WO2013111578A1 - アルツハイマー病の診断方法、及び診断システム - Google Patents

アルツハイマー病の診断方法、及び診断システム Download PDF

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崇臣 福原
俊文 南條
育夫 遠山
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パナソニック株式会社
国立大学法人滋賀医科大学
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    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2821—Alzheimer

Definitions

  • the present invention relates to a diagnostic method for diagnosing Alzheimer's disease (AD) using a specimen. More specifically, the present invention relates to a diagnostic method for realizing in vitro diagnosis using a sample collected from an AD patient or a healthy person who may have AD.
  • AD Alzheimer's disease
  • Alzheimer's disease is a disease characterized by progressive dementia that occurs from the early age to the old age.
  • the number of patients in Japan is said to be over 1 million. In the future, the number is expected to increase steadily as the population ages.
  • Clinical symptoms of Alzheimer's disease are memory impairment, higher brain memory impairment (aphasia, apraxia, agnosia, constitutional apraxia) and the like. The symptoms are often seen in other dementia diseases, and it is extremely difficult to make a definitive diagnosis of Alzheimer's disease based on clinical symptoms alone.
  • Alzheimer's disease has never had a fundamental treatment until now, but since 1999, when vaccine therapy was successful in model mice, expectations for development of the fundamental treatment have increased (see Non-Patent Document 1). In order to effectively use the fundamental therapy, it is necessary to diagnose Alzheimer's disease at an early stage.
  • senile plaques and neurofibrillary tangles are characteristic pathological findings of Alzheimer's disease.
  • the former main component is an aggregate of amyloid beta peptide (hereinafter referred to as A ⁇ ) having a ⁇ sheet structure, and the latter is an excessively phosphorylated tau protein.
  • a ⁇ amyloid beta peptide
  • the amyloid hypothesis that accumulation of A ⁇ in the brain is the first serious pathological change is dominant (see Non-Patent Document 2).
  • pathological tissue changes such as accumulation of A ⁇ in the brain and an increase in phosphorylated tau protein have begun long before clinical symptoms develop. Therefore, detection of A ⁇ or tau protein in the brain as a marker is one of early diagnosis methods for Alzheimer's disease.
  • a compound that binds to senile plaques has been developed into a compound labeled with a radioactive substance or a substance that emits MR signals and administered to the body to develop amyloid imaging methods that image senile plaques in the brain. It is being advanced.
  • simultaneous measurement of general clinical laboratory items by blood sampling may be used as a clinical indicator of cognitive dysfunction, for example, by measuring thyroid hormone in the blood.
  • administration of the above-described compound may be exposed to the measurer, which is not preferable.
  • the problem with the conventional example is that there is a risk of infection by sampling using a highly puncture needle. That is, since the substance to be collected is cerebrospinal fluid or blood, it was expected to be less dangerous without administering a toxic substance into the body, but it is intended to collect biological fluid circulating in the body. The risk of infection was high due to needle invasion.
  • an object of the present invention is to provide a method for diagnosing Alzheimer's disease that can reduce the risk of infection by making the invasiveness as low as possible.
  • the method for diagnosing Alzheimer's disease of the present invention comprises a pretreatment step of pretreating an intranasal sample collected from the nasal cavity, and tau protein and / or amyloid beta peptide (hereinafter referred to as “tau protein”) in the intranasal sample pretreated in the pretreatment step , A ⁇ ), a comparison step in which the value of the tau protein and / or the A ⁇ obtained in the detection step is compared with a predetermined value, and a result of comparison in the comparison step And a display step for displaying.
  • the invasiveness can be reduced as much as possible, and the risk of infection can be reduced.
  • FIG. (A) The figure which shows A ⁇ density
  • A) The figure which shows the tau protein density
  • a ⁇ in the nasal mucosa tissue was known, but it was thought that there was no possibility of detection from a sample in the nasal cavity because the concentration was extremely low.
  • Tau protein is also known as a major biomarker of AD, but it has not been confirmed in nasal mucosal tissues other than immunohistological examination using antigen-antibody reaction, and should be detected from intranasal specimens. There were no researchers who thought about.
  • the method for diagnosing Alzheimer's disease in an embodiment of the present invention includes a pretreatment step of pretreating an intranasal specimen collected from the nasal cavity, and tau protein and / or amyloid beta in the intranasal specimen pretreated in the pretreatment step.
  • a detection step for detecting a peptide (hereinafter referred to as A ⁇ ) a comparison step for comparing the value of the tau protein and / or the A ⁇ obtained in the detection step with a predetermined value, and a comparison in the comparison step
  • a display step for displaying the result.
  • the pretreatment step includes an extraction step for eluting the intranasal sample attached to the collection device into the extract, a filtration step for fractionating the extracted solution containing the eluted intranasal sample, and a filtered solution.
  • a concentration step of concentrating can be included.
  • a filter capable of fractionation can be used.
  • the concentration step may further include an optimization step in which the filtered solution is adjusted to a solution having conditions optimal for detection by neutralization or the like.
  • an extract containing formic acid when detecting A ⁇ , an extract containing formic acid was used in the extraction step.
  • a liquid containing a biological tissue for example, brain tissue or mucous membrane
  • a measurement kit capable of reliably and quantitatively measuring A ⁇ monomer manufactured and sold by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., an accurate amount of A ⁇ could not be measured.
  • the present inventors tried a method of adding formic acid to a solution as a means of decomposing into A ⁇ monomer using aggregated A ⁇ prepared from a standard substance.
  • Formic acid is generally used to solubilize and separate proteins contained in animal and human tissues, and proteins aggregated and adsorbed in tissues.
  • the present inventors have found that when formic acid is allowed to act on a liquid that does not contain living tissue, that is, a soluble A ⁇ oligomer already dispersed in the liquid, the soluble A ⁇ oligomer is unraveled and becomes an A ⁇ monomer. I found it.
  • the mechanism by which soluble A ⁇ oligomers become A ⁇ monomers is unclear, but in liquids, some of the soluble A ⁇ oligomers are reversibly partly dissociated from A ⁇ monomers. It is presumed that it contributes to the stabilization of A ⁇ monomer.
