JP5400903B2 - アミロイドβ測定方法 - Google Patents
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Description
以下では、本発明の第一実施形態における各工程の詳細を図11に沿って説明する。
以下では、本発明の第二実施形態における各工程の詳細を図12に沿って説明する。
本実施例については、図1を用いて説明する。
栄研化学が生産販売している綿棒(11)(γ滅菌アルミ軸綿棒)を用い、インフルエンザ簡易キットの方法を転用して、被験者a〜eの5名の健常な被験者から鼻粘液を採取した。鼻粘液を採取した綿棒(11)を試験管(12)に入れ、採取した鼻粘液を検体(13)とした。
次いで、検体(13)を採取した綿棒(11)を入れた試験管(12)に80%ギ酸(14)を500μL添加するとともに、10μM SAC(15)を50μL添加して、綿棒に付いた検体(13)を抽出するとともに可溶化を行い、試料(16)を得た。さらに、綿棒(11)の採取部を試験管(12)内の溶液から引き上げた状態で綿棒(11)を試験管(12)に固定し、試験管(12)を遠心機に入れて、回転数2000rpmで1分間遠心を行い、綿棒(11)を脱水し(17)、その後、綿棒(11)を試験管(12)から取り出して試料(18)を得た。その後、減圧濃縮(19)により試料(18)を濃縮して容量が40μLの試料(20)を得た。
その後、試料(20)に1Mトリス緩衝溶液(pH未調整)(21)を960μL加えてギ酸を中和し、容量が1mLの測定用試料(22)を得た。
測定は、アミロイドβを測定するELISAの測定キットを用いて実施した(和光純薬社製、Human/Rat βAmyloid42 ELISA Kit wako、High−Sensitive;商品番号292−64501およびHuman/Rat βAmyloid40 ELISA Kit wako II;商品番号;294−64701)。測定に先立って、検量線を作製するための溶液を、Aβ42およびAβ40のスタンダード溶液、あるいは、実施例4で調製した原液を用いて、Aβ42を0.05、0.1、0.2、0.25、1、2、2.5、5、10、又は20pM、Aβ40を0.25、0.5、1、1.25、2.5、5、10、12.5、25、50、又は100pM、に調製した。調製後は、検量線を作製するための溶液と各測定用試料をそれぞれ、前記測定キットのマイクロタイタープレートに100μL添加した。
以上の測定結果を、図2に示す。これによると、本実施例の方法で処理した鼻粘液検体において、Aβ40が0.75〜3.26pM、Aβ42が0.12〜0.27pMの値を示した。以上のように、鼻粘液検体にギ酸を添加して減圧濃縮することで、通常では測定出来なかった鼻粘液中に含まれるAβ量を測定することに成功した。
本実施例については、図3を用いて説明する。
Aβが大量発現されるように遺伝子改変されたマウス(以下APPマウスという)の脳切片を10mMリン酸緩衝液(PB)中でホモジナイズして得られた脳ホモジネート溶液の上清を用いた。本実施例では、これを検体(31)とし、試験管(32)に10μL添加した。
次いで、試験管(32)に添加された検体(31)に、80%ギ酸(33)を500μL添加し、10μM SAC(34)を50μL添加して可溶化を行い、容量が560μLの試料(35)を得た。その後、減圧濃縮(36)により試料(35)を濃縮して、容量が40μLの試料(37)を得た。
その後、試料(37)に1Mトリス緩衝溶液(pH未調整)(38)を960μL加えてギ酸の中和を行い、容量が1mLの測定用試料(39)を得た。
検体準備工程で調製した脳検体を10μL試験管に添加し、さらに10mMリン酸緩衝液(PB)を990μL添加して100倍希釈した。これは、中和工程まで実施した脳検体と同等の希釈倍率となる。これを、本実施例の処理検体と比較するための未処理検体とした。
測定は、アミロイドβを測定するELISAの測定キットを用いて実施した(和光純薬社製、Human/Rat βAmyloid42 ELISA Kit wako、High−Sensitive;商品番号292−64501およびHuman/Rat βAmyloid40 ELISA Kit wako II;商品番号;294−64701)。測定に先立って、検量線を作製するための溶液を、Aβ42およびAβ40のスタンダード溶液、あるいは、実施例4で調製した原液を用いて、Aβ42を0.1、0.2、0.25、1、2、2.5、5、10、又は20pM、Aβ40を1、1.25、2.5、5、10、12.5、25、50、又は100pM、に調製した。調製後は、検量線を作製するための溶液と各測定用試料をそれぞれ、前記測定キットのマイクロタイタープレートに100μL添加した。
以上の測定結果を、図4に示す。これによると、本実施例の方法で処理した脳検体において、Aβ40とAβ42はともに未処理検体と比較して高い値を示した。中でも、Aβ42は約18倍となり、脳検体中に多量の凝集Aβ42が含まれていたことがわかった。これにより、検体にギ酸を添加して減圧濃縮することで、通常では測定出来なかった検体中に含まれる凝集AβをAβモノマーに変換して測定することができ、非常に高感度にAβを測定できることがわかった。
本実施例については、図5を用いて説明する。
市販の固体Aβ42(ペプチド研究所製;商品番号4349−V)、市販の固体Aβ40(ペプチド研究所製;商品番号4307−V)、及び、ジメチルスルフォキシド(DMSO)を用いて、Aβ42のDMSO溶液(濃度20μM)、及び、Aβ40のDMSO溶液(濃度100μM)を調製した。これら溶液を等量混ぜAβ42とAβ40の混合液とした。
次に、この混合液を70%ギ酸により希釈することで可溶化を行い、最終濃度を、Aβ42は70%ギ酸溶液の10pM、Aβ40は70%ギ酸溶液の50pMとした。これを検体(41)とした。検体(41)を試験管(42)に1mL添加し、減圧濃縮(43)により検体(41)の濃縮を行い、完全乾固した試料(44)と、完全乾固させずに50μLの液体を残留させた試料(45)を作製した。その後、完全乾固した試料(44)に、40μLのギ酸(46)を入れて、試料(47)を得た。
次いで当該試料(47)に1Mトリス緩衝液(48)を960μL加えて中和を行い、1000μLの測定用試料(49)を得た。完全乾固させなかった試料(45)には、直接1Mトリス緩衝液(50)を950μL加えて中和を行い、1000μLの測定用試料(51)を得た。
測定は、アミロイドβを測定するELISAの測定キットを用いて実施した(和光純薬社製、Human/Rat βAmyloid42 ELISA Kit wako、 High−Sensitive;商品番号292−64501およびHuman/Rat βAmyloid40 ELISA Kit wako II;商品番号;294−64701)。測定に先立って、検量線を作製するための溶液を、Aβ42およびAβ40のスタンダード溶液、あるいは、実施例4で調製した原液を用いて、Aβ42を0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、又は20pM、Aβ40を1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50、又は100pM、に調製した。調製後は、検量線を作製するための溶液と各測定用試料1mLをそれぞれ、前記測定キットのマイクロタイタープレートに添加した。
以上の測定結果を、図6に示す。これによると、Aβ42及びAβ40の回収率は、可溶化剤添加後の濃縮工程により乾固させなかった試料では、それぞれ80%及び100%と、非常に高い値を示した。一方、可溶化剤添加後の濃縮工程により乾固させた試料では、回収率が10%未満及び20%未満と極めて低い値に留まった。これにより、可溶化剤添加後の濃縮工程で試料を乾固させないことにより、Aβの回収率、すなわち測定感度が著しく向上することが分かった。
本実施例については、図7を用いて説明する。
Aβ42、Aβ40等のAβモノマーのリン酸緩衝溶液の調製にはAβモノマーの凝集性および吸着性による損失が伴う。したがって、調製は、段階希釈に基づき、慎重に行った。具体的には、市販の固体Aβ42(ペプチド研究所製;商品番号4349−V)、市販の固体Aβ40(ペプチド研究所製;商品番号4307−V)、及び、ジメチルスルフォキシド(DMSO)を用いて、Aβ42のDMSO溶液(濃度20μM)、及び、Aβ40のDMSO溶液(濃度100μM)を調製した。これら溶液を等量混ぜAβ42とAβ40の混合液とした。その後、0.5%牛血清アルブミン(BSA)及び0.1%Tween20のリン酸生理食塩緩衝液(pH7.4、PBS)を用いて、Aβ42の濃度が5nM、Aβ40の濃度が25nMになるまで前記混合液を希釈した。この希釈された混合液では、Aβ42およびAβ40いずれも、Aβモノマーとして安定に存在させることができるので、本実施例における原液とした。
試験管(62)を13本準備し、各試験管に、添加剤(63)250μLを加えた。添加剤としては、次の(A)から(M)で示す13種類の添加剤(63)を準備し、試験管1本あたり1種類の添加剤を添加した。
(A) 0.9%BSA・80%ギ酸
(B) 10nMクルクミン・0.9%BSA・80%ギ酸
(C) 9%TritonX100・0.9%BSA・80%ギ酸
(D) 10μM SAC・0.9%BSA・80%ギ酸
(E) 20%DMSO・0.9%BSA・80%ギ酸
(F) 0.9%BSA・0.1%Tween20・PBS
(G) 10nMクルクミン・0.9%BSA・0.1%Tween20・PBS
(H) 9%TritonX100・0.9%BSA・0.1%Tween20・PBS(I) 10μM SAC・0.9%BSA・0.1%Tween20・PBS
(J) 50%DMSO・0.9%BSA・0.1%Tween20・PBS
(K) PB
(L) 28%NH3
(M) 5.6%NH3・0.9%BSA・0.1%Tween20・PBS
(検体準備工程の実施)
次に、各試験管に、検体(61)を2mL添加して2250μLの試料(64)を得た。
試料(64)に対し、減圧濃縮により濃縮(65)を実施し、容量を50μLまで濃縮した試料(66)を得た。
試料(66)に80%ギ酸(67)を300μL添加することで可溶化を行い、容量が350μLの試料(68)を得た。その後、減圧濃縮(69)により試料(67)の濃縮を実施し、容量が40μLの試料(70)を得た。
その後、試料(70)に1Mトリス緩衝溶液(pH未調整)(71)を960μL加えてギ酸の中和を行い、容量が1mLの測定用試料(72)を得た。
測定は、アミロイドβを測定するELISAの測定キットを用いて実施した(和光純薬社製、Human/Rat βAmyloid42 ELISA Kit wako、 High−Sensitive;商品番号292−64501およびHuman/Rat βAmyloid40 ELISA Kit wako II;商品番号;294−64701)。測定に先立って、検量線を作製するための溶液を、Aβ42およびAβ40のスタンダード溶液、あるいは、前記調製した原液を用いて、Aβ42を0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、又は20pM、Aβ40を1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50、又は100pM、に調製した。調製後は、検量線を作製するための溶液と測定用試料(72)をそれぞれ、前記測定キットのマイクロタイタープレートに添加した。
以上の測定結果を、図8に示す。これによると、検体処理容器に予めギ酸を添加していた試料(A)−(E)では、ギ酸を添加していない試料(F)−(M)と比較して、Aβ42及びAβ40双方の回収率が非常に高い値を示した。中でも、ギ酸とSACを併用した試料(D)は、最も高い回収率を示した。これにより、検体処理容器に予めギ酸に代表される添加剤を添加しておくことにより、濃縮工程(第二濃縮工程)の前に事前濃縮工程(第一濃縮工程)を行う場合であっても、Aβの回収率、すなわち測定感度が著しく向上することが分かった。
実施例4における添加剤を使用しない状態で第一濃縮工程を実施し、第一濃縮工程を実施する場合における添加剤の必要性を検討した。本参考例については、図9を用いて説明する。
市販の固体Aβ42(ペプチド研究所製;商品番号4349−V)、市販の固体Aβ40(ペプチド研究所製;商品番号4307−V)、及び、ジメチルスルフォキシド(DMSO)を用いて、Aβ42のDMSO溶液(濃度20μM)、及び、Aβ40のDMSO溶液(濃度100μM)を調製した。これら溶液を等量混ぜAβ42とAβ40の混合液とした。その後、0.5%牛血清アルブミン(BSA)及び0.1%Tween20のリン酸生理食塩緩衝液(pH7.4、PBS)を用いて、Aβ42の濃度は5nM、Aβ40の濃度は25nMになるまで前記混合液を希釈した。この希釈された混合液では、Aβ42およびAβ40いずれも、Aβモノマーとして安定に存在させることができるので、本参考例における原液とした。
検体(81)を試験管(82)に500μL添加した後、減圧濃縮により検体(81)の濃縮(83)を実施した。ここで、濃縮(83)では、凍結乾燥又は減圧濃縮を利用し、減圧濃縮により完全乾固させた試料(84)と、凍結乾燥により得た試料(85)と、減圧濃縮により容量を50μLまで濃縮したが乾固していない試料(86)を作製した。
各試料に70%ギ酸(87)を添加することで可溶化を行い、容量が500μLの試料(88)、(89)及び(90)を得た。
その後、各試料(92)、(93)及び(94)に1Mトリス緩衝溶液(pH未調整)(95)を960μL加えてギ酸を中和し、容量が1mLの測定用試料(96)、(97)及び(98)を得た。
測定は、アミロイドβを測定するELISAの測定キットを用いて実施した(和光純薬社製、Human/Rat βAmyloid42 ELISA Kit wako、 High−Sensitive;商品番号292−64501およびHuman/Rat βAmyloid40 ELISA Kit wako II;商品番号;294−64701。測定に先立って、検量線を作製するための溶液を、Aβ42およびAβ40のスタンダード溶液、あるいは、前記調製した原液を用いて、Aβ42を0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20pM、Aβ40を1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50、100pM、に調製した。調製後は、検量線を作製するための溶液と各測定用試料1mLをそれぞれ、前記測定キットのマイクロタイタープレートに添加した。
以上の測定結果を、図10に示す。これによると、いずれの試料でも、24%程度の回収率に留まった。可溶化剤添加の前に検体(81)を濃縮する第一濃縮工程においては、試料を完全乾固させても、完全乾固させなくても、回収率に有意差はなく、回収率は低かった。実施例4で示したように、可溶化剤添加の前に第一濃縮工程を実施する場合には、第一濃縮工程で試料の完全乾固を回避することよりも、検体処理容器に予めギ酸等の添加剤を添加しておくことの方が、Aβの回収率、すなわち測定感度を向上させるために重要であることが判明した。
12 試験管
13 検体
14 ギ酸添加
15 SAC添加
16 ギ酸及びSACを添加した試料
17 綿棒の脱水
18 ギ酸及びSAC添加後綿棒除去後の試料
19 濃縮
20 容量40μLに濃縮した試料
21 1Mトリス緩衝液添加
22 測定用試料
31 検体
32 試験管
33 ギ酸添加
34 SAC添加
35 ギ酸及びSACを添加した試料
36 濃縮
37 容量40μLに濃縮した試料
38 1Mトリス緩衝液添加
39 測定用検体
41 検体
42 試験管
43 濃縮
44 完全乾固した試料
45 完全乾固していない試料
46 ギ酸添加
47 ギ酸を添加した試料
48、50 1Mトリス緩衝液添加
49 測定用試料
51 測定用試料
61 検体
62 試験管
63 添加剤
64 添加剤を添加した試料
65、69 濃縮
66 濃縮後の、完全乾固していない試料
67 ギ酸添加
68 ギ酸を添加した試料
70 第二濃縮後の、完全乾固していない試料
71 1Mトリス緩衝液添加
72 測定用試料
81 検体
82 試験管
83、91 濃縮
84 第一濃縮後の、完全乾固した試料
85 凍結乾燥した試料
86 第一濃縮後の、完全乾固していない試料
87 ギ酸添加
88,88,89 ギ酸添加後の試料
92、93、94 第二濃縮後の、完全乾固していない試料
95 1Mトリス緩衝液添加
96、97、98 測定用試料
101 検体準備工程
102 濃縮工程
103 中和工程
104 測定工程
111 検体処理容器準備工程
112 検体準備工程
113 第一濃縮工程
114 第二濃縮工程
115 中和工程
116 測定工程
Claims (12)
- アミロイドβを含む可能性がある検体を検体処理容器に入れる検体準備工程と、
前記検体処理容器中の前記検体に、アミロイドβを可溶化する可溶化剤を添加して、濃縮操作により、前記検体を乾固させずに、前記検体に含まれる溶媒の量を低減する濃縮工程と、
前記濃縮工程で得られた検体処理液中の前記可溶化剤を中和する中和工程と、
前記中和された検体処理液に含まれる可能性があるアミロイドβを抗原抗体反応に基づいて定量する測定工程と、
を含む、アミロイドβ測定方法。 - 前記検体準備工程の前に、少なくともカルボキシル基又はスルホ基のいずれか一つを有する有機酸を含む添加剤を検体処理容器に入れる検体処理容器準備工程をさらに含む、請求項1に記載のアミロイドβ測定方法。
- 少なくともカルボキシル基又はスルホ基のいずれか一つを有する有機酸を含む添加剤を検体処理容器に入れる検体処理容器準備工程と、
アミロイドβを含む可能性がある検体を前記検体処理容器に入れる検体準備工程と、
前記検体処理容器内の前記検体を濃縮する第一濃縮工程と、
前記第一濃縮工程により濃縮された検体に、アミロイドβを可溶化する可溶化剤を添加して、濃縮操作により、前記検体に含まれる溶媒の量を低減する第二濃縮工程と、
前記第二濃縮工程で得られた検体処理液中の前記可溶化剤を中和する中和工程と、
前記中和された検体処理液に含まれる可能性があるアミロイドβを抗原抗体反応に基づいて定量する測定工程と、
を含む、アミロイドβ測定方法。 - 前記可溶化剤が、ギ酸である請求項1又は3に記載のアミロイドβ測定方法。
- 前記添加剤が、ギ酸とs−アリル−l−システインを含む請求項2又は3に記載のアミロイドβ測定方法。
- 前記検体処理容器は、ブロッキング剤を含む請求項1又は3に記載のアミロイドβ測定方法。
- 前記ブロッキング剤が、牛血清アルブミンを含む請求項6に記載のアミロイドβ測定方法。
- 前記検体処理容器が、アミロイドβの吸着を抑制する内壁表面を有する請求項1又は3に記載のアミロイドβ測定方法。
- 前記第一濃縮工程において、アミロイドβを不溶化させずに濃縮を行う請求項3に記載のアミロイドβ測定方法。
- 前記検体が、体液である請求項1又は3に記載のアミロイドβ測定方法。
- 前記検体が、生体組織を洗浄して得られる洗浄液である請求項1又は3に記載のアミロイドβ測定方法。
- 前記生体組織が、鼻粘膜である請求項11に記載のアミロイドβ測定方法。
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