WO2020080387A1 - 細胞外小胞の回収方法 - Google Patents

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extracellular
extracellular vesicles
polymer
sample
pbs
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佑季 川▲崎▼
綾子 栗本
達俊 犬塚
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合同会社みらか中央研究所
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    • G01N33/567—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds utilising isolate of tissue or organ as binding agent

Definitions

  • the present invention relates to a method for collecting extracellular vesicles and the like.
  • Extracellular vesicles are microscopic vesicles with a membrane structure that are secreted by various types of cells and are present in body fluids such as blood or cell culture medium. Extracellular vesicles secreted extracellularly include exosomes, ectosomes, and apoptotic blebs. Since extracellular vesicles are a diverse population containing various substances having functions such as information transmission between cells, they have been analyzed for the purpose of diagnosis, drug discovery and the like. Therefore, development of a method for recovering extracellular vesicles useful for such analysis is required. For example, Patent Document 1 describes a method for collecting extracellular vesicles using a chelating agent.
  • Extracellular vesicles are mainly collected by immunoprecipitation using an antibody against the extracellular vesicle marker or ultracentrifugation.
  • the extracellular vesicles are not always highly efficiently recovered, and the recovered extracellular vesicles are nonspecifically concentrated, so that the quality varies.
  • an object of the present invention is to develop a new method capable of recovering extracellular vesicles.
  • a method for collecting extracellular vesicles which comprises separating extracellular vesicles from a sample containing extracellular vesicles in the presence of a polymer.
  • the polymer has a viscosity of 1.5 mPa ⁇ s or more in a 1 to 20 wt% aqueous solution at 20 to 30 ° C.
  • the polymer is a cellulose derivative or a polyvinyl derivative having a carbonyl-containing hydrophilic group.
  • the extracellular vesicle membrane-binding substance is an antibody against a tetraspanin membrane protein or an antibody against an extracellular matrix metalloprotease inducer.
  • the extracellular vesicle membrane-binding substance is an antibody against CD9, CD63, CD81, or CD147.
  • extracellular vesicles can be collected with higher efficiency and higher purity by using a predetermined polymer.
  • FIG. 1 is a sample obtained by immunoprecipitation with an anti-CD9 antibody of a serum sample diluted with PBS, EDTA / EGTA-PBS (“ED / EG”), or various CMC-PBS at various concentrations in Example 1.
  • FIG. 3 is a diagram showing Western blotting using the biotinylated anti-CD9 antibody of FIG.
  • FIG. 2 is a biotinylated sample obtained in Example 2 by immunoprecipitating a serum sample diluted with PBS or CMC-PBS at each concentration with an anti-CD9 antibody at 4 ° C. overnight or at 37 ° C. for 1 hour. It is a figure which shows the western blotting by anti-CD9 antibody.
  • FIG. 1 is a sample obtained by immunoprecipitation with an anti-CD9 antibody of a serum sample diluted with PBS, EDTA / EGTA-PBS (“ED / EG”), or various CMC-PBS at various concentrations in Example 1.
  • FIG. 3
  • FIG. 3 shows nanoparticle tracking of a sample obtained by immunoprecipitation with an anti-CD9 antibody of a serum sample diluted with PBS, EDTA / EGTA-PBS (“ED / EG”), or CMC-PBS in Example 3. It is a figure which shows the particle number measurement result by analysis.
  • FIG. 4 shows serum and five anticoagulants (heparin, EDTA, citric acid), ACD (acid-citric acid-dextrose, acid-citrate-dextrose), and CPD (citric acid-citric acid) in Example 4.
  • ED / EG EDTA / EGTA / CMC-PBS
  • FIG. 5A is a serum sample diluted with PBS, CMC-PBS, EDTA / EGTA-PBS (“ED / EG”), or EDTA / EGTA / CMC-PBS (“ED / EG / C”) in Example 5.
  • FIG. 3 is a diagram showing Western blotting with an anti-tetraspanin membrane protein antibody (anti-CD63 antibody and anti-CD81 antibody) of a sample obtained by immunoprecipitation with an anti-tetraspanin membrane protein antibody (anti-CD63 antibody and anti-CD81 antibody).
  • FIG. 3 is a diagram showing Western blotting with an anti-tetraspanin membrane protein antibody (anti-CD63 antibody and anti-CD81 antibody) of a sample obtained by immunoprecipitation with an anti-tetraspanin membrane protein antibody (anti-CD63 antibody and anti-CD81 antibody).
  • FIG. 5B is a serum sample diluted with PBS, CMC-PBS, EDTA / EGTA-PBS (“ED / EG”), or EDTA / EGTA / CMC-PBS (“ED / EG / C”) in Example 5.
  • FIG. 3 is a diagram showing Western blotting using a biotinylated anti-CD9 antibody of a sample obtained by an immunoprecipitation method using the anti-CD147 antibody.
  • FIG. 6 shows body fluids (urine and saliva, two samples each, represented as “# 1” and “# 2” in Example 6) of PBS, CMC-PBS and EDTA / EGTA-PBS (“ ED / EG ”), or EDTA / EGTA / CMC-PBS (“ ED / EG / C ”) diluted sample with anti-CD9 antibody.
  • FIG. 7A is a western blotting with a biotinylated anti-CD9 antibody of a sample obtained by immunoprecipitation with an anti-CD9 antibody of a serum sample diluted with PBS, various concentrations of HEC-PBS, or CMC-PBS in Example 7.
  • FIG. 7B is a western blotting with biotinylated anti-CD9 antibody of a sample obtained by immunoprecipitation with anti-CD9 antibody of a serum sample diluted with PBS, various HPC-PBS at various concentrations, or CMC-PBS in Example 7.
  • FIG. 7C is a Western blotting using a biotinylated anti-CD9 antibody of a sample obtained by immunoprecipitation with an anti-CD9 antibody of a serum sample diluted with PBS, various concentrations of HPMC-PBS, or CMC-PBS in Example 7.
  • FIG. 8 is a diagram showing Western blotting with a biotinylated anti-CD9 antibody of a sample obtained by an immunoprecipitation method with an anti-CD9 antibody of a serum specimen diluted with PBS or various PVP-PBS at various concentrations in Example 8. is there.
  • FIG. 9A shows Western blotting using a biotinylated anti-CD9 antibody of a sample obtained by immunoprecipitating a serum sample diluted with PBS or CMC-PBS with an anti-CD9 antibody at each temperature of 35 to 60 ° C. in Example 9.
  • FIG. 9B is a diagram showing Western blotting with an anti-CD63 antibody of a sample obtained by immunoprecipitating a serum sample diluted with CMC-PBS with an anti-CD63 antibody at each temperature of 35 to 60 ° C. in Example 9.
  • FIG. 9C is a diagram showing Western blotting with an anti-CD81 antibody of a sample obtained by immunoprecipitating a serum sample diluted with CMC-PBS with an anti-CD81 antibody at each temperature of 35 to 60 ° C. in Example 9. .
  • FIG. 9C is a diagram showing Western blotting with an anti-CD81 antibody of a sample obtained by immunoprecipitating a serum sample diluted with CMC-PBS with an anti-CD81 antibody at each temperature of 35 to 60 ° C. in Example 9. .
  • Example 11 shows PBS, CMC-PBS (“CMC”), EDTA / EGTA-PBS (“ED / EG”), or EDTA / EGTA / CMC-PBS (“ED / EG / C”) in Example 11.
  • 2 shows the amount of EML4-ALK mRNA detected (expressed by the fold change relative to the sample diluted with PBS) of the sample obtained by immunoprecipitation with anti-CD9 antibody or anti-CD63 antibody of the culture supernatant of human lung cancer cell H2228 diluted with It is a figure.
  • the present invention provides a method for collecting extracellular vesicles.
  • Extracellular vesicles are microscopic vesicles with a membrane structure that are secreted by various types of cells.
  • Extracellular vesicles include, for example, exosomes, ectosomes, and apoptotic vesicles.
  • the extracellular vesicles are exosomes.
  • Extracellular vesicles can also be defined by their size. The size of extracellular vesicles is, for example, 30 to 1000 nm, preferably 50 to 300 nm, and more preferably 80 to 200 nm.
  • the size of extracellular vesicles can be measured by, for example, a method based on Brownian motion of extracellular vesicles, a light scattering method, an electric resistance method, or the like.
  • the size of extracellular vesicles is measured by NanoSight (manufactured by Malvern Instruments).
  • the recovery method of the present invention includes the following steps: (1) Separation of extracellular vesicles from a sample containing extracellular vesicles in the presence of a polymer.
  • An extracellular vesicle-containing sample is any sample containing extracellular vesicles.
  • the extracellular vesicle-containing sample is a biological fluid sample.
  • the extracellular vesicle-containing sample may be subjected to other treatments before being used in the method of the present invention. Such treatments include, for example, centrifugation, extraction, filtration, precipitation, heating, freezing, refrigerating, and stirring.
  • the extracellular vesicle-containing sample is a culture supernatant.
  • the culture supernatant may be a cell culture supernatant or a tissue culture supernatant.
  • organisms from which cells or tissues to be cultured are derived from mammals (eg, primates such as humans and monkeys; rodents such as mice, rats and rabbits; livestock such as cows, pigs and goats; and horses).
  • Working animals such as sheep
  • animals such as birds (eg, chicken), insects, microorganisms (eg, bacteria), plants, and fish.
  • the organism is a mammal such as human.
  • the extracellular vesicle-containing sample is body fluid.
  • the body fluid is a body fluid derived from the organism as described above.
  • body fluids include blood samples (eg, whole blood, serum and plasma), urine, saliva, lymph, tissue fluid, cerebrospinal fluid, ascites, sweat, semen, tears, mucus, milk, pleural fluid, bronchoalveolar.
  • Examples include lavage fluid and amniotic fluid.
  • the body fluid is a blood sample, urine or saliva.
  • the plasma include plasma containing heparin plasma, citrate plasma, sodium fluoride plasma, ACD (acid-citrate-dextrose) or CPD (citrate phosphate dextrose).
  • extracellular vesicles are recovered by mixing a larger amount of protein (eg, albumin, lysozyme, lactoferrin, histatin, peroxidase, agglutinin, defensin, immunoglobulin) than that in the culture supernatant. Difficulty in body fluids (eg blood, urine, saliva).
  • protein eg, albumin, lysozyme, lactoferrin, histatin, peroxidase, agglutinin, defensin, immunoglobulin
  • body fluids eg blood, urine, saliva.
  • the polymer used in the present invention is preferably a water-soluble polymer.
  • the “water-soluble polymer” refers to a polymer having a solubility in water at 4 to 80 ° C. (preferably 4 to 37 ° C.) of 0.01% by weight or more.
  • the solubility of the water-soluble polymer in water at 4 to 80 ° C (preferably 4 to 37 ° C) may be preferably 0.05% by weight or more, more preferably 0.1% by weight or more.
  • the polymer may have a viscosity of, for example, 1.5 mPa ⁇ s or more in a 1 to 20 wt% aqueous solution at 20 to 30 ° C.
  • the viscosity of the polymer under the above-mentioned conditions is preferably 5 mPa ⁇ s or more, more preferably 10 mPa ⁇ s or more, even more preferably 20 mPa ⁇ s or more, still more preferably 30 mPa ⁇ s or more, and particularly preferably 35 mPa ⁇ s. It may be more than.
  • the viscosity of the polymer under the above conditions is preferably 30,000 mPa ⁇ s or less, more preferably 20,000 mPa ⁇ s or less, still more preferably 10,000 mPa ⁇ s or less, still more preferably 5000 mPa ⁇ s or less, particularly preferably 1000 mPa ⁇ s. It may be the following.
  • the viscosity of the polymer under the above-mentioned conditions is preferably 5 to 30,000 mPa ⁇ s, more preferably 10 to 20,000 mPa ⁇ s, still more preferably 20 to 10,000 mPa ⁇ s, still more preferably 30 to It may be 5000 mPa ⁇ s, particularly preferably 35 to 1000 mPa ⁇ s.
  • the polymer has, for example, a viscosity of 1.5 mPa ⁇ s or more at 30 ° C. in a PBS solution in which the polymer is dissolved in phosphate buffered saline (PBS) to a concentration of 2% by weight. May have a value of.
  • the viscosity of the polymer under the above-mentioned conditions is preferably 5 mPa ⁇ s or more, more preferably 10 mPa ⁇ s or more, even more preferably 20 mPa ⁇ s or more, still more preferably 30 mPa ⁇ s or more, and particularly preferably 35 mPa ⁇ s. It may be more than.
  • the viscosity of the polymer under the above conditions is preferably 30,000 mPa ⁇ s or less, more preferably 20,000 mPa ⁇ s or less, still more preferably 10,000 mPa ⁇ s or less, still more preferably 5000 mPa ⁇ s or less, particularly preferably 1000 mPa ⁇ s. It may be the following.
  • the viscosity of the polymer under the above-mentioned conditions is preferably 5 to 30,000 mPa ⁇ s, more preferably 10 to 20,000 mPa ⁇ s, still more preferably 20 to 10,000 mPa ⁇ s, still more preferably 30 to It may be 5000 mPa ⁇ s, particularly preferably 35 to 1000 mPa ⁇ s.
  • the viscosity of the polymer can be measured, for example, by detecting the viscosity friction torque of the liquid generated on the outer circumference of the rotor when the liquid sample is rotated by a rotating body (method using a rotational viscometer) or in a measuring tube filled with the sample. Can be measured by a method in which the falling weight is allowed to fall freely, and the falling time is measured (method using a falling ball viscometer).
  • the vibrating body viscosity sensor
  • the vibration amplitude of the polymer is suppressed and decreased by the viscous resistance as the liquid viscosity increases.
  • the viscosity of the polymer can be measured using, for example, a viscosity analyzer (eg, Rheology Spectrometer SKR100, Yamato Scientific Co., Ltd.).
  • the polymer may be, for example, a cellulose derivative, a polyvinyl derivative having a hydrophilic group, or a polyether compound.
  • the cellulose derivative is a cellulose derivative in which at least one hydrogen atom of a hydroxyl group of cellulose is substituted with a hydrophilic group.
