JPWO2020080387A1 - 細胞外小胞の回収方法 - Google Patents
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Abstract
Description
〔1〕ポリマーの存在下で細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離することを含む、細胞外小胞の回収方法。
〔2〕ポリマーが、20〜30℃における1〜20重量%水溶液中の粘度として1.5mPa・s以上の値を有する、〔1〕の方法。
〔3〕ポリマーが、セルロース誘導体またはカルボニル含有親水性基を有するポリビニル誘導体である、〔1〕または〔2〕の方法。
〔4〕ポリマーが、少なくとも1つの水酸基の水素原子がカルボキシアルキルまたはヒドロキシアルキルで置換されたセルロース誘導体、または少なくとも1つの水素原子がラクタムで置換されたポリビニル誘導体である、〔3〕の方法。
〔5〕ポリマーが、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはポリビニルピロリドンである、〔4〕の方法。
〔6〕ポリマーが、10kDa以上の重量平均分子量を有する、〔1〕〜〔5〕のいずれかの方法。
〔7〕細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離する際のポリマーの濃度が、0.01〜10.00重量%である、〔1〕〜〔6〕のいずれかの方法。
〔8〕細胞外小胞含有試料とキレート剤を合わせることをさらに含む、〔1〕〜〔7〕のいずれかの方法。
〔9〕細胞外小胞が、エクソソームである、〔1〕〜〔8〕のいずれかの方法。
〔10〕前記分離が、細胞外小胞膜結合物質を用いた分離法、または細胞外小胞含有試料の超遠心法により行われる、〔1〕〜〔9〕のいずれかの方法。
〔11〕細胞外小胞膜結合物質が、テトラスパニン膜タンパク質に対する抗体、または細胞外マトリクスメタロプロテアーゼ誘導物質に対する抗体である、〔10〕の方法。
〔12〕細胞外小胞膜結合物質がCD9、CD63、CD81、またはCD147に対する抗体である、〔11〕の方法。
〔13〕細胞外小胞含有試料が血液試料、尿、または唾液である、〔1〕〜〔12〕のいずれかの方法。
〔14〕以下を含む、細胞外小胞の分析方法:
(1)ポリマーの存在下で、細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離すること;および
(2)分離された細胞外小胞を分析すること。
〔15〕キレート剤の細胞外小胞含有試料への添加をさらに含む、〔14〕の方法。
〔16〕分離された細胞外小胞中のタンパク質または核酸が分析される、〔14〕または〔15〕の方法。
〔17〕ポリマーおよび細胞外小胞膜結合物質を含む、キット。
〔18〕キレート剤をさらに含む、〔17〕のキット。
(1)ポリマーの存在下で、細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離すること。
ポリマーの粘度は、例えば、粘性解析装置(例、レオロジースペクトロメータSKR100、ヤマト科学社)を用いて測定することができる。
カルボキシアルキルとしては、例えば、カルボキシメチル、カルボキシエチル(1−カルボキシエチル、2−カルボキシエチル)、カルボキシプロピル(1−カルボキシプロピル、2−カルボキシプロピル、3−カルボキシプロピル)、カルボキシイソプロピル(1−カルボキシ−2−メチルエチル、2−カルボキシ−2−メチルエチル)、カルボキシブチル(1−カルボキシブチル、2−カルボキシブチル、3−カルボキシブチル、4−カルボキシブチル)、カルボキシt−ブチル、カルボキシペンチル(1−カルボキシペンチル、2−カルボキシペンチル、3−カルボキシペンチル、4−カルボキシペンチル、5−カルボキシペンチル)、カルボキシヘキシル(1−カルボキシヘキシル、2−カルボキシヘキシル、3−カルボキシヘキシル、4−カルボキシヘキシル、5−カルボキシヘキシル、6−カルボキシヘキシル)が挙げられる。
