CN113186166B - 一种基于刺猬状磁性微球的外泌体富集方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于刺猬状磁性微球的外泌体富集方法，该方法基于刺猬状磁性微球，在其硅酸镁壳层表面修饰CD63抗体来特异性捕获外泌体，磁铁收集得到富集外泌体的磁性微球，对捕获到的外泌体裂解之后检测其内容物。其特征在于刺猬状磁性微球硅酸镁外壳呈纳米针状结构，形似刺猬，表面可修饰更多CD63抗体结合外泌体；所述微球内核为磁性四氧化三铁纳米粒子，能够在外加磁场的作用下迅速分离富集外泌体的磁性微球，从而进行下游检测。这种基于刺猬状磁性微球的外泌体富集方法具有特异性强、简易高效、安全环保、可重复性高等优点。

Description

一种基于刺猬状磁性微球的外泌体富集方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于刺猬状磁性微球的外泌体富集方法，该磁性微球捕获外泌体可应用于肿瘤诊断、肿瘤治疗等技术领域中。
背景技术
外泌体(Exosomes)是活细胞分泌的具有生物活性的双层膜结构的小囊泡，直径约30-150nm。它携带分泌细胞中含有的多种生物活性物质，如RNA(mRNA和microRNAs)、DNA片段、蛋白质和脂质。肿瘤细胞释放的外泌体参与了肿瘤发生、发展的多个过程，包括肿瘤转移及血管新生、肿瘤免疫逃逸等。这使外泌体有望成为识别早期肿瘤和监测治疗反应的潜在癌症生物标志物。
外泌体的提取方法多种多样，目前常见的方法包括蔗糖密度梯度离心法、聚合物沉淀法、尺寸排阻色谱法、超速离心法、免疫磁珠法等，其中磁珠富集是比较理想的方法。然而传统的磁珠往往表面结构过于简单，无法连接大量探针，与外泌体的结合效率仍不够理想，阻碍了相关研究的进一步发展。因此新型的外泌体富集策略仍然有待开发。
基于二氧化硅包裹的磁性纳米粒子制备的硅酸镁核壳微球，表面可以形成纳米针状的结构，形似刺猬，比表面积大大增加，有更多结合位点。且形成过程中不影响内核的磁性，当施加磁场时，更易于分离富集到外泌体的刺猬状磁性微球。因此，在本发明中，我们基于刺猬状磁性微球，设计发明了一种外泌体的富集方法，可用于肿瘤诊断、肿瘤治疗等技术领域中。
发明内容
为了解决传统磁性微球表面结构简单、制备较复杂、难以高效捕获外泌体的缺点，本发明提供了一种基于刺猬状磁性微球的外泌体富集方法。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：
一种基于刺猬状磁性微球的外泌体富集方法，包括如下步骤：
(1)通过低温超速离心的方法从HepG2细胞系的培养上清液中收集标准外泌体样品，将得到的标准外泌体样品用PBS重悬，储存在4℃以供使用；
(2)刺猬状磁性微球在3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES的作用下进行氨基修饰，再在丁二酸酐的作用下羧基化，配置EDC和NHS溶液活化微球表面的羧基；然后加入CD63抗体，置于恒温混匀仪孵育，得到抗体标记的刺猬状磁性微球；
(3)然后将上述抗体标记的刺猬状磁性微球与标准外泌体样品充分混合，在恒温混匀仪中孵育，用磁铁收集成功富集外泌体的刺猬状磁性微球，使用PBS清洗；再通过免疫印迹WesternBlot检测外泌体标志性蛋白的存在。
其中，标准外泌体样品的收集通过以下步骤处理得到：
a)收集细胞培养液，300g离心10min，收集上清液；
b)将收集到的上清液2000g离心10min，收集上清液，0.22微米滤膜滤过；
c)收集0.22微米滤膜滤过的上清液，120000g离心70min，倒掉上清；
d)收集步骤c)的离心沉淀，使用PBS重悬，120000g离心70min，倒掉上清，再次用PBS重悬，得到标准外泌体样品。
步骤(2)中使用的3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES使用乙醇溶液配置，使用的丁二酸酐为二甲基亚砜溶液配置。
步骤(2)中使用的EDC、NHS为pH 6的MES溶液配置所得。
步骤(3)所述恒温混匀仪孵育的条件为4℃过夜或者室温孵育2h。
步骤(3)所述磁铁收集富集外泌体的刺猬状磁性微球1min后即可除去上清。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明基于刺猬状磁性微球来完成外泌体的富集，特异性强，易于操作，高效快捷，可重复性高，且易对刺猬状磁性微球的大小进行控制。
(2)本发明基于CD63抗体标记的刺猬状磁性微球特异性结合外泌体表面的蛋白分子，具有特异性强，简易快捷的特点，实现了高效外泌体富集。
(3)本发明制备的刺猬状磁性微球可在外加磁场下可控运动，实现外泌体富集后的迅速分离。
附图说明
图1为所述刺猬状磁性微球分离外泌体过程示意图。
图2为本发明在实施例1的条件下制备的标准外泌体样品的透射电镜形貌图。
图3为本发明在实施例1的条件下刺猬状磁性微球捕获外泌体的扫面电镜形貌图。
图4为本发明在实施例1的条件下所得产物中的蛋白CD63、ALIX、TOMM20表达的免疫印迹(WesternBlot)检测结果。
具体实施方式
以下通过实施例形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明均为常规方法，所用的试剂、方法和设备，如无特殊说明均为本技术领域常规试剂、方法和设备。
其中，刺猬状磁性微球的制备：
