CN105723221B - 分离方法、检测方法、信号测定方法、疾病的判定方法、疾病治疗药的药效评价方法、试剂盒以及液态组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供夹杂物的除去效率优异且具有脂质双层膜的囊泡不易被破坏的具有脂质双层膜的囊泡的分离方法。上述具有脂质双层膜的囊泡的分离方法的特征在于,包含:复合体形成工序,使含有具有脂质双层膜的囊泡的生物体试样与键合有识别存在于上述囊泡表面的表面抗原的配体的固相载体进行接触,形成上述囊泡和上述固相载体的复合体;清洗工序,清洗上述复合体;在非离子性表面活性剂的存在下进行上述复合体形成工序和上述清洗工序中的至少任一工序。
Description
技术领域
本发明涉及分离方法、检测方法、信号测定方法、疾病的判定方法、疾病治疗药的药效评价方法、试剂盒以及液态组合物。更详细而言,涉及外泌体等具有脂质双层膜的囊泡的分离方法,利用了该方法的核酸或者蛋白质的检测方法、信号测定方法、疾病的判定方法、疾病治疗药的药效评价方法、疾病判定或者药效评价用试剂盒以及上述分离方法中使用的液态组合物。
背景技术
囊泡具有脂质双层膜所包围的结构,这样的囊泡中,作为生物体内的体液中存在的囊泡颗粒,已知有外泌体。已知在外泌体的表面,与一般的细胞表面同样地存在各种膜蛋白质,另一方面,也可知在外泌体的内部,除细胞因子等各种蛋白质以外也含有microRNA(miRNA)。
另外,已知从免疫系统的细胞、各种癌细胞等各种细胞分泌外泌体,作为生物体内的细胞间通讯的媒介作用的外泌体的功能,外泌体与生理现象、癌等疾病的相关性受到关注,正在开展这些研究。例如,已经报告使用作为肿瘤标志物的EpCAM的抗体时,从卵巢癌患者的循环血液中分离外泌体,来自外泌体的miRNA表达量与卵巢癌的进展之间具有相关性(非专利文献1)。
另外,作为外泌体上表达的四次跨膜的膜蛋白质,有属于四次跨膜蛋白家族的CD9、CD63以及CD81,非专利文献2中报告了黑色素瘤患者的血浆中的外泌体量比健康人高,这能够用针对CD63的抗体、针对肿瘤相关标志物的Caveolin-1的抗体进行检测·定量化。另外,对离心分离后的血浆样品组合CD63抗体、针对各种膜蛋白质的抗体等进行反应,由此对来自癌患者的外泌体的信号进行定量解析(专利文献1)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开第2010/065968号
非专利文献
非专利文献1:D.D.Taylor.,et al.,Gynecol.Oncol.,110,13-21(2008)
非专利文献2:M.Logozzi.,et al.,PLoS ONE.,4,1-10(2009)
发明内容
然而,作为键合抗体的固相载体的反应液、清洗液、将抗体键合粒子悬浮的缓冲液的功能,要求减少对平板等反应容器、粒子表面的非特异性吸附,减少反应中发生的粒子的凝聚的功能。
然而,用磁性粒子这样的粒子捕捉像上述外泌体那样的被脂质双层膜覆盖的囊泡时,不但容易引起上述非特异性吸附,而且容易产生粒子彼此的凝聚,有时对囊泡的回收率、粒子的清洗效率造成负面影响。如果反应后的抗体键合粒子的清洗不充分,则存在来自检体的夹杂蛋白质混入,外泌体的精制度降低的问题。
因此,要将被脂质双层膜覆盖的囊泡分离时,也需要能够减少对固相载体的非特异性吸附和粒子的凝聚、清洗能力高的缓冲液。
然而,发现即使将一般用于抑制非特异性吸附、粒子凝聚所使用的BSA等蛋白质添加到粒子保存缓冲液、反应缓冲液等中,要将被脂质双层膜覆盖的囊泡分离时,粒子也会凝聚,进而对其后进行的精制外泌体的蛋白质组解析等造成影响。
另外,将被脂质双层膜覆盖的囊泡分离时,还要求对具有脂质双层膜的囊泡的破坏少。
本发明要解决的课题在于提供夹杂物的除去效率优异且具有脂质双层膜的囊泡不易被破坏的具有脂质双层膜的囊泡的分离方法。
因此,本发明人等深入研究,结果发现通过在包括复合体形成工序和清洗工序的具有脂质双层膜的囊泡的分离方法中,在非离子性表面活性剂的存在下进行上述复合体形成工序和上述清洗工序中的至少任一工序,能够解决上述课题,从而完成了本发明,其中,复合体形成工序是使含有具有脂质双层膜的囊泡的生物体试样与键合有识别存在于上述囊泡表面的表面抗原的配体的固相载体接触,形成上述囊泡和上述固相载体的复合体;清洗工序是清洗上述复合体。
即,本发明提供<1>一种具有脂质双层膜的囊泡的分离方法,其特征在于,包括:使含有具有脂质双层膜的囊泡的生物体试样与键合有识别存在于上述囊泡表面的表面抗原的配体的固相载体进行接触,形成上述囊泡和上述固相载体的复合体的复合体形成工序;和清洗上述复合体的清洗工序;在非离子性表面活性剂的存在下进行上述复合体形成工序和上述清洗工序中的至少任一工序。
另外,本发明提供<2>一种囊泡中的核酸的检测方法,其特征在于,在上述<1>的分离方法之后,进一步包含检测囊泡中的核酸的核酸检测工序。
进而,本发明提供<3>一种来自囊泡的蛋白质的检测方法,其特征在于,在上述<1>的分离方法之后,进一步包含对在囊泡的内侧和表面的至少一方存在的蛋白质进行检测的蛋白质检测工序。
进而,本发明提供<4>一种来自囊泡的信号测定方法,其特征在于,在上述<1>的分离方法之后,进一步包含对来自形成上述复合体的囊泡的信号强度进行测定的信号测定工序。
进而,本发明提供<5>一种疾病的判定方法,其特征在于,是判定被检者是否发病的方法,包含使用来自被检者的生物体试样,利用上述<4>的信号测定方法对来自形成上述复合体的囊泡的信号强度进行测定的工序。
进而,本发明提供<6>一种疾病治疗药的药效评价方法,其特征在于,是疾病治疗药的药效评价方法,包含使用疾病治疗药的给予前以及给予后的来自被检者的生物体试样,利用上述<4>的信号测定方法对来自形成上述复合体的囊泡的信号强度进行测定的工序。
进而,本发明提供<7>一种试剂盒,其特征在于,具备键合有识别存在于具有脂质双层膜的囊泡的表面的表面抗原的配体的固相载体和含有非离子性表面活性剂的液态组合物。
进而,本发明提供<8>一种液态组合物,其特征在于,含有非离子性表面活性剂,在具有脂质双层膜的囊泡的分离方法中使用,用于清洗上述复合体,上述具有脂质双层膜的囊泡的分离方法包含:使含有具有脂质双层膜的囊泡的生物体试样与键合有识别存在于上述囊泡表面的表面抗原的配体的固相载体接触,形成上述囊泡和上述固相载体的复合体的复合体形成工序;清洗上述复合体的清洗工序。
就本发明的具有脂质双层膜的囊泡的分离方法而言,夹杂物的除去效率优异,并且,具有脂质双层膜的囊泡不易被破坏。
另外,将本发明的试剂盒、液态组合物用于具有脂质双层膜的囊泡的分离时,夹杂物充分被除去,并且,具有脂质双层膜的囊泡不易被破坏。
附图说明
图1是表示非离子性表面活性剂对键合于粒子的抗体与外泌体的反应的影响的图。
图2是表示含有非离子性表面活性剂的清洗缓冲液的清洗能力的银染色图像。
图3是表示含有非离子性表面活性剂的清洗缓冲液难以从键合于粒子的抗体剥离外泌体的Western印迹图像。
图4是表示用键合了抗CD63抗体的磁性粒子捕捉的外泌体的粒径不成为问题的粒度分布的波形。
图5是表示用各抗体键合磁性粒子捕捉的外泌体的粒径不成为问题的粒度分布的图。
图6是表示用抗CD9抗体键合磁性粒子捕捉的外泌体的形态没有问题的透射式电子显微镜像。
图7是表示能够从用抗体键合磁性粒子捕捉的外泌体中检测核酸的生化分析仪的解析图。
图8是表示能够对从抗体键合磁性粒子捕捉的外泌体中的microRNA进行定量的扩增曲线。
图9是表示能够从用抗体键合磁性粒子捕捉的囊泡检测来自囊泡的内侧和表面的蛋白质的Western印迹图像。
图10是表示利用抗体键合磁性粒子得到的囊泡的捕捉量与反应的囊泡的量成比例的Western印迹图像。
图11是表示能够检测来自用抗体键合磁性粒子从各种培养上清液和体液中捕捉的囊泡的表面蛋白质的Western印迹图像。