ヒドロキシアルキルとしては、例えば、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル(1−ヒドロキシエチル、2−ヒドロキシエチル)、ヒドロキシプロピル(1−ヒドロキシプロピル、2−ヒドロキシプロピル、3−ヒドロキシプロピル)、ヒドロキシイソプロピル(1−ヒドロキシ−2−メチルエチル、2−ヒドロキシ−2−メチルエチル)、ヒドロキシブチル(1−ヒドロキシブチル、2−ヒドロキシブチル、3−ヒドロキシブチル、4−ヒドロキシブチル)、ヒドロキシt−ブチル、ヒドロキシペンチル(1−ヒドロキシペンチル、2−ヒドロキシペンチル、3−ヒドロキシペンチル、4−ヒドロキシペンチル、5−ヒドロキシペンチル)、ヒドロキシヘキシル(1−ヒドロキシヘキシル、2−ヒドロキシヘキシル、3−ヒドロキシヘキシル、4−ヒドロキシヘキシル、5−ヒドロキシヘキシル、6−ヒドロキシヘキシル)が挙げられる。
セルロース誘導体の具体例としては、カルボキシメチルセルロース(CMC)、ヒドロキシエチルセルロース(HEC)、ヒドロキシプロピルセルロース(HPC)、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)が挙げられる。
セルロース誘導体には、ナノセルロース誘導体も含まれる。ナノセルロース誘導体とは、後述するナノセルロースの誘導体である。
(1)ポリマーの存在下で、細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離すること;および
(2)分離された細胞外小胞を分析すること。
分析される成分がタンパク質である場合、分析方法としては、例えば、イムノアッセイ、質量分析法が挙げられる。イムノアッセイとしては、例えば、直接競合法、間接競合法、およびサンドイッチ法が挙げられる。また、このようなイムノアッセイとしては、化学発光イムノアッセイ(CLIA)〔例、化学発光酵素免疫測定法(CLEIA)〕、免疫比濁法(TIA)、酵素免疫測定法(EIA)(例、直接競合ELISA、間接競合ELISA、およびサンドイッチELISA)、放射イムノアッセイ(RIA)、ラテックス凝集反応法、蛍光イムノアッセイ(FIA)、およびイムノクロマトグラフィー法、ウエスタンブロッティング、免疫染色、蛍光活性化細胞選別(fluorescence activated cell sorting、FACS)が挙げられる。複数成分が分析される場合、プロテオーム分析が行われてもよい。
分析される成分が核酸である場合、分析方法としては、例えば、プローブを用いるハイブリダイゼーション法、逆転写酵素を用いる逆転写(RT)反応、プライマー(例、2、3、または4個のプライマー)を用いる遺伝子増幅法(例、定量PCR、RT−PCR等のPCR法)、シークエンシング、質量分析法が挙げられる。
分析される成分がタンパク質および核酸以外の成分である場合、分析方法としては、例えば、イムノアッセイ、質量分析法が挙げられる。複数成分が分析される場合、メタボローム分析が行われてもよい。
(1)細胞外小胞膜結合物質を用いて細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離すること;および
(2)分離された細胞外小胞内に含まれる、癌等の疾患の指標となるマーカーを分析すること。
市販の3種類のCMCナトリウム塩(以下、単に「CMC」と呼ぶ。CAS No.9004−32−4、ナカライテスク社#07326−95(平均分子量不明)、シグマアルドリッチ社#C5678(平均分子量90kDa)、#C4888(平均分子量250kDa))の、EV回収への効果を検討した。EV回収は、抗CD9抗体を用いて行った。
健常人血清を20,000×g、4℃で15分間遠心した後、200μLの血清を200μLのPBS(2.9mM NaH2PO4、9.0mM Na2HPO4、137mM NaCl)、EDTA/EGTA−PBS(血清を希釈した後の各終濃度が50mMになるようにEDTAおよびEGTAを含むPBS)(ED/EG)、または終濃度0.2〜2.5重量%のCMC−PBS(血清を希釈した後の終濃度が0.2〜2.5重量%になるようにCMCを溶解したPBS)で希釈し、抗CD9抗体(自社製)を固定した磁性ビーズ(Dynabeads M−280 tosylactivated(ライフテクノロジーズ社))を0.26mg/mLとなるように添加した。4℃で一晩回転反応させた後に、磁性ビーズをPBS−Tで3回洗浄し、サンプルバッファー(BIO−RAD社)で希釈してウエスタンブロッティング用サンプルとした。ウエスタンブロッティング用サンプルでは、エクソソームを含むサンプルがSDSで処理されることにより、エクソソームが破壊され、エクソソームのマーカータンパク質(例、CD9)がサンプル溶液中に放出されている。ビオチン化した抗CD9抗体(自社製)によるウエスタンブロッティング法で免疫沈降効率を解析した(図1)。4種類のCMC全てにおいて、PBS希釈サンプルと比較してEV回収効率向上の効果を認めた。
