CN116254225A - 膜蛋白双阳性特异细胞外囊泡亚群分离富集方法、试剂盒及其应用 - Google Patents

膜蛋白双阳性特异细胞外囊泡亚群分离富集方法、试剂盒及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116254225A
CN116254225A CN202310315720.6A CN202310315720A CN116254225A CN 116254225 A CN116254225 A CN 116254225A CN 202310315720 A CN202310315720 A CN 202310315720A CN 116254225 A CN116254225 A CN 116254225A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
dna
membrane protein
evs
rna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310315720.6A
Other languages
English (en)
Inventor
郑磊
刘春辰
林慧娴
潘炜伦
李博
于海洋
麦雪盈
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Southern Hospital Southern Medical University
Original Assignee
Southern Hospital Southern Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Southern Hospital Southern Medical University filed Critical Southern Hospital Southern Medical University
Priority to CN202310315720.6A priority Critical patent/CN116254225A/zh
Publication of CN116254225A publication Critical patent/CN116254225A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0641—Erythrocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0644—Platelets; Megakaryocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/069—Vascular Endothelial cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种膜蛋白双阳性特异细胞外囊泡亚群分离富集方法、试剂盒及其应用。所述方法，包括如下步骤：将待处理的细胞外囊泡(EVs)样本、两个特异性靶向EVs膜蛋白标志物的抗体核酸复合物与能连接两个抗体核酸复合物的RNA连接链孵育，得到DNA‑RNA杂合体，实现EVs双阳性膜蛋白的捆绑；通过功能化磁珠特异性地捕获DNA‑RNA杂合体，实现膜蛋白双阳性特异EVs亚群的分离；通过酶切核酸链实现膜蛋白双阳性特异EVs亚群的富集。本发明提供的技术可实现膜蛋白双阳性特异EVs亚群无损分离富集，既能保证EVs数量，又能保证质量，还具有通用性，可根据实际需要更换抗体或靶向膜表面分子的识别原件实现双靶标阳性EVs亚群无损分离富集。

Description

膜蛋白双阳性特异细胞外囊泡亚群分离富集方法、试剂盒及 其应用
技术领域
本发明涉及生物化学技术领域，特别是涉及一种膜蛋白双阳性特异细胞外囊泡亚群分离富集方法、试剂盒及其应用。
背景技术
细胞外囊泡(extracellular vesicle，EVs)是细胞分泌至胞外的一种直径在30-2000nm的含脂质双分子层的膜性囊泡，携带蛋白与核酸等信号分子，介导细胞间通讯、细胞增殖、血管生成等过程，参与肿瘤的发生发展。EVs具有巨大的异质性，尤其在蛋白标志物上，携带不同蛋白的EVs生物学功能也不一样，例如，HER2+EVs用于乳腺癌诊断，PDL1+EVs用于疗效评估，Integrin+EVs可用于转移预测；不同蛋白标志物阳性的EV亚群携带的核酸谱也不同，预示着对某一类蛋白阳性EVs亚群进行测序更能准确的筛选出核酸标志物。因此，将特异蛋白EVs亚群分类分析有利于更为精准的了解EVs生物学意义。