  • formic acid was used as an additive for decomposing A ⁇ in the extraction step, but the additive is a general denaturing agent or solubilizing agent such as guanidine or solubilizing agent used as a means for denaturing proteins. It may be urea or the like.
  • the detection step includes immunoassay using an antigen-antibody reaction with the substance to be measured as an antigen.
  • the immunoassay is preferably an ELISA method.
  • a method that can directly or indirectly detect a protein as a measurement target substance may be used.
  • MS Mass Spectrometry
  • MS / MS MS
  • liquid chromatography is suitable.
  • the amount may be compared with a predetermined amount.
  • a calibration curve obtained from a standard concentration curve of the target tau protein or A ⁇ is prepared using values obtained by absorption, fluorescence, luminescence or electrochemical detection, and this is set as a predetermined value.
  • the comparison step may be a step of comparing a value obtained by performing a reverse regression from the calibration curve and a value of tau protein or A ⁇ calculated based on the detection step.
  • the logarithm of the amount of tau protein and / or the amount of A ⁇ is used as the value of tau protein and the value of A ⁇ . Good.
  • the display process includes displaying numerical values, diagrams and pictures. This process is a process that can support human understanding in determining the degree of divergence between the calculated value and the predetermined value, and whether the calculated value has increased or decreased from the predetermined value. It is preferable.
  • a calculation step of calculating the sum of the square of the calculated tau protein value and the square of the calculated A ⁇ value may be performed. That is, only this sum may be used as an output (result) of the calculation process, but calculation using other parameters may be performed on this sum, and a value obtained by calculating a square root or a multiplier on these values may be calculated. It may be output. What is necessary is just to make the output of these calculation processes the comparison object in a comparison process.
  • the detection means for detecting tau protein and A ⁇ in the intranasal sample collected from the nasal cavity in a single diagnostic system obtained by the detection means Comparing means for comparing the values of the tau protein and the A ⁇ with predetermined values, respectively, and display means for displaying the result of comparison by the comparing means are included.
  • the diagnostic system may further include a calculation unit that calculates the square of the sum of the square of the value of the tau protein obtained by the detection unit and the square of the value of the A ⁇ . The calculated value obtained by the above is used as the value of the tau protein and the A ⁇ in the comparison step.
  • AD Probable AD (hereinafter referred to as AD) patients were determined based on the clinical diagnostic criteria for Alzheimer's disease of NINCDS-ADRDA Work Group.
  • Probable AD patients dementia is confirmed by clinical examination, intelligence test (such as mini-mental state), and neuropsychological test.
  • the classification includes patients with two or more cognitive impairments, patients with memorized and other cognitive impairments, patients with no consciousness impairment, and onset age 40-90 Among them, there are patients over 65 years of age and patients who have no brain diseases other than systemic diseases and Alzheimer's disease that cause dementia.
  • findings to determine that the patient is an AD patient include progressive deterioration of language, motor activity, and cognitive impairment (aphasia, aphasia, and agnosia) and disturbances in daily living activities and behavioral patterns.
  • aphasia, aphasia, and agnosia progressive deterioration of language, motor activity, and cognitive impairment
  • disturbances in daily living activities and behavioral patterns include progressive deterioration of language, motor activity, and cognitive impairment (aphasia, aphasia, and agnosia) and disturbances in daily living activities and behavioral patterns.
  • there may be a family history of similar diseases especially pathologically diagnosed as Alzheimer's disease).
  • Example 1 In this example, 12 AD subjects were 64 to 92 years old and averaged 83.2 years. Nine non-AD subjects were 29 to 65 years old and averaged 41.3 years old. Among these subjects, 11 subjects from 64 to 92 years old averaged 83.7 years for non-AD subjects, and 4 subjects from 36 to 64 years old averaged 40 subjects for subjects who measured both A ⁇ and tau protein. I was 8 years old.
  • the nasal mucosa tissue was abraded using a cotton swab, and the cotton balls with the nasal mucosa tissue adhered thereto were put into a microtube to which 270 ⁇ L of ultrapure water had been added in advance. And it cut
  • the cotton swab is suitable for collecting a sample in the nasal cavity because it has low invasiveness and can scrape a narrow and narrow area.
  • a sampling device such as a scoop or a container for sampling may be used instead of the cotton swab.
  • a sampling device that can be inserted into the nasal cavity and can be collected after the invasiveness is equivalent to that of a cotton swab or paralyzed in the nasal cavity.
  • a quantitative collection device that can collect a fixed amount of sample in the nostril from the nostril.
  • a commercially available plastic shaft swab medical auxiliary swab HUBY-COTIX EM3-50S (manufactured by Sanyo Co., Ltd.) was used.
  • Ultrapure water is chemically independent of pH, so the extract used to elute tau protein is ultrapure.
  • the ultrapure water preferably has an absorbance (210 to 400 nm) of 0.01 or less and a total organic carbon (TOC) of 4 ppb or less.
  • the cotton swab was pulled up so that the cotton ball floated from the ultrapure water, and the cotton ball was fixed to the microtube by a lid and centrifuged at 14000 g to dehydrate the cotton ball. Thereafter, a cotton swab was taken out from the microtube, and the solution in the microtube was repeatedly suspended by suction and discharge 30 times with a syringe equipped with a 27G needle. 40 ⁇ L of the suspended solution was used for DNA, electrolyte, and total protein measurements. 200 ⁇ L of the remaining solution was transferred to a test tube, 500 ⁇ L of 100% formic acid was added as an extract, stirred, and allowed to stand for 1 hour in a thermostatic layer kept at 70 ° C.
  • the test tube was taken out from the thermostatic layer, and the solution was subjected to fractional filtration with a filter (NANOSEP 100K OMEGA (PALL): a filter that excludes proteins of 100 kDa or more and allows only proteins with a molecular weight of 100 kDa or less to pass through).
  • the filtrate was transferred to a test tube and concentrated under reduced pressure using a centrifugal evaporator until the amount of the solution reached 20 ⁇ L.
  • 480 ⁇ L of 1 mol / L Tris pH unadjusted was added to prepare a 500 ⁇ L solution.
  • the pH of each solution was measured, and the success or failure of neutralization was recorded on a recording sheet. It was confirmed that the pH was in the range of about 7.0 to 8.6.