実施例で用いたCMCの各物性値を以下の表1にまとめた。
CMC(シグマアルドリッチ社#C4888)の濃度(0.06重量%〜1.0重量%の終濃度)および反応温度(4℃、37℃)がEV回収に与える効果を検討した。
健常人血清を20,000×g、4℃で15分間遠心した後、200μLの血清を200μLのPBSもしくはCMC−PBS(血清希釈後の終濃度が0.06〜1.0重量%になるようにCMCを溶解したPBS)で希釈し、抗CD9抗体(自社製)を固定した磁性ビーズ(Dynabeads M−280 tosylactivated(ライフテクノロジーズ社))を0.26mg/mLとなるように添加した。4℃で一晩もしくは37℃で1時間回転反応させた後に、磁性ビーズをPBS−Tで3回洗浄し、サンプルバッファー(BIO−RAD社)で希釈してウエスタンブロッティング用サンプルとした。ビオチン化した抗CD9抗体によるウエスタンブロッティング法でEVの回収効率を解析した(図2)。反応温度4℃および37℃において、CMCの終濃度0.25重量%〜1重量%の範囲で、PBS希釈サンプルと比較してEV回収効率向上の効果を認めた。
CMC(シグマアルドリッチ社#C4888)のEV回収への効果をナノ粒子トラッキング解析(NanoSight LM10、カンタムデザイン社)により検討した。
200μLの健常人血清を20,000×g、4℃で15分間遠心した後、その上清に200μLのPBS、EDTA/EGTA−PBS(血清希釈後の各終濃度50mMになるようにEDTAおよびEGTAを含むPBS)(ED/EG)、またはCMC−PBS(血清希釈後の終濃度が0.5重量%になるようにCMCを溶解したPBS)(CMC)で希釈し、抗CD9抗体(自社製)を固定した磁性ビーズ(Dynabeads M−280 tosylactivated(ライフテクノロジーズ社))を0.26mg/mLとなるように添加した。37℃で30分間回転反応させた後に、磁性ビーズをPBS−Tで3回洗浄し、40μL BRUB(Britton & Robinson Universal Buffer)(pH2.6)で5分間反応させた後、20μLの1M Tris−HCl(pH8.0)で中和することで細胞外小胞を抗体磁性ビーズ粒子から遊離させた。Qubit protein assay(ライフテクノロジーズ社)で総タンパク質濃度を定量した後、PBS 450μLを添加してNanoSightにより粒子数を解析した(図3)。CMCで希釈した条件においてEVの総回収粒子数と総タンパク質あたりの粒子数の増加が認められ、高純度で細胞外小胞が回収されたことが示された。
血清、および5種類の抗凝固剤(ヘパリン、EDTA、クエン酸(citrate)、ACD(酸−クエン酸−デキストロース;acid−citrate−dextrose)、CPD(クエン酸−リン酸−デキストロース;citrate phosphate dextrose))を含有する血漿において、CMC(シグマアルドリッチ社#C4888)のEV回収への効果を検討した。
200μLの健常人血清、および抗凝固剤含有健常人血漿を20,000×g、4℃で15分間遠心した後、その上清に200μLのPBS、EDTA/EGTA−PBS(血清または血漿希釈後の各終濃度が50mMになるようにEDTAおよびEGTAを含むPBS)(ED/EG)、CMC−PBS(血清または血漿希釈後の終濃度が0.5重量%になるようにCMCを溶解したPBS)(CMC)、またはEDTA/EGTA/CMC−PBS(血清または血漿希釈後のそれぞれの終濃度が37.5mM/37.5mM/0.5重量%になるようにEDTA、EGTAおよびCMCを含むPBS)(ED/EG/C)で希釈し、抗CD9抗体(自社製)を固定した磁性ビーズ(Dynabeads M−280 tosylactivated(ライフテクノロジーズ社))を0.26mg/mLとなるように添加した。37℃で1時間回転反応させた後に、磁性ビーズをPBS−Tで3回洗浄し、サンプルバッファー(BIO−RAD社)で希釈してウエスタンブロッティング用サンプルとした。ビオチン化した抗CD9抗体によるウエスタンブロッティング法で免疫沈降効率を解析した(図4)。抗凝固剤の種類を問わず、血漿検体においてもCMCによるEV回収効率向上の効果を認めた。また、CMCとキレート剤を組み合わせることでさらにEV回収効率が向上した。
CMC(シグマアルドリッチ社#C4888)が、CD9以外の2種類のテトラスパニン膜タンパク質(CD63およびCD81)、および細胞外マトリクスメタロプロテアーゼ誘導物質(CD147)に対する抗体を用いたEV回収に与える効果を検討した。
200μLの健常人血清を20,000×g、4℃で15分間遠心した後、その上清に200μLのPBS、EDTA/EGTA−PBS(血清希釈後の各終濃度50mM)(ED/EG)、CMC−PBS(血清希釈後の終濃度0.5重量%)(CMC)、またはEDTA/EGTA/CMC−PBS(血清希釈後のそれぞれの終濃度37.5mM/37.5mM/0.5重量%)(ED/EG/C)で希釈し、抗CD63抗体(8A12:コスモバイオ社)、抗CD81抗体(M38:アブカム社)および抗CD147抗体(MEM−M6/1:アブカム社)の各抗体を固定した磁性ビーズ(Dynabeads M−280 tosylactivated(ライフテクノロジーズ社))を0.26mg/mLとなるように添加した。4℃で一晩回転反応させた後に、磁性ビーズをPBS−Tで3回洗浄し、サンプルバッファー(BIO−RAD社)で希釈してウエスタンブロッティング用サンプルとした。抗CD63抗体(自社製)、抗CD81抗体(12C4:コスモバイオ社)およびビオチン化抗CD9抗体(自社製)によるウエスタンブロッティング法でEV回収効率を解析した(図5Aおよび図5B)。CD63、CD81、およびCD147に対する抗体を用いた場合でもCMCによるEV回収効率向上の効果を認めた。また、CMCとキレート剤を組み合わせることでさらにEV回収効率が向上した。
2種類の体液(尿および唾液)において、CMC(シグマアルドリッチ社#C4888)のEV回収への効果を検討した。
200μLの健常人尿および唾液(それぞれ、2個のサンプル。「#1」および「#2」として表わす。)を15,000×g、4℃で15分間遠心し、0.22μmフィルターにより濾過を行った後、200μLのPBS、EDTA/EGTA−PBS(尿または唾液希釈後の各終濃度50mM)(ED/EG)、CMC−PBS(尿または唾液希釈後の終濃度0.5重量%)(CMC)、またはEDTA/EGTA/CMC−PBS(尿または唾液希釈後のそれぞれの終濃度37.5mM/37.5mM/0.5重量%)(ED/EG/C)で希釈し、抗CD9抗体(自社製)を固定した磁性ビーズ(Dynabeads M−280 tosylactivated(ライフテクノロジーズ社))を0.26mg/mLとなるように添加した。37℃で1時間回転反応させた後に、磁性ビーズをPBS−Tで3回洗浄し、サンプルバッファー(BIO−RAD社)で希釈してウエスタンブロッティング用サンプルとした。ビオチン化した抗CD9抗体によるウエスタンブロッティング法で免疫沈降効率を解析した(図6)。血清、血漿のみならず、尿および唾液においてもCMCによるEV回収効率向上の効果を認めた。
下記表2に示すセルロース誘導体(0.13重量%〜4.0重量%の各終濃度)の、EV回収への効果を検討した。
健常人血清を20,000×g、4℃で15分間遠心した後、200μLの血清を200μLのPBS、CMC−PBS(血清希釈後の終濃度0.5重量%)(CMC)、またはPBSに溶解したセルロース誘導体(血清希釈後の各終濃度0.13〜4.0重量%)で希釈し、抗CD9抗体(自社製)を固定した磁性ビーズ(Dynabeads M−280 tosylactivated(ライフテクノロジーズ社))を0.26mg/mLとなるように添加した。37℃で1時間回転反応させた後に、磁性ビーズをPBS−Tで3回洗浄し、サンプルバッファー(BIO−RAD社)で希釈してウエスタンブロッティング用サンプルとした。ビオチン化した抗CD9抗体によるウエスタンブロッティング法でEVの回収効率を解析した(図7A〜C)。CMC以外の3種類のセルロース誘導体においてもPBS希釈サンプルと比較してEV回収効率向上の効果を認めた(HECは0.13重量%〜2.0重量%の範囲、HPCは0.25重量%〜4.0重量%の範囲、HPMCは0.25重量%〜2.0重量%の範囲において)。
下記表3に示すポリビニルピロリドン(1重量%、2重量%、4重量%の各終濃度)の、EV回収への効果を検討した。
健常人血清を20,000×g、4℃で15分間遠心した後、200μLの血清を200μLのPBS、またはPBSに溶解したポリビニルピロリドン(血清希釈後の各終濃度1.0〜4.0重量%)で希釈し、抗CD9抗体(自社製)を固定した磁性ビーズ(Dynabeads M−280 tosylactivated(ライフテクノロジーズ社))を0.26mg/mLとなるように添加した。37℃で1時間回転反応させた後に、磁性ビーズをPBS−Tで3回洗浄し、サンプルバッファー(BIO−RAD社)で希釈してウエスタンブロッティング用サンプルとした。ビオチン化した抗CD9抗体によるウエスタンブロッティング法でEVの回収効率を解析した(図8)。ポリビニルピロリドンは1.0重量%〜4.0重量%の範囲で、PBS希釈サンプルと比較して、EV回収効率向上の効果が認められた。
CMC(シグマアルドリッチ社#C4888)について、35℃から60℃の各反応温度におけるEV回収への効果を検討した。
健常人血清を20,000×g、4℃で15分間遠心した後、100μLの血清を100μLのPBSまたはCMC−PBS(血清希釈後の終濃度0.5重量%)で希釈し、抗CD9抗体(自社製)、抗CD63抗体(8A12:コスモバイオ社)または抗CD81抗体(12C4:コスモバイオ社)を固定した磁性ビーズ(Dynabeads M−280 tosylactivated(ライフテクノロジーズ社))を0.26mg/mLとなるように添加した。各反応温度で5分間反応させた後に、磁性ビーズをPBS−Tで3回洗浄し、サンプルバッファー(BIO−RAD社)で希釈してウエスタンブロッティング用サンプルとした。ビオチン化した抗CD9抗体(自社製)、抗CD63抗体(自社製)および抗CD81抗体(12C4:コスモバイオ社)によるウエスタンブロッティング法でEVの回収効率を解析した(図9A〜図9C)。CMC添加により35℃から60℃の各反応温度においてEV回収効率向上の効果を認めた。さらに40℃以上の高温条件においてCMC添加によりEV回収効率向上の、より高い効果を認めた。また、CMCによるEV回収効率向上効果は短時間の反応においても効果を認めた。
実施例7で用いたセルロース誘導体および実施例8で用いたポリビニルピロリドンのPBS溶液中の粘度を測定した。具体的には、2重量%になるように各セルロース誘導体又はポリビニルピロリドンをPBSに溶解して調製した各PBS溶液を粘性解析装置レオロジースペクトロメータSKR100(ヤマト科学社)を用いて、30℃、測定時間60秒にて、200rpm、400rpm、600rpm、800rpmの各回転速度で測定した結果の平均として求めた(表4)。
CMC(シグマアルドリッチ社#C4888)およびテトラスパニン膜タンパク質(CD9およびCD63)に対する抗体を用いた免疫沈降法によるEV回収およびEVからのマーカー(EML4−ALK融合遺伝子)RNAの検出への効果を検討した。
3日間無血清培地で培養したヒト肺癌細胞H2228の培養上清をサンプルとして用いた。培養上清を、2,000×g、4℃で5分間遠心し、0.22μmフィルター(ミリポア社製)で濾過した後、Amicon Ultra−15(ミリポア社製)を用いて100倍に濃縮した。
濃縮物を等量のPBS、EDTA/EGTA−PBS(濃縮物を希釈した後の各終濃度50mM)(ED/EG)、CMC−PBS(濃縮物を希釈した後の終濃度0.5重量%)(CMC)、またはEDTA/EGTA/CMC−PBS(濃縮物を希釈した後のそれぞれの終濃度37.5mM/37.5mM/0.5重量%)(ED/EG/C)で希釈し、抗CD9抗体(自社製)、抗CD63抗体(自社製)の各抗体を固定したDynabeads M−280 tosylactivated(ライフテクノロジーズ社)をそれぞれ0.26mg/mLとなるように添加した。4℃で一晩、回転反応させた後に、PBS−Tで3回洗浄し、miRNeasy micro kit(QIAGEN社製)を用いてトータルRNAを精製した。精製したトータルRNAからSuperScript(商標)IV First−Strand Synthesis System(Thermo Fisher Scientific社製)を用いてcDNAを作成し、Droplet Digital PCR(BioRad社製)を用いてEML4−ALK mRNAを定量した(図10)。
EML4−ALK mRNAの検出には以下の表5に示す配列のプライマーおよび蛍光プローブを用いた。蛍光プローブとして、5’末端に蛍光物質HEXと、プローブの内部にZENクエンチャーと、3’末端にIowa Black(登録商標)クエンチャー(IABkFQ)とを有するダブルクエンチャープローブを用いた。表5に示す配列のプライマーおよび蛍光プローブを用いることにより、EML4−ALK融合遺伝子のバリアント3aおよび3bを検出することができる。
Claims (18)
- ポリマーの存在下で細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離することを含む、細胞外小胞の回収方法。
- ポリマーが、20〜30℃における1〜20重量%水溶液中の粘度として1.5mPa・s以上の値を有する、請求項1に記載の方法。
- ポリマーが、セルロース誘導体またはカルボニル含有親水性基を有するポリビニル誘導体である、請求項1または2に記載の方法。
- ポリマーが、少なくとも1つの水酸基の水素原子がカルボキシアルキルまたはヒドロキシアルキルで置換されたセルロース誘導体、または少なくとも1つの水素原子がラクタムで置換されたポリビニル誘導体である、請求項3に記載の方法。
- ポリマーが、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはポリビニルピロリドンである、請求項4に記載の方法。
- ポリマーが、10kDa以上の重量平均分子量を有する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離する際のポリマーの濃度が、0.01〜10.00重量%である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞外小胞含有試料とキレート剤を合わせることをさらに含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞外小胞が、エクソソームである、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記分離が、細胞外小胞膜結合物質を用いた分離法、または細胞外小胞含有試料の超遠心法により行われる、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞外小胞膜結合物質が、テトラスパニン膜タンパク質に対する抗体、または細胞外マトリクスメタロプロテアーゼ誘導物質に対する抗体である、請求項10に記載の方法。
- 細胞外小胞膜結合物質がCD9、CD63、CD81、またはCD147に対する抗体である、請求項11に記載の方法。
- 細胞外小胞含有試料が血液試料、尿、または唾液である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 以下を含む、細胞外小胞の分析方法:
(1)ポリマーの存在下で、細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離すること;および
(2)分離された細胞外小胞を分析すること。 - キレート剤の細胞外小胞含有試料への添加をさらに含む、請求項14に記載の方法。
- 分離された細胞外小胞中のタンパク質または核酸が分析される、請求項14または15に記載の方法。
- ポリマーおよび細胞外小胞膜結合物質を含む、キット。
- キレート剤をさらに含む、請求項17に記載のキット。
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