现有EVs分离技术，如超离、超滤和尺寸排阻法是基于EVs的尺寸、比重等物理性质来实现了，不具有选择性，一定程度阻碍EVs生物功能的探索。一些研究报道了基于抗体和适配体修饰的磁珠或者可以提供反应界面的新材料可以实现特异蛋白阳性EVs的分离。本申请发明人前期将脂质探针修饰在比表面积比较大的有机金属框架(Metal-OrganicFrameworks,MOFs)上通过与EVs进行脂质亲和结合构建了名为EV-FISHER的EV分离平台(Pan WL,Feng JJ,Luo TT,Tan Y,Situ B,Nieuwland R,Guo JY,Liu CC,Zhang H,Chen J,Zhang WH,Chen J,Chen XH,Chen HY,Zheng L,Chen JX,Li B.Rapid and efficientisolation platform for plasma extracellular vesicles:EV-FISHER[J].Journal ofExtracellular Vesicles,2022,11(11).)。但他们均是基于单一参数的EVs分离方法，难免会受游离蛋白、脂蛋白和破裂碎片等影响。流式分选可以实现多参数的颗粒的分离富集，但是受其检出限的影响，目前仅能进行粒径大于200nm的大EVs的分选操作，而且分选速度有限，得到足够的EVs含量用于标志物筛选或者功能研究耗时久。因此，目前实现多参数分离富集特异EVs亚群仍具挑战。
邻位连接分析(Proximity Ligation Assay,PLA)是一种特殊的免疫分析方法，通过一对抗体核酸复合物，抗体特异性的识别目的蛋白，当这两个分子识别同一个蛋白时，两个抗体核酸复合物携带的核酸链之间的距离靠近，产生了所谓的邻近效应。EVs作为标志物的集合体，近年来PLA被广泛的应用于膜蛋白双阳性EV特异亚群的检测，然而基于PLA用于膜蛋白双阳性特异EV亚群的分离并未见报道。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种膜蛋白双阳性特异细胞外囊泡亚群分离富集方法、试剂盒及其应用，为膜蛋白双阳性特异细胞外囊泡亚群的无损分离富集提供一种新的通用技术。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种膜蛋白双阳性特异细胞外囊泡亚群分离富集方法，包括如下步骤：
将待处理的细胞外囊泡样本、两个特异性靶向细胞外囊泡膜蛋白标志物的抗体核酸复合物与能连接两个所述抗体核酸复合物的RNA连接链孵育，得到DNA-RNA杂合体，实现细胞外囊泡双阳性膜蛋白的捆绑；
通过功能化磁珠特异性地捕获所述DNA-RNA杂合体，实现膜蛋白双阳性特异细胞外囊泡亚群的分离，所述功能化磁珠为偶联了能特异识别所述DNA-RNA杂合体的第二抗体的免疫磁珠；
通过酶切核酸链实现膜蛋白双阳性特异细胞外囊泡亚群的富集。
于本发明的一实施例中，两个所述抗体核酸复合物分别为第一抗体-DNA1偶联物(即所述第一抗体与DNA1的偶联物)和第一抗体-DNA2偶联物(即所述第一抗体与DNA2的偶联物)，所述第一抗体为细胞外囊泡膜蛋白标志物的抗体，
所述DNA1的序列如SEQ ID NO.1所示：
TGTGGTCTATGTCGTCGTTCGCTAGTAGTTCCTGGGCTGCAC，
所述DNA2的序列如SEQ ID NO.2所示：
TCGAGGCGTAGAATTCCCCCGATGCGCGCTGTTCT。
于本发明的一实施例中，所述第一抗体选自CD9抗体、CD63抗体、CD81抗体、CD235a抗体、CD45抗体、CD41a抗体、CD144抗体中的至少一种；优选地，与DNA1偶联的第一抗体选自CD9抗体、CD63抗体、CD81抗体中的至少一种，与DNA2偶联的第一抗体选自CD9抗体、CD63抗体、CD81抗体、CD235a抗体、CD45抗体、CD41a抗体、CD144抗体中的至少一种。
于本发明的一实施例中，所述第一抗体-DNA1偶联物选自CD9抗体-DNA1偶联物(简称为CD9-DNA1)、CD63抗体-DNA1偶联物(简称为CD63-DNA1)、CD81抗体-DNA1偶联物(简称为CD81-DNA1)中的至少一种，所述第一抗体-DNA2偶联物选自CD235a抗体-DNA2偶联物(简称为CD235a-DNA2)、CD45抗体-DNA2偶联物(简称为CD45-DNA2)、CD41a抗体-DNA2偶联物(简称为CD41a-DNA2)、CD144抗体-DNA2偶联物(简称为CD144-DNA2)中的至少一种。
于本发明的一实施例中，用于分离富集红细胞、白细胞、血小板、血管上皮细胞来源细胞外囊泡的第一抗体-DNA2偶联物分别选自CD235a抗体-DNA2偶联物、CD45抗体-DNA2偶联物、CD41a抗体-DNA2偶联物、CD144抗体-DNA2偶联物。