具体实施方式
〔具有脂质双层膜的囊泡的分离方法〕
本发明的具有脂质双层膜的囊泡的分离方法,其特征在于,包含:使含有具有脂质双层膜的囊泡的生物体试样与键合有识别存在于上述囊泡表面的表面抗原的配体的固相载体接触,形成上述囊泡和上述固相载体的复合体的复合体形成工序;和清洗上述复合体的清洗工序,在非离子性表面活性剂的存在下进行上述复合体形成工序和上述清洗工序中的至少任一工序。
(非离子性表面活性剂)
作为本发明的分离方法中使用的非离子性表面活性剂,优选在分子中不含有芳香族基团。通过使用这样的在分子中不含有芳香族基团的非离子性表面活性剂,从而能够在不破坏构成外泌体等囊泡的脂质双层膜的情况下,减少夹杂物对固相载体的非特异性吸附。另外,囊泡与固相载体的捕捉反应的反应性提高。并且,也能够抑制精制的外泌体对蛋白质组解析等的影响。
作为上述的在分子中不含有芳香族基团的非离子性表面活性剂,可举出聚乙二醇型非离子性表面活性剂,对甘油、季戊四醇等多元醇加入疏水性基团而得的多元醇型非离子性表面活性剂。
作为上述聚乙二醇型非离子性表面活性剂,只要是具有聚环氧乙烷链作为亲水性基团,就没有特别限定,可举出聚亚烷基二醇环氧乙烷加成物、多元醇脂肪酸酯环氧乙烷加成物、高级醇环氧乙烷加成物、脂肪酸环氧乙烷加成物、高级烷基胺环氧乙烷加成物、脂肪酸酰胺环氧乙烷加成物、油脂的环氧乙烷加成物等。
其中,从非特异性吸附减少效果、对囊泡的损伤少方面考虑,优选聚亚烷基二醇环氧乙烷加成物、多元醇脂肪酸酯环氧乙烷加成物。
作为上述聚亚烷基二醇环氧乙烷加成物,优选嵌段共聚型,更优选具有由聚环氧乙烷构成的嵌段(以下,也称为嵌段A)和由聚氧化亚烷基构成的上述亚烷基的碳原子数为3以上的嵌段(以下,也称为嵌段B)的嵌段共聚物。另外,作为嵌段B中含有的亚烷基氧基的碳原子数,优选3~6,更优选3或者4,特别优选3。应予说明,嵌段B中含有的亚烷基氧基的碳原子数为3的聚亚烷基二醇环氧乙烷加成物为聚丙二醇环氧乙烷加成物。
另外,作为嵌段A的合计含量,在嵌段共聚物中,优选15~99质量%,更优选50~99质量%,进一步优选60~95质量%,特别优选70~90质量%。
另外,作为嵌段B的合计含量,从细胞毒性的观点考虑,在嵌段共聚物中,优选1~85质量%,更优选1~50质量%,进一步优选5~40质量%,特别优选10~30质量%。
应予说明,这些含量可以用NMR等进行测定,嵌段A为2个以上时,表示2个以上的嵌段A的各含量的合计值。同样地嵌段B为2个以上时,为2个以上的嵌段B的各含量的合计值。
这样的聚亚烷基二醇环氧乙烷加成物中,优选普朗尼克型非离子性表面活性剂等所例示的那样的具有以2个嵌段A夹着嵌段B的结构的ABA型三嵌段共聚物。
作为聚亚烷基二醇环氧乙烷加成物的市售品,例如,可举出Pluronic F-68、Pluronic L-62(均为ADEKA制)等。
另外,作为上述多元醇脂肪酸酯环氧乙烷加成物,优选山梨糖醇酐脂肪酸酯的环氧乙烷加成物、山梨糖醇脂肪酸酯的环氧乙烷加成物,更优选山梨糖醇酐脂肪酸酯的环氧乙烷加成物。
另外,多元醇脂肪酸酯环氧乙烷加成物中的“脂肪酸”可以是不饱和脂肪酸、饱和脂肪酸中的任一种。另外,脂肪酸可以是直链状,也可以是支链状,但优选为直链状。另外,脂肪酸的碳原子数优选8~18,更优选为10~20,进一步优选为12~18。具体而言,可举出月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸等。
作为多元醇脂肪酸酯环氧乙烷加成物的市售品,例如,可举出Tween20、Tween40、Tween60、Tween65、Tween80、Tween85(均为和光纯药制)等。
另外,作为对多元醇加入疏水性基团而得的多元醇型非离子性表面活性剂,可举出甘油的脂肪酸酯、季戊四醇的脂肪酸酯、山梨糖醇或者山梨糖醇酐的脂肪酸酯、蔗糖的脂肪酸酯、多元醇的烷基醚、烷醇胺类的脂肪酸酰胺等。其中,优选具有脂肪酸残基作为疏水性基团的多元醇型非离子性表面活性剂。应予说明,脂肪酸残基优选与上述多元醇脂肪酸酯环氧乙烷加成物中含有的脂肪酸残基相同的基团。
具有这样的脂肪酸残基的多元醇型非离子性表面活性剂中,优选山梨糖醇或者山梨糖醇酐的脂肪酸酯,更优选山梨糖醇酐脂肪酸酯。
另外,上述的在分子中不含有芳香族基团的非离子性表面活性剂中,从非特异性吸附减少效果、对囊泡的损伤少方面考虑,优选聚乙二醇型非离子性表面活性剂,更优选聚亚烷基二醇环氧乙烷加成物、多元醇脂肪酸酯环氧乙烷加成物,进一步优选聚亚烷基二醇环氧乙烷加成物。
应予说明,非离子性表面活性剂可以单独使用1种,也可以组合2种以上使用。
另外,聚亚烷基二醇环氧乙烷加成物以外的非离子性表面活性剂的HLB(Hydrophile-Lipophile Balance)值优选为13.1以上,更优选13.5以上。
应予说明,本说明书中,HLB值表示Griffin的亲水亲油平衡值,表示表面活性剂对水、油的亲和性的程度的值。例如,Tween20的HLB值为16.7,Tween80的HLB值为15.0。另外,属于含有芳香族基团的非离子性表面活性剂的TritonX-100的HLB值为13.5,Nonidet P-40的HLB值为13.1。
另外,从细胞毒性的观点考虑,作为非离子性表面活性剂的重均分子量,优选500~50000,更优选1000~30000,进一步优选2000~20000。
应予说明,重均分子量可以用液相色谱、NMR、MALDI-TOF/MS等测定。
非离子性表面活性剂的浓度相对于体系内的液相的总量(从生物体试样、缓冲液等的总容积中减去固相载体等固体成分的量)以终浓度计,优选为0.005%(w/v)以上,更优选为0.01%(w/v)以上,进一步优选为0.015%(w/v)以上,特别优选为0.02%(w/v)以上,另外,优选为10%(w/v)以下,更优选为5%(w/v)以下,进一步优选为3.5%(w/v)以下,特别优选为2%(w/v)以下。应予说明,在复合体形成工序、清洗工序中均优选上述的终浓度。
如果非离子性表面活性剂的浓度在上述的数值的范围内,则非特异性吸附减少效果优异,固相载体为粒子的情况下防止凝聚的作用优异。另外,不阻碍配体与表面抗原之间的结合。
另外,本发明中,可以在非离子性表面活性剂的存在下进行复合体形成工序和清洗工序中的任一工序,也可以在非离子性表面活性剂的存在下进行复合体形成工序和清洗工序这两方。另外,可以在复合体形成工序之前,预先将含有非离子性表面活性剂的缓冲液等组合物添加到生物体试样中而使用。
具体而言,固相载体为平板、纤维状而不分散在液相中的形状的情况下,非离子性表面活性剂可以以复合体形成工序时的液相中、清洗工序中使用的清洗液中等的形式添加到体系内。另外,固相载体以磁性粒子这样的粒子状分散在液相中的情况下,优选预先添加到向作为检体的生物体试样添加前的粒子分散液中而使用,或添加到调整生物体试样的缓冲液中、清洗工序中使用的清洗液中等。
例如,通过在抗体键合粒子的保存缓冲液中添加非离子性表面活性剂,与BSA、其他聚合物相比,提高粒子状的固相载体的分散性,能够减少凝聚和对保存容器、反应容器的非特异性吸附。另外,通过在清洗缓冲液中添加非离子性表面活性剂,能够在不破坏动物细胞、外泌体等囊泡的情况下显著减少来自检体的非特异成分的吸附,使用在分子中不含有芳香族基团的非离子性表面活性剂时,也能够将抗体键合粒子的清洗能力提高到与作为具有芳香族基团的非离子性表面活性剂的Triton X-100同等的水平。
(复合体形成工序)
复合体形成工序是使含有具有脂质双层膜的囊泡的生物体试样与键合有识别存在于囊泡表面的表面抗原的配体的固相载体接触,形成囊泡和固相载体的复合体的工序。通过上述接触,囊泡被配体捕捉,形成囊泡和固相载体的复合体。应予说明,复合体形成工序的反应体系中,在与上述固相载体键合的配体以外,还可以共存识别存在于具有脂质双层膜的囊泡的表面的表面抗原的配体。