  • the hydrophilic group in the cellulose derivative include carboxyalkyl (eg, carboxy C 1-6 alkyl) and hydroxyalkyl (eg, hydroxy C 1-6 alkyl).
  • the hydrophilic group in the cellulose derivative is preferably carboxyalkyl or hydroxyalkyl.
  • carboxyalkyl examples include carboxymethyl, carboxyethyl (1-carboxyethyl, 2-carboxyethyl), carboxypropyl (1-carboxypropyl, 2-carboxypropyl, 3-carboxypropyl), carboxyisopropyl (1-carboxy- 2-methylethyl, 2-carboxy-2-methylethyl), carboxybutyl (1-carboxybutyl, 2-carboxybutyl, 3-carboxybutyl, 4-carboxybutyl), carboxy t-butyl, carboxypentyl (1-carboxy) Pentyl, 2-carboxypentyl, 3-carboxypentyl, 4-carboxypentyl, 5-carboxypentyl), carboxyhexyl (1-carboxyhexyl, 2-carboxyhexyl, 3-carboxyhexyl) , 4-carboxy-hexyl, 5-carboxy-hexyl,
  • hydroxyalkyl examples include hydroxymethyl, hydroxyethyl (1-hydroxyethyl, 2-hydroxyethyl), hydroxypropyl (1-hydroxypropyl, 2-hydroxypropyl, 3-hydroxypropyl), hydroxyisopropyl (1-hydroxy-).
  • the cellulose derivative examples include carboxymethyl cellulose (CMC), hydroxyethyl cellulose (HEC), hydroxypropyl cellulose (HPC), and hydroxypropyl methyl cellulose (HPMC).
  • CMC carboxymethyl cellulose
  • HEC hydroxyethyl cellulose
  • HPMC hydroxypropyl methyl cellulose
  • the cellulose derivative also includes a nanocellulose derivative.
  • the nanocellulose derivative is a derivative of nanocellulose described later.
  • the polyvinyl derivative having a hydrophilic group is a polyvinyl derivative in which at least one hydrogen atom is replaced with a hydrophilic group, and a polyvinyl derivative in which one hydrogen atom in a methylene unit is replaced with a hydrophilic group is preferable.
  • the hydrophilic group of the polyvinyl derivative include a carbonyl-containing hydrophilic group, a carboxy-containing hydrophilic group, a nitrogen-containing hydrophilic group, and a ring (carbocycle or heterocycle) -containing hydrophilic group.
  • the hydrophilic group of the polyvinyl derivative is preferably a carbonyl-containing hydrophilic group, a nitrogen-containing hydrophilic group, or a heterocycle-containing hydrophilic group, and a lactam (eg, ⁇ -lactam, ⁇ -lactam, ⁇ -lactam, ⁇ -lactam, ( ⁇ -lactam) is more preferable.
  • a lactam eg, ⁇ -lactam, ⁇ -lactam, ⁇ -lactam, ⁇ -lactam, ( ⁇ -lactam
  • Specific examples of the polyvinyl derivative having a hydrophilic group include polyvinylpyrrolidone.
  • the polyether compound is a polymer having an ether structure in the main chain of repeating units.
  • the polyether compound include polyalkyleneoxy compounds (eg, poly C 1-6 alkyleneoxy compounds).
  • examples of the polyalkyleneoxy compound include polyethylene glycol and polypropylene glycol.
  • the polyalkyleneoxy compound is preferably polyethylene glycol.
  • ⁇ Nanocellulose is a fibrous cellulose having a fiber width on the order of nanometers.
  • the fiber width of the nanocellulose may be, for example, 500 nm or less, preferably 200 nm or less, more preferably 100 nm or less, even more preferably 50 nm or less, still more preferably 10 nm or less, and particularly preferably 5 nm or less.
  • Cellulose derivatives, polyvinyl derivatives having hydrophilic groups, and polyether compounds also include salts thereof.
  • the salt include salts of metals (eg, monovalent metals such as lithium, sodium, potassium, rubidium, and cesium, and divalent metals such as calcium, magnesium, and zinc), and inorganic bases (eg, Ammonia) salt.
  • the polymer may have a weight average molecular weight of, for example, 10 kDa or more in order to achieve the object of the present invention.
  • the weight average molecular weight of the polymer may be preferably 12 kDa or higher, more preferably 14 kDa or higher, even more preferably 16 kDa or higher, even more preferably 18 kDa or higher, and particularly preferably 20 kDa or higher.
  • the weight average molecular weight of the polymer may be preferably 5000 kDa or less, more preferably 3000 kDa or less, even more preferably 2000 kDa or less, still more preferably 1000 kDa or less, and particularly preferably 500 kDa or less.
  • the weight average molecular weight of the polymer is preferably 12 to 5000 kDa, more preferably 14 to 3000 kDa, even more preferably 16 to 2000 kDa, still more preferably 18 to 1000 kDa, and particularly preferably 20 to 500 kDa. It may be.
  • the concentration of the polymer in the step of separating extracellular vesicles is particularly preferably as long as it is a concentration at which the extracellular vesicles can be recovered with high efficiency as compared with the case where the polymer is not contained and the polymer can be dissolved in the solution used in the separation step Not limited.
  • concentration varies depending on the kind of the polymer, it is, for example, 0.01 to 10.00% by weight, preferably 0.05 to 7.50% by weight, more preferably 0.10 to 5.00% by weight. It may be.
  • the separation step in the present invention is different from the separation by the coprecipitation method using a coprecipitable polymer (eg, polyethylene glycol precipitation). Therefore, the polymer used in the present invention is preferably a non-coprecipitable polymer.
  • the polymer may be present in the separation step, and therefore the recovery method of the present invention may include combining the extracellular vesicle-containing sample and the polymer.
  • the extracellular vesicles may be separated from the extracellular vesicle-containing sample after combining the extracellular vesicle-containing sample and the polymer.
  • a polymer is added to a solution containing the extracellular vesicle membrane-binding substance in advance, and an extracellular vesicle-containing sample is added to the polymer. You may add.
  • the recovery method of the present invention may further include combining an extracellular vesicle-containing sample with a chelating agent.
  • the extracellular vesicles may be separated from the extracellular vesicle-containing sample in the presence of the polymer and the chelating agent. May be added simultaneously, the chelating agent may be added after adding the polymer to the extracellular vesicle-containing sample, or the polymer may be added after adding the chelating agent to the extracellular vesicle-containing sample. Good.
  • a polymer and a chelating agent are added in advance to a solution containing the extracellular vesicle membrane-binding substance, and the extracellular vesicle is added to this. You may add a content sample.
  • the chelating agent is a compound or a salt thereof having a coordinating moiety capable of coordinating with a metal ion.
  • the number of coordination moieties is preferably 2 or more, more preferably 3 or more (eg, 3 or 6).
  • Examples of the coordinating atom as the coordinating moiety include an oxygen atom, a phosphorus atom, a nitrogen atom, a sulfur atom, and a chlorine atom.
  • the coordinating atom is preferably an oxygen atom or a phosphorus atom, more preferably an oxygen atom.
  • Examples of the coordinating group as the coordinating moiety include groups having the above coordinating atom.
  • the coordinating group is preferably a carboxylic acid group or a phosphoric acid group, more preferably a carboxylic acid group.
  • chelating agent examples include oxalic acid, hydroxyethyliminodiacetic acid (HIDA), nitrilotriacetic acid (NTA), hydroxyethylethylenediaminetriacetic acid (HEDTA), ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), ethylenediaminetetra (methylenephosphonic acid) (EDTMP), glycol ether diamine tetraacetic acid (EGTA), and salts thereof.
  • HIDA hydroxyethyliminodiacetic acid
  • NDA nitrilotriacetic acid
  • HEDTA hydroxyethylethylenediaminetriacetic acid
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • EDTMP ethylenediaminetetra (methylenephosphonic acid)
  • EGTA glycol ether diamine tetraacetic acid
  • the salt examples include metal salts (eg, monovalent metal salts such as sodium salts and potassium salts, and divalent metal salts such as calcium salts and magnesium salts), inorganic salts (eg, fluorides, chlorides, Bromides, halide salts such as iodides, and ammonium salts), organic salts (eg, ammonium salts substituted with an alkyl group), and acid addition salts (eg, sulfuric acid, hydrochloric acid, hydrobromic acid, nitric acid, phosphoric acid) And salts with inorganic acids, and salts of organic acids such as acetic acid, oxalic acid, lactic acid, citric acid, trifluoromethanesulfonic acid and trifluoroacetic acid).
  • a mixture of two or more (eg, 2, 3, 4, 5, etc.) chelating agents may be used for separating the extracellular vesicle-containing sample.
  • Chelating agents are effective in recovering extracellular vesicles with high purity, probably by suppressing adsorption of contaminants to extracellular vesicles (International Publication No. 2018/070479). Therefore, separating extracellular vesicles from a sample containing extracellular vesicles in the presence of a polymer and a chelating agent has a synergistic effect on improving the recovery efficiency of extracellular vesicles. Since all of the above-mentioned chelating agents are effective in recovering extracellular vesicles with high purity, the same synergistic effect is provided by the combined use with a polymer.
  • the concentration of the chelating agent in the step of separating extracellular vesicles is not particularly limited as long as it is a concentration that can suppress adsorption of contaminants to the extracellular vesicles and can dissolve the chelating agent in the solution used in the separating step.
  • a concentration varies depending on the type of chelating agent, it is, for example, 1 mM to 200 mM.
  • the chelating agent concentration may be 10 mM or higher, 15 mM or higher, 20 mM or higher, 30 mM or higher, 40 mM or higher, or 50 mM or higher.
  • Such a concentration may also be 200 mM or less, 180 mM or less, 160 mM or less, 140 mM or less, 120 mM or less, or 100 mM or less, though it depends on the kind of the chelating agent.
  • Step (1) Separation of extracellular vesicles from a sample containing extracellular vesicles in the presence of a polymer (step (1)) is performed, for example, by a separation method using an extracellular vesicle membrane-binding substance or an ultracentrifugation method. be able to. Separation using an extracellular vesicle membrane-binding substance may be performed in the course of an analytical method (eg, immunoassay described later).
  • an analytical method eg, immunoassay described later.
  • the extracellular vesicle membrane-binding substance When the extracellular vesicle membrane-binding substance is used to separate extracellular vesicles, the extracellular vesicle membrane-binding substance is mixed with the sample containing extracellular vesicle membranes to separate the extracellular vesicle membrane-binding substance from the extracellular vesicle membrane-binding substance.
  • the extracellular vesicles can be collected by binding to the vesicles and then separating the extracellular vesicles bound with the extracellular vesicle membrane-binding substance from the sample.
  • the extracellular vesicles in the extracellular vesicle-containing sample are precipitated by the ultracentrifugation method, and then the supernatant is discarded to remove the extracellular vesicles. Can be recovered. Furthermore, when the extracellular vesicles are separated in the course of the analysis method, the extracellular vesicles can be separated by removing the solution or washing the solid phase in the analysis method (eg, immunoassay such as ELISA).
  • extracellular vesicles can be separated along with binding of extracellular vesicles to an antibody and removal of a solution containing a sample containing extracellular vesicles and / or washing of a solid phase. Separation is preferably isolation or purification. Therefore, the recovery method of the present invention can also be utilized as an isolation or purification method.
  • the extracellular vesicle membrane-binding substance used in the recovery method of the present invention is a substance having an affinity for the extracellular vesicle marker.
  • extracellular vesicle markers include tetraspanin membrane protein (extracellular vesicle membrane-specific four-pass membrane protein, eg, CD9, CD63, CD81), extracellular matrix metalloproteinase inducer (CD147), carcinoembryonic Antigen (Carcinoembryonic antigen, CEA), heat shock protein (HSP) 70, HSP90, major histocompatibility complex (MHC) I, tumor susceptibility gene (TSG) 101, lysosomal associated membrane protein (LAMP) 1, intercellular adhesion molecule (ICAM) -1, integrin, ceramide, cholesterol, phosphatidylserine, ALIX, Annexins, Caveolin-I, Flotillin-I, Rab protein, EpCAM and the like can be mentioned.
  • IAM intercellular adhe
  • the extracellular vesicle marker is preferably tetraspanin membrane protein, extracellular matrix metalloprotease inducer.
  • the extracellular vesicle marker is preferably CD9, CD63, CD81, or CD147.
  • Examples of the extracellular vesicle membrane-binding substance include antibodies (eg, monoclonal antibodies, polyclonal antibodies) and antigen-binding fragments thereof, aptamers, phosphatidylserine-binding proteins, and ceramide-binding proteins.
  • the antigen-binding fragment may be any antibody fragment that maintains the binding property to the target extracellular vesicle marker, and examples thereof include Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 and scFv.
  • the extracellular vesicle membrane-binding substance is preferably an antibody or an antigen-binding fragment thereof, more preferably a monoclonal antibody or an antigen-binding fragment thereof.
  • the extracellular vesicle membrane-binding substance used when collecting the extracellular vesicles may be a single substance or a combination of plural substances.
  • the extracellular vesicle membrane-binding substance may be bound to a solid phase for facilitating the separation of extracellular vesicles.
  • a solid phase for example, sepharose beads, agarose beads, magnetic beads, or plastic plates can be used. Immobilization of the extracellular vesicle membrane-binding substance on the solid phase can be performed by a conventional method well known to those skilled in the art.
  • the polymer mixes at least the extracellular vesicle membrane-binding substance and the extracellular vesicle-containing sample.
  • the extracellular vesicle membrane-binding substance and the extracellular vesicle membrane-binding substance and the extracellular vesicle membrane-binding substance are mixed by mixing the extracellular vesicle membrane-binding substance bound to the magnetic beads and the extracellular vesicle-containing sample in the presence of a polymer.
  • Extracellular vesicles bound to beads can be separated from the extracellular vesicle-containing sample.
  • a method well known to those skilled in the art can be used for collecting the magnetic beads. Further, for example, when using Sepharose beads or agarose beads, by mixing the extracellular vesicle membrane-binding substance bound to these beads and the extracellular vesicle-containing sample in the presence of a polymer, the extracellular vesicle membrane-bound substance is bound.
  • Cells bound to beads by binding the substance to extracellular vesicles in the sample containing extracellular vesicles, precipitating the beads by centrifugation, and discarding the supernatant containing the components not bound to the beads
  • the outer vesicles can be separated from the extracellular vesicle-containing sample.