于本发明的一实施例中，所述第一抗体-DNA1偶联物、第一抗体-DNA2偶联物通过链霉亲和素修饰的第一抗体分别与生物素化的DNA1、DNA2混合孵育构建而得。
于本发明的一实施例中，所述RNA连接链含有若干能与所述DNA1和DNA2的碱基互补的碱基；优选地，所述RNA连接链为RNA3，所述RNA3的序列如SEQ ID NO.5所示：
CGCCUCGAGUGCAGCC。
于本发明的一实施例中，所述第二抗体选自Ab S9.6。
于本发明的一实施例中，所述功能化磁珠为生物素化或亲和素化第二抗体与亲和素化或生物素化磁珠结合而成，所述磁珠优选为DynabeadsTMMyOneTMStreptavidin C1磁珠。
于本发明的一实施例中，所述酶为能水解所述DNA-RNA杂合体的核酸内切酶。
于本发明的一实施例中，所述核酸内切酶选自DNaseⅠ、RNase A、RNase H中的至少一种；优选地，所述核酸内切酶选自RNase A和/或RNase H；更优选地，所述核酸内切酶选自RNase H。
于本发明的一实施例中，所述方法包括如下步骤：
先将待处理的细胞外囊泡样本与两个特异性靶向细胞外囊泡膜蛋白标志物的抗体核酸复合物一起进行孵育，经超滤去除多余游离的抗体核酸复合物，得到被抗体核酸复合物标记的细胞外囊泡；
然后将所述RNA连接链与被抗体核酸复合物标记的细胞外囊泡混合进行杂交，形成所述DNA-RNA杂合体；
再加入所述功能化磁珠，孵育，洗涤，所述功能化磁珠会捕获膜蛋白双阳性特异细胞外囊泡；
随后加入酶，水解所述DNA-RNA杂合体，实现捕获细胞外囊泡的释放。
上述实施例中，孵育和杂交均在室温下进行，时间为0.5～2小时。
本发明第二方面提供一种试剂盒，所述试剂盒用于膜蛋白双阳性特异细胞外囊泡亚群分离富集，所述试剂盒包括：
至少两个特异性靶向细胞外囊泡膜蛋白标志物的抗体核酸复合物、能连接所述抗体核酸复合物的RNA连接链、功能化磁珠、核酸内切酶，所述功能化磁珠为偶联了能特异识别DNA-RNA杂合体的第二抗体的免疫磁珠；
所述DNA-RNA杂合体由待处理的细胞外囊泡样本、两个特异性靶向细胞外囊泡膜蛋白标志物的抗体核酸复合物与能连接两个所述抗体核酸复合物的RNA连接链孵育得到。
本发明第三方面提供一种试剂盒，所述试剂盒用于膜蛋白双阳性特异细胞外囊泡亚群分离富集，所述试剂盒包括：
至少两个第一抗体、DNA1、DNA2、RNA连接链、第二抗体、磁珠、核酸内切酶，
所述第一抗体为细胞外囊泡膜蛋白标志物的抗体，
所述DNA1、DNA2的序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示，所述RNA连接链含有若干能与所述DNA1和DNA2的碱基互补的碱基，
所述第二抗体为能特异识别DNA-RNA杂合体的抗体，
所述核酸内切酶用于水解所述DNA-RNA杂合体。
于本发明的一实施例中，所述试剂盒还包括以下组分中的至少一种：生物素、链霉亲和素。
上述实施例中，所述试剂盒根据如第一方面所述的方法对待处理的细胞外囊泡样本中的细胞外囊泡亚群进行分离富集。
本发明第四方面提供根据第一方面所述的方法、根据第二方面或第三方面所述的试剂盒在膜蛋白双阳性特异细胞外囊泡亚群分离富集中的应用。
如上所述，本发明的膜蛋白双阳性特异细胞外囊泡亚群分离富集方法、试剂盒及其应用具有以下有益效果：
本发明提出的设计以PLA为技术核心，通过两个抗体核酸复合物特异性的靶向细胞外囊泡膜蛋白标志物，再引入连接两个抗体核酸复合物的RNA链形成DNA-RNA杂合体，实现细胞外囊泡双阳性膜蛋白的捆绑，然后通过偶联了DNA-RNA杂合体抗体的免疫磁珠特异性地捕获DNA-RNA杂合体实现膜蛋白双阳性细胞外囊泡亚群的分离，最后通过酶切核酸链实现膜蛋白双阳细胞外囊泡亚群的富集。
本发明提供的技术可以实现膜蛋白双阳性特异细胞外囊泡亚群无损分离富集，既能保证细胞外囊泡数量，又能保证质量；同时，本发明提供的技术为通用的技术平台，可以根据实际需要更换抗体或者靶向膜表面分子(如糖基/脂质)的识别原件实现双靶标阳性细胞外囊泡亚群无损分离富集。
附图说明
图1显示为本发明实施例中膜蛋白双阳性特异细胞外囊泡亚群分离富集方法的原理示意图。
图2显示为本发明实施例中功能化磁珠的活性验证实验结果图。
图3显示为本发明实施例中RNA连接链优化实验结果图。
图4显示为本发明实施例中生物酶选择实验结果图。
图5显示为本发明实施例中膜蛋白双阳性特异EVs亚群分离富集方法的可行性分析实验结果图。
图6显示为本发明实施例中膜蛋白双阳性EVs亚群捕获电镜图。