上述生物体试样只要是含有具有脂质双层膜的囊泡,就没有特别限定,例如,可举出体液、菌体液、细胞培养的培养基、细胞培养上清液、组织细胞的粉碎液等各种液体。其中,优选体液、细胞培养上清液。作为体液,可举出全血、血清、血浆、血液成分、各种血细胞、血块、血小板等血液组成成分,以及尿、精液、母乳、汗、间质液、间质性淋巴液、骨髓液、组织液、唾液、胃液、关节液、胸膜液、胆汁、腹水、羊水等,优选血液组成成分、尿。采用本发明的分离方法,能够选择性且高效地从广泛种类的生物体试样分离出囊泡。例如,使用血浆、血清作为生物体试样时,也不易发生非特异性吸附。
应予说明,血液组成成分可以用柠檬酸、肝素、EDTA等抗凝剂进行处理。
上述生物体试样,可以预先添加到含有非离子性表面活性剂的缓冲液组合物等中进行预先前处理而使用,但也可以直接使用从生物体采取的试样。即,采用本发明的分离方法,也能够不进行利用PEG沉淀法、采用超离心机等的分离法等的前处理而简便地进行选择性分离。
另外,作为上述具有脂质双层膜的囊泡,可举出细胞、从细胞向细胞外放出的外泌体这样的囊泡,本发明的分离方法特别优选用于囊泡为外泌体的情况。一般而言,固相载体为磁性粒子这样的粒子状的情况下,介由键合于粒子的抗体捕捉外泌体时,粒子彼此容易凝聚,粒子的再分散变得困难,因此有时夹杂物的冲洗变得困难,但本发明中,可以通过添加非离子性表面活性剂来减少粒子彼此的凝聚。
另外,在囊泡的表面存在的表面抗原只要是在囊泡的表面存在的物质且具有抗原性,就没有特别限定。举出外泌体的表面抗原为例,可举出CD9、CD63、CD81等四跨膜蛋白超家族类;MHCI、MHCII等抗原呈递相关蛋白;整合素、ICAM-1、EpCAM等粘接分子;EGFRvIII、TGF-β等细胞因子/细胞因子受体、酶类等。其中,优选存在于外泌体表面的抗原蛋白质。
另外,上述生物体试样的使用量相对于体系内的液相的总量(从生物体试样、缓冲液等的总容积中减去固相载体等固体成分的量)以终浓度计,优选1~90%(w/v),更优选10~50%(w/v)。
另外,本发明的分离方法中使用的固相载体只要是键合有识别存在于囊泡表面的的表面抗原的配体的固相载体,就没有特别限定。
作为配体,优选识别存在于囊泡表面的表面抗原的抗体,更优选识别存在于外泌体表面的抗原蛋白质的抗体。另外,可以是单克隆抗体,也可以是多克隆抗体,但优选单克隆抗体。
上述单克隆抗体,没有特别限定,可以根据公知的方法,例如K.Watanabe et al.,Vasohibin as an endothelium-derived negative feedback regulator ofangiogenesis,J.Clin.Invest.114(2004),898-907中记载的方法制备。另外,识别外泌体的表面抗原CD9、CD63、CD81等四跨膜蛋白超家族类的单克隆抗体可以参照国际公开第2013/099925号公报等制造。
应予说明,作为上述抗体的种类,可举出IgG、IgM,优选IgG。另外,可以使用将它们低分子化的片段。例如,可举出F(ab’)2、Fab’、Fab等。
作为键合上述配体的固相载体的材质,例如,可举出聚苯乙烯类、聚乙烯类、聚丙烯类、聚酯类、聚(甲基)丙烯腈类、苯乙烯-丁二烯共聚物、聚(甲基)丙烯酸酯类、氟树脂、交联葡聚糖、多糖等高分子化合物;玻璃;金属;磁性体;含有磁性体的树脂组合物;它们的组合等。
另外,固相载体的形状没有特别限定,例如,可举出托盘状、球状、粒子状、纤维状、棒状、盘状、容器状、池(セル)、微型板、试验管等。
本发明中,从固液分离、清洗的容易性的观点考虑,优选磁性粒子。
作为上述磁性粒子,例如,可举出四氧化三铁(Fe3O4)、三氧化二铁(γ-Fe2O3)、各种铁氧体、铁、锰、镍、钴、铬等金属;由钴、镍、锰等的合金构成的磁性体微粒;树脂中含有这些磁性体的磁性粒子。作为树脂,可举出疏水性聚合物、亲水性聚合物等。
其中,优选树脂中含有磁性体的磁性粒子,更优选在含有超顺磁性微粒的母粒的表面形成有聚合物层的磁性粒子。例如,可举出日本特开2008-32411号公报记载的通过在含有超顺磁性微粒的母粒的表面形成疏水性的第1聚合物层,在该第1聚合物层上形成至少在表面具有缩水甘油基的第2聚合物层,对该缩水甘油基进行化学修饰而导入了极性基团的磁性粒子。
这里,作为超顺磁性微粒,代表性的是粒径20nm以下(优选粒径5~20nm)的氧化铁系的微粒,可举出由XFe2O4(X=Mn,Co,Ni,Mg,Cu,Li0.5Fe0.5等)表示的铁氧体、由Fe3O4表示的磁铁矿、γ-Fe2O3,从饱和磁化强且残留磁化少的方面考虑,优选含有γ-Fe2O3和Fe3O4中任一方。
另外,用于形成上述疏水性的第1聚合物层的单体,大致分为单官能性单体、交联性单体。
作为上述单官能性单体,例如,可以例示苯乙烯、α-甲基苯乙烯、卤代苯乙烯等的芳香族乙烯基系单体;丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸乙酯、丙烯酸硬脂酯、甲基丙烯酸硬脂酯、丙烯酸环己酯、甲基丙烯酸环己酯、丙烯酸异冰片酯、甲基丙烯酸异冰片酯等烯键式不饱和羧酸烷基酯系单体。
另外,作为上述交联性单体,可以例示乙二醇二丙烯酸酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、季戊四醇三丙烯酸酯、季戊四醇三甲基丙烯酸酯、二季戊四醇六丙烯酸酯、二季戊四醇六甲基丙烯酸酯等多官能性(甲基)丙烯酸酯;丁二烯、异戊二烯等共轭二烯以及二乙烯基苯、邻苯二甲酸二烯丙酯、丙烯酸烯丙酯、甲基丙烯酸烯丙酯等。
另外,用于形成上述第2聚合物层的单体以向粒子表面导入官能团为主要目的,包括含有缩水甘油基的单体。作为含有缩水甘油基的单体的含量,在用于形成第2聚合物层的单体中,优选20质量%以上。这里,作为含有缩水甘油基的共聚性单体,可举出丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、烯丙基缩水甘油基醚等。
作为对第2聚合物层的缩水甘油基进行化学修饰而导入的极性基团,优选可与配体反应的官能团,更优选含有1个以上选自氧原子、氮原子和硫原子中的至少1种原子。其中,更优选氨基、醛基、羧基、活性酯基。特别是磁性粒子的第2聚合物层具有上述极性基团和2,3-二羟基丙基时,与配体的键合性良好。
作为将配体与固相载体键合的方法,可使用物理吸附法,共价键法、离子键法之类的化学键合的方法等。作为物理吸附法,可举出将配体直接固定于固相载体的方法、与白蛋白等其他蛋白质化学键合后吸附而固定的方法等。作为化学键合的方法,可举出利用导入到固相载体表面的可与配体反应的官能团直接键合在固相载体上的方法;在固相载体与配体之间以化学键导入间隔分子(碳二亚胺化合物等)后进行键合的方法;使配体与白蛋白等其他蛋白质键合后,将该蛋白质与固相载体化学键合的方法等。
另外,键合有上述配体的固相载体的使用量相对于体系内的液相的总量(从生物体试样、缓冲液等的总容积减去固相载体等固体成分的量)以终浓度计,优选0.005~5%(w/v),更优选0.01~1%(w/v)。
复合体形成工序,除了上述各成分之外,根据需要还可以使用盐类、白蛋白等蛋白质、前述的非离子性表面活性剂以外的表面活性剂等,但如果考虑之后的分析等,则优选不使用蛋白质、核酸。
复合体形成工序中的反应温度通常为2~42℃的范围内,反应时间通常为5分钟~24小时。在2~8℃进行反应时,反应时间优选为8~30小时左右,在室温(20℃)~42℃进行反应时,反应时间优选为5~60分钟左右。
复合体形成工序中,体系中的pH没有特别限定,但优选为pH5~10的范围,更优选为pH6~8的范围。为了维持目标pH,通常使用缓冲液,例如,可举出磷酸缓冲液、三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液等。