  • the measurement of A ⁇ was carried out using an ELISA measurement kit for measuring A ⁇ (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Human / Rat ⁇ Amyloid42 ELISA Kit wako, High-Sensitive; product number 292-64501). Prior to the measurement, 0.05, 0.1, 0.2, 0.25, 1, 2, 2.5, 5, 10, and 10 were prepared using a standard solution of A ⁇ 42. Or 20 pM. After the preparation, 100 ⁇ L each of a solution for preparing a calibration curve and 1 mL of a measurement sample were added to the microtiter plate of the measurement kit.
  • the measurement was performed according to the instructions for use of the measurement kit. After the measurement, the concentration of A ⁇ 42 (A ⁇ value) contained in each measurement sample was calculated using a calibration curve.
  • each sample for measurement showed a value of A ⁇ 42 of 0.39 to 2.99 pM.
  • the amount of A ⁇ contained in the nasal mucosa tissue that could not be measured normally could be measured.
  • the A ⁇ amount contained in the nasal mucosa tissue is useful information for the diagnosis of Alzheimer's disease. It was.
  • the nasal mucosa tissue was abraded using a cotton swab similar to the A ⁇ measurement, and the cotton ball to which the nasal mucosa tissue was attached was put into a microtube to which 150 ⁇ L of ultrapure water was added in advance. And it cut
  • the cotton swab was pulled up, and the cotton ball was fixed to the microtube while being floated from the ultrapure water.
  • the microtube was put into a centrifuge and centrifuged at normal pressure for 1 minute to dehydrate the cotton ball, and then the cotton swab was taken out from the microtube.
  • the obtained solution is used as a sample for measuring tau protein.
  • Measurement of tau protein was performed using an ELISA measurement kit for measuring tau protein (manufactured by Invitrogen, Tau (Total) Human ELISA Kit; product number KHB0041). Prior to measurement, prepare a calibration curve to 15.6, 31.2, 62.5, 125, 250, 500, 1000, or 2000 pg / mL using tau protein standard solution. did. After the preparation, 100 ⁇ L each of a solution for preparing a calibration curve and 1 mL of a measurement sample were added to the microtiter plate of the measurement kit.
  • the measurement was performed according to the instructions for use of the measurement kit. After the measurement, the concentration of tau protein (tau protein value) contained in each measurement sample was calculated using a calibration curve.
  • each measurement sample showed a tau protein value of 16.4 to 923.8 pM.
  • the present inventors have succeeded in detecting for the first time the amount of tau protein contained in nasal mucosal tissue that was not even considered to be normally detectable. Furthermore, since there was a significant difference between the amount of tau protein in AD subjects and the amount of tau protein in non-AD subjects, the amount of tau protein contained in the nasal mucosal tissue is useful information for the diagnosis of Alzheimer's disease. It has been shown.
  • FIG. 3 shows a plot of the data of each subject with the tau protein concentration obtained by the above measurement as the horizontal axis and the A ⁇ concentration as the axis.
  • the square a of the sum of the square of (A ⁇ concentration) and the square of (log 10 (tau protein concentration)), that is, the distance from the origin can be expressed as an individual value of the subject. It is a calculated value that can be done.
  • FIG. 5 shows the number of people at each level in which the level of Alzheimer's disease is divided into 6 stages based on the calculated value of a obtained in FIG. More specifically, the calculated values shown in FIG. 4 are classified into 6 levels (0 to 2, 2 to 4, 4 to 6, 6 to 8, 8 to 10, 10 or more), and AD subjects are not classified.
  • the number of persons corresponding to each level in each AD subject is shown in the upper table of FIG. In the middle of FIG. 5, the cumulative number of people is shown in order from the level “10 or higher”. That is, the number of calculation values “10 or more” is 3 AD subjects, 0 non-AD subjects, and the number of “8 or more” is 8 AD subjects, 0 non-AD subjects, and “6 or more”.
  • the number of AD subjects was 11, 11 non-AD subjects, the number of “4 or more” was 11 AD subjects, the number of non-AD subjects was 3, and the numbers of “2 or more” and “0 or more” were AD subjects. There are 11 non-AD subjects and 4 people.
  • the lower part of FIG. 5 shows a tpf value (true positive fraction) and an fpf value (false positive fraction) calculated from the cumulative number of people in the middle part.
  • the tpf value is a true positive rate, and is a test performance index (value is 0 to 1) indicating the proportion of subjects judged to be positive positive among subjects judged to be positive (AD). .
  • the fpf value is a false positive rate, and is a test performance index (value is 0 to 1) indicating the proportion of subjects judged to be negative (nonAD). .
  • the result of the current fpf value is 0.00 when the calculated value is “10 or more” and “8 or more” as positive, 0.25 when “6 or more” is positive, and “4 or more”. Is 0.75 when positive, and “1.00” when “2 or more” and “0 or more” are positive.
  • the fpf value is calculated in the case of six types in which the test values are “10 or more”, “8 or more”, “6 or more”, “4 or more”, “2 or more”, or “0 or more”.
  • tpf values are shown as values on the horizontal axis and the vertical axis, respectively.
  • these 6 points are connected with a curve.
  • This curve is generally called an ROC curve indicating specificity.
  • ROC curve when the distance from the point where the fpf value is 0 and the tpf value is 1 to the curve is short, that is, when the area below the ROC curve is close to 1, it is known that the measurement accuracy is high. Yes.
  • Example 2 Next, in this example, 5 AD subjects (average 85.6 years), 5 elderly non-AD subjects (average 75.6 years), and 15 young non-AD subjects (average 33 years) were used as subjects. The results of further detailed investigation will be described with reference to FIG.
  • the results of young non-AD subjects are concentrated in a low concentration range compared to the results of other subjects. What is important here is that even if an AD subject who is an elderly person with a relatively close age is compared with a non-AD subject, a relatively high concentration of subjects exists in the AD subject, so there is a significant difference. is there. That is, it is considered that measuring the intranasal A ⁇ concentration is useful for discriminating between healthy subjects and AD patients.