图7显示为本发明实施例中酶解释放的膜蛋白双阳性EVs亚群的形态和粒径表征图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
鉴于以上所述现有技术的缺点和应用需求，本发明实施例提供了一种膜蛋白双阳性特异细胞外囊泡(以下简称EVs)亚群分离富集方法，基于所述方法可以开发一种新的试剂盒，实现膜蛋白双阳性特异EVs亚群的无损分离富集。
在一具体实施方式中，所述膜蛋白双阳性特异细胞外囊泡亚群分离富集方法的实施过程如下：
1、实验设计原理
实验设计原理如图1所示。首先，将特异识别DNA-RNA杂合体的抗体(Ab S9.6)生物素化处理，将其与亲和素磁珠混合制备功能化磁珠；其次，待处理的EVs样本与抗体核酸复合物1和抗体核酸复合物2孵育，经超滤去除多余游离的抗体核酸复合物，随后引入RNA连接链，通过条件优化，只有膜蛋白双阳性的EVs会结合RNA连接链，形成DNA-RNA杂合体；最后，加入制备的功能化磁珠，通过一定条件下的孵育，磁珠可以捕获预先捆绑好的膜蛋白双阳性EVs，随后加入酶分子，水解DNA-RNA杂合体，实现捕获EVs的释放。
2、材料与方法
2.1材料
2.1.1细胞系
人乳腺癌细胞系：MCF7，购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，保存于液氮中。
2.1.2血浆标本：健康人混合血浆收集于南方医科大学南方医院检验科。
2.1.3主要试剂耗材如表1和表2所示，主要实验仪器有：倒置荧光显微镜尼康Ti2-U、流式细胞仪(BriCyte E6)、HulaMixer。
表1主要试剂耗材表
Figure BDA0004150151780000051
表2实验所需要的核酸序列表
Figure BDA0004150151780000061
上述核酸序列均在生工生物工程(上海)有限公司合成。
2.2方法
2.2.1细胞系来源EVs分离
①细胞传代：弃去原培养基，往培养皿(d＝10cm)中加入2mL PBS，轻轻洗涤2-3次，加入胰酶1mL，静置消化2-3min，随后加入胎牛血清终止消化，再加入1mL培养基，轻轻吹打使细胞脱落，收集细胞悬液，800rpm低速离心3min，然后弃去上清液，加入含10％胎牛血清的DMEM培养基重悬，按1：1传至培养皿(d＝15cm)后置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养；
②细胞饥饿处理以及细胞上清的收集：待细胞生长密度达到60-70％时，弃原培养基，PBS轻轻洗涤，加入不含血清的DMEM基础培养基，饥饿处理12h，再弃去培养基，PBS轻轻洗涤，加入含1-2％ Exo-FBSTM(去外泌体胎牛血清)的DMEM培养基，继续培养48h，最后收集细胞上清；
④细胞上清前处理：3000g离心20min，取上清，16000g离心30min，取上清；
⑤细胞上清超速离心：将前处理完成的上清以离心力为135000g进行超速离心，处理70min，弃去上清，用加入PBS重悬，135000g超速离心70min，最后重悬沉淀，获取MCF7细胞上清来源的EVs。
2.2.2血浆来源EVs分离
从南方医科大学南方医院检验科50名健康志愿者中收集了50mL混合血浆。血浆经PBS以1：1的比例稀释后，3000g离心20min，取上清，16000g离心30min，取上清。随后，将前处理完成的上清以离心力为135000g进行超速离心，处理70min，弃去上清，用加入PBS重悬，135000g超速离心70min，最后重悬沉淀，获取健康人混合血浆来源的EVs。
2.2.3功能化磁珠/苯乙烯微球制备
5μL Ab S9.6与7μL 10mM Sulfo-NHS-LC-Biotin(Thermo Fisher公司)在室温条件下反应30min制备生物素化的Ab S9.6。然后取12μL生物素化AbS9.6用PBS定容至200μL，4℃保存备用。200μL DynabeadsTMMyOneTMStreptavidin C1磁珠(Thermo Fisher公司)用PBS洗涤3次，重悬于200μL生物素化抗体S9.6中。室温孵育30min后，磁珠用PBS洗涤3次，然后用200μL 1％ BSA封闭1h。最后经PBS洗涤数次并重悬于含有0.1％BSA的200μL PBS中制备功能化磁珠。还使用上述步骤制备了功能化聚苯乙烯微球(美国Bangs Laboratories)用于EVs捕获的后续TEM表征。
2.2.4功能化磁珠的活性验证
2μL功能化磁珠与2μL去离子水(阴性对照)、2μL 10μmol DNA1-FAM、2μL 10μmolRNA1-FAM和6μL DNA-RNA杂合体(包含2μL 10μmol DNA1、2μL 10μmol DNA2和2μL 10μmolRNA1-FAM)在50μL PBS中在室温下分别放置1小时。然后，将磁珠用PBS洗涤3次，重悬于100μl PBS中用于流式细胞术分析(BriCyte E6)。