(1)在乙二醇溶液中，依次加入无水三氯化铁、乙酸钠、聚(4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸)钠盐(摩尔比率1:1)、L-抗坏血酸和适量水，搅拌形成混合溶液。在混合溶液中加入氢氧化钠，继续搅拌得到棕色透明溶液。将其转移至反应釜中，通过一步水热法得到磁性纳米粒子。
(2)将上述磁性纳米粒子分散于乙醇中，加入氨水，超声分散，于50℃水浴条件下缓慢滴加正硅酸四乙酯，搅拌1h收集得到二氧化硅包裹的磁性纳米粒子。
(3)配制氯化镁和氯化铵的混合溶液，与上述二氧化硅包裹的磁性纳米粒子混合均匀，加入氨水，超声分散。将其转移至反应釜中，通过一步水热法得到刺猬状磁性微球。
实施例1
(1)标准外泌体样品的制备：
收集160ml HepG2细胞系培养上清液，300g离心10min，收集上清液。将上一步收集到的上清液2000g离心10min，收集上清液，0.22微米滤膜滤过。收集0.22微米滤膜滤过的上清液，4℃120000g离心70min，倒掉上清。收集离心沉淀，2ml PBS重悬，4℃120000g离心70min。倒掉上清，用200ul PBS重悬，收集得到标准外泌体样品，储存在4℃以供使用。
(2)微球的活化与抗体标记：
0.1mg刺猬状磁性微球在150ul 2％APTES的作用下进行氨基修饰1h，酒精清洗两遍，再加入150ul 10％丁二酸酐处理1h，MES缓冲液清洗两遍。取55mg EDC和35mg NHS加入1ml PH6的MES缓冲液中，与上述处理过的微球混合均匀，加入CD63抗体置于恒温混匀仪4℃300r孵育过夜，得到抗体标记的磁性微球，PBS清洗以去除非特异结合的外泌体。
(3)微球富集外泌体：
然后取上述抗体标记的刺猬状磁性微球与150ul标准外泌体样品充分混合，恒温混匀仪4℃300r孵育12h，磁铁收集上述成功富集外泌体的刺猬状磁性微球，PBS清洗两遍。再通过免疫印迹检测外泌体标志性蛋白CD63的存在。
实施例2
(1)标准外泌体样品的制备：
收集160ml HepG2细胞系培养上清液，300g离心10min，收集上清液。将上一步收集到的上清液2000g离心10min，收集上清液，0.22微米滤膜滤过。收集0.22微米滤膜滤过的上清液，4℃120000g离心70min，倒掉上清。收集离心沉淀，2ml PBS重悬，4℃120000g离心70min。倒掉上清，用200ul PBS重悬，收集得到标准外泌体样品，储存在4℃以供使用。
(2)微球的活化与抗体标记：
0.1mg刺猬状磁性微球在150ul 2％APTES的作用下进行氨基修饰1h，酒精清洗两遍，再加入150ul 10％丁二酸酐处理1h，MES缓冲液清洗两遍。取55mg EDC和35mg NHS加入1ml PH6的MES缓冲液中，与上述处理过的微球混合均匀，加入CD63抗体置于恒温混匀仪常温400r孵育2h，得到抗体标记的磁性微球，PBS清洗以去除非特异结合的外泌体。
(3)微球富集外泌体：
然后取上述抗体标记的刺猬状磁性微球与150ul标准外泌体样品充分混合，恒温混匀仪常温400r孵育2h，磁铁收集上述成功富集外泌体的刺猬状磁性微球，PBS清洗两遍。再通过免疫印迹检测外泌体标志性蛋白CD63的存在。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，依据本发明的技术实质，对以上实施例所作的任何简单的修改、等同替换与改进等，均仍属于本发明技术方案的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种基于刺猬状磁性微球的外泌体富集方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）标准外泌体样品的制备：
收集HepG2细胞系培养上清液，300g离心10min，收集上清液；将收集到的上清液2000g离心10min，收集上清液，0.22微米滤膜滤过；收集0.22微米滤膜滤过的上清液，4℃120000g离心70min，倒掉上清；收集离心沉淀，用PBS重悬，4℃ 120000g离心70min；倒掉上清，用PBS重悬，收集得到标准外泌体样品，储存在 4 ℃以供使用；
（2）微球的活化与抗体标记：
刺猬状磁性微球在2%APTES的作用下进行氨基修饰1h，酒精清洗两遍，再加入10%丁二酸酐处理1h，MES缓冲液清洗两遍；取EDC和NHS加入PH6的MES缓冲液中，与处理过的微球混合均匀，加入CD63 抗体置于恒温混匀仪孵育，得到抗体标记的磁性微球，PBS清洗以去除非特异结合的外泌体；
（3）微球富集外泌体：
然后取抗体标记的刺猬状磁性微球与标准外泌体样品充分混合，孵育，磁铁收集富集外泌体的刺猬状磁性微球，PBS 清洗两遍；再通过免疫印迹检测外泌体标志性蛋白CD63的存在；
其中，刺猬状磁性微球的制备：
（1）在乙二醇溶液中，依次加入无水三氯化铁、乙酸钠、聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐、L-抗坏血酸和适量水，搅拌形成混合溶液；在混合溶液中加入氢氧化钠，继续搅拌得到棕色透明溶液；将其转移至反应釜中，通过一步水热法得到磁性纳米粒子；
（2）将上述磁性纳米粒子分散于乙醇中，加入氨水，超声分散，于50℃水浴条件下缓慢滴加正硅酸四乙酯，搅拌1h收集得到二氧化硅包裹的磁性纳米粒子；
（3）配制氯化镁和氯化铵的混合溶液，与上述二氧化硅包裹的磁性纳米粒子混合均匀，加入氨水，超声分散；将其转移至反应釜中，通过一步水热法得到刺猬状磁性微球。
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