  • a method of precipitating the beads by centrifugation a method well known to those skilled in the art can be used.
  • the temperature at which the extracellular vesicle membrane-binding substance and the extracellular vesicle-containing sample are mixed is The temperature may be any temperature as long as the mixture of the extracellular vesicle membrane-binding substance and the extracellular vesicle-containing sample is in a liquid state, and may be 0 to 100 ° C. Such a temperature may be, for example, 4 ° C. or higher, preferably 15 ° C. or higher, more preferably 35 ° C. or higher, even more preferably 40 ° C. or higher.
  • Such a temperature may also be, for example, 80 ° C. or lower, preferably 70 ° C. or lower, more preferably 60 ° C. or lower, still more preferably 50 ° C. or lower. More specifically, such a temperature may be, for example, 4 to 80 ° C., preferably 15 to 70 ° C., more preferably 35 to 60 ° C., and further preferably 40 to 50 ° C.
  • the time for binding the extracellular vesicle membrane-binding substance and the extracellular vesicle is not particularly limited as long as it is a time sufficient for the extracellular vesicle membrane-binding substance to bind to the extracellular vesicle, and for example, 1 minute. It may be 5 minutes or more, 10 minutes or more, or 20 minutes or more. Such time may also be 24 hours or less, 18 hours or less, 8 hours or less, 4 hours or less, 2 hours or less, or 1 hour or less.
  • the polymer when the extracellular vesicles are collected by ultracentrifugation, the polymer may be present when the extracellular vesicle-containing sample is subjected to ultracentrifugation.
  • at least one ultracentrifugation may be performed in the presence of the polymer.
  • Ultracentrifugation can be performed using an ultracentrifuge.
  • the gravity applied in ultracentrifugation may be, for example, 10,000 ⁇ g to 200,000 ⁇ g, preferably 70,000 ⁇ g to 150,000 ⁇ g.
  • the ultracentrifugation time is, for example, 0.5 to 24 hours, preferably 1 to 5 hours.
  • the temperature in ultracentrifugation is, for example, 4 to 30 ° C. Ultracentrifugation may be performed once or multiple times (eg, twice, three times).
  • the present invention also provides a method for analyzing extracellular vesicles.
  • the analytical method of the present invention comprises: (1) separating extracellular vesicles from a sample containing extracellular vesicles in the presence of a polymer; and (2) analyzing the separated extracellular vesicles.
  • the step (1) in the analysis method of the present invention can be performed in the same manner as the step (1) in the recovery method of the present invention.
  • step (2) the separated extracellular vesicles are analyzed.
  • the target to be analyzed is, for example, a component contained in the extracellular vesicle (eg, a component contained in the extracellular vesicle, a membrane component of the extracellular vesicle, or a substance present on the membrane surface of the extracellular vesicle). Components) and extracellular vesicles themselves (particles).
  • a component contained in extracellular vesicles When a component contained in extracellular vesicles is analyzed, the analysis is detection or quantification of the component. Such an analysis is also a one or more component analysis.
  • Components to be analyzed include, for example, proteins, nucleic acids (eg RNA, DNA), sugars, lipids, amino acids, vitamins, polyamines, and peptides. Separation of extracellular vesicles from a sample containing extracellular vesicles in the presence of polymer can increase the recovery of extracellular vesicles. Therefore, according to the analysis method of the present invention, components such as proteins and nucleic acids in extracellular vesicles can be analyzed with high accuracy.
  • the components can be analyzed by any method known in the art.
  • the component to be analyzed is a protein
  • examples of the analysis method include immunoassay and mass spectrometry.
  • Immunoassays include, for example, direct competition method, indirect competition method, and sandwich method.
  • immunoassays include chemiluminescent immunoassay (CLIA) [eg, chemiluminescent enzyme immunoassay (CLEIA)], immunoturbidimetric assay (TIA), enzyme immunoassay (EIA) (eg, direct competitive ELISA).
  • CLIA chemiluminescent immunoassay
  • TIA immunoturbidimetric assay
  • EIA enzyme immunoassay
  • Proteome analysis may be performed when multiple components are analyzed.
  • the analysis method includes, for example, a hybridization method using a probe, a reverse transcription (RT) reaction using a reverse transcriptase, a primer (eg, 2, 3 or 4 primers).
  • the gene amplification method (eg, PCR method such as quantitative PCR, RT-PCR, etc.) using, sequencing, and mass spectrometry can be mentioned.
  • the analysis method include immunoassay and mass spectrometry.
  • Metabolome analysis may be performed when multiple components are analyzed.
  • the analysis method of the present invention can be used to detect a marker contained in extracellular vesicles.
  • the marker contained in the extracellular vesicle include a marker that serves as an indicator of the presence of extracellular vesicles and a marker that serves as an indicator of diseases such as cancer (eg, diagnostic marker, disease risk assessment marker).
  • the marker serving as an indicator of the presence of extracellular vesicles examples include tetraspanin membrane protein (extracellular vesicle membrane-specific four-pass membrane protein, eg, CD9, CD63, CD81), extracellular matrix metalloproteinase inducer ( CD147), carcinoembryonic antigen (CEA), heat shock protein (HSP) 70, HSP90, major histocompatibility complex (MHC) I, tumor susceptibility gene (TSG) 101, lysosomal associated membrane protein (LAMP).
  • extracellular vesicle membrane-specific four-pass membrane protein eg, CD9, CD63, CD81
  • extracellular matrix metalloproteinase inducer CD147
  • CEA carcinoembryonic antigen
  • HSP heat shock protein
  • MHC major histocompatibility complex
  • TSG tumor susceptibility gene
  • LAMP lysosomal associated membrane protein
  • ICM intercellular adhesion molecule
  • integrin 1, integrin, ceramide, cholesterol, phosphatidylserine, ALIX, Annexins, Caveolin-I, Flotillin-I, Rab protein, EpCAM, and these proteins Nucleic acid encoding (eg, DNA, RNA) and the like.
  • markers that is an index of disease include, for example, extracellular vesicles derived from organisms affected by diseases such as cancer or proteins specifically present in extracellular vesicles secreted from abnormal cells such as cancer cells (hereinafter , “Abnormal protein.” Examples include mutant proteins and foreign proteins. Examples of the mutein include fusion proteins such as EML4-ALK.
  • EML4-ALK has variants 1, 2, 3a, 3b, 4,5a, 5b, 6 and the like.
  • foreign proteins include virus-derived proteins.
  • the marker which is an indicator of disease also includes the presence or absence of expression of nucleic acids encoding these proteins, or changes in the amount thereof, and mutations such as SNPs, haplotypes, translocations, presence or absence of methylation of nucleic acids, and There are various types of variants.
  • extracellular vesicles themselves can be carried out by, for example, a particle analysis device, an electron microscope, a flow cytometer, or other device.
  • a particle analysis device an electron microscope, a flow cytometer, or other device.
  • the number of extracellular vesicle particles, the size and shape of the particles, and their distribution can be analyzed.
  • the recovery method and analysis method of the present invention are useful, for example, in extracellular vesicle-based diagnosis and drug discovery.
  • detection of EML4-ALK which is a cancer marker for lung cancer and the like, by the analysis method of the present invention can be useful as an index for determining the administration of an ALK tyrosine kinase inhibitor such as crizonitib and alectinib to a cancer patient such as lung cancer.
  • the invention provides a method of analyzing extracellular vesicles, including: (1) Separation of extracellular vesicles from a sample containing extracellular vesicles using an extracellular vesicle membrane-binding substance; and (2) of diseases such as cancer contained in the separated extracellular vesicles. Analyze the markers that serve as indicators.
  • Examples of the extracellular vesicle membrane-binding substance in the present embodiment include substances having an affinity for the extracellular vesicle marker described above.
  • the extracellular vesicle marker is preferably tetraspanin membrane protein, extracellular matrix metalloprotease inducer.
  • the extracellular vesicle marker is preferably CD9, CD63, CD81, or CD147, more preferably CD9 or CD63.
  • Examples of the extracellular vesicle membrane-binding substance include the above-mentioned antibodies (eg, monoclonal antibodies, polyclonal antibodies) and antigen-binding fragments thereof, aptamers, phosphatidylserine-binding proteins, and ceramide-binding proteins.
  • abnormal protein The presence or absence of expression of the above-mentioned abnormal protein or a change in the amount thereof can be mentioned as a marker serving as an index of diseases such as cancer.
  • abnormal proteins include fusion proteins such as EML4-ALK.
  • marker that is an indicator of disease the presence or absence of the expression of nucleic acids encoding these proteins, or changes in the amount thereof, and mutations such as SNPs, haplotypes, translocations, the presence or absence of methylation of nucleic acids, and There are various types of variants.
  • the present invention also provides a kit containing a polymer as described above and an extracellular vesicle membrane-binding substance.
  • the kit of the present invention may further contain a chelating agent.
  • the kit of the present invention is useful, for example, for convenient implementation of the recovery method and analysis method of the present invention.
  • Example 1 Commercially available three types of CMC sodium salts (hereinafter simply referred to as "CMC”. CAS No. 9004-32-4, Nacalai Tesque Co. # 07326-95 (average molecular weight unknown), Sigma-Aldrich Co. # C5678 (average molecular weight 90 kDa). , # C4888 (average molecular weight 250 kDa)) on EV recovery was examined. EV recovery was performed using anti-CD9 antibody.
  • CMC CMC sodium salts
  • Serum of healthy person was centrifuged at 20,000 ⁇ g for 15 minutes at 4 ° C., and 200 ⁇ L of serum was added to 200 ⁇ L of PBS (2.9 mM NaH 2 PO 4 , 9.0 mM Na 2 HPO 4 , 137 mM NaCl), EDTA / EGTA.
  • Example 2 The effects of the concentration of CMC (Sigma Aldrich # C4888) (final concentration of 0.06 wt% to 1.0 wt%) and the reaction temperature (4 ° C., 37 ° C.) on EV recovery were examined. Serum of healthy person was centrifuged at 20,000 xg for 15 minutes at 4 ° C, and 200 ⁇ L of serum was added to 200 ⁇ L of PBS or CMC-PBS (so that the final concentration after dilution of serum was 0.06 to 1.0% by weight).
  • CMC Sigma Aldrich # C4888
  • Example 3 The effect of CMC (Sigma Aldrich # C4888) on EV recovery was examined by nanoparticle tracking analysis (NanoSight LM10, Quantum Design). After 200 ⁇ L of healthy human serum was centrifuged at 20,000 ⁇ g at 4 ° C. for 15 minutes, 200 ⁇ L of PBS and EDTA / EGTA-PBS (EDTA and EGTA at a final concentration of 50 mM after dilution with serum were added to the supernatant).
  • CMC Sigma Aldrich # C4888
  • Extracellular vesicles were released from the antibody magnetic bead particles by neutralizing with HCl (pH 8.0). After quantifying the total protein concentration by Qubit protein assay (Life Technologies), 450 ⁇ L of PBS was added and the number of particles was analyzed by NanoSight (FIG. 3). An increase in the total number of EV particles recovered and the number of particles per total protein was observed under the condition diluted with CMC, indicating that extracellular vesicles were recovered with high purity.
  • Example 4 Serum and 5 kinds of anticoagulants (heparin, EDTA, citric acid), ACD (acid-citric acid-dextrose; acid-citrate-dextrose), CPD (citric acid-phosphoric acid-dextrose; citrate phosphate dextrose)
  • CMC Sigma Aldrich # C4888
  • the magnetic beads were washed 3 times with PBS-T and diluted with a sample buffer (BIO-RAD) to prepare a sample for Western blotting.
  • Immunoprecipitation efficiency was analyzed by Western blotting using a biotinylated anti-CD9 antibody (Fig. 4). Regardless of the type of anticoagulant, the effect of improving the EV recovery efficiency by CMC was observed in plasma samples. Further, the EV recovery efficiency was further improved by combining CMC and the chelating agent.
  • Example 5 The effect of CMC (Sigma Aldrich # C4888) on EV recovery using antibodies against two types of tetraspanin membrane proteins (CD63 and CD81) other than CD9 and an extracellular matrix metalloproteinase inducer (CD147) was examined. After 200 ⁇ L of healthy human serum was centrifuged at 20,000 ⁇ g at 4 ° C.
  • Example 6 The effect of CMC (Sigma Aldrich # C4888) on EV recovery in two types of body fluids (urine and saliva) was examined. 200 ⁇ L of normal human urine and saliva (2 samples each, designated as “# 1” and “# 2”) were centrifuged at 15,000 ⁇ g, 4 ° C. for 15 minutes and filtered through a 0.22 ⁇ m filter.
  • Example 7 The effect of the cellulose derivatives shown in Table 2 below (each final concentration of 0.13 wt% to 4.0 wt%) on EV recovery was examined. Serum of healthy person was centrifuged at 20,000 xg at 4 ° C for 15 minutes, and 200 ⁇ L of serum was added to 200 ⁇ L of PBS, CMC-PBS (final concentration 0.5% by weight after dilution of serum) (CMC), or PBS.
  • CMC-PBS final concentration 0.5% by weight after dilution of serum
  • Magnetic beads (Dynabeads M-280 tosylivated (Life Technologies)) diluted with dissolved cellulose derivative (each final concentration after serum dilution 0.13 to 4.0% by weight) and fixed with anti-CD9 antibody (manufactured by in-house) was added at 0.26 mg / mL. After rotating reaction at 37 ° C. for 1 hour, the magnetic beads were washed 3 times with PBS-T and diluted with a sample buffer (BIO-RAD) to prepare a sample for Western blotting. The recovery efficiency of EV was analyzed by Western blotting using a biotinylated anti-CD9 antibody (FIGS. 7A to 7C).
  • HEC cellulose derivatives other than CMC as compared with the PBS diluted sample
  • HPC HPC was 0.25% by weight
  • HPMC 0.25 wt% to 2.0 wt%
  • Example 8 The effect of polyvinylpyrrolidone (final concentrations of 1% by weight, 2% by weight and 4% by weight) shown in Table 3 below on EV recovery was examined. Serum of healthy person was centrifuged at 20,000 ⁇ g for 15 minutes at 4 ° C., and then 200 ⁇ L of serum was dissolved in 200 ⁇ L of PBS or polyvinylpyrrolidone dissolved in PBS (final concentration after serum dilution was 1.0 to 4.0% by weight). %), And magnetic beads (Dynabeads M-280 tosylactivated (Life Technologies)) to which anti-CD9 antibody (manufactured by in-house) was immobilized were added to 0.26 mg / mL.
  • Example 9 The effect of CMC (Sigma Aldrich # C4888) on EV recovery at each reaction temperature of 35 ° C. to 60 ° C. was examined. Healthy human serum was centrifuged at 20,000 ⁇ g for 15 minutes at 4 ° C., and then 100 ⁇ L of serum was diluted with 100 ⁇ L of PBS or CMC-PBS (final concentration after dilution of serum was 0.5% by weight) to obtain anti-CD9 antibody. 0.26 mg / mL of magnetic beads (Dynabeads M-280 tosylivated (Life Technologies)) immobilized with (in-house), anti-CD63 antibody (8A12: Cosmobio) or anti-CD81 antibody (12C4: Cosmobio) was added.
  • CMC Sigma Aldrich # C4888
  • the recovery efficiency of EV was analyzed by Western blotting using a biotinylated anti-CD9 antibody (manufactured in-house), anti-CD63 antibody (manufactured in-house) and anti-CD81 antibody (12C4: Cosmo Bio Inc.) (FIGS. 9A to 9C).
  • the effect of improving the EV recovery efficiency was recognized at each reaction temperature of 35 ° C to 60 ° C by the addition of CMC.
  • a higher effect of improving the EV recovery efficiency was recognized by adding CMC under a high temperature condition of 40 ° C. or higher. Further, the effect of improving the EV recovery efficiency by CMC was recognized even in the reaction for a short time.
  • Example 10 The viscosity of the cellulose derivative used in Example 7 and the polyvinylpyrrolidone used in Example 8 in a PBS solution was measured. Specifically, each PBS solution prepared by dissolving each cellulose derivative or polyvinylpyrrolidone in PBS so as to be 2% by weight is measured at 30 ° C. using a viscosity analyzer Rheology Spectrometer SKR100 (Yamato Scientific Co., Ltd.). It was calculated as an average of the results measured at each rotation speed of 200 rpm, 400 rpm, 600 rpm, and 800 rpm at a time of 60 seconds (Table 4).
  • Example 11 The effect on EV recovery and detection of marker (EML4-ALK fusion gene) RNA from EV by immunoprecipitation using antibodies against CMC (Sigma Aldrich # C4888) and tetraspanin membrane proteins (CD9 and CD63) was examined.
  • the culture supernatant of human lung cancer cell H2228 cultured in serum-free medium for 3 days was used as a sample.
  • the culture supernatant was centrifuged at 2,000 ⁇ g at 4 ° C. for 5 minutes, filtered through a 0.22 ⁇ m filter (manufactured by Millipore), and then concentrated 100 times using Amicon Ultra-15 (manufactured by Millipore). .
  • the primers and fluorescent probe having the sequences shown in Table 5 below were used.
  • the fluorescent probe As the fluorescent probe, a double quencher probe having a fluorescent substance HEX at the 5'end, a ZEN quencher inside the probe, and an Iowa Black (registered trademark) quencher (IABkFQ) at the 3'end was used.
  • IABkFQ Iowa Black (registered trademark) quencher
  • EML4-ALK contained in EV recovered by immunoprecipitation was detected.
  • CMC CMC
  • the amount of EML4-ALK mRNA detected was increased, and the effect of improving EV recovery efficiency was confirmed.
  • the amount of EML4-ALK mRNA detected was further increased, and the effect of further improving EV recovery efficiency was confirmed.

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Abstract

本発明は、細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を回収する方法を提供する。より具体的には、本発明は、ポリマーの存在下で細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離することを含む、細胞外小胞の回収方法を提供する。

Description

細胞外小胞の回収方法
　本発明は、細胞外小胞の回収方法などに関する。
　細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅｓ：ＥＶ）は、さまざまな種類の細胞から分泌される、膜構造を有する微小な小胞であり、血液などの体液中あるいは細胞培養液中に存在する。細胞外に分泌される細胞外小胞には、エクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）、エクトソーム（ｅｃｔｏｓｏｍｅ）、アポトーシス胞（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ　ｂｌｅｂ）が含まれる。細胞外小胞は、細胞間の情報伝達等の機能を担う種々の物質を含む多様な集団であることから、診断、創薬等の目的のために解析されている。よって、このような解析に有用な細胞外小胞の回収方法の開発が求められている。例えば、特許文献１には、キレート剤を用いた細胞外小胞の回収方法が記載されている。
国際公開第２０１８／０７０４７９号
　細胞外小胞含有試料から高効率で細胞外小胞を回収することができれば、診断、創薬等の応用に有望である。細胞外小胞は主に、細胞外小胞マーカーに対する抗体を用いる免疫沈降法、または超遠心法により回収されている。しかし、このような方法では、細胞外小胞は必ずしも高効率で回収されず、また、回収された細胞外小胞は非特異的に濃縮されるため品質にばらつきを有する。
　したがって、本発明の目的は、細胞外小胞を回収できる新規方法を開発することである。
　本発明者らは、鋭意検討した結果、所定のポリマーの存在下で細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離することにより、細胞外小胞を高効率で回収できること等を見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
〔１〕ポリマーの存在下で細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離することを含む、細胞外小胞の回収方法。
〔２〕ポリマーが、２０～３０℃における１～２０重量％水溶液中の粘度として１．５ｍＰａ・ｓ以上の値を有する、〔１〕の方法。
〔３〕ポリマーが、セルロース誘導体またはカルボニル含有親水性基を有するポリビニル誘導体である、〔１〕または〔２〕の方法。
〔４〕ポリマーが、少なくとも１つの水酸基の水素原子がカルボキシアルキルまたはヒドロキシアルキルで置換されたセルロース誘導体、または少なくとも１つの水素原子がラクタムで置換されたポリビニル誘導体である、〔３〕の方法。
〔５〕ポリマーが、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはポリビニルピロリドンである、〔４〕の方法。
〔６〕ポリマーが、１０ｋＤａ以上の重量平均分子量を有する、〔１〕～〔５〕のいずれかの方法。
〔７〕細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離する際のポリマーの濃度が、０．０１～１０．００重量％である、〔１〕～〔６〕のいずれかの方法。
〔８〕細胞外小胞含有試料とキレート剤を合わせることをさらに含む、〔１〕～〔７〕のいずれかの方法。
〔９〕細胞外小胞が、エクソソームである、〔１〕～〔８〕のいずれかの方法。
〔１０〕前記分離が、細胞外小胞膜結合物質を用いた分離法、または細胞外小胞含有試料の超遠心法により行われる、〔１〕～〔９〕のいずれかの方法。
〔１１〕細胞外小胞膜結合物質が、テトラスパニン膜タンパク質に対する抗体、または細胞外マトリクスメタロプロテアーゼ誘導物質に対する抗体である、〔１０〕の方法。
〔１２〕細胞外小胞膜結合物質がＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、またはＣＤ１４７に対する抗体である、〔１１〕の方法。
〔１３〕細胞外小胞含有試料が血液試料、尿、または唾液である、〔１〕～〔１２〕のいずれかの方法。
〔１４〕以下を含む、細胞外小胞の分析方法：
（１）ポリマーの存在下で、細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離すること；および
（２）分離された細胞外小胞を分析すること。
〔１５〕キレート剤の細胞外小胞含有試料への添加をさらに含む、〔１４〕の方法。
〔１６〕分離された細胞外小胞中のタンパク質または核酸が分析される、〔１４〕または〔１５〕の方法。
〔１７〕ポリマーおよび細胞外小胞膜結合物質を含む、キット。
〔１８〕キレート剤をさらに含む、〔１７〕のキット。
　本発明によれば、所定のポリマーを用いることにより、より高効率かつより高純度で、細胞外小胞の回収が可能になる。
図１は、実施例１における、ＰＢＳ、ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ－ＰＢＳ（「ＥＤ／ＥＧ」）、または各濃度の各種ＣＭＣ－ＰＢＳで希釈した血清検体の抗ＣＤ９抗体による免疫沈降法で得られたサンプルのビオチン化抗ＣＤ９抗体によるウエスタンブロッティングを示す図である。 図２は、実施例２における、ＰＢＳ、または各濃度のＣＭＣ－ＰＢＳで希釈した血清検体を４℃で一晩もしくは３７℃で１時間抗ＣＤ９抗体と免疫沈降させて得られたサンプルのビオチン化抗ＣＤ９抗体によるウエスタンブロッティングを示す図である。 図３は、実施例３における、ＰＢＳ、ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ－ＰＢＳ（「ＥＤ／ＥＧ」）、またはＣＭＣ－ＰＢＳで希釈した血清検体の抗ＣＤ９抗体による免疫沈降法で得られたサンプルのナノ粒子トラッキング解析による粒子数測定結果を示す図である。 図４は、実施例４における、血清、および５種類の抗凝固剤（ヘパリン、ＥＤＴＡ、クエン酸（ｃｉｔｒａｔｅ）、ＡＣＤ（酸－クエン酸－デキストロース、ａｃｉｄ－ｃｉｔｒａｔｅ－ｄｅｘｔｒｏｓｅ）、ＣＰＤ（クエン酸－リン酸－デキストロース、ｃｉｔｒａｔｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｘｔｒｏｓｅ））を含有する血漿を、ＰＢＳ、ＣＭＣ－ＰＢＳ、ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ－ＰＢＳ（「ＥＤ／ＥＧ」）、またはＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＣＭＣ－ＰＢＳ（「ＥＤ／ＥＧ／Ｃ」）で希釈した検体の抗ＣＤ９抗体による免疫沈降法で得られたサンプルのビオチン化抗ＣＤ９抗体によるウエスタンブロッティングを示す図である。 図５Ａは、実施例５における、ＰＢＳ、ＣＭＣ－ＰＢＳ、ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ－ＰＢＳ（「ＥＤ／ＥＧ」）、またはＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＣＭＣ－ＰＢＳ（「ＥＤ／ＥＧ／Ｃ」）で希釈した血清検体の抗テトラスパニン膜タンパク質抗体（抗ＣＤ６３抗体および抗ＣＤ８１抗体）による免疫沈降法で得られたサンプルの抗テトラスパニン膜タンパク質抗体（抗ＣＤ６３抗体および抗ＣＤ８１抗体）によるウエスタンブロッティングを示す図である。 図５Ｂは、実施例５における、ＰＢＳ、ＣＭＣ－ＰＢＳ、ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ－ＰＢＳ（「ＥＤ／ＥＧ」）、またはＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＣＭＣ－ＰＢＳ（「ＥＤ／ＥＧ／Ｃ」）で希釈した血清検体の抗ＣＤ１４７抗体による免疫沈降法で得られたサンプルのビオチン化抗ＣＤ９抗体によるウエスタンブロッティングを示す図である。 図６は、実施例６における、体液（尿および唾液、それぞれ、２個のサンプル。「＃１」および「＃２」として表わす。）を、ＰＢＳ、ＣＭＣ－ＰＢＳ、ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ－ＰＢＳ（「ＥＤ／ＥＧ」）、またはＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＣＭＣ－ＰＢＳ（「ＥＤ／ＥＧ／Ｃ」）で希釈した検体の抗ＣＤ９抗体による免疫沈降法で得られたサンプルのビオチン化抗ＣＤ９抗体によるウエスタンブロッティングを示す図である。 図７Ａは、実施例７における、ＰＢＳ、各濃度の各種ＨＥＣ－ＰＢＳ、またはＣＭＣ－ＰＢＳで希釈した血清検体の抗ＣＤ９抗体による免疫沈降法で得られたサンプルのビオチン化抗ＣＤ９抗体によるウエスタンブロッティングを示す図である。 図７Ｂは、実施例７における、ＰＢＳ、各濃度の各種ＨＰＣ－ＰＢＳ、またはＣＭＣ－ＰＢＳで希釈した血清検体の抗ＣＤ９抗体による免疫沈降法で得られたサンプルのビオチン化抗ＣＤ９抗体によるウエスタンブロッティングを示す図である。 図７Ｃは、実施例７における、ＰＢＳ、各濃度の各種ＨＰＭＣ－ＰＢＳ、またはＣＭＣ－ＰＢＳで希釈した血清検体の抗ＣＤ９抗体による免疫沈降法で得られたサンプルのビオチン化抗ＣＤ９抗体によるウエスタンブロッティングを示す図である。 図８は、実施例８における、ＰＢＳ、または各濃度の各種ＰＶＰ－ＰＢＳで希釈した血清検体の抗ＣＤ９抗体による免疫沈降法で得られたサンプルのビオチン化抗ＣＤ９抗体によるウエスタンブロッティングを示す図である。 図９Ａは、実施例９における、ＰＢＳまたはＣＭＣ－ＰＢＳで希釈した血清検体を３５～６０℃の各温度で抗ＣＤ９抗体と免疫沈降させて得られたサンプルのビオチン化抗ＣＤ９抗体によるウエスタンブロッティングを示す図である。 図９Ｂは、実施例９における、ＣＭＣ－ＰＢＳで希釈した血清検体を３５～６０℃の各温度で抗ＣＤ６３抗体と免疫沈降させて得られたサンプルの抗ＣＤ６３抗体によるウエスタンブロッティングを示す図である。 図９Ｃは、実施例９における、ＣＭＣ－ＰＢＳで希釈した血清検体を３５～６０℃の各温度で抗ＣＤ８１抗体と免疫沈降させて得られたサンプルの抗ＣＤ８１抗体によるウエスタンブロッティングを示す図である。 図１０は、実施例１１における、ＰＢＳ、ＣＭＣ－ＰＢＳ（「ＣＭＣ」）、ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ－ＰＢＳ（「ＥＤ／ＥＧ」）、またはＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＣＭＣ－ＰＢＳ（「ＥＤ／ＥＧ／Ｃ」）で希釈した、ヒト肺癌細胞Ｈ２２２８の培養上清の抗ＣＤ９抗体または抗ＣＤ６３抗体による免疫沈降法で得られたサンプルのＥＭＬ４－ＡＬＫ　ｍＲＮＡ検出量（ＰＢＳで希釈したサンプルに対する倍率変化で表わす）を示す図である。
　本発明は、細胞外小胞の回収方法を提供する。
　細胞外小胞は、さまざまな種類の細胞から分泌される、膜構造を有する微小な小胞である。細胞外小胞としては、例えば、エクソソーム、エクトソーム、およびアポトーシス胞が挙げられる。好ましくは、細胞外小胞は、エクソソームである。細胞外小胞はまた、そのサイズにより規定することができる。細胞外小胞のサイズは、例えば、３０～１０００ｎｍであり、好ましくは５０～３００ｎｍ、より好ましくは８０～２００ｎｍである。細胞外小胞のサイズの測定は、例えば、細胞外小胞のブラウン運動に基づく方法、光散乱法、および電気抵抗法などにより行うことができる。好ましくは、細胞外小胞のサイズの測定は、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ（Ｍａｌｖｅｒｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）により行われる。
　本発明の回収方法は、以下の工程を含む：
（１）ポリマーの存在下で、細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離すること。
　細胞外小胞含有試料は、細胞外小胞を含有する任意の試料である。好ましくは、細胞外小胞含有試料は、生物学的な液体試料である。細胞外小胞含有試料は、本発明の方法に用いられる前に、他の処理に付されてもよい。このような処理としては、例えば、遠心分離、抽出、ろ過、沈殿、加熱、凍結、冷蔵、および攪拌が挙げられる。
　一実施形態では、細胞外小胞含有試料は、培養上清である。培養上清は、細胞培養上清であっても組織培養上清であってもよい。培養される細胞または組織が由来する生物としては、例えば、哺乳動物（例、ヒト、サル等の霊長類；マウス、ラット、ウサギ等の齧歯類；ウシ、ブタ、ヤギ等の家畜；およびウマ、ヒツジ等の使役動物）、鳥類（例、ニワトリ）等の動物、昆虫、微生物（例、細菌類）、植物、および魚類が挙げられる。好ましくは、生物は、ヒト等の哺乳動物である。
　別の実施形態では、細胞外小胞含有試料は、体液である。体液は、上述したような生物に由来する体液である。体液としては、例えば、血液試料（例、全血、血清および血漿）、尿、唾液、リンパ液、組織液、脳脊髄液、腹水、汗、精液、涙液、粘液、乳汁、胸腔液、気管支肺胞洗浄液および羊水が挙げられる。好ましくは、体液は、血液試料、尿、または唾液である。血漿としては、例えば、ヘパリン血漿、クエン酸血漿、フッ化ナトリウム血漿、ＡＣＤ（ａｃｉｄ－ｃｉｔｒａｔｅ－ｄｅｘｔｒｏｓｅ）またはＣＰＤ（ｃｉｔｒａｔｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｘｔｒｏｓｅ））を含有する血漿が挙げられる。一般に、細胞外小胞の回収は、培養上清に比し、培養上清よりも多量のタンパク質（例、アルブミン、リゾチーム、ラクトフェリン、ヒスタチン、ペルオキシダーゼ、アグルチニン、ディフェンシン、免疫グロブリン）が混在している体液（例、血液、尿、唾液）において困難である。一方、本発明の方法によれば、細胞外小胞含有試料からの細胞外小胞の回収量が増加し、このような体液からであっても細胞外小胞を高効率かつ高純度で回収することができる。
　本発明で用いられるポリマーは、水溶性ポリマーであることが好ましい。「水溶性ポリマー」とは、４～８０℃（好ましくは、４～３７℃）での水に対する溶解度が０．０１重量％以上のポリマーをいう。水溶性ポリマーの４～８０℃（好ましくは、４～３７℃）での水に対する溶解度は、好ましくは０．０５重量％以上、より好ましくは０．１重量％以上であってもよい。
　ポリマーは、本発明の目的を達成するため、例えば、２０～３０℃における１～２０重量％水溶液中の粘度として１．５ｍＰａ・ｓ以上の値を有していてもよい。ポリマーの上述の条件での粘度としては、好ましくは５ｍＰａ・ｓ以上、より好ましくは１０ｍＰａ・ｓ以上、さらにより好ましくは２０ｍＰａ・ｓ以上、なおさらにより好ましくは３０ｍＰａ・ｓ以上、特に好ましくは３５ｍＰａ・ｓ以上であってもよい。ポリマーの上述の条件での粘度としては、好ましくは３００００ｍＰａ・ｓ以下、より好ましくは２００００ｍＰａ・ｓ以下、さらにより好ましくは１００００ｍＰａ・ｓ以下、なおさらにより好ましくは５０００ｍＰａ・ｓ以下、特に好ましくは１０００ｍＰａ・ｓ以下であってもよい。より具体的には、ポリマーの上述の条件での粘度としては、好ましくは５～３００００ｍＰａ・ｓ、より好ましくは１０～２００００ｍＰａ・ｓ、さらにより好ましくは２０～１００００ｍＰａ・ｓ、なおさらにより好ましくは３０～５０００ｍＰａ・ｓ、特に好ましくは３５～１０００ｍＰａ・ｓであってもよい。
　ポリマーは、本発明の目的を達成するため、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にポリマーを２重量％になるように溶解したＰＢＳ溶液中の３０℃における粘度として１．５ｍＰａ・ｓ以上の値を有していてもよい。ポリマーの上述の条件での粘度としては、好ましくは５ｍＰａ・ｓ以上、より好ましくは１０ｍＰａ・ｓ以上、さらにより好ましくは２０ｍＰａ・ｓ以上、なおさらにより好ましくは３０ｍＰａ・ｓ以上、特に好ましくは３５ｍＰａ・ｓ以上であってもよい。ポリマーの上述の条件での粘度としては、好ましくは３００００ｍＰａ・ｓ以下、より好ましくは２００００ｍＰａ・ｓ以下、さらにより好ましくは１００００ｍＰａ・ｓ以下、なおさらにより好ましくは５０００ｍＰａ・ｓ以下、特に好ましくは１０００ｍＰａ・ｓ以下であってもよい。より具体的には、ポリマーの上述の条件での粘度としては、好ましくは５～３００００ｍＰａ・ｓ、より好ましくは１０～２００００ｍＰａ・ｓ、さらにより好ましくは２０～１００００ｍＰａ・ｓ、なおさらにより好ましくは３０～５０００ｍＰａ・ｓ、特に好ましくは３５～１０００ｍＰａ・ｓであってもよい。
　ポリマーの粘度は、例えば、液体試料を回転体によって回転させた際にロータの外周に発生した液の粘度摩擦トルクを検出する方法（回転粘度計を用いる方法）、または試料が満たされた測定管内を、落下錘を自由落下させ、その落下時間を計測する方法（落球粘度計を用いる方法）により測定することができる。また、ポリマーの粘度は、例えば、液体試料中に振動体（粘度センサ）を入れて振動させると、センサの振動振幅は、液体粘度が大きくなるにしたがってその粘性抵抗により抑制され、低下するが、この抑制される力に打ち勝ち、定振幅を維持するように振動子駆動電流を増加させ、この時の入力電流量を測定する方法（振動粘度計を用いる方法）により測定することができる。
　ポリマーの粘度は、例えば、粘性解析装置（例、レオロジースペクトロメータＳＫＲ１００、ヤマト科学社）を用いて測定することができる。
　ポリマーは、例えば、セルロース誘導体、親水性基を有するポリビニル誘導体、ポリエーテル化合物であってもよい。
　セルロース誘導体とは、セルロースの少なくとも１つの水酸基の水素原子が親水性基で置換されたセルロース誘導体である。セルロース誘導体における親水性基としては、例えば、カルボキシアルキル（例、カルボキシＣ１～６アルキル）、ヒドロキシアルキル（例、ヒドロキシＣ１～６アルキル）が挙げられる。セルロース誘導体における親水性基は、カルボキシアルキルまたはヒドロキシアルキルが好ましい。
　カルボキシアルキルとしては、例えば、カルボキシメチル、カルボキシエチル（１－カルボキシエチル、２－カルボキシエチル）、カルボキシプロピル（１－カルボキシプロピル、２－カルボキシプロピル、３－カルボキシプロピル）、カルボキシイソプロピル（１－カルボキシ－２－メチルエチル、２－カルボキシ－２－メチルエチル）、カルボキシブチル（１－カルボキシブチル、２－カルボキシブチル、３－カルボキシブチル、４－カルボキシブチル）、カルボキシｔ－ブチル、カルボキシペンチル（１－カルボキシペンチル、２－カルボキシペンチル、３－カルボキシペンチル、４－カルボキシペンチル、５－カルボキシペンチル）、カルボキシヘキシル（１－カルボキシヘキシル、２－カルボキシヘキシル、３－カルボキシヘキシル、４－カルボキシヘキシル、５－カルボキシヘキシル、６－カルボキシヘキシル）が挙げられる。
　ヒドロキシアルキルとしては、例えば、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル（１－ヒドロキシエチル、２－ヒドロキシエチル）、ヒドロキシプロピル（１－ヒドロキシプロピル、２－ヒドロキシプロピル、３－ヒドロキシプロピル）、ヒドロキシイソプロピル（１－ヒドロキシ－２－メチルエチル、２－ヒドロキシ－２－メチルエチル）、ヒドロキシブチル（１－ヒドロキシブチル、２－ヒドロキシブチル、３－ヒドロキシブチル、４－ヒドロキシブチル）、ヒドロキシｔ－ブチル、ヒドロキシペンチル（１－ヒドロキシペンチル、２－ヒドロキシペンチル、３－ヒドロキシペンチル、４－ヒドロキシペンチル、５－ヒドロキシペンチル）、ヒドロキシヘキシル（１－ヒドロキシヘキシル、２－ヒドロキシヘキシル、３－ヒドロキシヘキシル、４－ヒドロキシヘキシル、５－ヒドロキシヘキシル、６－ヒドロキシヘキシル）が挙げられる。
　セルロース誘導体の具体例としては、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）が挙げられる。
　セルロース誘導体には、ナノセルロース誘導体も含まれる。ナノセルロース誘導体とは、後述するナノセルロースの誘導体である。
　親水性基を有するポリビニル誘導体とは、少なくとも１つの水素原子が親水性基で置換されたポリビニル誘導体であり、メチレン単位中の１個の水素原子が親水性基で置換されたポリビニル誘導体が好ましい。ポリビニル誘導体の親水性基としては、例えば、カルボニル含有親水性基、カルボキシ含有親水性基、含窒素親水性基、環（炭素環または複素環）含有親水性基が挙げられる。ポリビニル誘導体の親水性基は、カルボニル含有親水性基、含窒素親水性基、または複素環含有親水性基が好ましく、ラクタム（例、α－ラクタム、β－ラクタム、γ－ラクタム、δ－ラクタム、ε－ラクタム）がより好ましい。親水性基を有するポリビニル誘導体の具体例としては、ポリビニルピロリドンが挙げられる。
　ポリエーテル化合物とは、反復単位の主鎖にエーテル構造を含むポリマーである。ポリエーテル化合物としては、例えば、ポリアルキレンオキシ化合物（例、ポリＣ１～６アルキレンオキシ化合物）が挙げられる。ポリアルキレンオキシ化合物としては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールが挙げられる。ポリアルキレンオキシ化合物は、ポリエチレングリコールが好ましい。
　ナノセルロースとは、ナノメートルオーダーの繊維幅を有する繊維状セルロースである。ナノセルロースの繊維幅は、例えば５００ｎｍ以下であり、好ましくは２００ｎｍ以下、より好ましくは１００ｎｍ以下、さらにより好ましくは５０ｎｍ以下、なおさらにより好ましくは１０ｎｍ以下、特により好ましくは５ｎｍ以下であってもよい。
　セルロース誘導体、親水性基を有するポリビニル誘導体、およびポリエーテル化合物には、それらの塩も含まれる。塩としては、例えば、金属（例、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、およびセシウム等の一価の金属、ならびにカルシウム、マグネシウム、および亜鉛等の二価の金属）の塩、ならびに無機塩基（例、アンモニア）の塩が挙げられる。
　ポリマーは、本発明の目的を達成するため、例えば、１０ｋＤａ以上の重量平均分子量を有してもよい。ポリマーの重量平均分子量としては、好ましくは１２ｋＤａ以上、より好ましくは１４ｋＤａ以上、さらにより好ましくは１６ｋＤａ以上、なおさらにより好ましくは１８ｋＤａ以上、特に好ましくは２０ｋＤａ以上であってもよい。ポリマーの重量平均分子量としては、好ましくは５０００ｋＤａ以下、より好ましくは３０００ｋＤａ以下、さらにより好ましくは２０００ｋＤａ以下、なおさらにより好ましくは１０００ｋＤａ以下、特に好ましくは５００ｋＤａ以下であってもよい。より具体的には、ポリマーの重量平均分子量としては、好ましくは１２～５０００ｋＤａ、より好ましくは１４～３０００ｋＤａ、さらにより好ましくは１６～２０００ｋＤａ、なおさらにより好ましくは１８～１０００ｋＤａ、特に好ましくは２０～５００ｋＤａであってもよい。
　細胞外小胞の分離工程におけるポリマーの濃度は、ポリマーを含まない場合に比べて細胞外小胞を高効率で回収でき、かつ分離工程で用いられる溶液中にポリマーが溶解できる濃度である限り特に限定されない。このような濃度は、ポリマーの種類によっても異なるが、例えば０．０１～１０．００重量％、好ましくは０．０５～７．５０重量％、より好ましくは０．１０～５．００重量％であってもよい。
　細胞外小胞の分離工程において、細胞外小胞は、細胞外小胞含有試料から液相中で分離される。すなわち、細胞外小胞は、ポリマーと共沈しない状態で、後述する分離手法により、細胞外小胞含有試料から分離される。したがって、本発明における分離工程は、共沈性ポリマーを用いた共沈法による分離（例、ポリエチレングリコール沈殿）とは異なる。したがって、本発明で用いるポリマーは、非共沈性ポリマーであることが好ましい。
　本発明の回収方法において、ポリマーは、分離工程に存在すればよいので、本発明の回収方法は、細胞外小胞含有試料とポリマーを合わせることを含んでもよい。例えば、細胞外小胞含有試料とポリマーを合わせた後に、当該細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離してもよい。また、例えば、後述する細胞外小胞膜結合物質を用いた分離法を用いる場合、細胞外小胞膜結合物質を含む溶液に予めポリマーを添加しておき、これに細胞外小胞含有試料を添加してもよい。
　本発明の回収方法は、細胞外小胞含有試料とキレート剤を合わせることをさらに含んでもよい。この場合、本発明の回収方法において、ポリマーおよびキレート剤の存在下で、細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離すればよいので、例えば、細胞外小胞含有試料にポリマーおよびキレート剤を同時に添加してもよいし、細胞外小胞含有試料にポリマーを添加した後にキレート剤を添加してもよいし、細胞外小胞含有試料にキレート剤を添加した後にポリマーを添加してもよい。また、例えば、後述する細胞外小胞膜結合物質を用いた分離法を用いる場合、細胞外小胞膜結合物質を含む溶液に予めポリマーおよびキレート剤を添加しておき、これに細胞外小胞含有試料を添加してもよい。
　キレート剤は、金属イオンとの配位結合が可能である配位部分を有する化合物またはその塩である。配位部分の数は、好ましくは２個以上、より好ましくは３個以上（例、３個または６個）である。配位部分としての配位原子としては、例えば、酸素原子、リン原子、窒素原子、硫黄原子、および塩素原子が挙げられる。配位原子は、好ましくは酸素原子又はリン原子であり、より好ましくは酸素原子である。配位部分としての配位基としては、例えば、上記配位原子を有する基が挙げられる。配位基は、好ましくはカルボン酸基またはリン酸基であり、より好ましくはカルボン酸基である。
　キレート剤としては、例えば、シュウ酸、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）（ＥＤＴＭＰ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）、並びにそれらの塩が挙げられる。塩としては、例えば、金属塩（例、ナトリウム塩、カリウム塩等の一価の金属塩、およびカルシウム塩、マグネシウム塩等の二価の金属塩）、無機塩（例、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物等のハロゲン化物塩、およびアンモニウム塩）、有機塩（例、アルキル基で置換されたアンモニウム塩）、および酸付加塩（例、硫酸、塩酸、臭化水素酸、硝酸、リン酸等の無機酸との塩、および酢酸、シュウ酸、乳酸、クエン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸等の有機酸等の塩）が挙げられる。本発明では、２種以上（例、２種、３種、４種、５種）のキレート剤の混合物を細胞外小胞含有試料の分離に用いてもよい。
　キレート剤は、恐らくは細胞外小胞への夾雑物の吸着を抑制することにより、細胞外小胞の高純度での回収に効果を示す（国際公開第２０１８／０７０４７９号）。したがって、ポリマーおよびキレート剤の存在下で、細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離することにより、細胞外小胞の回収効率向上に相乗効果を与える。上述のキレート剤はいずれも細胞外小胞の高純度での回収に効果を示すので、ポリマーとの併用により同質の相乗効果を与える。
　細胞外小胞の分離工程におけるキレート剤の濃度は、細胞外小胞への夾雑物の吸着を抑制でき、かつ分離工程で用いられる溶液中にキレート剤が溶解できる濃度である限り特に限定されない。このような濃度は、キレート剤の種類によっても異なるが、例えば、１ｍＭ～２００ｍＭである。好ましくは、キレート剤の濃度は、１０ｍＭ以上、１５ｍＭ以上、２０ｍＭ以上、３０ｍＭ以上、４０ｍＭ以上、または５０ｍＭ以上であってもよい。このような濃度はまた、キレート剤の種類によっても異なるが、２００ｍＭ以下、１８０ｍＭ以下、１６０ｍＭ以下、１４０ｍＭ以下、１２０ｍＭ以下、または１００ｍＭ以下であってもよい。
　ポリマーの存在下での、細胞外小胞含有試料からの細胞外小胞の分離（工程（１））は、例えば、細胞外小胞膜結合物質を用いた分離法、または超遠心法により行うことができる。細胞外小胞膜結合物質を用いた分離は、分析方法（例、後述するイムノアッセイ）の過程において行われてもよい。細胞外小胞膜結合物質を用いて細胞外小胞を分離する場合、細胞外小胞膜結合物質を細胞外小胞含有試料と混合することで、細胞外小胞膜結合物質を細胞外小胞に結合させ、次いで細胞外小胞膜結合物質が結合した細胞外小胞を、試料から分離することにより、細胞外小胞を回収することができる。また、細胞外小胞の分離を超遠心法により行う場合、超遠心法により細胞外小胞含有試料中の細胞外小胞を沈殿させ、次いで、上清を廃棄することにより、細胞外小胞を回収することができる。さらに、細胞外小胞の分離を分析方法の過程において行う場合、分析方法（例、ＥＬＩＳＡ等のイムノアッセイ）における溶液の除去または固相の洗浄に伴い、細胞外小胞を分離することができる。具体的には、イムノアッセイにおいて、細胞外小胞の抗体との結合および細胞外小胞含有試料を含む溶液の除去および／または固相の洗浄に伴い、細胞外小胞を分離することができる。分離は、好ましくは、単離または精製である。したがって、本発明の回収方法はまた、単離または精製方法として利用することができる。
　本発明の回収方法において用いられる細胞外小胞膜結合物質は、細胞外小胞マーカーに親和性を有する物質である。細胞外小胞マーカーとしては、例えば、テトラスパニン膜タンパク質（細胞外小胞膜特異的４回貫通膜タンパク質、例、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１）、細胞外マトリクスメタロプロテアーゼ誘導物質（ＣＤ１４７）、癌胎児性抗原（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ、ＣＥＡ）、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）７０、ＨＳＰ９０、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）Ｉ、腫瘍感受性遺伝子（ＴＳＧ）１０１、リソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ）１、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）－１、インテグリン、セラミド、コレステロール、ホスファチジルセリン、ＡＬＩＸ、Ａｎｎｅｘｉｎｓ、Ｃａｖｅｏｌｉｎ－Ｉ、Ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ－Ｉ、Ｒａｂタンパク質、ＥｐＣＡＭなどが挙げられる。細胞外小胞マーカーは、好ましくはテトラスパニン膜タンパク質、細胞外マトリクスメタロプロテアーゼ誘導物質である。また細胞外小胞マーカーは、好ましくはＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、またはＣＤ１４７である。細胞外小胞膜結合物質としては、例えば、抗体（例、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体）およびその抗原結合性断片、アプタマー、ホスファチジルセリン結合タンパク質、セラミド結合タンパク質が挙げられる。抗原結合性断片は、対象とする細胞外小胞マーカーに対する結合性を維持している抗体断片であればよく、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ等が挙げられる。細胞外小胞膜結合物質は、好ましくは抗体またはその抗原結合性断片であり、より好ましくはモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片である。また、細胞外小胞を回収する際に用いられる細胞外小胞膜結合物質は、一つでも複数を組み合わせてもよい。
　細胞外小胞膜結合物質は、細胞外小胞の分離を容易にするための固相と結合していてもよい。固相としては、例えば、セファロースビーズ、アガロースビーズ、磁性ビーズ、またはプラスチックプレートを用いることができる。固相への細胞外小胞膜結合物質の固定化は当業者に周知の常法によって行うことができる。
　本発明の回収方法において、細胞外小胞膜結合物質を用いた分離法により細胞外小胞を回収する場合、ポリマーは、少なくとも細胞外小胞膜結合物質と細胞外小胞含有試料とを混合する際に、存在していればよい。例えば、磁性ビーズを用いる場合、ポリマーの存在下で、磁性ビーズに結合した細胞外小胞膜結合物質と細胞外小胞含有試料を混合することにより、細胞外小胞膜結合物質と細胞外小胞含有試料中の細胞外小胞とを結合させ、磁性ビーズを永久磁石または電磁石などを用いて集磁し、次いで、磁性ビーズに結合しなかった成分を含む上清を廃棄することにより、磁性ビーズに結合した細胞外小胞を細胞外小胞含有試料から分離することができる。磁性ビーズを集磁する方法は、当業者に周知の方法を用いることができる。また、例えば、セファロースビーズまたはアガロースビーズを用いる場合、ポリマーの存在下で、これらビーズに結合した細胞外小胞膜結合物質と細胞外小胞含有試料を混合することにより、細胞外小胞膜結合物質と細胞外小胞含有試料中の細胞外小胞とを結合させ、遠心分離により、ビーズを沈殿させ、ビーズに結合しなかった成分を含む上清を廃棄することにより、ビーズに結合した細胞外小胞を細胞外小胞含有試料から分離することができる。ビーズを遠心分離により沈殿させる方法は、当業者に周知の方法を用いることができる。
　細胞外小胞膜結合物質を用いた分離法により、細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離する場合、細胞外小胞膜結合物質と細胞外小胞含有試料を混合する温度は、細胞外小胞膜結合物質と細胞外小胞含有試料との混合物が液体で存在する温度であればいかなる温度であってもよく、０～１００℃であってもよい。このような温度は、例えば４℃以上であり、好ましくは１５℃以上、より好ましくは３５℃以上、さらに好ましくは４０℃以上であってもよい。このような温度はまた、例えば８０℃以下であり、好ましくは７０℃以下、より好ましくは６０℃以下、さらに好ましくは５０℃以下であってもよい。より具体的には、このような温度は、例えば４～８０℃であり、好ましくは１５～７０℃、より好ましくは３５～６０℃、さらに好ましくは４０～５０℃であってもよい。細胞外小胞膜結合物質と細胞外小胞を結合させる時間は、細胞外小胞膜結合物質が細胞外小胞に結合するために十分な時間である限り特に限定されず、例えば、１分以上、５分以上、１０分以上、または２０分以上であってもよい。このような時間はまた、２４時間以下、１８時間以下、８時間以下、４時間以下、２時間以下、または１時間以下であってもよい。
　本発明の回収方法において、超遠心法により細胞外小胞を回収する場合、ポリマーは、細胞外小胞含有試料が超遠心分離に供される際に存在すればよく、例えば、超遠心分離を複数回行う場合は、少なくとも１回の超遠心分離をポリマーの存在下で行えばよい。超遠心分離は、超遠心機を使用して行うことができる。超遠心分離で印加される重力は、例えば、１０，０００×ｇ～２００，０００×ｇであり、好ましくは、７０，０００×ｇ～１５０，０００×ｇであってもよい。超遠心分離の時間は、例えば、０．５～２４時間であり、好ましくは１～５時間である。超遠心分離での温度は、例えば、４～３０℃である。超遠心分離は、１回または複数回（例、２回、３回）行ってもよい。
　本発明はまた、細胞外小胞の分析方法を提供する。
　本発明の分析方法は、以下を含む：
（１）ポリマーの存在下で、細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離すること；および
（２）分離された細胞外小胞を分析すること。
　本発明の分析方法における工程（１）は、本発明の回収方法における工程（１）と同様にして行うことができる。
　工程（２）では、分離された細胞外小胞が分析される。分析される対象としては、例えば、細胞外小胞中に含まれる成分（例、細胞外小胞の内部に含まれる成分、細胞外小胞の膜成分、細胞外小胞の膜表面に存在している成分）、および細胞外小胞自体（粒子）が挙げられる。
　細胞外小胞中に含まれる成分が分析される場合、分析は、成分の検出または定量である。このような分析はまた、一成分または複数成分の分析である。分析される成分としては、例えば、タンパク質、核酸（例、ＲＮＡ、ＤＮＡ）、糖、脂質、アミノ酸、ビタミン類、ポリアミン、およびペプチドが挙げられる。ポリマーの存在下で細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離することにより、細胞外小胞の回収量を増加させることができる。したがって、本発明の分析方法によれば、細胞外小胞中のタンパク質、核酸等の成分を高精度で分析することができる。
　成分の分析は、当該分野において公知である任意の方法により行うことができる。
　分析される成分がタンパク質である場合、分析方法としては、例えば、イムノアッセイ、質量分析法が挙げられる。イムノアッセイとしては、例えば、直接競合法、間接競合法、およびサンドイッチ法が挙げられる。また、このようなイムノアッセイとしては、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）〔例、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）〕、免疫比濁法（ＴＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、およびサンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射イムノアッセイ（ＲＩＡ）、ラテックス凝集反応法、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、およびイムノクロマトグラフィー法、ウエスタンブロッティング、免疫染色、蛍光活性化細胞選別（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔｉｎｇ、ＦＡＣＳ）が挙げられる。複数成分が分析される場合、プロテオーム分析が行われてもよい。
　分析される成分が核酸である場合、分析方法としては、例えば、プローブを用いるハイブリダイゼーション法、逆転写酵素を用いる逆転写（ＲＴ）反応、プライマー（例、２、３、または４個のプライマー）を用いる遺伝子増幅法（例、定量ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ等のＰＣＲ法）、シークエンシング、質量分析法が挙げられる。
　分析される成分がタンパク質および核酸以外の成分である場合、分析方法としては、例えば、イムノアッセイ、質量分析法が挙げられる。複数成分が分析される場合、メタボローム分析が行われてもよい。
　本発明の分析方法は、細胞外小胞に含まれるマーカーの検出に用いることができる。細胞外小胞に含まれるマーカーとしては、例えば、細胞外小胞の存在の指標となるマーカー、癌等の疾患の指標となるマーカー（例、診断マーカー、疾患のリスク評価マーカー）が挙げられる。細胞外小胞の存在の指標となるマーカーとしては、例えば、テトラスパニン膜タンパク質（細胞外小胞膜特異的４回貫通膜タンパク質、例、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１）、細胞外マトリクスメタロプロテアーゼ誘導物質（ＣＤ１４７）、癌胎児性抗原（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ、ＣＥＡ）、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）７０、ＨＳＰ９０、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）Ｉ、腫瘍感受性遺伝子（ＴＳＧ）１０１、リソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ）１、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）－１、インテグリン、セラミド、コレステロール、ホスファチジルセリン、ＡＬＩＸ、Ａｎｎｅｘｉｎｓ、Ｃａｖｅｏｌｉｎ－Ｉ、Ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ－Ｉ、Ｒａｂタンパク質、ＥｐＣＡＭ、およびこれらのタンパク質をコードする核酸（例、ＤＮＡ、ＲＮＡ）が挙げられる。疾患の指標となるマーカーとしては、例えば、癌等の疾患に罹患した生物に由来する細胞外小胞または癌細胞等の異常細胞から分泌される細胞外小胞に特異的に存在するタンパク質（以下、「異常タンパク質」と呼ぶ。例、変異タンパク質、外来タンパク質）が挙げられる。変異タンパク質としては、例えば、ＥＭＬ４－ＡＬＫ等の融合タンパク質が挙げられる。ＥＭＬ４－ＡＬＫには、バリアント１、２、３ａ、３ｂ、４，５ａ、５ｂ、６等のバリアントが存在する。外来タンパク質としては、例えば、ウイルス由来タンパク質が挙げられる。疾患の指標となるマーカーとしてはまた、これらのタンパク質をコードする核酸の発現の有無またはその量の変化、ならびに、ＳＮＰ等の変異、ハプロタイプ、転座、核酸のメチル化の存在もしくは非存在、およびバリアントの種類が挙げられる。
　細胞外小胞自体（粒子）の分析は、例えば、粒子分析機器、電子顕微鏡、フローサイトメーター等の機器により行うことができる。この場合、細胞外小胞の粒子数、粒子の大きさおよび形状、並びにそれらの分布を分析することができる。
　細胞外小胞は、癌等の種々の疾患に関与し得ることが報告されている（国際公開第２０１４／００３０５３号；国際公開第２０１４／１５２６２２号；Ｔａｙｌｏｒ　ｅｔ　　ａｌ．，Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ　Ｏｎｃｏｌ，１００（２００８）　ｐｐ１３－２１）。したがって、本発明の回収方法および分析方法は、例えば、細胞外小胞に基づく診断および創薬に有用である。例えば、肺癌等の癌マーカーであるＥＭＬ４－ＡＬＫを本発明の分析方法により検出することは、肺癌等の癌患者に対するクリゾニチブ、アレクチニブ等のＡＬＫチロシンキナーゼ阻害剤の投与決定の指標として有用となり得る。
　別の実施形態では、本発明は、以下を含む、細胞外小胞の分析方法を提供する：
（１）細胞外小胞膜結合物質を用いて細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離すること；および
（２）分離された細胞外小胞内に含まれる、癌等の疾患の指標となるマーカーを分析すること。
　本実施形態における細胞外小胞膜結合物質としては、上述の細胞外小胞マーカーに親和性を有する物質が挙げられる。細胞外小胞マーカーは、好ましくはテトラスパニン膜タンパク質、細胞外マトリクスメタロプロテアーゼ誘導物質である。また細胞外小胞マーカーは、好ましくはＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、またはＣＤ１４７、より好ましくはＣＤ９、またはＣＤ６３である。細胞外小胞膜結合物質としては、例えば、上述の抗体（例、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体）およびその抗原結合性断片、アプタマー、ホスファチジルセリン結合タンパク質、セラミド結合タンパク質が挙げられる。
　癌等の疾患の指標となるマーカーして、上述した異常タンパク質の発現の有無またはその量の変化が挙げられる。異常タンパク質としては、例えば、ＥＭＬ４－ＡＬＫ等の融合タンパク質が挙げられる。疾患の指標となるマーカーとしてはまた、これらのタンパク質をコードする核酸の発現の有無またはその量の変化、ならびに、ＳＮＰ等の変異、ハプロタイプ、転座、核酸のメチル化の存在もしくは非存在、およびバリアントの種類が挙げられる。
　本発明はまた、上述したようなポリマーおよび細胞外小胞膜結合物質を含むキットを提供する。本発明のキットは、キレート剤をさらに含んでもよい。本発明のキットは、例えば、本発明の回収方法、および分析方法の簡便な実施に有用である。
　以下、実施例を参照して本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
　市販の３種類のＣＭＣナトリウム塩（以下、単に「ＣＭＣ」と呼ぶ。ＣＡＳ　Ｎｏ．９００４－３２－４、ナカライテスク社＃０７３２６－９５（平均分子量不明）、シグマアルドリッチ社＃Ｃ５６７８（平均分子量９０ｋＤａ）、＃Ｃ４８８８（平均分子量２５０ｋＤａ））の、ＥＶ回収への効果を検討した。ＥＶ回収は、抗ＣＤ９抗体を用いて行った。
　健常人血清を２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心した後、２００μＬの血清を２００μＬのＰＢＳ（２．９ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４、９．０ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４、１３７ｍＭ　ＮａＣｌ）、ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ－ＰＢＳ（血清を希釈した後の各終濃度が５０ｍＭになるようにＥＤＴＡおよびＥＧＴＡを含むＰＢＳ）（ＥＤ／ＥＧ）、または終濃度０．２～２．５重量％のＣＭＣ－ＰＢＳ（血清を希釈した後の終濃度が０．２～２．５重量％になるようにＣＭＣを溶解したＰＢＳ）で希釈し、抗ＣＤ９抗体（自社製）を固定した磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍ－２８０　ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（ライフテクノロジーズ社））を０．２６ｍｇ／ｍＬとなるように添加した。４℃で一晩回転反応させた後に、磁性ビーズをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、サンプルバッファー（ＢＩＯ－ＲＡＤ社）で希釈してウエスタンブロッティング用サンプルとした。ウエスタンブロッティング用サンプルでは、エクソソームを含むサンプルがＳＤＳで処理されることにより、エクソソームが破壊され、エクソソームのマーカータンパク質（例、ＣＤ９）がサンプル溶液中に放出されている。ビオチン化した抗ＣＤ９抗体（自社製）によるウエスタンブロッティング法で免疫沈降効率を解析した（図１）。４種類のＣＭＣ全てにおいて、ＰＢＳ希釈サンプルと比較してＥＶ回収効率向上の効果を認めた。
　実施例で用いたＣＭＣの各物性値を以下の表１にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（実施例２）
　ＣＭＣ（シグマアルドリッチ社＃Ｃ４８８８）の濃度（０．０６重量％～１．０重量％の終濃度）および反応温度（４℃、３７℃）がＥＶ回収に与える効果を検討した。
　健常人血清を２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心した後、２００μＬの血清を２００μＬのＰＢＳもしくはＣＭＣ－ＰＢＳ（血清希釈後の終濃度が０．０６～１．０重量％になるようにＣＭＣを溶解したＰＢＳ）で希釈し、抗ＣＤ９抗体（自社製）を固定した磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍ－２８０　ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（ライフテクノロジーズ社））を０．２６ｍｇ／ｍＬとなるように添加した。４℃で一晩もしくは３７℃で１時間回転反応させた後に、磁性ビーズをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、サンプルバッファー（ＢＩＯ－ＲＡＤ社）で希釈してウエスタンブロッティング用サンプルとした。ビオチン化した抗ＣＤ９抗体によるウエスタンブロッティング法でＥＶの回収効率を解析した（図２）。反応温度４℃および３７℃において、ＣＭＣの終濃度０．２５重量％～１重量％の範囲で、ＰＢＳ希釈サンプルと比較してＥＶ回収効率向上の効果を認めた。
（実施例３）
　ＣＭＣ（シグマアルドリッチ社＃Ｃ４８８８）のＥＶ回収への効果をナノ粒子トラッキング解析（ＮａｎｏＳｉｇｈｔ　ＬＭ１０、カンタムデザイン社）により検討した。
　２００μＬの健常人血清を２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心した後、その上清に２００μＬのＰＢＳ、ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ－ＰＢＳ（血清希釈後の各終濃度５０ｍＭになるようにＥＤＴＡおよびＥＧＴＡを含むＰＢＳ）（ＥＤ／ＥＧ）、またはＣＭＣ－ＰＢＳ（血清希釈後の終濃度が０．５重量％になるようにＣＭＣを溶解したＰＢＳ）（ＣＭＣ）で希釈し、抗ＣＤ９抗体（自社製）を固定した磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍ－２８０　ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（ライフテクノロジーズ社））を０．２６ｍｇ／ｍＬとなるように添加した。３７℃で３０分間回転反応させた後に、磁性ビーズをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、４０μＬ　ＢＲＵＢ（Ｂｒｉｔｔｏｎ　＆　Ｒｏｂｉｎｓｏｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｂｕｆｆｅｒ）（ｐＨ２．６）で５分間反応させた後、２０μＬの１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和することで細胞外小胞を抗体磁性ビーズ粒子から遊離させた。Ｑｕｂｉｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｓｓａｙ（ライフテクノロジーズ社）で総タンパク質濃度を定量した後、ＰＢＳ　４５０μＬを添加してＮａｎｏＳｉｇｈｔにより粒子数を解析した（図３）。ＣＭＣで希釈した条件においてＥＶの総回収粒子数と総タンパク質あたりの粒子数の増加が認められ、高純度で細胞外小胞が回収されたことが示された。
（実施例４）
　血清、および５種類の抗凝固剤（ヘパリン、ＥＤＴＡ、クエン酸（ｃｉｔｒａｔｅ）、ＡＣＤ（酸－クエン酸－デキストロース；ａｃｉｄ－ｃｉｔｒａｔｅ－ｄｅｘｔｒｏｓｅ）、ＣＰＤ（クエン酸－リン酸－デキストロース；ｃｉｔｒａｔｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｘｔｒｏｓｅ））を含有する血漿において、ＣＭＣ（シグマアルドリッチ社＃Ｃ４８８８）のＥＶ回収への効果を検討した。
　２００μＬの健常人血清、および抗凝固剤含有健常人血漿を２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心した後、その上清に２００μＬのＰＢＳ、ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ－ＰＢＳ（血清または血漿希釈後の各終濃度が５０ｍＭになるようにＥＤＴＡおよびＥＧＴＡを含むＰＢＳ）（ＥＤ／ＥＧ）、ＣＭＣ－ＰＢＳ（血清または血漿希釈後の終濃度が０．５重量％になるようにＣＭＣを溶解したＰＢＳ）（ＣＭＣ）、またはＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＣＭＣ－ＰＢＳ（血清または血漿希釈後のそれぞれの終濃度が３７．５ｍＭ／３７．５ｍＭ／０．５重量％になるようにＥＤＴＡ、ＥＧＴＡおよびＣＭＣを含むＰＢＳ）（ＥＤ／ＥＧ／Ｃ）で希釈し、抗ＣＤ９抗体(自社製)を固定した磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍ－２８０　ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（ライフテクノロジーズ社））を０．２６ｍｇ／ｍＬとなるように添加した。３７℃で１時間回転反応させた後に、磁性ビーズをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、サンプルバッファー（ＢＩＯ－ＲＡＤ社）で希釈してウエスタンブロッティング用サンプルとした。ビオチン化した抗ＣＤ９抗体によるウエスタンブロッティング法で免疫沈降効率を解析した（図４）。抗凝固剤の種類を問わず、血漿検体においてもＣＭＣによるＥＶ回収効率向上の効果を認めた。また、ＣＭＣとキレート剤を組み合わせることでさらにＥＶ回収効率が向上した。
（実施例５）
　ＣＭＣ（シグマアルドリッチ社＃Ｃ４８８８）が、ＣＤ９以外の２種類のテトラスパニン膜タンパク質（ＣＤ６３およびＣＤ８１）、および細胞外マトリクスメタロプロテアーゼ誘導物質（ＣＤ１４７）に対する抗体を用いたＥＶ回収に与える効果を検討した。
　２００μＬの健常人血清を２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心した後、その上清に２００μＬのＰＢＳ、ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ－ＰＢＳ（血清希釈後の各終濃度５０ｍＭ）（ＥＤ／ＥＧ）、ＣＭＣ－ＰＢＳ（血清希釈後の終濃度０．５重量％）（ＣＭＣ）、またはＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＣＭＣ－ＰＢＳ（血清希釈後のそれぞれの終濃度３７．５ｍＭ／３７．５ｍＭ／０．５重量％）（ＥＤ／ＥＧ／Ｃ）で希釈し、抗ＣＤ６３抗体（８Ａ１２：コスモバイオ社）、抗ＣＤ８１抗体（Ｍ３８：アブカム社）および抗ＣＤ１４７抗体（ＭＥＭ－Ｍ６／１：アブカム社）の各抗体を固定した磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍ－２８０　ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（ライフテクノロジーズ社））を０．２６ｍｇ／ｍＬとなるように添加した。４℃で一晩回転反応させた後に、磁性ビーズをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、サンプルバッファー（ＢＩＯ－ＲＡＤ社）で希釈してウエスタンブロッティング用サンプルとした。抗ＣＤ６３抗体（自社製）、抗ＣＤ８１抗体（１２Ｃ４：コスモバイオ社）およびビオチン化抗ＣＤ９抗体（自社製）によるウエスタンブロッティング法でＥＶ回収効率を解析した（図５Ａおよび図５Ｂ）。ＣＤ６３、ＣＤ８１、およびＣＤ１４７に対する抗体を用いた場合でもＣＭＣによるＥＶ回収効率向上の効果を認めた。また、ＣＭＣとキレート剤を組み合わせることでさらにＥＶ回収効率が向上した。
（実施例６）
　２種類の体液（尿および唾液）において、ＣＭＣ（シグマアルドリッチ社＃Ｃ４８８８）のＥＶ回収への効果を検討した。
　２００μＬの健常人尿および唾液（それぞれ、２個のサンプル。「＃１」および「＃２」として表わす。）を１５，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心し、０．２２μｍフィルターにより濾過を行った後、２００μＬのＰＢＳ、ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ－ＰＢＳ（尿または唾液希釈後の各終濃度５０ｍＭ）（ＥＤ／ＥＧ）、ＣＭＣ－ＰＢＳ（尿または唾液希釈後の終濃度０．５重量％）（ＣＭＣ）、またはＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＣＭＣ－ＰＢＳ（尿または唾液希釈後のそれぞれの終濃度３７．５ｍＭ／３７．５ｍＭ／０．５重量％）（ＥＤ／ＥＧ／Ｃ）で希釈し、抗ＣＤ９抗体（自社製）を固定した磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍ－２８０　ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（ライフテクノロジーズ社））を０．２６ｍｇ／ｍＬとなるように添加した。３７℃で１時間回転反応させた後に、磁性ビーズをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、サンプルバッファー（ＢＩＯ－ＲＡＤ社）で希釈してウエスタンブロッティング用サンプルとした。ビオチン化した抗ＣＤ９抗体によるウエスタンブロッティング法で免疫沈降効率を解析した（図６）。血清、血漿のみならず、尿および唾液においてもＣＭＣによるＥＶ回収効率向上の効果を認めた。
（実施例７）
　下記表２に示すセルロース誘導体（０．１３重量％～４．０重量％の各終濃度）の、ＥＶ回収への効果を検討した。
　健常人血清を２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心した後、２００μＬの血清を２００μＬのＰＢＳ、ＣＭＣ－ＰＢＳ（血清希釈後の終濃度０．５重量％）（ＣＭＣ）、またはＰＢＳに溶解したセルロース誘導体（血清希釈後の各終濃度０．１３～４．０重量％）で希釈し、抗ＣＤ９抗体（自社製）を固定した磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍ－２８０　ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（ライフテクノロジーズ社））を０．２６ｍｇ／ｍＬとなるように添加した。３７℃で１時間回転反応させた後に、磁性ビーズをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、サンプルバッファー（ＢＩＯ－ＲＡＤ社）で希釈してウエスタンブロッティング用サンプルとした。ビオチン化した抗ＣＤ９抗体によるウエスタンブロッティング法でＥＶの回収効率を解析した（図７Ａ～Ｃ）。ＣＭＣ以外の３種類のセルロース誘導体においてもＰＢＳ希釈サンプルと比較してＥＶ回収効率向上の効果を認めた（ＨＥＣは０．１３重量％～２．０重量％の範囲、ＨＰＣは０．２５重量％～４．０重量％の範囲、ＨＰＭＣは０．２５重量％～２．０重量％の範囲において）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（実施例８）
　下記表３に示すポリビニルピロリドン（１重量％、２重量％、４重量％の各終濃度）の、ＥＶ回収への効果を検討した。
　健常人血清を２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心した後、２００μＬの血清を２００μＬのＰＢＳ、またはＰＢＳに溶解したポリビニルピロリドン（血清希釈後の各終濃度１．０～４．０重量％）で希釈し、抗ＣＤ９抗体(自社製)を固定した磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍ－２８０　ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（ライフテクノロジーズ社））を０．２６ｍｇ／ｍＬとなるように添加した。３７℃で１時間回転反応させた後に、磁性ビーズをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、サンプルバッファー（ＢＩＯ－ＲＡＤ社）で希釈してウエスタンブロッティング用サンプルとした。ビオチン化した抗ＣＤ９抗体によるウエスタンブロッティング法でＥＶの回収効率を解析した（図８）。ポリビニルピロリドンは１．０重量％～４．０重量％の範囲で、ＰＢＳ希釈サンプルと比較して、ＥＶ回収効率向上の効果が認められた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（実施例９）
　ＣＭＣ（シグマアルドリッチ社＃Ｃ４８８８）について、３５℃から６０℃の各反応温度におけるＥＶ回収への効果を検討した。
　健常人血清を２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心した後、１００μＬの血清を１００μＬのＰＢＳまたはＣＭＣ－ＰＢＳ（血清希釈後の終濃度０．５重量％）で希釈し、抗ＣＤ９抗体（自社製）、抗ＣＤ６３抗体（８Ａ１２：コスモバイオ社）または抗ＣＤ８１抗体（１２Ｃ４：コスモバイオ社）を固定した磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍ－２８０　ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（ライフテクノロジーズ社））を０．２６ｍｇ／ｍＬとなるように添加した。各反応温度で５分間反応させた後に、磁性ビーズをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、サンプルバッファー（ＢＩＯ－ＲＡＤ社）で希釈してウエスタンブロッティング用サンプルとした。ビオチン化した抗ＣＤ９抗体（自社製）、抗ＣＤ６３抗体（自社製）および抗ＣＤ８１抗体（１２Ｃ４：コスモバイオ社）によるウエスタンブロッティング法でＥＶの回収効率を解析した（図９Ａ～図９Ｃ）。ＣＭＣ添加により３５℃から６０℃の各反応温度においてＥＶ回収効率向上の効果を認めた。さらに４０℃以上の高温条件においてＣＭＣ添加によりＥＶ回収効率向上の、より高い効果を認めた。また、ＣＭＣによるＥＶ回収効率向上効果は短時間の反応においても効果を認めた。
（実施例１０）
　実施例７で用いたセルロース誘導体および実施例８で用いたポリビニルピロリドンのＰＢＳ溶液中の粘度を測定した。具体的には、２重量％になるように各セルロース誘導体又はポリビニルピロリドンをＰＢＳに溶解して調製した各ＰＢＳ溶液を粘性解析装置レオロジースペクトロメータＳＫＲ１００（ヤマト科学社）を用いて、３０℃、測定時間６０秒にて、２００ｒｐｍ、４００ｒｐｍ、６００ｒｐｍ、８００ｒｐｍの各回転速度で測定した結果の平均として求めた（表４）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（実施例１１）
　ＣＭＣ（シグマアルドリッチ社＃Ｃ４８８８）およびテトラスパニン膜タンパク質（ＣＤ９およびＣＤ６３）に対する抗体を用いた免疫沈降法によるＥＶ回収およびＥＶからのマーカー（ＥＭＬ４－ＡＬＫ融合遺伝子）ＲＮＡの検出への効果を検討した。
　３日間無血清培地で培養したヒト肺癌細胞Ｈ２２２８の培養上清をサンプルとして用いた。培養上清を、２，０００×ｇ、４℃で５分間遠心し、０．２２μｍフィルター（ミリポア社製）で濾過した後、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－１５（ミリポア社製）を用いて１００倍に濃縮した。
　濃縮物を等量のＰＢＳ、ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ－ＰＢＳ（濃縮物を希釈した後の各終濃度５０ｍＭ）（ＥＤ／ＥＧ）、ＣＭＣ－ＰＢＳ（濃縮物を希釈した後の終濃度０．５重量％）（ＣＭＣ）、またはＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＣＭＣ－ＰＢＳ（濃縮物を希釈した後のそれぞれの終濃度３７．５ｍＭ／３７．５ｍＭ／０．５重量％）（ＥＤ／ＥＧ／Ｃ）で希釈し、抗ＣＤ９抗体（自社製）、抗ＣＤ６３抗体（自社製）の各抗体を固定したＤｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍ－２８０　ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（ライフテクノロジーズ社）をそれぞれ０．２６ｍｇ／ｍＬとなるように添加した。４℃で一晩、回転反応させた後に、ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、ｍｉＲＮｅａｓｙ　ｍｉｃｒｏ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてトータルＲＮＡを精製した。精製したトータルＲＮＡからＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＶ　Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いてｃＤＮＡを作成し、Ｄｒｏｐｌｅｔ　Ｄｉｇｉｔａｌ　ＰＣＲ（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いてＥＭＬ４－ＡＬＫ　ｍＲＮＡを定量した（図１０）。
　ＥＭＬ４－ＡＬＫ　ｍＲＮＡの検出には以下の表５に示す配列のプライマーおよび蛍光プローブを用いた。蛍光プローブとして、５’末端に蛍光物質ＨＥＸと、プローブの内部にＺＥＮクエンチャーと、３’末端にＩｏｗａ　Ｂｌａｃｋ（登録商標）クエンチャー（ＩＡＢｋＦＱ）とを有するダブルクエンチャープローブを用いた。表５に示す配列のプライマーおよび蛍光プローブを用いることにより、ＥＭＬ４－ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント３ａおよび３ｂを検出することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　免疫沈降法により回収したＥＶに含まれるＥＭＬ４－ＡＬＫを検出した。ＣＭＣを用いることで、ＥＭＬ４－ＡＬＫ　ｍＲＮＡ検出量が増大し、ＥＶ回収効率の向上効果を認めた。さらに、キレート剤を添加することで、ＥＭＬ４－ＡＬＫ　ｍＲＮＡ検出量がより増大し、ＥＶ回収効率のより向上した効果を認めた。

Claims (18)

  1. 　ポリマーの存在下で細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離することを含む、細胞外小胞の回収方法。
  2. 　ポリマーが、２０～３０℃における１～２０重量％水溶液中の粘度として１．５ｍＰａ・ｓ以上の値を有する、請求項１に記載の方法。
  3. 　ポリマーが、セルロース誘導体またはカルボニル含有親水性基を有するポリビニル誘導体である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　ポリマーが、少なくとも１つの水酸基の水素原子がカルボキシアルキルまたはヒドロキシアルキルで置換されたセルロース誘導体、または少なくとも１つの水素原子がラクタムで置換されたポリビニル誘導体である、請求項３に記載の方法。
  5. 　ポリマーが、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはポリビニルピロリドンである、請求項４に記載の方法。
  6. 　ポリマーが、１０ｋＤａ以上の重量平均分子量を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離する際のポリマーの濃度が、０．０１～１０．００重量％である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　細胞外小胞含有試料とキレート剤を合わせることをさらに含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 　細胞外小胞が、エクソソームである、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 　前記分離が、細胞外小胞膜結合物質を用いた分離法、または細胞外小胞含有試料の超遠心法により行われる、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 　細胞外小胞膜結合物質が、テトラスパニン膜タンパク質に対する抗体、または細胞外マトリクスメタロプロテアーゼ誘導物質に対する抗体である、請求項１０に記載の方法。
  12. 　細胞外小胞膜結合物質がＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、またはＣＤ１４７に対する抗体である、請求項１１に記載の方法。
  13. 　細胞外小胞含有試料が血液試料、尿、または唾液である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 　以下を含む、細胞外小胞の分析方法：
    （１）ポリマーの存在下で、細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離すること；および
    （２）分離された細胞外小胞を分析すること。
  15. 　キレート剤の細胞外小胞含有試料への添加をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
  16. 　分離された細胞外小胞中のタンパク質または核酸が分析される、請求項１４または１５に記載の方法。
  17. 　ポリマーおよび細胞外小胞膜結合物質を含む、キット。
  18. 　キレート剤をさらに含む、請求項１７に記載のキット。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021210622A1 (ja) * 2020-04-15 2021-10-21 合同会社Ｈ．Ｕ．グループ中央研究所 細胞外小胞の回収方法
WO2022211006A1 (ja) * 2021-03-31 2022-10-06 三洋化成工業株式会社 架橋ポリマー、物質を分離する方法、物質を分離するためのキット、疾患を検査するためのキット及び物質を分離するための装置
WO2023074541A1 (ja) * 2021-10-26 2023-05-04 国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所 組織特異的な細胞外小胞マーカーの選定方法、組織特異的マーカー、及びその精製方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014003053A1 (ja) 2012-06-27 2014-01-03 独立行政法人国立がん研究センター 膵臓がんの検出方法及び検出用キット
WO2014152622A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Mirna biogenesis in exosomes for diagnosis and therapy
US20150125864A1 (en) * 2013-11-06 2015-05-07 Samsung Electronics Co., Ltd. Methods of stabilizing a vesicle in a sample
WO2017178472A1 (en) * 2016-04-12 2017-10-19 Unicyte Ev Ag Isolation of extracellular vesicles (evs) from biological fluid samples
WO2018070479A1 (ja) 2016-10-13 2018-04-19 合同会社みらか中央研究所 細胞外小胞の回収方法
US20180164197A1 (en) * 2015-03-31 2018-06-14 Postech Academy-Industry Foundation Method for isolating extracellular vesicles using aqueous two-phase system

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130273544A1 (en) * 2012-04-17 2013-10-17 Life Technologies Corporation Methods and compositions for exosome isolation
US10139402B2 (en) * 2013-11-06 2018-11-27 Jsr Corporation Separation method, detection method, signal measurement method, method for determining disease, method for evaluating drug efficacy of disease treatment drug, kit, and liquid composition
KR101762833B1 (ko) * 2014-06-20 2017-07-28 (주)프로스테믹스 지방 조직으로부터 지방유래 줄기세포와 엑소좀을 분리하는 방법
CN113980089A (zh) * 2014-12-05 2022-01-28 富士胶片和光纯药株式会社 一种检测试样中的细胞外膜囊泡的方法和检测用试剂盒的用途
WO2016123556A1 (en) * 2015-01-30 2016-08-04 The Johns Hopkins University Extracellular vesicles for agent delivery
KR101895916B1 (ko) * 2017-08-11 2018-09-07 주식회사 엑소코바이오 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 및 이를 포함하는 조성물의 제조 방법
CN108546671A (zh) * 2018-04-17 2018-09-18 马英淙 一种生物样品中细胞微囊泡的分离方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014003053A1 (ja) 2012-06-27 2014-01-03 独立行政法人国立がん研究センター 膵臓がんの検出方法及び検出用キット
WO2014152622A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Mirna biogenesis in exosomes for diagnosis and therapy
US20150125864A1 (en) * 2013-11-06 2015-05-07 Samsung Electronics Co., Ltd. Methods of stabilizing a vesicle in a sample
US20180164197A1 (en) * 2015-03-31 2018-06-14 Postech Academy-Industry Foundation Method for isolating extracellular vesicles using aqueous two-phase system
WO2017178472A1 (en) * 2016-04-12 2017-10-19 Unicyte Ev Ag Isolation of extracellular vesicles (evs) from biological fluid samples
WO2018070479A1 (ja) 2016-10-13 2018-04-19 合同会社みらか中央研究所 細胞外小胞の回収方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CAS , no. 9004-32-4
See also references of EP3869177A4
TAYLOR ET AL., GYNECOLOGIC ONCOL., vol. 100, 2008, pages 13 - 21

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021210622A1 (ja) * 2020-04-15 2021-10-21 合同会社Ｈ．Ｕ．グループ中央研究所 細胞外小胞の回収方法
EP4137559A4 (en) * 2020-04-15 2024-06-12 H.U. Group Research Institute G.K. METHOD FOR SAMPLING EXTRACELLULAR VESICLES
WO2022211006A1 (ja) * 2021-03-31 2022-10-06 三洋化成工業株式会社 架橋ポリマー、物質を分離する方法、物質を分離するためのキット、疾患を検査するためのキット及び物質を分離するための装置
WO2023074541A1 (ja) * 2021-10-26 2023-05-04 国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所 組織特異的な細胞外小胞マーカーの選定方法、組織特異的マーカー、及びその精製方法

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