2.2.5 RNA连接链优化
将2μL 10μmol DNA1、2μL 10μmol DNA2以及2μL 10μmol DNA1和2μL 10μmol DNA2的组合与1μL 1μmol RNA1-FAM在50μl PBS中混合，分别在室温下进行DNA-RNA杂交1小时。然后，加入2μl功能化磁珠，在室温下捕获荧光DNA-RNA杂合体1小时。捕获后磁珠经PBS洗涤3次，重悬于100μl PBS中用于流式细胞术分析(BriCyte E6)。上述流程也分别应用RNA2-FAM、RNA3-FAM和RNA4-FAM。
2.2.6生物酶选择
2μL功能化磁珠与2μL去离子水在50μL PBS中室温孵育1h作为阴性对照。2μL功能化磁珠与6μL DNA-RNA杂合体(包含2μL 10μmol DNA1、2μL 10μmol DNA2和1μL 1μmolRNA3-FAM)在50μL PBS中室温孵育1小时作为阳性对照。溶解在相应裂解缓冲液中的5μLDNase I(5U/μL)、1μL RNase A(10mg/mL)和1μL RNase H(约20-60U/μL)分别于阳性对照组中的磁珠孵育1小时，用于酶解荧光DNA-RNA杂合体。随后，磁珠用PBS洗涤3次，重悬于100μLPBS中用于流式细胞术分析(BriCyte E6)评估酶切效果。
2.2.7抗体核酸复合物构建
首先，使用Streptavidin Conjugation Kit-Lightning-
Figure BDA0004150151780000071
(ab102921,Abcam)试剂盒并按照制造商的说明对10μg CD9(0.532mg/mL，ab236630，Abcam)、CD63(ab134045，Abcam)、CD81(ab79559，Abcam)、CD235a(ab134111，Abcam)、CD45(ab208022，Abcam)、CD41a(ab134131，Abcam)和CD144(D87F2，Cell Signaling Technology)抗体进行了修饰。将链霉亲和素修饰的CD9/CD63/CD81抗体与生物素化的DNA1以1:1的比例分别混合，并在室温下孵育1小时以构建抗体-DNA1偶联物。将链霉亲和素连接的CD9/CD63/CD81、CD235a、CD45、CD41a和CD144抗体分别与生物素化DNA2按1:1的比例混合，室温孵育1小时，构建抗体-DNA2偶联物。然后将抗体-DNA复合物用PBS稀释1000倍，每100μL复合物用1μLDynabeadsTMMyOneTMStreptavidin C1(Thermo Fisher公司)在HulaMixer(Thermo Fisher公司)上室温旋转30min，重复8-10次以去除多余的未结合的生物素化DNA寡核苷酸。然后收集纯化的上清液并在使用前储存在4℃。
2.2.8膜蛋白双阳性EVs亚群无损分离富集可行性分析
根据Sigma-Aldrich提供的PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Midi Kit(PKH67)产品手册对超速离心提取的MCF7来源的EVs进行染色，然后与纯化的CD9/CD63/CD81-DNA1和CD9/CD63/CD81-DNA2偶联混合物在室温下孵育1h作为阳性对照。PKH67染料代替PKH67预染色的EVs和去离子水代替抗体-DNA结合物分别被视为阴性对照Ⅰ和阴性对照Ⅱ。接下来，向反应混合物中添加PBS至总体积为500μL，并转移到用于300KD超滤管(OD300C34，Pall)中，然后以13800g离心2分钟两次，以洗去多余的抗体-DNA偶联物。随后，将50μL PBS添加到超滤管中的膜中，并重新悬浮抗体-DNA标记的EVs。然后，将1μL 1μmolRNA3与抗体-DNA标记的EVs混合，在室温下进行DNA-RNA杂交1小时，然后在每组中与2μL功能化磁珠在室温下孵育30分钟。用PBS洗涤3次后，将阳性对照的磁珠与0.25μL RNase H在50μL 1:1000稀释的PBS裂解缓冲液中在室温下孵育40分钟以释放捕获的EVs。最后，将功能化磁珠重悬于100μL PBS中进行流式细胞仪分析(Mindray，BriCyte E6)，荧光显微镜观察和TEM表征以验证该测定的可行性。
2.2.9红细胞、白细胞、血小板和血管上皮细胞来源的膜蛋白双阳性EV的分离、富集和表征
使用不同的抗体组合来实现不同EVs亚群的分离和富集，例如CD9/CD63/CD81-DNA1和CD235a-DNA2用于红细胞来源EVs，CD9/CD63/CD81-DNA1和CD45-DNA2用于白细胞来源EVs，CD9/CD63/CD81-DNA1和CD41a-DNA2用于血小板来源EVs，以及CD9/CD63/CD81-DNA1和CD144-DNA2用于血管上皮细胞来源EVs。膜蛋白双阳性EVs的分离参照上述步骤制备。DNA-RNA杂交后，抗体-DNA-RNA标记的EVs在室温下与200μL功能化磁珠一起孵育30分钟。经PBS洗涤3次后，磁珠与RNase H室温孵育40分钟以释放捕获的EVs。富集的EVs储存在PBS中分别进行了投射电子显微镜(transmission electron microscopy,TEM)和纳米粒子分总分析(nanoparticle tracking analysis,NTA)，以表征特定的EVs亚群。使用功能化的苯乙烯微球替代磁珠拍摄TEM用于表征膜蛋白双阳性EVs的捕获。
TEM分析：已稀释的EVs悬液20-40μL点于铜网静置2min，加20-40μL磷钨酸于铜网上进行负染，静置2min，加PBS洗涤1次。白炽灯下烤20min后在电子显微镜HITACHI H-7650上放大5-8万倍进行观察，找到合适视野拍照。
NTA分析：PBS稀释EVs的悬液至1×107/mL-1×109/mL后，上纳米粒度分析仪NS300(英国马尔文)检测，选取405nm激光作为激光，拍摄持续60s(30frames/s)粒子运动视频，再用NTA software(version2.3,NanoSight)软件对视频进行计算分析，最后输出二维粒径分布图。
2.3实验结果分析
图2为功能化磁珠的活性验证实验结果图。由图2可知，磁珠与荧光DNA单链和荧光RNA单链孵育后均无显著的荧光位移，而与荧光DNA-RNA杂合体孵育后荧光显著位移，证明构建的功能化磁珠可以特异性地捕获DNA-RNA杂合体。
图3为RNA连接链优化实验结果图。由图3可知，随着RNA连接链与DNA1/DNA2互补碱基个数的减少，磁珠捕获的单一DNA链与RNA结合的杂合体逐渐减少(荧光信号逐渐左移)，当RNA3与单一DNA链(DNA1或DNA2)混合，荧光信号相对于阴性对照组并未显著右移，只有当DNA1和DNA2都存在的条件下才会形成DNA-RNA杂合体，致使荧光信号显著右移，而在RNA4实验组中，无论是单一DNA链存在还是两条DNA均存在情况下，磁珠均不能有效捕获，因此证明RNA3符合本发明后续的需求。
图4为生物酶选择实验结果图。由图4可知，DNaseⅠ在一定程度上可以分解DNA-RNA复合物，而RNase A和RNase H均能显著破坏DNA-RNA复合物，考虑到后续EV的生物功能开发或者标志物筛选等应用，拟选择可以特异水解DNA-RNA复合物中RNA部分的RNase H用于后续实验步骤。
图5为膜蛋白双阳性特异EVs亚群分离富集方法的可行性分析实验结果图。其中，Ⅰ为阴性对照组1(DNA1+DNA2+RNA3+PKH67)；Ⅱ为阴性对照组2(PKH67+EVs)；Ⅲ为阳性对照组(DNA1+DNA2+RNA3+PKH67+EVs)；Ⅳ为酶处理组(DNA1+DNA2+RNA3+PKH67+EVs+RNase H)。由图5可知，阴性对照组在流式细胞检测和荧光显微镜下均无荧光信号；阳性对照组则在流式细胞检测和荧光显微镜下均有明显的荧光信号，证明磁珠捕获了膜蛋白双阳性EVs亚群；酶处理组流式细胞检测和荧光显微镜下荧光信号均降低，证明酶切反应释放了磁珠捕获的EVs。
图6为膜蛋白双阳性EVs亚群捕获电镜图。其中，A为乳胶微球捕获的CD9/CD63/CD81+CD235a+EVs亚群；B为乳胶微球捕获的CD9/CD63/CD81+CD45+EVs亚群；C为乳胶微球捕获的CD9/CD63/CD81+CD41a+EVs亚群；D为乳胶微球捕获的CD9/CD63/CD81+CD144+EVs亚群。蓝色箭头指示的是捕获的膜蛋白双阳性EVs。
图7为酶解释放的膜蛋白双阳性EVs亚群形态和粒径表征。其中，A和E分别为酶解释放的CD9/CD63/CD81+CD235a+EVs亚群电镜图和粒径分布图，粒径峰值为159nm；B和F分别为酶解释放的CD9/CD63/CD81+CD45+EVs亚群电镜图和粒径分布图，粒径峰值为87.2nm；C和G分别为酶解释放的CD9/CD63/CD81+CD41a+EVs亚群电镜图和粒径分布图，粒径峰值为170nm；D和H分别为酶解释放的CD9/CD63/CD81+CD144+EV亚群电镜图和粒径分布图，粒径峰值为154.7nm。标尺是100nm。上述结果证明，本发明实施例的方法分离的膜蛋白双阳性EVs可经酶切反应实现富集，并且通过TEM和NTA进行了形态和粒径分布的鉴定表征。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种膜蛋白双阳性特异细胞外囊泡亚群分离富集方法，其特征在于，包括如下步骤：
将待处理的细胞外囊泡样本、两个特异性靶向细胞外囊泡膜蛋白标志物的抗体核酸复合物与能连接两个所述抗体核酸复合物的RNA连接链孵育，得到DNA-RNA杂合体，实现细胞外囊泡双阳性膜蛋白的捆绑；
通过功能化磁珠特异性地捕获所述DNA-RNA杂合体，实现膜蛋白双阳性特异细胞外囊泡亚群的分离，所述功能化磁珠为偶联了能特异识别所述DNA-RNA杂合体的第二抗体的免疫磁珠；
通过酶切核酸链实现膜蛋白双阳性特异细胞外囊泡亚群的富集。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：两个所述抗体核酸复合物分别为第一抗体-DNA1偶联物和第一抗体-DNA2偶联物，所述第一抗体为细胞外囊泡膜蛋白标志物的抗体，所述DNA1的序列如SEQ ID NO.1所示：
TGTGGTCTATGTCGTCGTTCGCTAGTAGTTCCTGGGCTGCAC，
所述DNA2的序列如SEQ ID NO.2所示：
TCGAGGCGTAGAATTCCCCCGATGCGCGCTGTTCT。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述第一抗体选自CD9抗体、CD63抗体、CD81抗体、CD235a抗体、CD45抗体、CD41a抗体、CD144抗体中的至少一种。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述RNA连接链含有若干能与所述DNA1和DNA2的碱基互补的碱基。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述RNA连接链为RNA3，所述RNA3的序列如SEQ ID NO.5所示：
CGCCUCGAGUGCAGCC。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述第二抗体选自Ab S9.6。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述酶为能水解所述DNA-RNA杂合体的核酸内切酶。
8.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于膜蛋白双阳性特异细胞外囊泡亚群分离富集，所述试剂盒包括：
至少两个特异性靶向细胞外囊泡膜蛋白标志物的抗体核酸复合物、能连接所述抗体核酸复合物的RNA连接链、功能化磁珠、核酸内切酶，所述功能化磁珠为偶联了能特异识别DNA-RNA杂合体的第二抗体的免疫磁珠；
所述DNA-RNA杂合体由待处理的细胞外囊泡样本、两个特异性靶向细胞外囊泡膜蛋白标志物的抗体核酸复合物与能连接两个所述抗体核酸复合物的RNA连接链孵育得到。
9.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于膜蛋白双阳性特异细胞外囊泡亚群分离富集，所述试剂盒包括：
至少两个第一抗体、DNA1、DNA2、RNA连接链、第二抗体、磁珠、核酸内切酶，所述第一抗体为细胞外囊泡膜蛋白标志物的抗体，
所述DNA1、DNA2的序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示，所述RNA连接链含有若干能与所述DNA1和DNA2的碱基互补的碱基，
所述第二抗体为能特异识别DNA-RNA杂合体的抗体，
所述核酸内切酶用于水解所述DNA-RNA杂合体。
10.根据权利要求1-7任一项所述的方法、根据权利要求8-9任一项所述的试剂盒在膜蛋白双阳性特异细胞外囊泡亚群分离富集中的应用，所述应用为非疾病检测或治疗目的。
CN202310315720.6A 2023-03-27 2023-03-27 膜蛋白双阳性特异细胞外囊泡亚群分离富集方法、试剂盒及其应用 Pending CN116254225A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310315720.6A CN116254225A (zh) 2023-03-27 2023-03-27 膜蛋白双阳性特异细胞外囊泡亚群分离富集方法、试剂盒及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310315720.6A CN116254225A (zh) 2023-03-27 2023-03-27 膜蛋白双阳性特异细胞外囊泡亚群分离富集方法、试剂盒及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116254225A true CN116254225A (zh) 2023-06-13

Family

ID=86687980

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310315720.6A Pending CN116254225A (zh) 2023-03-27 2023-03-27 膜蛋白双阳性特异细胞外囊泡亚群分离富集方法、试剂盒及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116254225A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105723221B (zh) 分离方法、检测方法、信号测定方法、疾病的判定方法、疾病治疗药的药效评价方法、试剂盒以及液态组合物
US5646001A (en) Affinity-binding separation and release of one or more selected subset of biological entities from a mixed population thereof
Franquesa et al. Update on controls for isolation and quantification methodology of extracellular vesicles derived from adipose tissue mesenchymal stem cells
Wu et al. A PLGA nanofiber microfluidic device for highly efficient isolation and release of different phenotypic circulating tumor cells based on dual aptamers
CN108690832B (zh) 循环肿瘤细胞的捕获及释放方法
WO2009140876A1 (zh) 从生物体液样本中富集与检测稀有细胞的整合方法
JPH08501390A (ja) 特殊細胞集団もしくは混合細胞集団および混合細胞集団を含有する溶液中の特異標的細胞の検出方法
CN110036111A (zh) 用于细胞外分离的基于脂质的探针
CN111073846B (zh) 一种分离组织特异来源细胞外囊泡的方法及其试剂盒
CN111454907A (zh) 一种循环肿瘤细胞快速无损伤捕获、释放和检测试剂盒
CN106366197B (zh) 一种HER2、EGFR、EpCAM、MUC1多重抗体免疫磁珠及其制备方法
WO2019149115A1 (zh) 核酸适配体在识别并结合碱性磷酸酶异源二聚体或肿瘤检测中的应用
CN113774008A (zh) 一种外泌体的提取方法及其应用
CN109913417A (zh) 一种采用快速免疫磁珠法分离脑脊液中不同细胞来源外泌体亚型的方法
CN113186166B (zh) 一种基于刺猬状磁性微球的外泌体富集方法
CN114276992A (zh) 一种完整外泌体分离、纯化试剂盒及检测分析方法
CN116254225A (zh) 膜蛋白双阳性特异细胞外囊泡亚群分离富集方法、试剂盒及其应用
KR20110094475A (ko) 특이적 결합분자―나노섬유 복합체 및 이의 제조방법
US20200149117A1 (en) Kit and method for detecting target-tumor serum aptamer complex
CN115851888A (zh) 一种单囊泡膜蛋白表达谱分析用于多亚群细胞外囊泡计数的方法及其应用
KR102323360B1 (ko) 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플 제조장치 및 제조방법
CN114657184A (zh) 一种多价适体功能化dna纳米结构探针及其制备方法和应用
CN115786349B (zh) 一种用于外周血中杀伤性t淋巴细胞无痕分选的核酸适体、互补序列及其应用
CN106432504B (zh) 一种E-cadherin、Cadherin-11、EpCAM多重抗体免疫磁珠及其制备方法
CN115449511B (zh) 一种基于代谢标记策略的新生肿瘤源外泌体选择性分离方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination