JP6873995B2 - ヘプシジンの検出用キット - Google Patents
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Description
本出願は、それらの全体が参照により組み入れられる、2015年11月25日に出願された米国特許仮出願第62/260,106号および2015年12月4日に出願された米国特許仮出願第62/263,245号の恩典を主張する。
本出願は、ASCII形式で電子的に提出されていて、かつその全体が参照により本明細書に組み入れられる配列表を含有する。前記ASCIIコピーは、2016年11月18日に作成され、44546-710_601_SL.txtと名付けられ、かつ4,024バイトのサイズである。
鉄は、生存生物の成長および発育に必要とされる必須微量元素である。哺乳動物では、鉄含量は、鉄吸収、鉄再利用、および鉄を貯蔵する細胞からの鉄の放出を制御することによって調節される。鉄は、十二指腸および空腸上部において腸細胞によって主に吸収される。鉄は、骨髄中の細網内皮マクロファージ、肝クッパー細胞および脾臓により分解した赤血球から再利用される。鉄放出は、血漿内に鉄を放出する能力を有する主要な細胞である腸細胞、マクロファージおよび肝細胞の細胞表面に位置している主要な鉄排出タンパク質、フェロポーチンによって制御される。ヘプシジンはフェロポーチンに結合し、それを細胞表面から内部移行させ、分解させることによって、その機能活性を低下させる。
[本発明1001]
(a) 抗ヘプシジン抗体で予めコーティングした96マイクロウェルストリッププレート;
(b) ヘプシジン-25標準物質;
(c) 第1のヘプシジン-25対照;
(d) 第2のヘプシジン-25対照;
(e) ビオチン化ヘプシジン-25トレーサー;
(f) ストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート;
(g) 3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB)基質;
(h) 停止液;
(i) 洗浄緩衝液;および
(j) 試料希釈液
を含む、キット。
[本発明1002]
マイクロウェルストリッププレートがポリスチレンマイクロウェルストリッププレートである、本発明1001のキット。
[本発明1003]
マイクロウェルストリッププレート用の2つの接着性カバーをさらに含む、本発明1001のキット。
[本発明1004]
(a)の抗体が、SEQ ID NO:5に記載される可変重鎖およびSEQ ID NO:7に記載される可変軽鎖を有する抗体である、本発明1001のキット。
[本発明1005]
8バイアルのヘプシジン-25標準物質を含む、本発明1001のキット。
[本発明1006]
各バイアルが0.5 mLのヘプシジン-25標準物質を含む、本発明1005のキット。
[本発明1007]
1バイアルの第1のヘプシジン-25対照を含む、本発明1001のキット。
[本発明1008]
第1のヘプシジン-25対照のバイアルが0.5 mLの試薬を含む、本発明1007のキット。
[本発明1009]
1バイアルの第2のヘプシジン-25対照を含む、本発明1001のキット。
[本発明1010]
第2のヘプシジン25対照のバイアルが0.5 mLの試薬を含む、本発明1009のキット。
[本発明1011]
1ボトルのビオチン化ヘプシジン-25トレーサーを含む、本発明1001のキット。
[本発明1012]
バイアルが12 mLのビオチン化ヘプシジン-25トレーサーを含む、本発明1011のキット。
[本発明1013]
ビオチン化ヘプシジン-25トレーサーが、(i) 酸化的に折り畳まれたヘプシジンペプチド;(ii) 2個の(2-(2-アミノ-エトキシ)エトキシ)酢酸(AEEAc)残基からなる親水性スペーサーであって、(i)のペプチドが該ペプチドのアミノ末端で該親水性スペーサーに共有結合的に連結される、親水性スペーサー;および(iii) (ii)の親水性スペーサーに共有結合的に連結されているビオチンからなる、本発明1001のキット。
[本発明1014]
ビオチン化ヘプシジン-25トレーサーが、SEQ ID NO:1に記載されるアミノ酸配列を有するヘプシジンペプチドを含む、本発明1013のキット。
[本発明1015]