  • intranasal tau protein that we newly discovered as a result of earnest research, it is very invasive compared to collecting cerebrospinal fluid by indexing the risk of developing Alzheimer's disease.
  • a diagnostic method with low risk can be provided.
  • the nasal cavity is close to the brain, the A ⁇ concentration and the tau protein concentration in the nasal cavity accurately and quickly reflect each concentration in the brain, and the effectiveness as a diagnostic method is improved.
  • the present invention is useful as a method for diagnosing Alzheimer's disease.
  • diagnosis does not include a specialized medical practice performed by a doctor, but includes various processes such as preprocessing, detection, comparison, and display using various instruments as described in the present embodiment. This is to support medical practice performed by doctors.

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Abstract

侵襲性を限りなく低くすることで感染の危険を低下させることができることを目的とし、本発明のアルツハイマー病の診断方法は、鼻腔内検体を前処理する前処理工程と、前処理された鼻腔内検体中のタウ蛋白またはアミロイドベータペプチド（Ａβ）を検出する検出工程と、前記検出工程で得られた前記タウ蛋白または前記Ａβの値を、予め定めた値と比較する比較工程と、前記比較工程で比較された結果を表示する表示工程と、からなる。

Description

アルツハイマー病の診断方法、及び診断システム
　本発明は、検体を利用してアルツハイマー病（ＡＤ）を診断する際の診断方法に関する。より詳細には、ＡＤ患者やＡＤの可能性がある健常者から採取した検体を利用した体外での診断を実現する診断方法に関する。
　アルツハイマー病は、初老期から老年期に起こる進行性の認知症を特徴とする疾患であり、現在、国内の患者数は１００万人以上と言われている。今後、人口の高齢化に伴いその数は確実に増加すると予想される。
　アルツハイマー病の臨床症状は、記憶障害、高次脳記憶障害（失語、失行、失認、構成失行）等である。その症状は他の認知症疾患でも共通して見られることが多く、臨床症状だけでアルツハイマー病を確定診断することは極めて困難である。
　アルツハイマー病はこれまで根本治療法がなかったが、１９９９年にワクチン療法がモデルマウスで成功して以来、根本治療法開発への期待が高まっている（非特許文献１を参照）。根本治療法を有効に活用する為には、早期にアルツハイマー病を診断する必要がある。
　一方、アルツハイマー病の特徴的な病理組織所見として老人斑と神経原線維変化がある。前者の主構成成分はβシート構造をとったアミロイドベータペプチド（以下、Ａβという）の凝集体であり、後者のそれは過剰にリン酸化されたタウ蛋白である。現在、アルツハイマー病においてはＡβが脳内に蓄積することが最初に起こる重大病理変化であるというアミロイド仮説が有力である（非特許文献２を参照）。さらに、臨床症状が発症するかなり前から脳内でＡβが蓄積すると共に、リン酸化されたタウ蛋白が増加する等の病理的組織変化が始まっていることが知られている。したがって、脳内のＡβまたはタウ蛋白をマーカーとして検出することがアルツハイマー病の早期診断方法の１つとなる。
　こうした考えをもとに、老人斑に結合する化合物を放射性物質やＭＲ信号を出す物質で標識した化合物に改変して体内に投与し、脳内の老人斑を画像化するアミロイドイメージング法の開発が進められている。
　このような検査は脳内の老人斑を直接可視化することを目的としているので、投与した化合物の生体への毒性が強いか弱いかは特に問題とならない。
　しかしながら一般臨床検査項目を採血によって同時測定することによって、例えば血液中の甲状腺ホルモンの測定などで認知機能障害の臨床指標とする場合もある。その場合には、前述した化合物の投与は測定者が被爆する可能性があり、好ましくないものとなる。
　そこで、静脈から採血した血液中から脳内のＡβの蓄積量を間接的に検出する方法や、患者の背骨を直接穿刺して脳脊髄液を取り出し、髄液中に含まれるタウ蛋白などを検出しアルツハイマー病の診断を行なう方法が提案されている（例えば、特許文献１を参照）。
特表平１０－５０９７９７号公報
Ｓｃｈｅｎｋ　Ｄ、Ｓｅｕｂｅｒｔ　Ｐ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　４００：１７３－１７７，１９９９． Ｈａｒｄｙ　ＪＡ，　Ｓｅｌｋｏｓｅ　ＤＦ，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２９７：３５３－３５６，２００２．
　従来例における課題は、侵襲性が高い穿刺針を用いた採取による感染の危険があるということであった。すなわち、採取する物質が髄液や血液であるので、体内へ毒性のある物質を投与することなく危険が少ないと予想されたが、所詮体内を循環する生体液を採取しようとするものであるので、針による侵襲で感染の危険が高いものになっていた。
　そこで本発明は、侵襲性を限りなく低くすることで感染の危険を低下させることができるアルツハイマー病の診断方法を提供することを目的とする。
　本発明のアルツハイマー病の診断方法は、鼻腔から採取した鼻腔内検体を前処理する前処理工程と、前記前処理工程で前処理された鼻腔内検体中のタウ蛋白および／またはアミロイドベータペプチド（以下、Ａβとする）を検出する検出工程と、前記検出工程で得られた前記タウ蛋白および／または前記Ａβの値を、予め定めた値と比較する比較工程と、前記比較工程で比較された結果を表示する表示工程と、からなる。
　本発明のアルツハイマー病の診断方法によれば、鼻腔内検体を用いるため侵襲性を限りなく低くでき、感染の危険を低下させることができる。
（ａ）本実施例１に係るＡＤおよびｎｏｎ　ＡＤの鼻腔内Ａβ濃度を示す図。（ｂ）本実施例１に係るＡＤおよびｎｏｎ　ＡＤの鼻腔内Ａβ濃度値 （ａ）本実施例１に係るＡＤおよびｎｏｎ　ＡＤの鼻腔内タウ蛋白濃度を示す図。（ｂ）本実施例に係るＡＤおよびｎｏｎ　ＡＤの鼻腔内タウ蛋白濃度値 本実施例１に係る各被験者の鼻腔内Ａβ濃度と鼻腔内タウ蛋白濃度をプロットした図 本実施例１に係るＡＤおよびｎｏｎ　ＡＤで得られた鼻腔内Ａβおよびタウ蛋白濃度を用いて得られたａの演算値を示す図 本実施例１に係るＡＤおよびｎｏｎ　ＡＤで得られた鼻腔内Ａβおよびタウ蛋白濃度を用いて得られたａの演算値に基づいてアルツハイマー病のレベルを６段階に分けた各レベルの人数とＲＯＣに必要な計算値の関係を示す図 本実施例１に係るＡＤおよびｎｏｎ　ＡＤで得られた鼻腔内Ａβおよびタウ蛋白濃度を用いて得られたａの演算値から得られたＲＯＣ曲線図 本実施例２に係るＡＤおよびｎｏｎ　ＡＤの鼻腔内Ａβ濃度を示す図。
　従来、鼻粘膜組織におけるＡβの局在は知られていたが、極めて濃度が低いので鼻腔内検体から検出できる可能性は無いと思われていた。また、タウ蛋白も、ＡＤの主要なバイオマーカとして知られているが、鼻粘膜組織では抗原抗体反応を利用した免疫組織学的検査以外では確認されておらず、ましてや鼻腔内検体から検出することを考える研究者はいなかった。
　我々は、Ａβ４２の凝集性を分解する新しいアプローチを考え、従来、無謀と思われてきた、鼻腔内検体におけるＡβ４２とタウ蛋白の定量検出に成功した。これにより侵襲性を限りなく低くすることで感染の危険を低下させることができることを見出した。
　本発明の実施形態におけるアルツハイマー病の診断方法は、鼻腔から採取した鼻腔内検体を前処理する前処理工程と、前記前処理工程で前処理された鼻腔内検体中のタウ蛋白および／またはアミロイドベータペプチド（以下、Ａβとする）を検出する検出工程と、前記検出工程で得られた前記タウ蛋白および／または前記Ａβの値を、予め定めた値と比較する比較工程と、前記比較工程で比較された結果を表示する表示工程と、からなる。
　さらに、前処理工程は、採取器具に付着した前記鼻腔内検体を抽出液中に溶出する抽出工程と、溶出された前記鼻腔内検体を含む抽出液を分画するろ過工程と、ろ過した溶液を濃縮する濃縮工程を含むことができる。前記ろ過工程では、分画できるフィルターを用いることができる。当該フィルターとしては、１００ｋＤａ以上のタンパク質を排除し、ろ液には１００ｋＤａ以下の分子量のタンパク質のみを通過させるフィルターを好ましく使用することができる。濃縮工程は、後の検出工程によっては、ろ過した溶液を、中和等によって、検出に最適な条件の溶液に調整する最適化工程をさらに含んでもよい。
　本発明では、Ａβを検出するにあたって、抽出工程においてギ酸を含む抽出液を用いた。それは次のような理由による。すなわち、Ａβが凝集や吸着されている可能性のある生体組織（例えば脳組織や粘膜等）を含んだ液体は、可溶性Ａβオリゴマー、または不溶性Ａβポリマー等の凝集Ａβを多く含んでいる。このため、例えば和光純薬株式会社より製造販売されているＡβモノマーを確実に定量測定できる測定キットを用いて直接ＥＬＩＳＡ測定を行うと、正確なＡβ量を測定することができなかった。
　そこで、本発明者らは、標準物質から作製した凝集Ａβを用い、Ａβモノマーに分解する手段として、ギ酸を溶液へ添加する方法を試みた。
　ギ酸は、一般的に、動物やヒトの組織に含まれるタンパク質、さらに組織中で凝集や吸着されているタンパク質を可溶化させ、組織から分離するために用いられている。しかし、本発明者らは、生体組織を含まない液体、即ち、既に液体中に分散している可溶性Ａβオリゴマーに対してギ酸を作用させると可溶性Ａβオリゴマーが解きほぐされ、Ａβモノマーとなることを見出した。可溶性ＡβオリゴマーがＡβモノマーとなるメカニズムについては不明であるが、おそらく、液体中では、可溶性Ａβオリゴマーの一部は、可逆的にＡβモノマーに極一部乖離しており、その中で、ギ酸がＡβモノマーの安定化に寄与しているものと推測される。
　この実施例では、抽出工程においてＡβを分解する添加剤としてギ酸を用いたが、当該添加剤は、タンパク質を変性させる手段として使用している一般的な変性剤や可溶化剤のようなグアニジンや尿素などであってもよい。
　次に検出工程について説明する。検出工程は、測定対象物質を抗原として、抗原抗体反応を利用した免疫測定を含む。当該免疫測定はＥＬＩＳＡ法であることが望ましい。これ以外に、測定対象物質であるタンパク質を直接的または間接的に検出できる方法であってもよい。このような例としては、ＭＳ（Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）や、ＭＳ／ＭＳまたは液体クロマトグラフィーなどが好適である。
　比較工程では、直接的または間接的にタウ蛋白またはＡβの量を算出した後、当該量を予め定めた量と比較すればよい。例えば、吸光、蛍光、発光または電気化学的な検出などで得られた値を用いて目的のタウ蛋白またはＡβの標準濃度曲線から得られる検量線を作成し、これを予め定めた値とし、この検量線から逆回帰した値と、検出工程に基づき算出されたタウ蛋白またはＡβの値を比較する工程を比較工程としてもよい。ここで、比較するタウ蛋白の値およびＡβの値は、両者の比率を同程度にするために、タウ蛋白の量および／またはＡβの量の対数を、タウ蛋白の値およびＡβの値としてもよい。
　表示工程は、数値、図および絵などを表示することを含む。当該工程は、算出された値と予め定めた値との乖離度や、算出された値が予め定めた値よりも増加したか減少したのかを判断するにあたって、人の理解を支援できる工程であることが好ましい。
　検出工程の後、算出されたタウ蛋白の値の２乗と、算出されたＡβの値の２乗との和を演算する演算工程を行ってもよい。すなわち、この和のみを演算工程の出力（結果）としてもよいが、この和に他のパラメータを使った演算を施してもよいし、これらの値に平方根や乗数を演算したものを演算工程の出力としてもよい。これら演算工程の出力を比較工程での比較対象とすればよい。
　なお、上述における各工程の全体的な実施態様としては、単一の診断システムの中に、鼻腔から採取した鼻腔内検体中のタウ蛋白およびＡβを検出する検出手段、前記検出手段で得られた前記タウ蛋白および前記Ａβの値を、それぞれ予め定めた値と比較する比較手段、前記比較手段で比較された結果を表示する表示手段が含まれており、前処理が行われた鼻腔内検体に対して、診断システム内の各手段により、前述した各工程が実行されて、診断を実現する態様が考えられる。また、前記診断システムは、前記検出手段で得られた前記タウ蛋白の値の２乗と前記Ａβの値の２乗との和の平方を演算する演算手段をさらに有していてもよく、これにより得られた演算値を、前記比較工程における前記タウ蛋白および前記Ａβの値として使用する。
　以下に実施例を掲げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
　ＮＩＮＣＤＳ－ＡＤＲＤＡ　Ｗｏｒｋ　Ｇｒｏｕｐのアルツハイマー病の臨床診断基準に基づきＰｒｏｂａｂｌｅ　ＡＤ（以下、ＡＤという）患者を判定した。
　臨床診断基準によれば、Ｐｒｏｂａｂｌｅ　ＡＤ患者の分類では、認知症が臨床的診察、知能テスト（ミニメンタルステートなど）、神経心理学的テストの三つで確認される。その分類には、認知機能のうち二つ以上が障害されている患者、記銘と他の認知機能が進行性に悪化している患者、意識障害がない患者、および発症年齢が４０～９０歳のあいだで、６５歳以上の患者、認知症の原因となる全身疾患やアルツハイマー病以外の脳疾患がない患者がある。
　また、ＡＤ患者であると判断する所見としては、言語・運動行為・認知機能の障害（失語・失行・失認）の進行性悪化や日常生活動作の障害と行動パターンの変化がある。この他、類似疾患の家族歴がある（とくにアルツハイマー病と病理診断されている）場合もある。
　さらに検査所見では、髄液が正常で脳波が正常あるいは非特異的変化（徐波増加など）、ＣＴ（ＭＲＩ）の経過追跡で脳萎縮が確認されている場合はＡＤ患者であることが支持される。
　（実施例１）
　本実施例では、ＡＤ被験者は６４歳から９２歳の１２名で平均８３．２歳であった。非ＡＤ被験者は２９歳から６５歳の９名で平均４１．３歳であった。これらのうちＡβとタウ蛋白の両方を測定した被験者については、ＡＤ被験者は６４歳から９２歳の１１名で平均８３．７歳、非ＡＤ被験者は３６歳から６４歳の４名で平均４０．８歳であった。
　次にＡβの測定条件について述べる。本実施例では綿棒を用いて鼻粘膜組織を擦過し、鼻粘膜組織が付着した綿球を、超純水２７０μＬを予め添加したマイクロチューブに投入した。そして綿球の先から３．０ｃｍの位置で切断し、攪拌して綿棒に付着した鼻粘膜組織検体を溶出させた。
　ここで綿棒は、侵襲性が低く、狭く細い範囲を擦過できることから、鼻腔内の検体を採取するのに適している。同様の目的を達成できるものであれば、綿棒に代えて、採取を目的としたスコップや容器などの採取器具を使用してもよい。例えば、鼻腔内に挿入でき侵襲性が綿棒と同等であるか鼻腔内を麻痺させた後に採取できる採取器具などである。また、定量の鼻孔内検体を鼻孔内から採取可能とする定量採取器具を使用することもできる。本実施例では、市販されているプラ軸綿棒（医療補助用綿棒ＨＵＢＹ－ＣＯＴＩＸ　ＥＭ３－５０Ｓ（（株）山洋製））を使用した。
　タンパク質の溶解性はタンパク質を含む溶液のｐＨに応じて大きく異なるが、超純水は化学的にもｐＨに依存しないため、タウ蛋白を溶出することを目的とする時に使用する抽出液は超純水であることが望ましい。これは、一般的にタンパク質は疎水部分と親水部分を含むアミノ酸の集合体であり、ほとんど全てのタンパク質は電気的に偏りを持ち、溶液中では不安定に存在していることによる。超純水としては、吸光度（２１０～４００ｎｍ）が０．０１以下、全有機炭素（ＴＯＣ）が４ｐｐｂ以下のものが好ましい。
　次に、綿棒を引き上げて綿球を超純水から浮かした状態にし、蓋をすることでマイクロチューブに固定し、１４０００ｇで遠心することで綿球を脱水した。その後、マイクロチューブから綿棒を取り出し、マイクロチューブ内の溶液を２７Ｇニードル装着のシリンジで３０回吸込および吐出を繰り返し懸濁した。懸濁後の溶液のうち４０μＬをＤＮＡ、電解質、および総タンパクの測定に使用した。残りの溶液のうち２００μＬを試験管に移し、抽出液として１００％ギ酸を５００μＬ添加、攪拌し、７０℃に保たれた恒温層で１時間静置した。１時間後に恒温層から試験管を取り出し、溶液をフィルター（ＮＡＮＯＳＥＰ　１００Ｋ　ＯＭＥＧＡ（ＰＡＬＬ）：１００ｋＤａ以上のタンパク質を排除し、１００ｋＤａ以下の分子量のタンパク質のみを通過させるフィルター）で分画ろ過した。ろ液を試験管に移し、溶液量が２０μＬになるまで遠心エバポレーターで減圧濃縮した。濃縮した溶液を攪拌した後、１ｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ未調整）を４８０μＬ加え、５００μＬ溶液に調製した。尚、各溶液のｐＨを測定し中和の成否を記録用紙へ記録し、ｐＨ７．０～８．６程度の範囲であることを確認した。これら溶液をＡβの測定用試料とする。
　Ａβの測定は、Ａβを測定するＥＬＩＳＡの測定キットを用いて実施した（和光純薬社製、Ｈｕｍａｎ／Ｒａｔ　βＡｍｙｌｏｉｄ４２　ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔ　ｗａｋｏ、Ｈｉｇｈ－Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ；商品番号２９２－６４５０１）。測定に先立って、検量線を作製するための溶液を、Ａβ４２のスタンダード溶液を用いて、０．０５、０．１、０．２、０．２５、１、２、２．５、５、１０、または２０ｐＭに調製した。調製後は、検量線を作製するための溶液と測定用試料１ｍＬをそれぞれ、測定キットのマイクロタイタープレートに１００μＬ添加した。
　その後、測定キットの使用説明に従い、測定を実施した。測定後は、検量線を用いて、各測定用試料に含まれるＡβ４２の濃度（Ａβの値）を算出した。
　以上の測定結果を、図１に示す。図１によると、各測定用試料は、Ａβ４２が０．３９～２．９９ｐＭの値を示した。以上のように、通常では測定出来なかった鼻粘膜組織中に含まれるＡβ量を測定することができた。さらに、ＡＤ被験者のＡβ量と非ＡＤ被験者のＡβ量のあいだには有意差が存在したことから、鼻粘膜組織中に含まれるＡβ量はアルツハイマー病の診断に有用な情報であることが示された。
　次にタウ蛋白の測定条件について述べる。本実施例ではＡβ測定と同様の綿棒を用いて鼻粘膜組織を擦過し、鼻粘膜組織が付着した綿球を、超純水１５０μＬを予め添加したマイクロチューブに投入した。そして綿球の先から３．０ｃｍの位置で切断し、攪拌して綿棒に付着した鼻粘膜組織検体を溶出させた。
　そして、綿棒を引き上げ、綿球を超純水から浮かした状態でマイクロチューブに固定した。遠心機にマイクロチューブ入れ、１分間常圧遠心して綿球を脱水した後、マイクロチューブから綿棒を取り出した。得られた溶液をタウ蛋白の測定用試料とする。
　タウ蛋白の測定は、タウ蛋白を測定するＥＬＩＳＡの測定キットを用いて実施した（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、Ｔａｕ　（Ｔｏｔａｌ）　Ｈｕｍａｎ　ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔ；商品番号ＫＨＢ００４１）。測定に先立って、検量線を作製するための溶液を、タウ蛋白のスタンダード溶液を用いて、１５．６、３１．２、６２．５、１２５、２５０、５００、１０００、または２０００ｐｇ／ｍＬに調製した。調製後は、検量線を作製するための溶液と測定用試料１ｍＬをそれぞれ、測定キットのマイクロタイタープレートに１００μＬ添加した。
　その後、測定キットの使用説明に従い、測定を実施した。測定後は、検量線を用いて、各測定用試料に含まれるタウ蛋白の濃度（タウ蛋白の値）を算出した。
　以上の測定結果を、図２に示す。これによると、各測定用試料は、タウ蛋白が１６．４～９２３．８ｐＭの値を示した。以上のように、通常では検出できることすら考えなかった鼻粘膜組織中に含まれるタウ蛋白量を初めて検出することに成功した。さらに、ＡＤ被験者のタウ蛋白量と非ＡＤ被験者のタウ蛋白量のあいだには有意差が存在したことから、鼻粘膜組織中に含まれるタウ蛋白量はアルツハイマー病の診断に有用な情報であることが示された。
　上記測定で得られたタウ蛋白濃度を横軸、Ａβ濃度を軸として各被験者のデータをプロットしたものを図３に示す。このグラフから明らかなように、（Ａβ濃度）の２乗と（ｌｏｇ１０（タウ蛋白濃度））の２乗の和の平方ａ、すなわち原点からの距離は、被験者の個別の値として示すことが出来る演算値である。
　さらに、図４において、この原点からの距離を示す平方ａに関して、Ａβ濃度とタウ蛋白濃度の両方を測定した各被験者、すなわちＡＤ被験者１１名、非ＡＤ被験者４名の演算値を具体的に示す。
　次に、図４で得られたａの演算値に基づいて、アルツハイマー病のレベルを６段階に分けた各レベルの人数を図５に示す。より詳細には、図４で示した演算値を、６段階（０～２、２～４、４～６、６～８、８～１０、１０以上）のレベルに分類し、ＡＤ被験者、非ＡＤ被験者のそれぞれにおいて、各レベルに該当する人数を図５の上段の表において示す。そして、図５の中段に、「１０以上」のレベルから順に、累積人数を示す。つまり、演算値が「１０以上」の人数はＡＤ被験者が３名、非ＡＤ被験者が０名、「８以上」の人数はＡＤ被験者が８名、非ＡＤ被験者が０名、「６以上」の人数はＡＤ被験者が１１名、非ＡＤ被験者が１名、「４以上」の人数はＡＤ被験者が１１名、非ＡＤ被験者が３名、「２以上」及び「０以上」の人数はＡＤ被験者が１１名、非ＡＤ被験者が４名である。そして、図５の下段に、中段の累積人数から算出された、ｔｐｆ値（ｔｒｕｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｆｒａｃｔｉｏｎ）、及び、ｆｐｆ値（ｆａｌｓｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｆｒａｃｔｉｏｎ）を示す。このｔｐｆ値とは、真陽性率であり、陽性（ＡＤ）と判断された被験者のうち、検査が正しく陽性と判断した被験者の割合を示す検査性能指標（値は０～１）のことである。今回のｔｐｆ値の結果は、演算値が「１０以上」の被験者を陽性とした場合には０．２７（＝３／１１）、「８以上」の被験者を陽性とした場合には０．７３（＝８／１１）、「６以上」「４以上」「２以上」及び「０以上」の被験者を陽性とした場合には１．００である。またｆｐｆ値とは、偽陽性率であり、陰性（ｎｏｎＡＤ）と判断された被験者のうち、検査が誤って陽性と判断したものの割合を示す検査性能指標（値は０～１）のことである。今回のｆｐｆ値の結果は、演算値が「１０以上」及び「８以上」を陽性とした場合には０．００、「６以上」を陽性とした場合には０．２５、「４以上」を陽性とした場合には０．７５、「２以上」及び「０以上」を陽性とした場合には１．００である。
