8为超速离心法的富集结果，M为蛋白质分子量标记。
图17显示，由于超速离心法具有一定量的迁移体损耗，磁性适配体探针MAP能够富集到更多相同分子量的蛋白质，还能富集到一些离心法损耗丢失的蛋白质成分，这也暗示磁性适配体探针MAP能够为迁移体的疾病生物标志物筛选提供更多的可能。
由以上实施例可知，本发明提供的磁性适配体探针MAP特异性良好，且不容易受杂质干扰，能够用于快速高效富集迁移体。本发明提供的迁移体富集方法具有快速简便、特异性高、富集成本低、可以批量操作的优点，突破了当前方法学上的瓶颈，为临床样本迁移体的富集提供了新的选择，也为更深入的迁移体检测方法提供了技术支持。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种磁性适配体探针，其特征在于：包括骨架和修饰在骨架表面的适配体Apt_B3，所述骨架为Fe3O4纳米粒子，所述适配体Apt_B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的磁性适配体探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
在Fe3O4纳米粒子表面修饰SiO2层、氨基层和中性亲和素蛋白，得到Fe3O4@SiO2-NA纳米粒子；
在适配体Apt_B3的5’端修饰生物素，得到Biotin-Apt_B3，所述适配体Apt_B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
将Biotin-Apt_B3粉末与水混合，然后依次进行热处理和低温处理，得到Biotin-Apt_B3水溶液；
将Biotin-Apt_B3水溶液和Fe3O4@SiO2-NA纳米粒子混合，孵育20~40分钟，得到所述磁性适配体探针。
3.根据权利要求2所述的磁性适配体探针的制备方法，其特征在于，所述热处理的温度为90~100℃，所述热处理的时间为3~8分钟。
4.根据权利要求2所述的磁性适配体探针的制备方法，其特征在于，所述低温处理的温度为-5~5℃，所述低温处理的时间为5~15分钟。
5.根据权利要求2所述的磁性适配体探针的制备方法，其特征在于，所述Biotin-Apt_B3水溶液的浓度为300~800nM；
所述Fe3O4@SiO2-NA纳米粒子和Biotin-Apt_B3水溶液混合时，Fe3O4@SiO2-NA纳米粒子和Biotin-Apt_B3水溶液的质量体积比为0.5~1.5mg:1mL。
6.根据权利要求2所述的磁性适配体探针的制备方法，其特征在于，所述孵育的温度为2~6℃；
所述孵育伴随振荡，所述振荡的转速为800~1200rpm。
7.根据权利要求6所述的磁性适配体探针的制备方法，其特征在于，所述孵育之后还包括将磁性适配体探针进行洗涤；
所述洗涤的次数为1~3次。
8.权利要求1所述的磁性适配体探针在制备肿瘤诊断试剂盒和/或肿瘤治疗药物中的应用。
9.一种迁移体富集方法，其特征在于，包括以下步骤：
将样品进行第一次离心，得到第一上清和第一沉淀；
将第一上清进行第二次离心，得到第二上清和第二沉淀；
将第二上清与权利要求1所述的磁性适配体探针混合，孵育20~40分钟，得到混合液；
将混合液进行磁分离，即实现迁移体富集。
10.根据权利要求9所述的迁移体富集方法，其特征在于，所述第一次离心的转速为800~1200g；
所述第一次离心的时间为5~15分钟；
所述第二次离心的转速为3800~4200g；
所述第二次离心的时间为15~25分钟；
所述第一次离心和第二次离心的温度独立的为2~6℃；
所述样品的体积与磁性适配体探针的质量的添加比例为1~30mL:0.05~1mg。
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