1ボトルのストレプトアビジン-HRPコンジュゲートを含む、本発明1001のキット。
[本発明1016]
ボトルが12 mLのストレプトアビジン-HRPコンジュゲートを含む、本発明1015のキット。
[本発明1017]
1ボトルのストレプトアビジン-HRPコンジュゲートを含む、本発明1001のキット。
[本発明1018]
ボトルが12 mLのストレプトアビジン-HRPコンジュゲートを含む、本発明1017のキット。
[本発明1019]
1ボトルのTMB基質を含む、本発明1001のキット。
[本発明1020]
ボトルが12 mLのTMB基質を含む、本発明1019のキット。
[本発明1021]
1ボトルの停止液を含む、本発明1001のキット。
[本発明1022]
ボトルが12 mLの停止液を含む、本発明1021のキット。
[本発明1023]
1ボトルの洗浄緩衝液を含む、本発明1001のキット。
[本発明1024]
ボトルが25 mLの洗浄緩衝液を含む、本発明1023のキット。
[本発明1025]
20×溶液の洗浄緩衝液を含む、本発明1023のキット。
[本発明1026]
洗浄液がキットでの使用前に希釈される、本発明1025のキット。
[本発明1027]
1ボトルの試料希釈液を含む、本発明1001のキット。
[本発明1028]
ボトルが3 mLの試料希釈液を含む、本発明1027のキット。
[本発明1029]
使用のための説明書をさらに含む、本発明1001〜1028のいずれかのキット。
[本発明1030]
説明書が、キットで使用するための生物試料の特定を含む、本発明1029のキット。
[本発明1031]
生物試料の収集のための1つまたは複数の収集手段をさらに含む、本発明1030のキット。
[本発明1032]
1つまたは複数の収集手段が、シリンジ、ニードル、カップ、スワブ、またはそれらの組み合わせを含む、本発明1031のキット。
[本発明1033]
生物試料が、血液試料、組織試料または尿試料を含む、本発明1030のキット。
[本発明1034]
ラベルをさらに含む、本発明1001〜1033のいずれかのキット。
[本発明1035]
ヘプシジンのレベルの上昇、ヘプシジンのレベルの低下、鉄のレベルの上昇、鉄のレベルの低下、またはそれらの組み合わせに関連する1つまたは複数の疾患または障害の検出に使用するための、本発明1034のキット。
[本発明1036]
ヘプシジンのレベルの上昇、ヘプシジンのレベルの低下、鉄のレベルの上昇、鉄のレベルの低下、またはそれらの組み合わせに関連する1つまたは複数の疾患または障害が、アフリカ型鉄過剰症、アルファサラセミア、アルツハイマー病、貧血、癌による貧血、慢性疾患による貧血、炎症による貧血、動脈硬化症もしくはアテローム動脈硬化症、運動失調、鉄に関連する運動失調、無トランスフェリン血症、癌、セルロプラスミン欠乏症、化学療法誘発性貧血、末期腎疾患もしくは慢性腎/腎臓不全を含む慢性腎疾患、急性腎傷害(AKI)、肝硬変、古典的ヘモクロマトーシス(classic hemochromatosis)、コラーゲン誘発関節炎(CIA)、先天性赤血球形成異常性貧血、うっ血性心不全、クローン病、セリアック病、炎症性腸疾患(IBD)、糖尿病、鉄体内分布の異常、鉄恒常性の異常、鉄代謝の異常、フェロポーチン病、フェロポーチン変異ヘモクロマトーシス、葉酸欠乏症、フリードライヒ運動失調症、索性脊髄症、グラシル(gracile)症候群、細菌感染、ハラーホルデン・スパッツ病、ヘモクロマトーシス、トランスフェリン受容体2の変異によって生じるヘモクロマトーシス、ヘモグロビン異常症、肝炎、肝細胞癌、遺伝性ヘモクロマトーシス、ウイルス感染、ハンチントン病、高フェリチン血症、低色素性小球性貧血、低鉄血症、インスリン抵抗性、鉄欠乏性貧血、鉄欠乏症、鉄過剰症、ヘプシジン過剰による鉄欠乏状態、若年性ヘモクロマトーシス(HFE2)、多発性硬化症、トランスフェリン受容体2、HFE、ヘモジュベリン(hemojuvelin)、フェロポーチン、TMPRSS6(IRIDA)、もしくは鉄代謝の他の遺伝子の変異、新生児ヘモクロマトーシス、鉄に関連する神経変性疾患、骨減少症、骨粗鬆症膵炎、パントテン酸キナーゼ関連神経変性症、パーキンソン病、ペラグラ、異食症、ポルフィリン症、晩発性皮膚ポルフィリン症、仮性脳炎(pseudoencephalitis)、肺ヘモジデリン沈着症、赤血球障害、関節リウマチ、敗血症、鉄芽球性貧血、全身性エリトマトーデス、サラセミア、中間型サラセミア、輸液鉄過剰症、腫瘍、血管炎、ビタミンB6欠乏症、ビタミンB12欠乏症、ウイルソン病、またはそれらの組み合わせである、本発明1035のキット。
本明細書において言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個別の刊行物、特許、または特許出願が参照によって組み入れられると具体的かつ個別に指示されている場合と同じ程度で、参照により本明細書に組み入れられる。
精度および正確度は、いかなるアッセイでも最も重要な機能的特徴の中に入る。正確度は、アッセイが乏しい再現性である場合および/または標準物質がキットに開示された濃度でなかった場合には評価することが難しい。1回のアッセイでのウェル毎の試料測定およびアッセイ毎の試料測定を再現する能力は、アッセイの実行可能性を理解するための第1段階である。市販のイムノアッセイは一般に、20%を下回るアッセイ内およびアッセイ間変動係数(CV)を有する。本願に記載されるアッセイおよびキットは、このパーセンテージと比較し有意に改善される。
1つの局面において、本明細書において、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、ヘプシジンまたは成熟ヒトヘプシジンペプチドに特異的に結合する抗体が提供される。いくつかの態様において、抗体は、成熟ヒトヘプシジン25アミノ酸ペプチドのN末端に結合する。
本明細書において、(i) 酸化的にフォールディングされるヘプシジンペプチド;(ii) 2個の(2-(2-アミノ-エトキシ)エトキシ)酢酸(AEEAc)残基からなる親水性スペーサー、ここで、(i)のペプチドは該ペプチドのアミノ末端(N末端)で該親水性スペーサーに共有結合的に連結される;および(iii) (ii)の親水性スペーサーに共有結合的に連結されたビオチンからなるイムノアッセイトレーサー試薬が提供される。いくつかの場合において、ヘプシジンペプチドは、(ii)の親水性スペーサーに共有結合的に連結される前に酸化的にフォールディングされる。いくつかの場合において、酸化的にフォールディングされるヘプシジンペプチドは、
のアミノ酸配列を有する。酸化的にフォールディングされるヘプシジンペプチドはヒトヘプシジン25のアミノ酸配列を有しうる。
本明細書において、抗体、許容される担体および賦形剤を含む本明細書に記載の組成物、およびキットの使用のための工程を説明するラベルを含むキットが提供される。いくつかの場合において、キットは、キットでの使用前に試料を入手および加工するための説明書も含みうる。1つの局面において、本明細書において、本明細書に記載されたような抗体でコーティングされかつブロッキング剤でブロッキングされる96ウェルマイクロウェルプレート、ビオチン化トレーサー分子、ストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ、基質溶液、停止液、洗浄緩衝液、試料希釈液、および標準物質(すなわち、正の対照)を含む、ヘプシジンレベルの上昇または鉄恒常性の異常に関連する障害を診断するためのキットが提供される。標準物質を含まない希釈液は、負の対照として使用されうる。
1つの態様において、抗体または抗原結合断片は、検出可能な成分をさらに含む。検出はインビトロで行うことができる。本明細書に記載の抗体によるヘプシジンの検出および/または判定(定量、定性等)のためのインビトロアッセイは、例えば、競合的酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)を含む。インビトロでのヘプシジンの検出、診断またはモニタリングは、対象から試料(例えば、血液試料、組織試料または尿試料)を得ること、および、例えば以下の実施例に記載されるような競合的ELISAアッセイなどで試料を試験することによって行うことができる。
ヒトヘプシジンペプチド(ヘプシジン-25、hep-25、Hep-25、hヘプシジン-25):(25aa)
ヒトヘプシジン-20ペプチド(ヘプシジン-20、hep-20、Hep-25、hヘプシジン-20):(20aa)
ヒトヘプシジン22ペプチド(ヘプシジン-22、hep-22、Hep-22、hヘプシジン-22):(22aa)
Intrinsic LifeSciences(ILS)ヘプシジンIDx(商標)ELISAキットは、一定数の高親和性抗ヘプシジン-25 N-末端特異的mAb結合部位に対する、試験検体中のヘプシジン-25と生物学的に活性なビオチン化ヒトヘプシジン-25トレーサーとの間の競合結合アッセイである。初めに、精製したヘプシジン-25標準物質、ヘプシジン-25対照(対照1および対照2)、および患者試料(全て二度繰り返す)を、mAbをコーティングしたマイクロウェルストリッププレートに加え、ビオチン化ヘプシジン-25トレーサーと一緒に60分間インキュベートした。ビオチン化ヘプシジン-25トレーサーは、固定数のN末端特異的抗体結合部位についてネイティブなヘプシジンまたは参照ヘプシジンと競合する。よって、患者試料由来の結合したネイティブな血清ヘプシジンの濃度が増大するにつれ、結合したビオチン化ヘプシジン-25トレーサーの量は次第に減少する。未結合のビオチン化ヘプシジン-25トレーサーは洗い流され、ストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲートがウェルに添加される。ウェルは30分間インキュベートされ、洗浄され、未結合のストレプトアビジン-HRPが取り除かれる。TMB基質を15分間加え、反応を停止液の添加により停止させる。マイクロウェルプレートリーダーを用いて、450 nmでの吸光度を測定し、データを記録した。
蒸留水または脱イオン水
血液検体は、血清、血清セパレーター、リチウムもしくはナトリウムヘパリン血漿、またはEDTA血漿チューブで収集されうる。血清および血漿検体は、採血時から最大で24時間、2〜8℃で冷蔵保存されうる。
全ての試薬および検体は、使用前に室温に達せさせなければならない。全ての試薬は、発泡することなく、緩やかに混合させなければならない。手法が開始されると、全ての工程は中断なしに完了させるべきである。ボトルの内容物(25 mL、20×)に475 mLの蒸留水または脱イオン水を添加することによって、1×洗浄緩衝液を調製する。洗浄緩衝液は室温(18〜24℃)で保存する。
最良の結果を出すために、キット中に提供される96ウェルポリプロピレン(PP)プレート中でELISA用の試料、標準物質、対照およびトレーサーを予混合する。
試料中のヘプシジン濃度が定量の上限(およそ250 ng/ml)に近づくまたはそれを上回る場合、試料を希釈し、ELISAを再実行する(警告および注意を参照されたい)。低タンパク質結合96マイクロウェルプレート(含まれず)または個別の低タンパク質結合微量遠心チューブ(含まれず)で試料希釈液(供給済み)での希釈を実施する。以下の表に図示する試料希釈例を参照されたい。22 μlの希釈試料を、標準的アッセイ手法(上記)に記載されているように96ウェルPPプレートに移す。
アッセイを実施する前に、全ての試薬を室温に導く。使用前に全ての試薬を緩やかに混合する。
ソフトウエア計算:
標準曲線を作成し、GRAPHPAD PRISM(登録商標)(Version 6.01)ソフトウエア(ワールドワイドウェブサイト: graphad.com)によるFour Parameterロジスティック(4PL)またはPoint-to-Point curve fittingアルゴリズムのいずれかを用いて、試料ヘプシジン濃度を決定した。この試験は、4PL curve fittingを用いて開発および検証された。どちらの方法とも非常に類似した結果を生じる。発明者らは、選択した後は一貫して一方の方法を用いることを推奨する。
標準曲線を構築するために、線形グラフ用紙上にヘプシジン-25標準物質濃度(横軸)に対するヘプシジン-25標準物質の吸光度(OD 450 nm)(縦軸)をプロットする。点を通る最良の曲線を描く。曲線から対照および各未知試料の吸光度を読み取り、記録する。
図1のグラフは、標準的な手法を用いて血清、リチウムヘパリン血漿、およびEDTA血漿として得られかつ調製された8つのヒト血液試料(低、中、高ヘプシジン-25)からの血漿ヘプシジンに対する血清ヘプシジンの回帰分析を表す。IntrinsicヘプシジンIDx(商標)ELISAキットを用いて、ヘプシジン-25濃度を測定した。血清とEDTA血漿との間(●、y=1.096x−1.25、R2=0.994)、および血清とリチウムヘパリン血漿(■、y=0.946x+0.19、R2=0.994)との間に強い相関性が観察された。図1を参照されたい。
キットを2〜8℃で保存する。
生物学的に有害である可能性がある物質:標準物質および対照は、肝炎B表面抗原ならびにHIV抗体についてFDA認可の試薬により検査され非応答性であると認められた、ヒト供給源成分を含む。しかしながら、いずれの検査方法も、HIV、肝炎Bウイルスまたは他の感染性因子が存在しないという完全な保証を与えることはできない。これらの試薬は、バイオセイフティーレベル2物質として取り扱われるべきである。
精度および正確度は、いかなるアッセイでも最も重要な機能的特徴の中に入る。正確度は、アッセイの再現性が乏しい場合、評価するのが難しい。1回のアッセイでのウェル毎の試料測定およびアッセイ毎の試料測定を再現する能力は、アッセイの実行可能性を理解するための第1段階である。
*平均n=16;3回のアッセイに対するCV。^3アッセイを通してn=48。
製造者の説明書を用いて、本出願に記載の現行のキットをDRG(登録商標)ヘプシジン25 bioactive ELISA(EIA-5258)、version 4.1、2014年4月28日改訂、DRG International, Inc., USAと比較した。簡単に言うと、DRG(登録商標)キットの材料およびプロトコールは以下の通りである:
マイクロタイターウェル、12×8(分断)ストリップ、96ウェル;抗ヘプシジン-25抗体(モノクローナル)でコーティングされたウェル。
標準物質バイアルの凍結乾燥内容物を0.2 mL脱イオン水で再構成し、最小で10分間静置させる。使用前に標準物質を複数回混合する。
凍結乾燥内容物を0.2 mL脱イオン水で再構成し、最小で10分間静置させる。使用前に対照を複数回混合する。
脱イオン水を40×に濃縮した洗浄液に加える。30 mLの濃縮洗浄液を1170 mL脱イオン水で1200 mLの最終体積に希釈する。
血清またはヘパリン血漿をこのアッセイで用いることができる。EDTA血漿およびクエン酸血漿は値の低下(約20%)をもたらす。
血清:静脈穿刺(例えば、血清用Sarstedt Monovette)により血液を収集し、凝固させ、室温での遠心分離によって血清を分離する。完全な凝固が生じる前に遠心分離を行わない。抗凝固剤を含む試料は凝固時間を増やす必要がある可能性がある。
血漿:抗凝固剤を含む遠心チューブ内に全血を収集し(例えば、適切な血漿調製物を伴うSarstedt Monovette)、収集後直ちに遠心分離するべきである。
初回アッセイにおいて、検体が最高量の標準物質を上回って含むことが認められる場合、検体をアッセイ緩衝液で希釈し、アッセイ手法で記載したように再アッセイすることができる。濃度の計算に関して、この希釈係数を考慮する必要がある。例:
(a) 希釈1:10:10 μL血清+90 μLアッセイ緩衝液(完全に混合する)
(b) 希釈1:100:10 μL希釈(a)1:10+90 μLアッセイ緩衝液(完全に混合する)
各実行は標準曲線を含まなければならない。
1. フレームホルダー中に所望の数のマイクロタイターウェルを固定する。
2. 適切なウェル内に100 μLのアッセイ緩衝液を分注する。
3. 適切なウェル内に新しい使い捨てチップを用いて20 μLの標準物質、対照および試料のそれぞれを分注する。
4. 各ウェル内に50 μLの酵素コンジュゲートを分注する。10秒間完全に混合する。この工程において完全に混合することは重要である。
5. 攪拌(300〜700 rpm)下で室温にて60分間インキュベートする。
6. ウェルの内容物を素早く振り落とす。1ウェルあたり400 μL希釈洗浄液で3回 (プレート洗浄機を用いる場合)、または手動洗浄の場合は1ウェルあたり300 μL希釈洗浄液で4回、ウェルをすすぐ。ウェルを吸収紙上に鋭く打ち、残留している液滴を取り除く。
7. 適切なウェル内に100 μLの酵素複合体を分注する。
8. 攪拌なしで室温にて30分間インキュベートする。
9. ウェルの内容物を素早く振り落とす。1ウェルあたり400 μL希釈洗浄液で3回 (プレート洗浄機を用いる場合)、または手動洗浄の場合は1ウェルあたり300 μL希釈洗浄液で4回、ウェルをすすぐ。ウェルを吸収紙上に鋭く打ち、残留している液滴を取り除く。
10. 各ウェルに100 μLの基質溶液を加える。
11. 室温にて20分間インキュベートする。
12. 各ウェルに100 μLの停止液を加えることによって酵素反応を停止させる。
13. 各ウェルの吸光度(OD)をマイクロプレートリーダーにより450±10 nmにて決定した。停止液を添加した後10分以内にウェルを読み取ることが推奨される。
標準物質、対照および試料の各セットについて平均吸光度を計算する。片対数グラフ用紙を用いて、縦(Y)軸上に吸光度値によりその濃度に対する各標準物質から得られた平均吸光度および横(X)軸上に濃度をプロットすることによって、標準曲線を構築する。
図1は、ILSヘプシジンIDx(商標)ELISAキットおよびDRG(登録商標)比較キットからの血漿ヘプシジンの結果の線形回帰を示す。回帰の傾きは、DRG(登録商標)キットは、ILSヘプシジンIDx(商標)ELISAキットと比較してHIPPA準拠Li-ヘパリン試料においておよそ9倍低いヘプシジン濃度を測定することを示す。2つのキット間の相関性はR2=0.91で良好であった。血漿ヘプシジン濃度の不一致により、発明者らは、DRG(登録商標)比較キットを用いて本キットからの参照標準物質を測定し、かつILSヘプシジンIDx(商標)ELISAを用いてDRG(登録商標)キットからの参照標準物質を測定した。
Claims (27)
- 対象からの生物試料において、ヘプシジンのレベルの上昇、ヘプシジンのレベルの低下、鉄のレベルの上昇、鉄のレベルの低下、またはそれらの組み合わせに関連する1つまたは複数の疾患または障害を診断するためのキットであって、
(a) 抗ヘプシジン抗体で予めコーティングした96マイクロウェルストリッププレート;
(b) ヘプシジン-25標準物質;
(c) 第1のヘプシジン-25対照;
(d) 第2のヘプシジン-25対照;
(e) ビオチン化ヘプシジン-25トレーサー;
(f) ストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート;
(g) 3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB)基質;
(h) 停止液;
(i) 洗浄緩衝液;および
(j) 試料希釈液
を含み、かつ
i) 対象が男性である場合に、該キットが、キットを用いて定量的に測定されたヘプシジンのレベルを平均が41.5 ng/mlである参照レベルと比較するように用いられる、または
ii) 対象が女性である場合に、該キットが、キットを用いて定量的に測定されたヘプシジンのレベルを平均が21.9 ng/mlである参照レベルと比較するように用いられる
ことを特徴とする、キット。 - 前記抗ヘプシジン抗体が、成熟ヒトヘプシジン25アミノ酸ペプチドのN末端に結合する、請求項1記載のキット。
- 前記抗ヘプシジン抗体が、SEQ ID NO:8の重鎖CDR1、SEQ ID NO:9の重鎖CDR2、SEQ ID NO:10の重鎖CDR3、SEQ ID NO:11の軽鎖CDR1、SEQ ID NO:12の軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO:13の軽鎖CDR3を含む、請求項1または2記載のキット。
- (a)の前記抗ヘプシジン抗体が、SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO:7のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載のキット。
- 8バイアルのヘプシジン-25標準物質を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載のキット。
- 1バイアルの第1のヘプシジン-25対照を含む、請求項1〜5のいずれか一項記載のキット。
- 1バイアルの第2のヘプシジン-25対照を含む、請求項1〜6のいずれか一項記載のキット。
- 1ボトルのビオチン化ヘプシジン-25トレーサーを含む、請求項1〜7のいずれか一項記載のキット。
- ビオチン化ヘプシジン-25トレーサーが、(i) 酸化的に折り畳まれたヘプシジンペプチド;(ii) 2個の(2-(2-アミノ-エトキシ)エトキシ)酢酸(AEEAc)残基からなる親水性スペーサーであって、(i)のヘプシジンペプチドが該ペプチドのアミノ末端で該親水性スペーサーに共有結合的に連結される、親水性スペーサー;および(iii) (ii)の親水性スペーサーに共有結合的に連結されているビオチンからなる、請求項1〜8のいずれか一項記載のキット。
- 前記酸化的に折り畳まれたヘプシジンペプチドが、SEQ ID NO:1に記載されるアミノ酸配列を有する、請求項9記載のキット。
- 1ボトルのストレプトアビジン-HRPコンジュゲートを含む、請求項1〜10のいずれか一項記載のキット。
- 1ボトルのTMB基質を含む、請求項1〜11のいずれか一項記載のキット。
- 1ボトルの停止液を含む、請求項1〜12のいずれか一項記載のキット。
- 1ボトルの洗浄緩衝液を含む、請求項1〜13のいずれか一項記載のキット。
- 20×溶液の洗浄緩衝液を含む、請求項14記載のキット。
- 洗浄液がキットでの使用前に希釈される、請求項15記載のキット。
- 1ボトルの試料希釈液を含む、請求項1〜16のいずれか一項記載のキット。
- 使用のための説明書をさらに含む、請求項1〜17のいずれか一項記載のキット。
- 生物試料の収集のための1つまたは複数の収集手段をさらに含む、請求項1記載のキット。
- 1つまたは複数の収集手段が、シリンジ、ニードル、カップ、スワブ、またはそれらの組み合わせを含む、請求項19記載のキット。
- 生物試料が、血液試料、組織試料または尿試料を含む、請求項19または20記載のキット。
- ヘプシジンのレベルの上昇、ヘプシジンのレベルの低下、鉄のレベルの上昇、鉄のレベルの低下、またはそれらの組み合わせに関連する1つまたは複数の疾患または障害が、アフリカ型鉄過剰症、アルファサラセミア、アルツハイマー病、貧血、癌による貧血、慢性疾患による貧血、炎症による貧血、動脈硬化症もしくはアテローム動脈硬化症、運動失調、鉄に関連する運動失調、無トランスフェリン血症、癌、セルロプラスミン欠乏症、化学療法誘発性貧血、末期腎疾患もしくは慢性腎/腎臓不全を含む慢性腎疾患、急性腎傷害(AKI)、肝硬変、古典的ヘモクロマトーシス(classic hemochromatosis)、コラーゲン誘発関節炎(CIA)、先天性赤血球形成異常性貧血、うっ血性心不全、クローン病、セリアック病、炎症性腸疾患(IBD)、糖尿病、鉄体内分布の異常、鉄恒常性の異常、鉄代謝の異常、フェロポーチン病、フェロポーチン変異ヘモクロマトーシス、葉酸欠乏症、フリードライヒ運動失調症、索性脊髄症、グラシル(gracile)症候群、細菌感染、ハラーホルデン・スパッツ病、ヘモクロマトーシス、トランスフェリン受容体2の変異によって生じるヘモクロマトーシス、ヘモグロビン異常症、肝炎、肝細胞癌、遺伝性ヘモクロマトーシス、ウイルス感染、ハンチントン病、高フェリチン血症、低色素性小球性貧血、低鉄血症、インスリン抵抗性、鉄欠乏性貧血、鉄欠乏症、鉄過剰症、ヘプシジン過剰による鉄欠乏状態、若年性ヘモクロマトーシス(HFE2)、多発性硬化症、トランスフェリン受容体2、HFE、ヘモジュベリン(hemojuvelin)、フェロポーチン、TMPRSS6(IRIDA)、もしくは鉄代謝の他の遺伝子の変異、新生児ヘモクロマトーシス、鉄に関連する神経変性疾患、骨減少症、骨粗鬆症膵炎、パントテン酸キナーゼ関連神経変性症、パーキンソン病、ペラグラ、異食症、ポルフィリン症、晩発性皮膚ポルフィリン症、仮性脳炎(pseudoencephalitis)、肺ヘモジデリン沈着症、赤血球障害、関節リウマチ、敗血症、鉄芽球性貧血、全身性エリトマトーデス、サラセミア、中間型サラセミア、輸液鉄過剰症、腫瘍、血管炎、ビタミンB6欠乏症、ビタミンB12欠乏症、ウイルソン病、またはそれらの組み合わせである、請求項1記載のキット。
- 前記抗ヘプシジン抗体が、10-11から10-14の親和性でヘプシジンに結合する、請求項1〜22のいずれか一項記載のキット。
- 前記抗ヘプシジン抗体が、ヘプシジン-25(SEQ ID NO:1)のN末端に5.16×10-11の親和性で結合する、請求項1〜23のいずれか一項記載のキット。
- 競合的酵素結合免疫吸着測定法での使用のための、請求項1〜24のいずれか一項記載のキット。
- 血液試料でのヘプシジンの検出に使用するための、請求項1〜25のいずれか一項記載のキット。
- 5%を下回るアッセイ内およびアッセイ間変動係数を含む、ヘプシジンを検出するための、請求項1〜26のいずれか一項記載のキット。
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