　さらに図６において、演算値が「１０以上」「８以上」「６以上」「４以上」「２以上」「０以上」の被験者をそれぞれ陽性であると判断した６種類の場合において、ｆｐｆ値及びｔｐｆ値を、それぞれ横軸と縦軸の値として示す。さらにそれらの６点を曲線で結ぶ。この曲線は、一般に特異度を示すＲＯＣ曲線と呼ばれる。このＲＯＣ曲線において、ｆｐｆ値が０でありｔｐｆ値が１である点から曲線までの距離が短い場合、つまり、ＲＯＣ曲線以下の面積が１に近い場合、その測定精度が高いことが知られている。反対に、この距離が長い場合、つまり、ＲＯＣ曲線以下の面積が１／２に近い場合（ＲＯＣ曲線が図６の点線で示されるような直線に近い場合）、その測定精度が低いことが知られている。図６に示したＲＯＣ曲線から、本実施例における測定結果は、極めてその精度が高いことが明らかである。
　（実施例２）
　次に、本実施例では、ＡＤ被験者５名（平均８５．６歳）、高齢の非ＡＤ被験者５名（平均７５．６歳）、若年の非ＡＤ被験者１５名（平均３３歳）を被験者として、さらに詳細に調査した結果について、図７を用いて説明する。
　なお、他の測定の諸条件については、実施例１と重複するため説明を省略する。
　図７に示される通り、若年の非ＡＤ被験者の結果は、他の被験者の結果に比べると低濃度の範囲内に集中している。ここで重要なことは、比較的近い年齢の高齢者であるＡＤ被験者と非ＡＤ被験者とを比較しても、比較的高濃度の被験者がＡＤ被験者に存在するため、有意差が存在することである。すなわち、鼻腔内Ａβ濃度を測定することが健常者とＡＤ羅患者との判別に有用であると考えられる。
　これらの結果から従来不可能と考えられていた鼻腔内検体中のＡβ４２とタウ蛋白を検出し、Ａβ４２とタウ蛋白との関係から考案した指標を用いることで、健常者とＡＤ罹患者との判別が出来ることが判明した。これにより、侵襲性を限りなく低くすることで感染の危険を低下させたアルツハイマー病の診断に有用な情報を提供し得る。
　また、鋭意研究結果として我々が新たに発見した鼻腔内タウ蛋白の濃度を用いて、アルツハイマー病に関する発症危険度などとして指標化することにより、脳脊髄液を採取することに比べて、非常に侵襲リスクの少ない診断方法を提供することができる。さらに、鼻腔は脳に近いことにより、鼻腔内のＡβ濃度、タウ蛋白濃度は脳内の各濃度を正確かつ迅速に反映し、診断方法としての有効性も向上する。
　本発明は、アルツハイマー病の診断方法として有益である。なお、本願において、診断とは、医師が行なう専門的な医療行為を含むものではなく、本実施の形態で説明したような種々の器具を用いた前処理、検出、比較、表示等の各工程を実施することで、医師が行う医療行為を支援することである。

Claims (13)

  1. 　鼻腔から採取した鼻腔内検体を前処理する前処理工程と、
    　前記前処理工程で前処理された鼻腔内検体中のタウ蛋白またはアミロイドベータペプチド（以下、Ａβとする）を検出する検出工程と、
    　前記検出工程で得られた前記タウ蛋白または前記Ａβの値を、予め定めた値と比較する比較工程と、
    　前記比較工程で比較された結果を表示する表示工程と、からなる、アルツハイマー病の診断方法。
  2. 　前記前処理工程は、採取器具に付着した前記鼻腔内検体を抽出液中に溶出する抽出工程を含む、請求項１に記載のアルツハイマー病の診断方法。
  3. 　前記前処理工程は、前記鼻腔内検体を含む前記抽出液を分画するろ過工程を含む、請求項２に記載のアルツハイマー病の診断方法。
  4. 　前記ろ過工程において、分画できるフィルターを用いる、請求項３に記載のアルツハイマー病の診断方法。
  5. 　前記抽出液は、前記鼻腔内検体中のタウ蛋白を検出するときは超純水である、請求項２ないし４のいずれか１項に記載のアルツハイマー病の診断方法。
  6. 　前記抽出液は、前記鼻腔内検体中のＡβを検出するときはギ酸である、請求項２ないし４のいずれか１項に記載のアルツハイマー病の診断方法。
  7. 　前記鼻腔内検体は綿棒によって鼻腔内から採取されたものである、請求項１に記載のアルツハイマー病の診断方法。
  8. 　前記鼻腔内検体は定量採取器具によって鼻腔内から採取されたものである、請求項１に記載のアルツハイマーの診断方法。
  9. 　鼻腔から採取した鼻腔内検体を前処理する前処理工程と、
    　前記前処理工程で前処理された鼻腔内検体中のタウ蛋白およびＡβを検出する検出工程と、
    　前記検出工程で得られた前記タウ蛋白および前記Ａβの値を、それぞれ予め定めた値と比較する比較工程と、
    　前記比較工程で比較された結果を表示する表示工程と、からなる、アルツハイマー病の診断方法。
  10. 　前記前処理工程は、採取器具に付着した前記鼻腔内検体を抽出液中に溶出する抽出工程を含み、前記抽出液は、前記鼻腔内検体中のタウ蛋白を検出するときは超純水であり、前記鼻腔内検体中のＡβを検出するときはギ酸である、請求項９に記載のアルツハイマー病の診断方法。
  11. 　前記検出工程で得られた前記タウ蛋白の値の２乗と前記Ａβの値の２乗との和の平方を演算する演算工程をさらに有し、得られた演算値を、前記比較工程における前記タウ蛋白および前記Ａβの値として使用する、請求項９に記載のアルツハイマー病の診断方法。
  12. 　鼻腔から採取した鼻腔内検体中のタウ蛋白およびＡβを検出する検出手段と、
    　前記検出手段で得られた前記タウ蛋白および前記Ａβの値を、それぞれ予め定めた値と比較する比較手段と、
    　前記比較手段で比較された結果を表示する表示手段と、からなる、アルツハイマー病の診断システム。
  13. 　前記検出手段で得られた前記タウ蛋白の値の２乗と前記Ａβの値の２乗との和の平方を演算する演算手段をさらに有し、得られた演算値を、前記比較工程における前記タウ蛋白および前記Ａβの値として使用する、請求項１２に記載のアルツハイマー病の診断システム。
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