(清洗工序)
清洗工序是对上述复合体形成工序中形成的囊泡和固相载体的复合体进行清洗的工序。由此,除去未反应的成分、未反应的标记物质等。可以直接清洗复合体形成工序中的含有复合体的体系。
上述清洗工序通常根据固相载体的形状分为两种。像磁性粒子那样固相载体为粒子状时,可举出例如使磁性粒子分散在清洗液中进行清洗的方法,另一方面,固相载体为微孔板那样的形态时,可举出使清洗液接触其表面进行清洗的方法。不论是哪一种状态,本发明中,作为清洗液,优选使用含有上述在分子中不含有芳香族基团的非离子性表面活性剂的清洗液。
另外,固相载体为磁性粒子时,作为清洗工序,优选包含通过磁力将磁性粒子聚集而使磁性粒子与液相分离的集磁工序,和使该集磁工序中分离的磁性粒子分散在清洗液中的分散工序。由此,能够从磁性粒子表面更高效地将未反应的物质、生物体试样中的夹杂物清洗、分离除去。
具体而言,如下进行即可:使磁场作用于反应容器,使磁性粒子附着于反应容器壁而聚集后,除去反应上清液,进一步根据需要加入清洗液,同样地使磁场作用后除去上清液,反复上述操作。
作为清洗液,优选含有上述在分子中不含有芳香族基团的非离子性表面活性剂和上述复合体形成工序中举出的缓冲液的清洗液。清洗液的pH优选为pH5~10的范围,更优选为pH6~8的范围。具体而言,可举出含有0.01%非离子性表面活性剂的TBS等。
(解离工序)
本发明的分离方法在上述清洗工序后,还可以具有从配体解离被捕捉到的囊泡的解离工序。
配体为特定的抗体时,作为将抗原·抗体反应所致的特异性结合解离的条件,已知以亲和层析等进行的各种解离(例如,参照“Afinity Chromatography principles&methods”Pharmacia LKB Biotechnology)。上述解离工序可以据此进行。即,作为本发明中使用的解离液,可举出盐酸、硫酸、丙酸、乙酸、甘氨酸/盐酸缓冲液等酸性溶液;氢氧化钠水溶液、氢氧化钾水溶液、氨水溶液、二乙胺等碱性溶液;3M氯化钠水溶液、4.5M氯化镁水溶液等高离子强度溶液;含有SDS、TritonX-100、Tween20等表面活性剂的溶液;含有二烷、乙二醇等降低极性的物质的缓冲液;含有三氯乙酸、硫氰酸等离液离子和尿素、盐酸胍等的缓冲液。
〔核酸的检测方法和蛋白质的检测方法〕
本发明的囊泡中的核酸的检测方法是在上述分离方法之后,进一步包含对囊泡中的核酸进行检测的核酸检测工序。
另外,本发明的来自囊泡的蛋白质的检测方法是在上述分离方法之后,进一步包含对在囊泡的内侧和表面的至少一方存在的蛋白质进行检测的蛋白质检测工序。
这些检测方法除了进行上述分离方法以外,根据常规方法进行即可。上述具有脂质双层膜的囊泡为外泌体时,根据PCR法、电泳法、Western印迹法、免疫化学的方法等公知的方法从回收的外泌体检测核酸、蛋白质。另外,作为核酸,可举出miRNA、mRNA。
特别是,外泌体从各种细胞例如免疫系统的细胞、各种癌细胞分泌,所以采用本发明的核酸的检测方法,检测来自外泌体的核酸(特别是miRNA等),对其进行解析,由此能够进行生理现象、各种疾病的判定。
〔信号测定方法〕
本发明的来自囊泡的信号测定方法是在上述分离方法之后,进一步包含对来自形成上述复合体的囊泡的信号强度进行测定的信号测定工序。
上述信号强度的测定根据免疫测定法进行即可,例如,可举出酶免疫测定法(EIA)、酶联免疫分析法(ELISA)、荧光免疫测定法(FIA)、放射线免疫测定法(RIA)、发光免疫测定法、免疫印迹法、Western印迹法等,从能够简便且灵敏度好地检测抗体的方面考虑,优选ELISA法。作为ELISA法,可举出竞争法、夹心法等。
这里,示出使用夹心ELISA法时的分离方法的一个例子。首先,将识别存在于囊泡表面的表面抗原的配体与固相载体键合后,使含有具有脂质双层膜的囊泡的生物体试样接触而形成复合体,其后进行清洗。向其添加对单克隆抗体或其抗体片段、疾病特异性膜蛋白质抗体或其抗体片段进行了修饰的标记抗体,形成更进一步的复合体。接着,通过检测形成的复合体中的标记量,能够测定来自于生物体试样所含的囊泡的信号量、生物体试样所含的疾病特异性囊泡量。
〔疾病的判定方法〕
用于判定本发明的被检者是否发病的方法的特征在于,包含使用来自被检者的生物体试样,利用上述信号测定方法对来自形成上述复合体的囊泡的信号强度进行测定的工序(以下,也称为工序(I))。
接着,将工序(I)中测定的信号强度与来自对照者的生物体试样的信号强度进行对比,认为被检者的信号强度比对照者的信号强度强时,即可判定为被检者发病(以下,也称为工序(II))。
作为能够用本发明的疾病的判定方法判定的疾病,可例示癌症疾病(大肠癌、乳腺癌、子宫内膜癌、宫颈癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、食道癌、肝癌、肺癌、肾癌、皮肤癌等)、炎症类疾病(风湿病、骨关节炎、肾脏疾病、胰腺炎、肝炎、过敏等)、阿尔茨海默氏症等神经退行性疾病、脑部疾病、免疫缺陷相关的疾病、不孕症、抑郁症、自闭症等精神疾病、帕金森氏病等难治性疾病、自身免疫性疾病、循环系统疾病、血液病、消化系统疾病、伴随衰老的疾病、感染症等。其中,对癌症疾病、免疫系统疾病的判定有用,特别是对癌症疾病的判定特别有用。
另外,如果应用于细胞障碍性T细胞(CTL)的免疫活性的指标,也能够应用于癌症疫苗对癌症疾病的效果判定。
工序(I)除用上述信号测定方法进行测定以外,根据常规方法进行即可。
另外,工序(II)针对工序(I)中测定的信号强度,基于来自对照者的生物体试样的信号进行统计学解析来进行比较。解析方法没有特别限定,可以使用公知的方法。另外,其后的判定,例如来自被检者的生物体试样的信号比对照者的信号强时,判断为发病的可能性高。应予说明,本发明中,对照者是未发病的与被检者同年龄·同性别的人的平均,对照者的信号强度可以与被检者的信号强度一起进行测定,也可以使用由另外预先测定的值得到的统计值。
〔疾病治疗药的药效评价方法〕
本发明的疾病治疗药的药效评价方法的特征在于,包含使用疾病治疗药给予前和给予后的来自被检者的生物体试样,利用上述信号测定方法对来自形成复合体的囊泡的信号强度进行测定的工序(以下,也称为工序(A))。
接着,认为来自疾病治疗药给予后的被检者的生物体试样中的来自复合体的信号强度比来自疾病治疗药给予前的被检者的生物体试样中的来自复合体的信号强度弱时,可以判定疾病治疗药显示药效的可能性高(以下,也称为工序(B))。
作为上述疾病治疗药,可举出治疗可用上述判定方法判定的疾病的药物。合适的具体例是抗癌剂、抗免疫系统疾病药。
工序(A)除了用上述信号测定方法进行测定以外,可以根据常规方法进行。
另外,工序(B)是对工序(A)中测定的信号强度,基于疾病治疗药给予前的生物体试样中的信号进行统计学解析而进行比较。解析方法没有特别限定,可以使用公知的方法。另外,其后的判定,例如疾病治疗药给予后的生物体试样的信号量比给予前的生物体试样的信号量少时,判断为该药具有抑制疾病的效果的可能性高。
特别是外泌体由各种细胞例如免疫系统的细胞、各种癌细胞分泌,因此认为通过测定在疾病治疗药的给予前后的血中外泌体的变化(除了存在量的增减,还包括膜蛋白质的量的变动),能够评价在患者中的药效。另外,例如,如果组合针对癌细胞特异性膜蛋白质的配体和针对外泌体的表面抗原的配体,能够期待癌症诊断的特异性的提高、癌症种类的确定等,进而能够开发对癌症疾病特异性的诊断药。
〔试剂盒〕
本发明的试剂盒的特征在于,具备固相载体和液态组合物,所述固相载体键合有识别存在于具有脂质双层膜的囊泡的表面的表面抗原的配体,所述液态组合物含有非离子性表面活性剂。这种试剂盒对上述分离方法、上述疾病的判定、上述疾病治疗药的药效评价有用。
作为固相载体、液态组合物所含有的非离子性表面活性剂,可举出与上述分离方法中使用的物质相同的物质。非离子性表面活性剂的浓度相对于液态组合物总量,优选0.005~10%(w/v),更优选0.02~2%(w/v)。另外,液态组合物的pH没有特别限定,优选为pH5~10的范围,更优选为pH6~8的范围。为了维持目标pH,通常使用缓冲液,例如,可举出磷酸缓冲液、三(羟基甲基)氨基甲烷缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液等。
〔液态组合物〕
本发明的液态组合物的特征在于,含有非离子性表面活性剂,在具有脂质双层膜的囊泡的分离方法中使用,用于清洗复合体,该具有脂质双层膜的囊泡的分离方法包含:使含有具有脂质双层膜的囊泡的生物体试样与键合有识别存在于囊泡的表面的表面抗原的配体的固相载体接触,形成囊泡和固相载体的复合体的复合体形成工序;和清洗复合体的清洗工序。
本发明的液态组合物的组成、pH与上述本发明的试剂盒所具备的液态组合物相同。
本发明的液态组合物在本发明的分离方法中使用。
实施例
以下,举出实施例对本发明进行详细说明,本发明不限于这些实施例。
(试验例1凝聚确认试验(1))
首先,准备Tris缓冲生理食盐水(TBS,pH7.4)作为对照的缓冲液,准备以浓度为0.1%(w/v)的方式将非离子性表面活性剂(聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇PluronicF-68(ADEKA,以下相同))添加到TBS(pH7.4)中而得的混合液作为实施例1的缓冲液。
接着,向上述各缓冲液以浓度为0.1%(w/v)的方式添加抗CD63抗体键合磁性粒子(Exosome-Dynabeads Human CD63Isolation/Detection,Life technologies公司制Ref10606D),将该粒子保存缓冲液100μL和含有外泌体的HT29细胞的培养上清液(用TBS将100倍浓缩液稀释5倍)100μL加入1.5mL管中进行混合。将其在25℃振动1小时后,通过目视观察确认附着于管的内壁面的抗体键合磁性粒子的凝聚体。将结果示于表1。
[表1]
缓冲液组成 | 粒子凝聚体 | |
对照 | TBS | + |
实施例1 | 0.1%(w/v)Pluronic F68、TBS | - |
+:确认粒子凝聚体、-:未确认粒子凝聚体
如表1所示,仅在TBS中悬浮磁性粒子时(对照),确认磁性粒子凝聚体附着在内壁面,但在TBS中添加0.1%(w/v)的非离子性表面活性剂而悬浮磁性粒子时(实施例1),未确认该凝聚体的附着。
(试验例2凝聚确认试验(2))
首先,准备TBS(pH7.4)作为对照的缓冲液,作为实施例2~7的缓冲液,准备以成为下述表2所示的浓度的方式将非离子性表面活性剂(聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇Pluronic F-68)添加到TBS(pH7.4)中而得的混合液,作为比较例1和2的缓冲液,以成为下述表2所示的浓度的方式将牛血清白蛋白(BSA)添加到TBS(pH7.4)中而得的混合液。
接着,向上述各缓冲液以浓度为0.2%(w/v)的方式添加键合了抗EpCAM抗体(JSRLife Sciences公司制,以下相同)的磁性粒子(JSR Life Sciences公司制MS300/Carboxyl,以下相同),将该粒子保存缓冲液100μL和含有外泌体的HT29细胞的培养上清液(用TBS将100倍浓缩液稀释5倍)100μL加入到1.5mL管中并混合。将其在25℃振动1小时后,通过目视观察确认附着于管的内壁面的抗体键合磁性粒子的凝聚体。将结果示于表2。
[表2]
缓冲液组成 | 粒子凝聚体 | |
对照 | TBS | + |
比较例1 | 0.1%(w/v)BSA、TBS | + |
比较例2 | 0.1%(w/v)BSA、TBS | + |
实施例2 | 0.02%(w/v)Pluronic F68、TBS | - |
实施例3 | 0.05%(w/v)Pluronic F68、TBS | - |
实施例4 | 0.1%(w/v)Pluronic F68、TBS | - |
实施例5 | 0.2%(w/v)Pluronic F68、TBS | - |
实施例6 | 0.5%(w/v)Pluronic F68、TBS | - |
实施例7 | 1.0%(w/v)Pluronic F68、TBS | - |
+:确认粒子凝聚体、-:未确认粒子凝聚体
如表2所示,抗EpCAM抗体键合磁性粒子中,仅在TBS中悬浮时(对照),确认了磁性粒子的凝聚体附着于壁面的情况。另外,即便添加BSA该凝聚也不减少(比较例1、2)。
另一方面,在TBS中添加0.02~1.0%(w/v)的非离子性表面活性剂而悬浮时(实施例2~7),未确认该凝聚体的附着。
应予说明,将抗EpCAM抗体变为抗CD9抗体(Abcam公司制ab2215,以下相同)或者抗CD63抗体(JSR Life Sciences公司制,以下相同),除此以外,与上述试验例2同样地进行试验,结果得到与试验例2相同的结果。
(试验例3添加非离子性表面活性剂对反应的影响)
在96孔白色板(Corning公司制)中分别加入(i)含有键合了抗CD9抗体、抗CD63抗体、抗CD81抗体或者抗EpCAM抗体的磁性粒子(JSR Life Sciences公司制MS300/Carboxyl)0.05%(w/v)和非离子性表面活性剂(Pluronic F-68)1.0%(w/v)的TBS、(ii)用碱性磷酸酶对与上述(i)相同的抗体进行了标记的抗体的MES溶液(1μg/mL)、(iii)HT29细胞的培养上清液(用TBS将100倍浓缩液稀释100倍)各25μL进行混合。将其在25℃振动20分钟后,边集磁边使用清洗缓冲液(含有0.01%(w/v)Tween20的TBS)进行清洗反应后的抗体键合磁性粒子。添加50μL发光底物(LUMIPULSE底物溶液),5分钟后使用发光测定机(Promega公司制GloMax)测定发光强度。
另外,对将上述(i)的粒子悬浮液中的非离子性表面活性剂(Pluronic F-68)的浓度从1.0%(w/v)改变为0%(w/v)、0.01%(w/v)、0.02%(w/v)、0.05%(w/v)、0.1%(w/v)、0.2%(w/v)、0.5%(w/v)而得到的粒子保存缓冲液也与上述同样地测定发光强度。
将这些结果示于图1。
如图1所示,即便向粒子保存缓冲液添加0.01~1.0%(w/v)(终浓度0.0033~0.33%(w/v))非离子性表面活性剂(Pluronic F-68),键合于磁性粒子的4种抗体与外泌体的反应也不受到阻碍。
(试验例4清洗能力确认试验)
使检体(血清、血浆、尿)与抗体键合磁性粒子反应时,通过SDS-PAGE的银染色确认如果仅用TBS(pH7.4)进行粒子清洗,则无法充分减少来自检体的非特异性吸附。特别是,使用血清时,非特异性吸附多,因此使用血清按以下的顺序确认含有非离子性表面活性剂的粒子清洗缓冲液的清洗能力。
首先,将含有键合了抗CD9抗体、抗CD63抗体、抗CD81抗体或者抗EpCAM抗体的磁性粒子(JSR Life Sciences公司制MS300/Carboxyl)0.1%(w/v)和非离子性表面活性剂(Pluronic F-68)0.1%(w/v)的TBS(pH7.4)150μL与来自健康人的血清150μL放入1.5mL管中进行混合。
将其在25℃振动1小时后,集磁而除去血清,用0.5mL的清洗缓冲液((i)TBS、(ii)含有0.01%(w/v)Triton X-100的TBS或者(iii)含有0.01%(w/v)Pluronic F-68的TBS进行2次清洗。
接着集磁而将清洗液废弃后,用1×样品缓冲液(NuPAGE LDS Sample Buffer(4×),invitrogen Cat no.NP0008,以下相同)20μL将抗体键合磁性粒子悬浮,在95℃静置5分钟。将全部量用于SDS-PAGE,进行银染色(Cosmo Bio公司制)。将结果示于图2。
如图2所示,在全部4种抗体键合磁性粒子中,在仅利用TBS的清洗(图2:泳道TBS)中,大量来自血清的成分非特异性吸附于粒子,但通过在清洗缓冲液中添加0.01%(w/v)的非离子性表面活性剂(Pluronic F-68或者Triton X-100)(图2:泳道PL、泳道TX),非特异性吸附急剧减少。
应予说明,在分子中不含有芳香族基团的非离子性表面活性剂(Pluronic F-68)对脂质双层膜的影响少,因此认为这样的在分子中不含有芳香族基团的非离子性表面活性剂特别适合。
(试验例5含有非离子性表面活性剂的清洗缓冲液对特异性键合的影响)
为了利用含有非离子性表面活性剂(Pluronic F-68)的清洗缓冲液,确认不仅是来自检体的非特异成分的吸附,而且就连与抗体键合磁性粒子进行特异性反应的抗原(外泌体)也不从抗体剥离,按以下顺序进行基于Western印迹的蛋白质检测。
首先,将含有键合了抗CD9抗体、抗CD63抗体、抗CD81抗体或者抗EpCAM抗体的磁性粒子(JSR Life Sciences公司制MS300/Carboxyl)0.1%(w/v)和非离子性表面活性剂(Pluronic F-68)0.1%(w/v)的TBS(pH7.4)100μL与含有外泌体的HT29细胞的培养上清液(将100倍浓缩液用TBS稀释10倍)100μL加入1.5mL管中进行混合。
将其在25℃振动1小时后,集磁而除去培养上清液,用0.5mL的清洗缓冲液((i)含有0.1%(w/v)BSA的PBS,或者(ii)含有0.01%(w/v)非离子性表面活性剂(Pluronic F-68)的TBS)进行3次清洗。
接着集磁而将清洗液废弃后,用1×样品缓冲液20μL将抗体键合磁性粒子悬浮,在95℃静置5分钟。应用总量(20μL)的利用各清洗缓冲液对各抗体键合磁性粒子进行清洗后的样品,进行SDS-PAGE。将凝胶转印到PVDF膜(Trans-Blot Turbo Transfer Pack Midiformat,0.2μm PVDF(BIO-RAD,Control 400072019))后,用封闭缓冲液(含有1%(w/v)BSA和0.1%(w/v)Tween20的TBS)在37℃振动2小时。将其用清洗缓冲液(含有0.1%(w/v)Tween20的TBS)清洗后,使含有1μg/mL的作为一次抗体的抗CD81抗体(Clone M38,AbnovaMAB6435)的溶液(溶剂:含有0.5%(w/v)BSA的TBS)以及含有1μg/mL的作为标记抗体的HRP标记抗小鼠IgG抗体(Mouse TrueBlot ULTRA:Anti-Mouse IgG HRP,Rockland 18-8817-33)的溶液(溶剂:含有0.5%(w/v)BSA的TBS)分别在25℃反应1小时,将其用清洗缓冲液(含有0.1%(w/v)Tween20的TBS)清洗后,使发光底物(SuperSignal West FemtoMaximum Sensitivity substrate,Thermo scientific Cat#34095)反应,用发光测定器(LAS-3000,FUJIFILM)确认Western印迹图像。将结果示于图3。
如图3所示,即使将反应后的抗体键合磁性粒子(抗CD9抗体、抗CD63抗体、抗CD81抗体、抗EpCAM抗体)用含有0.01%(w/v)非离子性表面活性剂(Pluronic F-68)的TBS清洗(图3,泳道PLU),与利用含有0.1%BSA的PBS进行的清洗相比(图3,泳道BSA),也确认外泌体未从抗体剥离。
(试验例6稳定性试验)
为了确认即使抗体键合磁性粒子的反应时和清洗时含有非离子性表面活性剂(Pluronic F-68)外泌体也稳定,按以下的顺序测定外泌体的粒度分布。
首先,用(i)TBS(pH7.4)或者(ii)含有0.1%(w/v)非离子性表面活性剂(PluronicF-68)的TBS(pH7.4)将HT29细胞的培养上清液(100倍浓缩液)稀释10倍(10×培养上清液),冷藏保存3天。其后,将10×培养上清液用TBS稀释100倍,使用NanoSight LM10(NANOSIGHT公司)确认外泌体的粒度分布。
即使将外泌体在含有0.1%(w/v)的非离子性表面活性剂(Pluronic F-68)的TBS中保存,与仅用TBS的保存比较,也看不到外泌体的粒度分布的变化。因此,认为即便在抗体键合磁性粒子的保存缓冲液和清洗缓冲液中添加非离子性表面活性剂(Pluronic F-68),对外泌体的稳定性也没有影响。
(试验例7非离子性表面活性剂)
为了确认表3所示的各种非离子性表面活性剂在反应时的影响,按以下的顺序测定各非离子性表面活性剂存在下的抗体键合磁性粒子与外泌体的反应性。
首先,将(i)含有键合了抗CD81抗体的磁性粒子(JSR Life Sciences公司制MS300/Carboxyl)0.05%(w/v)和表3所示的非离子性表面活性剂1.0%(w/v)的TBS(pH7.4)200μL、或者(ii)含有键合了抗CD81抗体的磁性粒子(JSR Life Sciences公司制MS300/Carboxyl)0.05%(w/v)和BSA0.1%(w/v)的PBS200μL,与含有外泌体的HT29细胞的培养上清液(将100倍浓缩液用TBS稀释10倍)10μL加入1.5mL管中进行混合,在25℃振动1小时。
将其向96孔白色板(Corning公司制)中添加50μL,边集磁边使用清洗缓冲液(含有0.01%(w/v)Tween20的TBS)对反应后的抗体键合磁性粒子进行清洗。向其中加入用碱性磷酸酶标记了抗CD81抗体的抗体的MES溶液(1μg/mL)50μL进行混合。
将其在25℃振动20分钟后,边集磁边使用清洗缓冲液(含有0.01%(w/v)Tween20的TBS)对反应后的抗体键合磁性粒子进行清洗。添加50μL发光底物(FUJIREBIO制,LUMIPULSE底物溶液),5分钟后使用发光测定机(Promega公司制GloMax)测定发光强度。将结果示于表4。
如表4所示,即便添加聚亚烷基二醇环氧乙烷加成物(Pluronic F-68,PluronicL-62)和山梨糖醇酐的脂肪酸酯(Tween20、Tween80),也看不到外泌体的破坏所致的与抗体键合磁性粒子的反应性的降低。另一方面,对于作为含有芳香族基团的非离子性表面活性剂的TritonX-100(HLB值13.5)和Nonidet P-40(HLB值13.1),确认了认为外泌体的破坏为原因的反应性的降低。
根据以上,认为即便抗体键合磁性粒子的保存缓冲液和清洗缓冲液中添加非离子性表面活性剂(在分子中不含有芳香族基团),对外泌体的稳定性和与抗体键合磁性粒子的反应性也没有影响。
[表3]
[表4]
(试验例8捕捉囊泡的确认)
为了确认用抗体键合磁性粒子捕捉的外泌体未被破坏,使用粒度分布计和透射式电子显微镜,按以下的顺序测定外泌体的粒径和形态。
将含有终粒子浓度为0.1%(w/v)的键合了抗CD9抗体、抗CD63抗体、抗CD81抗体或者抗EpCAM抗体的磁性粒子(JSR Life Sciences公司制MS300/Carboxyl)和0.1%(w/v)的非离子性表面活性剂(Pluronic F-68)的TBS(pH7.4)100μL,与含有外泌体的HT29细胞的培养上清液100μL加入1.5mL管中进行混合。将其在25℃振动1小时后,集磁而除去培养上清液,用0.5mL的清洗缓冲液(含有0.1%(w/v)Pluronic F-68的TBS)进行3次清洗。
集磁而除去清洗缓冲液,用外泌体洗脱缓冲液(JSR Life Sciences公司制ExoCapTM Exosome Isolation and Enrichment Kits Exosome Elution Buffer)将抗体键合磁性粒子悬浮,制备洗脱外泌体。其后,用纳米粒子解析装置(NanoSight LM10,NANOSIGHT公司)测定洗脱外泌体的粒度分布。将结果示于图4和图5。应予说明,图4是使用抗CD63抗体键合磁性粒子时的洗脱外泌体的粒度分布图。
其结果,确认了在100nm左右具有峰的粒度分布的波形(图4)。另外,用键合了抗CD9抗体、抗CD63抗体、抗CD81抗体或者抗EpCAM抗体的粒子捕捉的全部洗脱外泌体中确认了相同的粒度分布(图5)。
使用键合了抗CD9抗体的磁性粒子,利用透射式电子显微镜直接观察与上述同样地制备的洗脱外泌体的形态。利用磷钨酸或者乙酸铀进行负染。将结果示于图6。
其结果,确认了囊泡这样的球形的结构体(图6)和囊泡的脂质双层膜(图6中的箭头)。
根据以上结果,用各抗体键合磁性粒子捕捉的囊泡与已报道的外泌体的粒径同样地具有100nm左右的粒径,且形态也与已报道的观察结果一致,因此认为是外泌体,通过捕捉工序和清洗工序外泌体未被破坏。
(试验例9囊泡中的核酸的检测)
使用微芯片型电泳装置对用抗体键合磁性粒子捕捉的囊泡中的核酸(全RNA)进行检测。作为样品使用的标准外泌体,利用超离心法从HT29细胞的培养上清液分离外泌体,用PBS调整后,进行蛋白定量(BIO-RAD DC Protein Assay)。以下示出具体的顺序。
将含有终粒子浓度为0.1%(w/v)的键合了抗CD9抗体、抗CD63抗体、抗CD81抗体或者抗EpCAM抗体的磁性粒子(JSR Life Sciences公司制MS300/Carboxyl)和0.1%(w/v)的非离子性表面活性剂(Pluronic F-68)的TBS(pH7.4)100μL,与含有标准外泌体(0μg、1μg、3μg或者10μg)的PBS100μL加入1.5mL管中进行混合。将其在4℃振动约18小时后,集磁而除去未反应的外泌体,用1mL的清洗缓冲液(含有0.1%(w/v)Pluronic F-68的TBS)进行3次清洗,集磁而除去清洗缓冲液。
使用RIP-Assay Kit for microRNA(MBL公司制,参照两步法),从用抗体键合磁性粒子捕捉的外泌体中提取全部RNA后,用RNase-free water调整。
使用微芯片型电泳装置生化分析仪(Agilent Technologies制)对来自用抗体键合磁性粒子捕捉的外泌体的全部RNA进行检测。将结果示于图7。
如图7所示,确认Small RNA和mRNA等的峰。另外,检测的核酸的量与标准外泌体量成比例地增加。
(试验例10囊泡中的microRNA的检测)
使用定量PCR法,按以下的顺序对用抗体键合磁性粒子捕捉的囊泡中的核酸(microRNA)进行测定。
首先,作为抗体键合磁性粒子,分别使用终粒子浓度为0.1%(w/v)的(i)抗CD63抗体键合磁性粒子或者(ii)抗CD9抗体键合磁性粒子、抗CD63抗体键合磁性粒子、抗CD81抗体键合磁性粒子和抗EpCAM抗体抗体键合磁性粒子的混合物(质量比1:1:1:1),除此以外,用与试验例9相同的方法提取全部RNA。接着,使用miScript II RT kit(QIAGEN公司制)和miScript SYBR Green PCR kit(QIAGEN公司制)对microRNA(let-7a-1)进行定量。将结果示于图8。
其结果,得到如图8所示的扩增曲线,能够从用抗体键合磁性粒子捕捉的外泌体检测到特异性的microRNA。由此,使用抗体键合磁性粒子对来自囊泡的各种microRNA进行定量,通过分析能够用于疾病的判定。
(试验例11来自囊泡的蛋白质的检测)
使用Western印迹法对在用抗体键合磁性粒子捕捉的囊泡的内侧和表面存在的来自囊泡的蛋白质进行检测。
首先,将含有键合了抗CD9抗体、抗CD63抗体、抗CD81抗体或者抗EpCAM抗体的磁性粒子(JSR Life Sciences公司制MS300/Carboxyl)0.1%(w/v)和非离子性表面活性剂(Pluronic F-68)0.1%(w/v)的TBS(pH7.4)100μL,与含有外泌体的HT29细胞的培养上清液(将100倍浓缩液用TBS稀释10倍)0.1mL加入1.5mL管中进行混合。
将其在25℃振动1小时后,集磁而除去培养上清液,用0.5mL的清洗缓冲液(含有0.1%(w/v)非离子性表面活性剂(Pluronic F-68)的TBS)进行3次清洗。
接着集磁而将清洗液废弃后,用1×样品缓冲液20μL将抗体键合磁性粒子悬浮,在95℃静置5分钟。应予说明,表面蛋白质(CD9、CD63、CD81、EpCAM)的检测以非还原处理进行,内侧蛋白质(Alix,Hsp70)的检测以还原处理进行。应用全部量(20μL)的各样品,进行SDS-PAGE。将凝胶转印到PVDF膜上后,用封闭缓冲液(含有1%(w/v)BSA和0.1%(w/v)Tween20的TBS)在37℃振动2小时。将其用清洗缓冲液(含有0.1%(w/v)Tween20的TBS)清洗,分别使一次抗体和标记抗体在25℃反应1小时。
应予说明,Hsp70以外的蛋白质的检测,使用抗CD9抗体(Abcam公司制ab2215)、抗CD63抗体(MX-49.129.5,Mouse IgG1,SantaCruz sc-5275)、抗CD81抗体(Clone M38,Abnova MAB6435)、抗EpCAM抗体(JSR Life Sciences公司制)、抗Alix抗体(Alix(3A9)Mouse mAb,Cell signaling technology#2171S)作为一次抗体,使用HRP标记抗小鼠IgG抗体(Mouse TrueBlot ULTRA:Anti-Mouse IgG HRP,Rockland 18-8817-33)作为标记抗体。另外,Hsp70的检测使用Anti-HSP70,Rabbit-Poly,with HRP Conjugated SecondaryAntibody(SBI公司制,EXOAB-Hsp70A-1)。
上述一次抗体和标记抗体的反应结束后,用清洗缓冲液(含有0.1%(w/v)Tween20的TBS)清洗,使发光底物(SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity substrate,Thermo scientific Cat#34095)反应,用发光测定器(LAS-3000,FUJIFILM)确认Western印迹图像。结果示于图9。
其结果,在全部的抗体键合磁性粒子中,从捕捉的外泌体以目标尺寸检测到来自囊泡的表面蛋白质(CD9、CD63、CD81、EpCAM)和内侧蛋白质(Alix、Hsp70)的条带(图9)。
另外,将上述反应使用的HT29细胞的培养上清液0.1mL分别变为标准外泌体(1、3、10μg)、HT29细胞的培养上清液1mL,利用与上述相同的方法检测来自囊泡的蛋白质的量(表面蛋白质CD9)。将使用抗CD9抗体作为一次抗体时的结果示于图10。
其结果,检测的来自囊泡的蛋白质的量与反应的标准外泌体量(1,3,10μg)和培养上清液的液量(0.1,1mL)成比例地增加(图10)。因此,通过对来自囊泡的蛋白质进行定量,能够测定体液或者培养上清液中的囊泡的量。
(试验例12来自体液和培养上清液的囊泡的检测)
使用Western印迹法对来自各种细胞培养上清液和体液(血清、血浆、尿)中的囊泡的蛋白质进行检测。应予说明,使用健康人血清3检体(Serum A、Serum B、Serum C)作为血清,使用健康人肝素血浆3检体(Plasma(Heparin)A、Plasma(Heparin)B、Plasma(Heparin)C)作为血浆,使用健康人尿3检体(Urine D、Urine E、Urine F)作为尿。以下示出具体的顺序。
首先,将(i)含有键合了抗CD9抗体、抗CD63抗体、抗CD81抗体或者抗EpCAM抗体的磁性粒子(JSR Life Sciences公司制MS300/Carboxyl)0.1%(w/v)和非离子性表面活性剂(Pluronic F-68)0.1%(w/v)的TBS(pH7.4)100μL,与(ii)细胞培养上清液(HT-29、293T或NCI-H520)或者来自健康人的体液(血清、血浆或尿(各3检体))100μL加入1.5mL管中进行混合。
将其在25℃振动20分钟后,集磁而将未反应液除去,用0.5mL的清洗缓冲液(含有0.1%(w/v)非离子性表面活性剂(Pluronic F-68)的TBS)进行3次清洗。
接着集磁而将清洗液废弃后,用1×样品缓冲液20μL将抗体键合磁性粒子悬浮,在95℃静置5分钟。应用全部量(20μL)的各样品,进行SDS-PAGE。将凝胶转印到PVDF膜上后,用封闭缓冲液(含有1%(w/v)BSA和0.1%(w/v)Tween20的TBS)在37℃振动2小时。将其用清洗缓冲液(含有0.1%(w/v)Tween20的TBS)进行清洗。
分别使作为一次抗体的抗CD9抗体和作为标记抗体的HRP标记抗小鼠IgG抗体(Mouse TrueBlot ULTRA:Anti-Mouse IgG HRP,Rockland 18-8817-33)在25℃反应1小时,将其用清洗缓冲液(含有0.1%(w/v)Tween20的TBS)进行清洗后,使发光底物反应,用发光测定器(LAS-3000,FUJIFILM)确认Western印迹图像。将结果示于图11。
其结果,在键合了抗CD9抗体、抗CD63抗体、抗CD81抗体的磁性粒子中,检测到来自从全部的培养上清液和体液捕捉的囊泡的表面蛋白质(CD9)(图11)。另一方面,键合了抗EpCAM抗体的磁性粒子中,从EpCAM产生细胞的HT29和NCI-H520的培养上清液,检测到来自囊泡的表面蛋白质(CD9),但从EpCAM非产生细胞的293T和全部的健康人体液(血清、血浆、尿)未检测到来自囊泡的表面蛋白质(CD9)(图11)。
因此,通过使用键合了针对癌症标志物等来自疾病的抗原的配体的粒子,能够分离来自健康人和来自罹患者的囊泡而检测。由此,通过将来自被检者的生物体试样的信号强度与来自健康人的生物体试样的信号强度对比,能够判定被检者发病。
(试验例13基于ELISA的囊泡的检测)
使用ELISA法对来自囊泡的信号强度进行定量检测。以下示出具体的顺序。
在96孔白色板(Corning公司制)中分别加入25μL含有键合有抗CD9抗体、抗CD63抗体、抗CD81抗体或者抗EpCAM抗体的磁性粒子(JSR Life Sciences公司制MS300/Carboxyl)0.1%(w/v)和非离子性表面活性剂(Pluronic F-68)0.1%(w/v)的TBS(pH7.4)以及细胞(293T、NCI-H520、HT29或者22Rv-1)的培养上清液并进行混合。将其在25℃振动20分钟后,边集磁边使用清洗缓冲液(含有0.01%(w/v)Tween20的TBS)对反应后的抗体键合磁性粒子进行清洗。边集磁边除去清洗缓冲液,加入用碱性磷酸酶标记抗CD9抗体或者抗CD81抗体的抗体的MES溶液(0.5μg/mL)50μL。将其在25℃振动20分钟后,边集磁边使用清洗缓冲液(含有0.01%(w/v)Tween20的TBS)对反应后的抗体键合磁性粒子进行清洗。添加50μL发光底物(FUJIREBIO制,LUMIPULSE底物溶液),5分钟后使用发光测定机(Promega公司制GloMax)测定发光强度。
其后,将对来自癌细胞(NCI-H520、HT29、22Rv-1)的囊泡测定的信号强度与对来自293T细胞的囊泡测定的信号强度进行对比。将结果示于表5和6。
其结果,键合了抗CD9抗体、抗CD63抗体或者抗CD81抗体的磁性粒子中,基于ALP标记抗CD9抗体的检测(表5)和基于ALP标记抗CD81抗体(表6)的检测都是来自癌细胞外囊泡的信号强度与来自293T细胞外囊泡的信号强度接近。另一方面,键合了抗EpCAM抗体的磁性粒子中,来自癌细胞外囊泡的信号强度显著高于来自293T细胞外囊泡的信号强度。
另外,对于被键合了抗CD9抗体、抗CD63抗体或者抗CD81抗体的磁性粒子捕捉的外泌体的比例,NCI-H520细胞外囊泡的基于抗CD81抗体键合磁性粒子的捕捉率高等,因癌细胞的种类而有所不同(表5、表6)。
因此,通过使用键合了针对来自囊泡的共同标记蛋白质(CD9、CD63、CD81等)和癌症标志物等(EpCAM等)来自疾病的抗原的配体的粒子,能够将来自健康人和来自罹患者的囊泡分离,利用ELISA法等进行定量检测。由此,通过将来自被检者的生物体试样的信号强度与来自健康人的生物体试样的信号强度对比,判定为被检者发病。
另外,通过由疾病治疗药给予前和给予后的来自被检者的生物体试样,用相同的方法对来自囊泡的信号强度进行检测、对比,能够评价疾病治疗药的药效。
[表5]
基于ALP标记CD9抗体的信号强度的对比(/来自293T的囊泡
[表6]
基于ALP标记CD81抗体的信号强度的对比(/来自293T的囊泡
Claims (13)
1.一种具有脂质双层膜的囊泡的分离方法,其特征在于,包括:
复合体形成工序,使含有具有脂质双层膜的囊泡的生物体试样与键合有配体的粒子状的固相载体进行接触,形成所述囊泡和所述固相载体的复合体,其中,所述配体识别存在于所述囊泡的表面的表面抗原;
清洗工序,清洗所述复合体;
在分子中不含有芳香族基团的非离子性表面活性剂的存在下进行所述复合体形成工序和所述清洗工序中的至少复合体形成工序。
2.根据权利要求1所述的分离方法,其中,所述非离子性表面活性剂为选自聚亚烷基二醇环氧乙烷加成物、山梨糖醇酐的脂肪酸酯、山梨糖醇的脂肪酸酯、山梨糖醇酐脂肪酸酯的环氧乙烷加成物、以及山梨糖醇脂肪酸酯的环氧乙烷加成物中的1种或者2种以上。
3.根据权利要求1所述的分离方法,其中,所述非离子性表面活性剂为选自聚亚烷基二醇环氧乙烷加成物和山梨糖醇酐脂肪酸酯的环氧乙烷加成物中的1种或者2种。
4.根据权利要求1所述的分离方法,其中,所述非离子性表面活性剂为嵌段共聚型的聚亚烷基二醇环氧乙烷加成物。
5.根据权利要求1所述的分离方法,其中,所述非离子性表面活性剂为具有由聚环氧乙烷构成的嵌段和由聚氧化亚烷基构成的所述亚烷基的碳原子数为3以上的嵌段的嵌段共聚物。
6.根据权利要求1所述的分离方法,其中,所述生物体试样为体液或者细胞培养上清液。
7.根据权利要求1所述的分离方法,其中,所述囊泡为外泌体。
8.根据权利要求7所述的分离方法,其中,所述表面抗原为存在于外泌体表面的抗原蛋白质,所述配体为识别存在于外泌体表面的抗原蛋白质的抗体。
9.根据权利要求1所述的分离方法,其中,所述固相载体为磁性粒子。
10.根据权利要求9所述的分离方法,其中,所述清洗工序包含利用磁力将所述磁性粒子聚集而将磁性粒子与液相分离的集磁工序,和使该集磁工序中分离的磁性粒子分散在清洗液中的分散工序。
11.一种囊泡中的核酸的检测方法,其特征在于,在权利要求1~10中任1项所述的分离方法之后,进一步包含对囊泡中的核酸进行检测的核酸检测工序。
12.一种来自囊泡的蛋白质的检测方法,其特征在于,在权利要求1~10中任1项所述的分离方法之后,进一步包含对存在于囊泡的内侧和表面的至少一方的蛋白质进行检测的蛋白质检测工序。
13.一种来自囊泡的信号测定方法,其特征在于,在权利要求1~10中任1项所述的分离方法之后,进一步包含对来自形成所述复合体的囊泡的信号强度进行测定的信号测定工序。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |