CN102713622B - β淀粉样蛋白的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种Aβ测定方法，即使在以极低浓度（数pM的程度）含有Aβ的样品中，也能够准确地测定Aβ浓度。本发明的β淀粉样蛋白的测定方法，包括：样品准备工序（101），在样品处理容器中加入可能含有β淀粉样蛋白的样品；浓缩工序（102），在上述样品处理容器中的上述样品中添加能够使β淀粉样蛋白溶液化的增溶剂，降低上述样品中含有的溶剂的量；中和工序（103），中和在上述浓缩工序中获得的样品处理液中的上述增溶剂；和测定工序（104），基于抗原抗体反应，确定经过上述中和后的样品处理液中可能含有的β淀粉样蛋白的量。

Description

β淀粉样蛋白的测定方法

技术领域

本发明涉及β淀粉样蛋白（后文中以Aβ进行说明）的高灵敏度测定方法。

背景技术

阿尔茨海默氏病是从刚进入老年期到老年期发生的以进行性的痴呆（认知症）为特征在疾病。目前，据说日本国内的患者数量达到100万人以上。可以预计在未来，伴随人口的老龄化，这一数字一定会增加。阿尔茨海默氏病的临床症状为记忆障碍、高级脑功能障碍（失语、失用、失认、结构性失用（constructional aparaxia））等。这些症状在其他痴呆症中也常见，仅通过临床症状确诊为阿尔茨海默氏病是非常困难的。

迄今为止，阿尔茨海默氏病没有根本治疗的方法，自1999年疫苗疗法在小鼠模型中成功以来，对于开发根本治疗的方法的期待不断增加（参见非专利文献1）。为了有效地利用这些根本治疗的方法，需要早期诊断阿尔茨海默氏病。

作为阿尔茨海默氏病的特征性病理组织观察结果，有脑组织中的老年斑和神经元纤维变化。前者的主要构成成分是具有β折叠结构的Aβ的凝集体，后者的主要构成成分是过度磷酸化的微管聚合蛋白（tau蛋白）。目前，关于阿尔茨海默氏病的发病，Aβ蓄积是最初发生的病理变化，这一淀粉样蛋白假说是非常有力的（参见非专利文献2）。即，已知在阿尔茨海默氏病中，在出现临床症状之前，发生Aβ在脑内蓄积等上述病理上的组织变化。因此，作为标记检测脑内的Aβ肽，成为了Aβ蓄积的疾病、特别是阿尔茨海默氏病的早期诊断方法之一。

作为阿尔茨海默氏病的体外诊断剂，广泛采用以使用对Aβ的特异性抗体的ELISA法为原理的诊断剂。根据ELISA法，基本确定了随着阿尔茨海默氏病的进行，脑脊液中由42个氨基酸构成的Aβ（Aβ42）减少（参见非专利文献3）。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Schenk D,Seubert P et al.,Nature 400:173-177,1999.

非专利文献2：Hardy JA,Selkose DF,Science 297:353-356,2002.

非专利文献3：Hansson O,Mithon L et al.,Lancet Neurol 5:228-234,2006.

发明内容

发明要解决的技术问题

但是，例如以将机体组织清洗而得到的清洗液这样的、以极低浓度（数pM的程度）含有Aβ的物质为样品，实施上述ELISA法等基于抗原抗体反应的定量测定时，由于浓度极低，所以存在不能精确测定的问题。

本发明是为了解决上述问题而完成的，其目的在于提供一种Aβ测定方法，即使在以数pM程度的极低浓度含有Aβ的样品中，也能够准确地测定Aβ浓度。

解决技术问题的手段

为了解决上述技术问题，本发明提供一种β淀粉样蛋白的测定方法，其包括：样品准备工序，在样品处理容器中加入可能含有β淀粉样蛋白的样品；浓缩工序，在上述样品处理容器中的上述样品中添加能够使β淀粉样蛋白溶液化的增溶剂，通过浓缩操作，降低上述样品中含有的溶剂的量；中和工序，中和在上述浓缩工序中获得的样品处理液中的上述增溶剂；和测定工序，基于抗原抗体反应，确定经过上述中和后的样品处理液中可能含有的β淀粉样蛋白的量。

本发明还提供一种β淀粉样蛋白的测定方法，其包括：样品处理容器准备工序，在样品处理容器中加入用于使β淀粉样蛋白附着的添加剂；样品准备工序，在上述样品处理容器中加入可能含有β淀粉样蛋白的样品；第一浓缩工序，将上述样品处理容器内的上述样品浓缩；第二浓缩工序，在通过上述第一浓缩工序浓缩后的样品中，添加能够使β淀粉样蛋白溶液化的增溶剂，通过浓缩操作，降低上述样品中含有的溶剂的量；中和工序，中和在上述第二浓缩工序中获得的样品处理液中的上述增溶剂；和测定工序，基于抗原抗体反应，确定经过上述中和后的样品处理液中可能含有的β淀粉样蛋白的量。

发明效果

根据本发明的β淀粉样蛋白的测定方法，即使在以极低浓度（例如数pM的程度）含有Aβ的样品中，也能够准确地测定Aβ浓度。

附图说明

图1是表示实施例1的各步骤的流程图。

图2是表示实施例1中测得的Aβ浓度的结果的图。

图3是表示实施例2的各步骤的流程图。

图4是表示实施例2中测得的Aβ浓度的结果的图。

图5是表示实施例3的各步骤的流程图。

图6是表示由实施例3获得的Aβ回收率的结果的图。

图7是表示实施例4的各步骤的流程图。

图8是表示由实施例4获得的Aβ回收率的结果的图。

图9是表示参考例的各步骤的流程图。

图10是表示由参考例获得的Aβ回收率的结果的图。

图11是表示本发明第一实施方式的Aβ测定方法各步骤的流程图。

图12是表示本发明第二实施方式的Aβ测定方法各步骤的流程图。

图13是表示由于有无增溶剂的差异带来的Aβ回收率的差异的图。

具体实施方式

本发明的Aβ测定方法中的Aβ是凝集性和吸附性高的物质。这是因为构成Aβ的氨基酸大多由疏水性高的氨基酸构成。

“凝集性高”意味着Aβ本身容易缔合而凝集的性质。这里，将不凝集而以一个分子游离的Aβ称为Aβ单体。另外，将两个分子以上的Aβ凝集、但是能够溶解在生理盐水中等水溶液中的Aβ称为可溶性Aβ多聚体或可溶性Aβ低聚物（以下统称为可溶性Aβ低聚物）。此外，将从上述可溶性Aβ低聚物的状态继续凝集、不溶于上述水溶液的Aβ称为不溶性Aβ多聚体或不溶性Aβ聚合物（以下统称为不溶性Aβ聚合物）。一般而言，疏水性强的Aβ在水溶液中以凝集物存在更为稳定是凝集性高的原因。

“吸附性高”意味着Aβ容易被吸附于Aβ以外的物质的性质。Aβ以外的物质例如为容器表面，或者为机体组织。在任何情况下都可以认为Aβ以外的物质的疏水性区域与Aβ的疏水性区域的疏水相互作用是原因之一。

在Aβ单体中，尤为重要的是由42个氨基酸构成的Aβ单体（将其称为Aβ42）和由40个氨基酸构成的Aβ单体（将其称为Aβ40）。可以认为，已知作为阿尔茨海默氏病的特征现象的、在脑组织中形成老年斑，是由上述Aβ42和Aβ40的凝集性和吸附性引起的。目前，在临床实践中，髓液中的Aβ42和Aβ40视为测定指标。对Aβ42和Aβ40进行比较，Aβ42的凝集性和吸附性都相对较强。在本发明中，在没有特别说明的情况下，“Aβ”一并表示Aβ单体、可溶性Aβ低聚物和不溶性Aβ聚合物。此外，在没有特别说明的情况下，“Aβ单体”表示Aβ42和Aβ40。

本发明的Aβ测定方法中的样品是从阿尔茨海默氏病患者或怀疑患有阿尔茨海默氏病的被检测者采集的体液（例如，脑脊液、血清、泪液、鼻涕、唾液等）。或者是通过利用棉棒或药签等采集工具从上述被检测者的鼻粘膜采集鼻粘液而获得的鼻涕或鼻腔内粘膜摩擦物。或者，上述样品还可以是利用生理盐水等对可能凝集或吸附有上述Aβ的机体组织（例如脑组织或粘膜等）进行清洗而获得的清洗液。

在本发明中，可以将通过利用棉棒或药签等采集工具从上述被检测者的鼻粘膜采集鼻粘液而获得的鼻涕或鼻腔内粘膜摩擦物作为样品。这是因为发现了脑内的Aβ在鼻粘膜周围的组织蓄积的倾向。具体而言，可以使用药签或棉棒（例如，荣研化学株式会社生产的γ灭菌铝轴棉棒）进行采集。通过将药签或棉棒等在鼻粘膜上擦拭，采集鼻粘液，将该采集的鼻粘液本身作为样品，或者将利用规定的提取液从该棉棒提取的鼻粘液作为样品。其中，作为规定的提取液，可以列举生理盐水、含有表面活性剂的溶液、有机溶剂等。

在本发明中，特别是可以将利用生理盐水等对鼻粘膜进行清洗而获得的清洗液作为样品。这是因为发现了脑内的Aβ在鼻粘膜周围的组织蓄积的倾向。具体而言，可以使用通常出售的鼻腔清洗设备采集上述清洗液。例如，使用泉精器制作所生产并出售的鼻清洗器（商品名：INC-7000、INC-7200、INC-7001），从一个鼻孔注入生理盐水，从另一个鼻孔接受清洗后的生理盐水。这样一来，就能够将鼻清洗后得到的液体全部采集，将其作为本发明的样品。其中，注入鼻腔内使用的清洗用液体，只要是具有生物相容性的液体即可，不限于生理盐水。

本发明的Aβ测定方法中作为对象的样品中的Aβ的量，可以为极微量。由于Aβ在粘膜等机体组织中牢固地凝集或吸附，所以在前面提及的利用药签或棉棒采集鼻粘液时，需要将该采集工具在鼻粘膜上用力地擦拭多次。然而，这样获得的鼻粘液中的Aβ是微量的，所以在用提取液提取时，样品中的Aβ浓度进一步降低。此外，在前面提及的进行鼻清洗时，由于利用少量的生理盐水难以取出Aβ，所以需要使用大量的生理盐水进行鼻清洗。因此，获得的样品中的Aβ浓度极低。

粘膜等机体组织中所含的Aβ大部分是可溶性Aβ低聚物或不溶性Aβ聚合物，Aβ单体为极微量。因此，例如使用和光纯药株式会社生产并出售的Aβ单体定量用试剂盒，对鼻粘液和鼻清洗液进行直接ELISA测定时，无法确认Aβ的存在。因此，制备测定时的浓度调整为规定的浓度（Aβ40为50pM，Aβ42为10pM）的样品，进行减压浓缩后，利用ELISA对该样品进行测定。于是，尽管非常微量，但也能够确认Aβ的存在。因此，当鼻粘液和鼻清洗液中所含的Aβ40单体浓度低于50pM、Aβ42单体浓度低于10pM时，被认为是极低。

Aβ主要在脑组织中蓄积，但是其他的体细胞、或者例如血液、脑脊液、鼻涕等体液中也有极微量的Aβ分泌。但是，例如，为了从鼻粘膜采集样品，将药签或棉棒在鼻粘膜上擦拭，或者用清洗用液体对鼻粘膜进行清洗。在用药签或棉棒采集时，优选用提取液对所采集的鼻粘液进行提取。此外，在通过鼻清洗进行采集时，优选使用大量的清洗用液体进行清洗。故而样品中的Aβ浓度降低。因此，在进行测定之前，需要对样品进行浓缩操作以提高样品中的Aβ浓度。

浓缩操作通常可以使用减压浓缩。本发明的发明人着眼于浓缩工序，对浓缩工序的条件和方法进行各种改变，反复进行实验。经过深入研究，结果发现在浓缩工序中，样品所含的溶剂蒸发，样品中的溶剂量减少，但是，在该过程中，样品中所含的Aβ40或Aβ42的单体彼此之间凝集，产生大量的单体的凝集物。即，明确了当直接对样品进行浓缩操作时，样品中的Aβ40或Aβ42的单体彼此之间凝集而形成牢固的凝集物，因此样品中的Aβ40或Aβ42的单体量剧减，其结果导致ELISA法测得的Aβ的测定值减少。

因此，本发明的发明人发现，为了防止在浓缩工序中单体之间的凝集，在样品中添加甲酸等增溶剂之后实施浓缩工序时，Aβ的测定灵敏度显著提高。结果如图13所示。将前面所示的标准物质调节至规定的浓度，并加入甲酸之后进行浓缩，将由此获得的样品与不加入甲酸进行浓缩而得到的样品进行比较，得到了约26倍至28倍的Aβ的测定值。由此可以判断，通过添加甲酸等增溶剂实施浓缩工序，与不进行添加而直接进行浓缩工序的情况相比，能够以极高的灵敏度进行Aβ的测定。

本发明的Aβ的测定方法包括：样品准备工序，在样品处理容器中加入可能含有β淀粉样蛋白的样品；浓缩工序，在上述样品处理容器中的上述样品中添加能够使β淀粉样蛋白溶液化的增溶剂，通过浓缩操作，降低上述样品中含有的溶剂的量；中和工序，中和在上述浓缩工序中获得的样品处理液中的上述增溶剂；和测定工序，基于抗原抗体反应，确定经过上述中和后的样品处理液中可能含有的β淀粉样蛋白的量。通过包括上述工序，从而在测定前使样品中所含的Aβ溶液化，并且由溶液化形成的Aβ单体经过浓缩工序也能够被保持，因而能够更准确地进行Aβ的定量测定。

在本发明的Aβ测定方法中，优选在样品处理容器中加入样品之前，在样品处理容器中加入用于使Aβ附着的添加剂。由此，添加剂附着在Aβ上，能够抑制Aβ之间的凝集。

此外，在本发明中，在以鼻清洗液这种大量的样品作为测定对象时，在进行上述浓缩工序之前实施预浓缩工序较为有效。即，本发明优选包括在上述浓缩工序（第二浓缩工序）之前，对上述样品处理容器内的上述样品进行浓缩的预浓缩工序（第一浓缩工序）。由此，能够有效地实施接下来的浓缩工序（第二浓缩工序）。

此外，本发明优选包括样品处理容器准备工序，在该工序中，在上述样品准备工序使用的样品处理容器中加入用于使Aβ附着的添加剂。由此，能够提高Aβ的回收率，能够更准确地进行Aβ的定量测定。特别是在实施上述预浓缩工序的情况下，通过预先在样品处理容器中加入用于使Aβ附着的添加剂，能够防止在预浓缩工序中发生Aβ的不溶化，能够更准确进行Aβ的定量测定。

本发明的Aβ测定方法包括：样品处理容器准备工序，在样品处理容器中加入用于使β淀粉样蛋白附着的添加剂；样品准备工序，在上述样品处理容器中加入可能含有β淀粉样蛋白的样品；第一浓缩工序，将上述样品处理容器内的上述样品浓缩；第二浓缩工序，在通过上述第一浓缩工序浓缩后的样品中，添加能够使β淀粉样蛋白溶液化的增溶剂，通过浓缩操作，降低上述样品中含有的溶剂的量；中和工序，中和在上述第二浓缩工序中获得的样品处理液中的上述增溶剂；和测定工序，基于抗原抗体反应，确定经过上述中和后的样品处理液中可能含有的β淀粉样蛋白的量。

（第一实施方式）

下面，按照图11说明本发明第一实施方式中的各工序的详细情况。

在本发明的Aβ测定中的样品准备工序101中，向样品处理容器中加入可能含有Aβ的样品。

在本发明的Aβ测定方法中使用的样品处理容器，为了抑制Aβ对于容器的内壁表面的吸附、提高Aβ的回收率，优选有具有抑制Aβ吸附的物性的内壁表面的容器。具体而言，优选内壁表面为非疏水性的容器。例如，通常可以使用玻璃制的容器。或者，也可以使用利用硅等对内壁表面实施了亲水处理的容器。通过使用上述容器，能够降低疏水性高的Aβ单体与容器内壁之间的疏水相互作用，其结果，能够抑制Aβ单体在容器的内壁表面上的吸附。因此，能够提高Aβ的回收率。

此外，通过使用封闭剂，能够进一步抑制Aβ单体对于容器内壁的吸附。封闭剂是包含不与Aβ单体反应或结合的蛋白质或化合物的试剂的统称。具体而言，可以列举牛血清白蛋白（BSA）或脱脂牛奶、酪蛋白、表面活性剂等。通过这些物质与容器的内壁表面发生相互作用，能够相对地阻止在样品中以低浓度存在的Aβ在内壁表面上的吸附。封闭剂通常以0.01％w/v～5％w/v浓度使用，在粘性等方面存在问题的情况下，使用浓度通常为0.01％w/v～0.5％w/v。

在使用封闭剂的情况下，在将样品放入容器时，封闭剂存在于容器中即可。具体而言，含有封闭剂的溶液以不泄漏的状态封入容器中，在该容器中投入样品。或者封闭剂以能够再溶解的干燥状态保持在容器中，在该容器中投入液体的样品。作为其他方式，可以预先使含有封闭剂的溶液与容器的内壁表面接触，从而使封闭剂吸附固定在内壁表面。此外，作为另外的方式，可以在容器中添加样品之后，添加封闭剂或含有封闭剂的溶液。其中，用于溶解封闭剂的溶液通常为缓冲液。例如，磷酸缓冲液或Tris缓冲液等。在使用封闭剂时能够进一步提高Aβ的回收率，因而优选。但是也可以不使用封闭剂。

本发明中使用的样品处理容器的容量及其形状没有特别限定。只要是能够保持样品的容量即可，可以任意设定。例如，作为1mL至2mL的容量的容器，可以使用Eppendorf管；作为50mL以下的容器，可以使用Corning管；作为1000mL以下的容器，可以使用烧杯或烧瓶。此外，关于形状，可以根据后续的处理方法任意选择。这里所说的处理方法是通常的生化实验或检测中使用的方法，为离心分离等方法。其中，上述Eppendorf管或Corning管多数情况下为与经常使用的离心机的转子相匹配的形状。

接着，进行浓缩工序102，在该工序中，在样品处理容器中的样品中添加能够使Aβ溶液化的增溶剂，对得到的混合物实施浓缩操作，从而降低上述样品中含有的溶剂的量。在浓缩工序102中，通过利用增溶剂对上述样品中可能含有的Aβ低聚物进行处理，转化为Aβ单体。由于基于抗原抗体反应的Aβ测定对于Aβ单体的灵敏度高，所以通过使用增溶剂的处理，预先使样品中的Aβ转化为Aβ单体，将其作为测定对象，从而能够实现更准确的定量测定。此外，通过减少样品中所含的溶剂量，样品中的Aβ浓度增高，能够实现更高灵敏度的测定。

作为增溶剂，可以使用甲酸。甲酸通常用于使动物或人的组织中凝集或吸附的蛋白质溶液化而从组织中分离。然而，本发明的发明人发现，当甲酸作用于分散在不含机体组织的液体中的可溶性Aβ低聚物时，可溶性Aβ低聚物被分解，成为Aβ单体。甲酸添加到样品中时，优选使用甲酸浓度在70％以上的甲酸。可溶性Aβ低聚物变为Aβ单体的机理尚不清楚，推测可能是因为在液体中部分可溶性低聚物极小一部分以可逆的方式偏离为Aβ单体，其中，甲酸有助于Aβ单体的稳定化。

在本发明中，增溶剂不限于甲酸。作为增溶剂，可以使用有能力使可溶性Aβ低聚物转化为Aβ单体的有机酸。作为这种有机酸，可以列举具有羧基或磺基的有机酸。具体而言，除了甲酸之外，还可以列举乙酸、草酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸、三氟乙酸、苯二甲酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸等。增溶剂可以只使用一种，也可以并用两种以上。

浓缩工序102中使用的增溶剂，优选含有甲酸，并且含有具有双键、三键或共轭键的化合物（例如，s-烯丙基-l-半胱氨酸（以后，简称为SAC））。由此，能够进一步提高Aβ的回收率。

作为浓缩工序102中进行浓缩的方法，可以使用减压浓缩法。在本发明的Aβ测定方法中的浓缩工序102中，优选不使Aβ不溶化而对样品进行浓缩。样品中含有Aβ单体或可溶性低聚物。随着浓缩，上述Aβ单体或可溶性低聚物发生凝集，形成不溶性Aβ聚合物，从而析出由Aβ构成的固相，将这种现象称为Aβ的不溶化。在本发明中，不使Aβ不溶化而对样品进行浓缩，是为了避免通过不使样品干燥固化而进行浓缩，或者不中和作为增溶剂添加的甲酸而进行浓缩，从而造成样品中不溶性Aβ聚合物的量（即，由Aβ构成的固相的量）随着浓缩实质上增加。进行浓缩工序102的目的在于提高样品中的Aβ浓度，但由于是以不使不溶性Aβ聚合物增加的方式进行浓缩，所以通过添加增溶剂而得到的Aβ单体以原状态保持，能够准确地进行Aβ的定量测定。

为了如上述那样不使样品干燥固化而进行浓缩，只要调节浓缩工序中的溶剂的减少量即可。由于溶剂的减少量过多时样品会干燥固化，所以需要抑制减少量。这里，样品干燥固化是指样品中所含的溶剂量相对减少，样品整体的流动性丧失而发生固化。因此，为了不使样品干燥固化而进行浓缩，可以在液态的样品维持其流动性的状态下结束浓缩工序。一旦样品在浓缩工序中干燥固化，Aβ单体或可溶性低聚物就会凝集，如后述的实施例3所示，Aβ的测定灵敏度降低。因此，在第一实施方式的浓缩工序中，优选以样品不发生干燥固化的程度降低样品中所含的溶剂的量，由此，能够显著提高Aβ的测定灵敏度。

接着，进行中和工序103，在该工序中，在通过浓缩工序102得到的样品处理液中添加中和剂，以中和样品处理液中所含的增溶剂。在浓缩工序102中使用甲酸等有机酸作为增溶剂时，由于样品处理液的酸性强，为了进行后续的测定工序104，就需要进行中和。

作为中和剂，例如可以添加规定量的1M的Tris来中和甲酸。

接着，进行测定工序104，在该工序中，基于抗原抗体反应，确定经过中和工序103中和后的样品处理液中的Aβ的量。在本发明的Aβ测定方法中的测定工序103中，利用基于抗原抗体反应的免疫测定法。鼻清洗液等样品中，除了含有作为测定对象的Aβ之外，还含有许多蛋白质和杂质。为了从该样品中仅测定作为测定对象的Aβ，优选使用与Aβ发生特异性反应的物质。因此，利用免疫测定法。所谓免疫测定法是指利用作为免疫反应的抗原抗体反应的测定法，由于能够人为制作需要测定的物质的抗体，所以作为测定原理而广泛应用。实际上，和光纯药公司出售有Aβ测定试剂盒。然而，仅使用这种市售的Aβ测定试剂盒时，在样品所含的Aβ的浓度低的情况下，无法准确地进行Aβ的定量。根据本发明，通过进行上述增溶剂存在下的浓缩工序，即使是以极低浓度含有Aβ的样品，也能够准确地进行Aβ的定量。

由于测定工序104的目的在于定量测定，所以优选在浓缩工序102中将其浓缩量（浓缩后的液体量）控制为一定量。例如可以在样品处理液中添加二甲基亚砜（DMSO）等不与水系介质共沸的、沸点高的介质，从而容易地实施浓缩量的控制。在这种情况下，将该高沸点介质的添加量调节为一定量时，通过利用水分蒸发的浓缩，只有水系介质蒸发，DMSO等高沸点介质保留，因而能够稳定地得到一定的浓缩量。

或者也可以利用光测量控制浓缩量。即，向容器的规定位置照射光，在检测出浓缩过程中样品处理液的弯月面（Meniscus）移动至规定位置时的光散射信号的时刻，停止浓缩。

或者还可以通过以电化学方式检测剩余量来控制浓缩量。即，在容器的规定位置设置电极对，在浓缩过程中样品液的弯月面超过位于规定位置的电极对而导致电流不再流通的时刻，停止浓缩。

另外，还可以通过设置测量挥发的溶液体积来计算剩余量的单元，控制浓缩量。或者，也可以通过设置利用浓缩液的重量而达到一定量的浓缩量的单元，来进行控制。例如，在容器上安装压电元件，利用该压电元件来测定质量变化量。

以上说明的包括101～104的所有工序的第一实施方式的测定方法，特别是能够有效地用于使用如下样品的情况，该样品利用棉棒或药签等采集工具从鼻粘膜采集鼻粘液而获得。这是因为在鼻粘液作为样品时，样品的体积小，所以能够直接在样品中添加增溶剂进行浓缩。

（第二实施方式）

下面，按照图12说明本发明第二实施方式中的各工序的详细情况。

在本发明的Aβ测定中的样品处理容器准备工序111中，在样品处理容器中加入用于使Aβ附着的添加剂。本发明的发明人发现，当使上述添加剂与Aβ单体和可溶性Aβ低聚物作用时，Aβ单体和可溶性低聚物彼此之间的凝集受到抑制。添加剂例如为甲酸。由于使用的甲酸不需要具有使可溶性Aβ低聚物转化为Aβ单体的能力，所以甲酸的浓度可以低于70％。

在本发明中，添加剂不限于甲酸。作为添加剂，可以使用有能力抑制Aβ单体和可溶性低聚物彼此之间的凝集的有机酸。作为这种有机酸，可以列举具有羧基或磺基的有机酸。具体而言，除了甲酸之外，还可以列举乙酸、草酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸、三氟乙酸、苯二甲酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸等。添加剂可以只使用一种，也可以并用两种以上。

样品处理容器准备工序111中使用的添加剂，优选含有甲酸，并且含有具有双键、三键或共轭键的化合物（例如，s-烯丙基-l-半胱氨酸（以后，简称为SAC））。由此，能够进一步提高Aβ的回收率。

由于样品处理容器准备工序111将添加剂加入样品处理容器中，由此能够提高Aβ的回收率，所以能够更准确地进行Aβ的定量测定。但是，在本发明中并不是必须预先将添加剂加入样品处理容器中，也可以使用未加入添加剂的样品处理容器实施样品准备工序112，之后再添加添加剂。

在本发明的Aβ测定方法中使用的样品处理容器，为了抑制Aβ对于容器的内壁表面的吸附、提高Aβ的回收率，优选内壁表面具有抑制Aβ吸附的特性。具体而言，优选内壁表面为非疏水性的容器。例如，通常可以使用玻璃制的容器。或者，也可以使用利用硅等对内壁表面实施了亲水处理的容器。通过使用上述容器，能够降低疏水性高的Aβ单体与容器内壁之间的疏水相互作用，其结果，能够抑制Aβ单体在容器的内壁表面上的吸附。因此，能够提高Aβ的回收率。

此外，通过使用封闭剂，能够进一步抑制Aβ单体对于容器内壁的吸附。封闭剂是包含不与Aβ单体反应或结合的蛋白质或化合物的试剂的统称。具体而言，可以列举牛血清白蛋白（BSA）或脱脂牛奶、酪蛋白、表面活性剂等。通过这些物质与容器的内壁表面发生相互作用，能够相对地阻止在样品中以低浓度存在的Aβ在内壁表面上的吸附。使用封闭剂的浓度通常为0.01％w/v～5％w/v。在粘性等方面存在问题的情况下，使用浓度为0.01％w/v～0.5％w/v。

在使用封闭剂的情况下，在将样品放入容器内时，封闭剂存在于容器中即可。具体而言，含有封闭剂的溶液以不泄漏的状态封入容器中，在该容器中投入样品。或者封闭剂以能够再溶解的干燥状态保持在容器中，在该容器中投入液态的样品。作为另一种方式，可以预先使含有封闭剂的溶液与容器的内壁表面接触，从而使封闭剂固定吸附在内壁表面。此外，作为又一种方式，可以在容器中添加样品之后，添加封闭剂或含有封闭剂的溶液。其中，用于溶解封闭剂的溶液通常为缓冲液。例如，磷酸缓冲液或Tris缓冲液等。在使用封闭剂时能够进一步提高Aβ的回收率，因而优选。但是也可以不使用。

本发明中使用的样品处理容器的容量及其形状没有特别限定。只要是能够保持样品的容量即可，可以任意设定。例如，作为1mL至2mL容量的容器，可以使用Eppendorf管；作为50mL以下的容器，可以使用Corning管；作为1000mL以下的容器，可以使用烧杯或烧瓶。此外，关于形状，可以根据后续的处理方法任意选择。这里所说的处理方法是通常的生化实验或检测中使用的方法，为离心分离等方法。其中，上述Eppendorf管或Corning管多数情况下为与经常使用的离心机的转子相匹配的形状。

接着，进行在准备好的样品处理容器中加入样品的样品准备工序112。

下面，进行对样品处理容器中的样品进行浓缩的第一浓缩工序113。在第一浓缩工序113中，通过使样品中Aβ的浓度升高，能够容易地进行后面的Aβ测定，并且，能够高效地实施接下来的溶液化。在进行第一浓缩工序113时，优选进行在样品处理容器中预先加入用于使Aβ溶液化的添加剂的样品处理容器准备工序111。由此，能够防止在第一浓缩工序113中发生Aβ的不溶化。在该第一浓缩工序113中，如后述的参考例所示，不使试样干燥固化而进行浓缩。

接着，进行第二浓缩工序114，在该工序中，在通过第一浓缩工序浓缩后的样品处理容器中的样品中添加能够使Aβ溶液化的增溶剂，对得到的混合物实施第二次浓缩操作，从而降低上述样品中含有的溶剂的量。在第二浓缩工序114中，利用增溶剂对上述样品中可能含有的Aβ低聚物进行处理，从而转化为Aβ单体。由于基于抗体抗原反应的Aβ测定对于Aβ单体的灵敏度高，所以通过使用增溶剂的处理，使样品中的Aβ转化为Aβ单体，从而能够实现更准确的定量测定。此外，通过减少样品中所含的溶剂量，样品中的Aβ浓度增高，就能够实现更高灵敏度的测定。

作为增溶剂，可以使用甲酸。甲酸通常用于使动物或人的组织中凝集或吸附的蛋白质溶液化而从组织中分离。然而，本发明的发明人发现，当甲酸作用于分散在不含机体组织的液体中的可溶性Aβ低聚物时，可溶性Aβ低聚物被分解，成为Aβ单体。甲酸添加到样品中时，优选使用甲酸浓度在70％以上的甲酸。可溶性Aβ单体低聚物变为Aβ单体的机理尚不清楚，推测可能是因为在液体中部分可溶性低聚物极小一部分以可逆的方式偏离为Aβ单体，其中，甲酸有助于Aβ单体的稳定化。

在本发明中，增溶剂不限于甲酸。作为增溶剂，可以使用有能力使可溶性Aβ低聚物转化为Aβ单体的有机酸。作为这种有机酸，可以列举具有羧基或磺基的有机酸。具体而言，除了甲酸之外，还可以列举乙酸、草酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸、三氟乙酸、苯二甲酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸等。增溶剂可以只使用一种，也可以并用两种以上。

第二浓缩工序114中使用的增溶剂，优选含有甲酸，并且含有具有双键、三键或共轭键的化合物（例如，s-烯丙基-l-半胱氨酸（以后，简称为SAC））。由此，能够进一步提高Aβ的回收率。

作为第二浓缩工序114中进行浓缩的方法，可以使用减压浓缩法。在本发明的Aβ测定方法中的第二浓缩工序114中，优选不使Aβ不溶化而对样品进行浓缩。样品中含有Aβ单体或可溶性低聚物。随着浓缩，上述Aβ单体或可溶性低聚物发生凝集，形成不溶性Aβ聚合物，从而析出由Aβ构成的固相，将这种现象称为Aβ的不溶化。在本发明中，不使Aβ不溶化而对样品进行浓缩，是为了避免通过不使样品干燥固化而进行浓缩，或者不中和作为增溶剂添加的甲酸而进行浓缩，从而导致样品中不溶性Aβ聚合物的量（即，由Aβ构成的固相的量）随着浓缩而实质上增加。进行第二浓缩工序114的目的在于提高样品中的Aβ浓度，但由于是以不使不溶性Aβ聚合物增加的方式进行浓缩，所以通过添加增溶剂而得到的Aβ单体以原状态保持，能够准确地进行Aβ的定量测定。

由于第二浓缩工序114后续的测定工序116的目的在于定量测定，所以优选在第二浓缩工序114中将其浓缩量（浓缩后的液体量）控制至一定量。例如可以在样品处理液中添加二甲基亚砜（DMSO）等不与水系介质共沸的、沸点高的介质，从而容易地实施浓缩量的控制。在这种情况下，将该高沸点介质的添加量调节为一定量时，通过利用水分蒸发的浓缩，只有水系介质蒸发，DMSO等高沸点介质保留，因而能够稳定地得到一定的浓缩量。

另外也可以利用光测量控制浓缩量。即，向容器的规定位置照射光，在检测出浓缩过程中样品处理液的弯月面移动至规定位置时的光散射信号的时刻，停止浓缩。

或者还可以通过以电化学方式检测剩余量来控制浓缩量。即，在容器的规定位置设置电极对，在浓缩过程中样品液的弯月面超过位于规定位置的电极对而导致电流不再流通的时刻，停止浓缩。

另外，还可以通过设置计量挥发的溶液的体积来计算剩余量的单元，控制浓缩量。或者，也可以通过设置利用浓缩液的重量而达到一定量的浓缩量的单元，来进行控制。例如，在容器上安装压电元件，利用该压电元件来测定质量变化量。

在本发明的Aβ测定方法中的浓缩工序中，在样品是鼻清洗液这种含有盐的溶液的情况下，通过进行浓缩而样品中的盐浓度增高，接着例如在利用酶免疫测定法进行测定时，有时会带来不利影响。在这种情况下，可以使用柱或超滤等进行样品的脱盐操作，也可以预先减少样品的液量再实施本发明。

接着，进行中和工序115，在该工序中，在第二浓缩工序114中得到的样品处理液中添加中和剂，中和样品处理液中所含的增溶剂。在第二浓缩工序114中使用甲酸等有机酸作为增溶剂时，由于样品处理液的酸性强，所以为了进行后续的测定工序116，需要进行中和。

作为中和剂，例如可以添加规定量的1M的Tris来中和甲酸。

接着，进行测定工序116，在该工序中，基于抗原抗体反应，确定经过中和工序115中和后的样品处理液中的Aβ的量。在本发明的Aβ测定方法中的测定工序116中，利用基于抗原抗体反应的免疫测定法。鼻清洗液等样品中，除了含有作为测定对象的Aβ之外，还含有许多蛋白质和杂质。为了从该样品中仅测定作为测定对象的Aβ，优选使用与Aβ发生特异性反应的物质。因此，利用免疫测定法。所谓免疫测定法是指利用作为免疫反应的抗原抗体反应的测定法，由于能够人为制作需要测定的物质的抗体，所以作为测定原理而广泛应用。实际上，和光纯药公司出售有Aβ测定试剂盒。然而，仅使用这种市售的Aβ测定试剂盒时，在样品所含的Aβ的浓度低的情况下，无法准确地进行Aβ的定量。根据本发明，通过进行上述增溶剂存在下的浓缩工序，即使是以极低浓度含有Aβ的样品，也能够准确地进行Aβ的定量。

以上说明的包括111～116的所有工序的第二实施方式的测定方法，特别是能够有效地用于鼻清洗液等样品体积大、且含有极低浓度的Aβ的情况。这是因为在鼻清洗液作为样品时，样品的体积大，直接在样品中添加增溶剂时，液量达到大量。因此，优选在实施第一浓缩工序而降低样品的液量之后，再添加增溶剂。

本发明中作为用于测定作为对象的Aβ的免疫测定法，例如有酶免疫测定法、荧光免疫测定法、化学发光免疫测定法、电化学发光免疫测定法。根据这些方法，将标记有酶、荧光性物质、化学发光反应性物质或电化学发光性物质的与测定对象物特异性结合的抗体、与作为测定对象物的抗原反应并结合，分离并除去未结合的上述标记抗体。之后，检测从与上述抗原结合的上述标记抗体上标记的酶、荧光性物质、化学发光反应性物质或电化学发光性物质发出的光学信号或电化学信号。这些免疫测定技术，需要将作为测定对象物的抗原和与测定对象物特异性结合的抗体的抗原结合体从未结合的标记抗体中分离的工艺。因此，统称为BF分离方式免疫测定（Bind-Free分离方式的缩写）。

具体而言，上述和光纯药公司生产的测定试剂盒，以酶免疫测定法为基本原理。该测定试剂盒的构成包括固定有Aβ单体（Aβ40、Aβ42）的第一抗体的微量滴定板、HRP标记的第二Aβ抗体和酶显色底物。作为性能，Aβ40/42 ELISA测定试剂盒，对于Aβ40，能够检测1pM至100pM；对于Aβ42，能够检测0.1pM至20pM。测定时间为17小时。灵敏度非常高。关于测定方法，首选，在微量滴定板中分别注入样品液，在利用缓冲液对微量滴定板进行清洗之后，加入第二抗体。然后，进一步利用缓冲液对微量滴定板进行清洗后，添加显色底物，使其显色，测定吸光度。

本发明中作为用于测定作为对象的Aβ的免疫测定法，也可以利用非BF分离方式的免疫测定法。例如，免疫比浊法、免疫散射比浊法（nephelometric immunoassay）和乳胶免疫比浊法为非BF分离方式的免疫测定。这种方法以光学方式测定抗原抗体凝集体，该凝集体通过作为测定对象物的抗原和与测定对象物特异性结合的抗体之间的结合反应而生成。在这些方法中，以光学变化检测出伴随抗原抗体结合反应而发生的大小的变化。免疫比浊法和胶乳免疫比浊法，以透射光强度的变化量检测出抗原抗体反应所产生的浊度，从而对测定对象物进行定量。此外，免疫散射比浊法，以散射光强度的变化量检测出抗原抗体反应所产生的凝集体的大小的变化，从而对测定对象物进行定量。

本发明中用于测定作为对象的Aβ的免疫测定法中使用的抗体，是与Aβ发生特异性反应并结合的抗体。抗体的制作方法已经确立了多种方法，已经是公知技术。作为代表性的方法，将测定对象物作为抗原对小鼠进行免疫，之后取出小鼠的脾脏，通过小鼠的脾脏与作为癌细胞的骨髓瘤的融合，从而制作杂交瘤（抗体产生细胞）。其中最重要的是抗原。本发明中，将Aβ作为抗原。具体而言是Aβ42和Aβ40。此外，与抗原结合的抗体识别并结合Aβ的哪些区域至关重要。例如，为了利用抗体区分Aβ42和Aβ40，需要识别Aβ42和Aβ40中不同区域的氨基酸序列。即，由于Aβ42和Aβ40中C末端侧的氨基酸序列不同，所以能够识别含有氨基酸序列的C末端侧的2个氨基酸的序列的抗体是对Aβ42特异的抗体，否则是对Aβ40特异的抗体。此外，N末端侧Aβ42和Aβ40的氨基酸序列都相同，所以是与Aβ42和Aβ40都结合的抗体。上述和光纯药公司的测定试剂盒中使用抗体是这些抗体的适当组合。

如上所述，根据本发明的Aβ测定方法，利用脑内的Aβ随着年龄的增长在鼻粘膜及其周边组织蓄积的现象，对利用药签和棉棒擦拭鼻粘膜等而得到的鼻粘液或者鼻粘膜等进行清洗，将清洗液作为样品。在这种情况下，本发明具有下述优点：能够不取出鼻骨，即，能够以有助于临床研究和诊断的方式，测定包括鼻骨和鼻粘膜的鼻腔内的Aβ的量。此外，通过不使Aβ凝集而浓缩样品，能够以高灵敏度测定Aβ，所以具有能够测定通常的浓缩方法所不能测定的从鼻等采集的样品中的Aβ的量。

实施例

下面，列举实施例进一步对本发明进行详细说明，但本发明不限于这些实施例。

（实施例1）由棉棒采集的鼻粘液的测定

利用图1对本实施例进行说明。

（样品准备工序的实施）

使用荣研化学公司生产并销售的棉棒（11）（γ杀菌铝轴棉棒），运用流感简易试剂盒的方法，从被检测者a～e五个健康的被检测者采集鼻粘液。将采集有鼻粘液的棉棒（11）放入试管（12）中，将采集的鼻粘液作为样品（13）。

（浓缩工序的实施）

然后，在装入采集有样品（13）的棉棒（11）的试管（12）中加入80％甲酸（14）500μL，并且加入10μM SAC（15）50μL，提取出附着于棉棒的样品（13），并进行溶液化，得到试样（16）。并且，在将棉棒（11）的采集部从试管（12）内的溶液中取出的状态下，将棉棒（11）固定于试管（12），将试管（12）放入离心机，以转速2000rpm离心1分钟，使棉棒（11）脱水（17），然后，从试管（12）取出棉棒（11），得到样品（18）。然后，通过减压浓缩（19）对试样（18）进行浓缩，得到体积为40μL的样品（20）。

（中和工序的实施）

然后，在试样（20）中加入1M Tris缓冲溶液（未调节pH）（21）960μL，中和甲酸，得到体积为1mL的测定用试样（22）。

（测定工序的实施）

使用用于测定β淀粉样蛋白的ELISA的测定试剂盒进行测定（和光纯药公司生产，Human/Rat β Amyloid42 ELISA Kit wako，High-Sensitive，商品编号292-64501和Human/Rat β Amyloid40 ELISAKit wako II，商品编号294-64701）。在进行测定之前，使用Aβ42和Aβ40的标准溶液或实施例4中制备的原液，将Aβ42制备为0.05、0.1、0.2、0.25、1、2、2.5、5、10或20pM，将Aβ40制备为0.25、0.5、1、1.25、2.5、5、10、12.5、25、50或100pM，来制备用于制作校正曲线的溶液。制备后，在上述测定试剂盒的微量滴定板中分别添加用于制作校正曲线的溶液和各测定用试样100μL。

然后，按照测定试剂盒的使用说明，实施测定。测定后，使用校正曲线，算出各测定用试样中所含的Aβ42和Aβ40的浓度。

（测定结果）

图2表示上述测定结果。根据该测定结果，在利用本实施例的方法处理过的鼻粘液样品中，Aβ40显示0.75～3.26pM的值，Aβ42显示0.12～0.27pM的值。如上所述，通过在鼻粘液样品中添加甲酸进行减压浓缩，成功地测定出了通常无法测定的鼻粘液中所含的Aβ量。

（实施例2）小鼠脑匀浆的测定

利用图3对本实施例进行说明。

（样品准备工序的实施）

将以Aβ大量表达的方式改变了基因的小鼠（以下称为APP小鼠）的脑切片在10mM磷酸缓冲液（PB）中匀浆化，得到脑匀浆溶液的上清液，使用该上清液。在本实施例中，将其作为样品（31），在试管（32）中加入10μL该样品。

（浓缩工序的实施）

然后，在添加于试管（32）的样品（31）中加入80％甲酸（33）500μL，并且加入10μM SAC（34）50μL，进行溶液化，得到体积为560μL的试样（35）。然后，通过减压浓缩（36）对试样（35）进行浓缩，得到体积为40μL的样品（37）。

（中和工序的实施）

然后，在试样（37）中加入1M Tris缓冲液（未调节pH）（38）960μL，中和甲酸，得到体积为1mL的测定用试样（39）。

（未处理样品的制备）

在10μL的试管中加入在样品准备工序中制备的脑样品，再添加10mM磷酸缓冲液（PB）990μL，稀释100倍。这与到中和工序为止实施的脑样品同等的稀释倍率。将其作为用于与本实施例的处理样品进行比较的未处理样品。

（测定工序的实施）

使用用于测定β淀粉样蛋白的ELISA的测定试剂盒进行测定（和光纯药公司生产，Human/Rat β Amyloid42 ELISA Kit wako，High-Sensitive，商品编号292-64501和Human/Rat β Amyloid40 ELISAKit wako II，商品编号294-64701）。在进行测定之前，使用Aβ42和Aβ40的标准溶液或实施例4中制备的原液，将Aβ42制备为0.1、0.2、0.25、1、2、2.5、5、10或20pM，将Aβ40制备为1、1.25、2.5、5、10、12.5、25、50或100pM，来制备用于制作校正曲线的溶液。制备后，在上述测定试剂盒的微量滴定板中分别加入用于制作校正曲线的溶液和各测定用试样100μL。

然后，按照测定试剂盒的使用说明，实施测定。测定后，使用校正曲线，算出各测定用试样中所含的Aβ42和Aβ40的浓度。

（测定结果）

图4表示上述测定结果。根据该测定结果，在利用本实施例的方法处理过的脑样品中，Aβ40和Aβ42均显示高于未处理样品的值。其中，Aβ42约为18倍，可知脑样品中含有大量的凝集Aβ42。由此可知，通过在样品中添加甲酸进行减压浓缩，能够使通常无法测定的样品中所含的凝集Aβ转化为Aβ单体进行测定，能够以非常高的灵敏度测定Aβ。

（实施例3）溶液化工序后的浓缩工序的有无

利用图5对本实施例进行说明。

其中，在实施例3中，作为假定鼻清洗液的模型，制备将Aβ在磷酸缓冲液中稀释的溶液，将其作为样品。该样品中Aβ的浓度，Aβ40为50pM，Aβ42为10pM。基于对APP小鼠进行鼻清洗、并对得到的清洗液进行测定得到的Aβ浓度，以按照体重比反映为人时得到的预测的浓度设定以上浓度。

（样品准备工序的实施）

使用市售的固体Aβ42（PEPTIDE INSTITUTE，INC.生产，商品编号4349-V）、市售的固体Aβ40（PEPTIDE INSTITUTE，INC.生产，商品编号4307-V）和二甲基亚砜（DMSO），制备Aβ42的DMSO溶液（浓度20μM）和Aβ40的DMSO溶液（浓度100μM）。将这些溶液等量混合，得到Aβ42与Aβ40的混合液。

（浓缩工序的实施）

接着，通过使用70％甲酸稀释该混合液进行溶液化，对于Aβ42最终浓度设为70％甲酸溶液的10pM，对于Aβ40最终浓度设为70％甲酸溶液的50pM。将其作为样品（41）。在试管（42）中加入样品（41）1mL，通过减压浓缩（43）进行样品（41）的浓缩，制作完全干燥固化的试样（44）和未完全干燥固化残留有50μL液体的试样（45）。然后，在完全干燥固化的试样（44）中加入40μL甲酸（46），得到试样（47）。

（中和工序的实施）

然后，在该试样（47）中加入1M Tris缓冲液（48）960μL，进行中和，得到1000μL的测定用试样（49）。在未完全干燥固化的试样（45）中直接加入1M Tris缓冲液（50）950μL，进行中和，得到1000μL的测定用试样（51）。

（测定工序的实施）

使用用于测定β淀粉样蛋白的ELISA的测定试剂盒进行测定（和光纯药公司生产，Human/Rat β Amyloid42 ELISA Kit wako，High-Sensitive，商品编号292-64501和Human/Rat β Amyloid40 ELISAKit wako II，商品编号294-64701）。在进行测定之前，使用Aβ42和Aβ40的标准溶液或实施例4中制备的原液，将Aβ42制备为0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10或20pM，将Aβ40制备为1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50或100pM，来制备用于制作校正曲线的溶液。制备后，在上述测定试剂盒的微量滴定板中分别加入用于制作校正曲线的溶液和各测定用试样1mL。

然后，按照测定试剂盒的使用说明，实施测定。测定后，使用校正曲线，算出各测定用试样中所含的Aβ42和Aβ40的浓度。进行体积校正后，评价对于各试样中所含的Aβ42量和Aβ40量的回收率。

（测定结果）

图6表示上述测定结果。根据该测定结果，Aβ42和Aβ40的回收率，在通过添加增溶剂后的浓缩工序没有使其干燥固化的试样中，分别为80%和100%，是非常高的值。而在通过添加增溶剂后的浓缩工序使其干燥固化的试样中，回收率低于10%和低于20%，仅为极低的值。由此可知，通过在利用添加增溶剂的浓缩工序不使试样干燥固化，Aβ的回收率、即测定灵敏度显著提高。

（实施例4）样品处理容器准备工序中的添加剂的研究

利用图7对本实施例进行说明。

（样品（61）的制备）

在制备Aβ42、Aβ40等Aβ单体的磷酸缓冲液时，会发生由于Aβ单体的凝集性和吸附性所带来的损失。因此，基于分段稀释谨慎地进行制备。具体而言，使用市售的固体Aβ42（PEPTIDE INSTITUTE，INC.生产，商品编号4349-V）、市售的固体Aβ40（PEPTIDE INSTITUTE，INC.生产，商品编号4307-V）和二甲基亚砜（DMSO），制备Aβ42的DMSO溶液（浓度20μM）和Aβ40的DMSO溶液（浓度100μM）。将这些溶液等量混合，得到Aβ42与Aβ40的混合液。然后，使用0.5％牛血清白蛋白（BSA）和0.1％的Tween 20的磷酸生理盐水缓冲液（PH7.4、PBS），将上述混合液稀释至Aβ42的浓度达到5nM、Aβ40的浓度达到25nM。在该稀释后的混合液中，能够使Aβ42和Aβ40均以Aβ单体稳定存在，所以将其作为本实施例中的原液。

之后，利用磷酸缓冲液（PB），对上述原液进行分段稀释，调节至目的浓度。在本实施例中，对于Aβ42将最终浓度设为磷酸缓冲溶液中5pM，对于Aβ40将最终浓度设为磷酸缓冲液中25pM。此外，在上述分段稀释的过程中进行调节，使得作为封闭剂含有最终浓度为0.9％的牛血清白蛋白（BSA）。之后，通过将制备的溶液放置24小时以上，得到可溶性Aβ低聚物、不溶性Aβ聚合物和Aβ单体的混合物溶液，将其作为样品（61）。

如上所述制备的样品为5pM Aβ42-25pM Aβ40-0.9％BSA的磷酸缓冲溶液（包含微量的DMSO）。

（样品处理容器准备工序的实施）

准备13支试管（62），在各试管中加入添加剂（63）250μL。作为添加剂，准备下列（A）至（M）所示的13种添加剂（63），每支试管添加一种添加剂。

（A）0.9%BSA-80%甲酸

（B）10nM酸性黄-0.9%BSA-80%甲酸

（C）9%TritonX100-0.9%BSA-80%甲酸

（D）10μM SAC-0.9%BSA-80%甲酸

（E）20%DMSO-0.9%BSA-80%甲酸

（F）0.9%BSA-0.1%Tween20-PBS

（G）10nM酸性黄-0.9%BSA-0.1%Tween20-PBS

（H）9%TritonX100-0.9%BSA-0.1%Tween20-PBS（I）10μMSAC-0.9%BSA-0.1%Tween20-PBS

（J）50%DMSO-0.9%BSA-0.1%Tween20-PBS

（K）PB

（L）28%NH₃

（M）5.6%NH₃-0.9%BSA-0.1%Tween20-PBS

（样品准备工序的实施）

接着，在各试管中加入样品（61）2mL，得到2250μL的试样（64）。

（第一浓缩工序的实施）

利用减压浓缩对试样（64）实施浓缩（65），得到将体积浓缩至50μL的试样（66）。

（第二浓缩工序）

通过在试样（66）中添加300μL 80％甲酸（67）进行溶液化，得到体积为350μL的试样（68）。然后，通过减压浓缩（69）对试样（67）进行浓缩，得到体积为40μL的试样（70）。

（中和工序的实施）

然后，在试样（70）中加入1M Tris缓冲液（未调节pH）（71）960μL，进行甲酸的中和，得到体积为1mL的测定用试样（72）。

（测定工序的实施）

使用用于测定β淀粉样蛋白的ELISA的测定试剂盒进行测定（和光纯药公司生产，Human/Rat β Amyloid42 ELISA Kit wako，High-Sensitive，商品编号292-64501和Human/Rat β Amyloid40 ELISAKit wako II，商品编号294-64701）。在进行测定之前，使用Aβ42和Aβ40的标准溶液或上述制备的原液，将Aβ42制备为0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10或20pM，将Aβ40制备为1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50或100pM，来制备用于制作校正曲线的溶液。制备后，在上述测定试剂盒的微量滴定板中分别加入用于制作校正曲线的溶液和各测定用试样（72）。

然后，按照测定试剂盒的使用说明，实施测定。测定后，使用校正曲线，算出测定用试样（72）中所含的Aβ42和Aβ40的浓度。进行体积校正后，评价对于各试样中所含的Aβ42量和Aβ40量的回收率。

（测定结果）

图8表示上述测定结果。根据该测定结果，与未添加甲酸的试样（F）～（M）相比，在样品处理容器中预先添加有甲酸的试样（A）～（E），Aβ42和Aβ40两者的回收率都显示非常高的值。其中，并用甲酸和SAC的试样（D）显示最高的回收率。由此可知，通过预先在样品处理容器中添加以甲酸为代表的添加剂，即使在浓缩工序（第二浓缩工序）之前进行预浓缩工序（第一浓缩工序）的情况下，Aβ的回收率、即测定灵敏度也显著提高。

（参考例）

在实施例4中不使用添加剂的状态下，实施第一浓缩工序，研究在实施第一浓缩工序时添加剂的必要性。利用图9对本参考例进行说明。

（样品（81）的制备）

使用市售的固体Aβ42（PEPTIDE INSTITUTE INC.生产，商品编号4349-V）、市售的固体Aβ40（PEPTIDE INSTITUTE INC.生产，商品编号4307-V）和二甲基亚砜（DMSO），制备Aβ42的DMSO溶液（浓度20μM）和Aβ40的DMSO溶液（浓度100μM）。将这些溶液等量混合，得到Aβ42与Aβ40的混合液。然后，使用0.5％牛血清白蛋白（BSA）和0.1％的Tween 20的磷酸生理盐水缓冲液（PH 7.4、PBS），将上述混合液稀释至Aβ42的浓度达到5nM、Aβ40的浓度达到25nM。在该稀释后的混合液中，能够使Aβ42和Aβ40均以Aβ单体稳定存在，因而将其作为本参考例的原液。

之后，利用磷酸缓冲液（PB），对上述原液进行分段稀释，调节至目的浓度。在本参考例中，对于Aβ42将最终浓度设为磷酸缓冲液中20pM，对于Aβ40将最终浓度设为磷酸缓冲液中100pM。此外，在上述分段稀释的过程中进行调节，使得作为封闭剂含有最终浓度为0.9％的牛血清白蛋白（BSA）。之后，将制备的溶液放置24小时以上，得到可溶性Aβ低聚物、不溶性Aβ聚合物和Aβ单体的混合物溶液，将其作为样品（81）。

如上所述制备的样品是20pM Aβ42-100pM Aβ40-0.9％BSA的磷酸缓冲液（包含微量的DMSO）。

（第一浓缩工序的实施）

在试管（82）中加入样品（81）500μL后，利用减压浓缩对试样（81）实施浓缩（83）。在此，在浓缩（83）中，利用冻结干燥或减压浓缩，制作通过减压浓缩完全干燥固化的试样（84）、通过冻结干燥得到的试样（85）和通过减压浓缩将体积浓缩至50μL的未干燥固化的试样（86）。

（第二浓缩工序）

通过在各试样中添加70％甲酸（87），进行溶液化，得到体积为500μL的试样（88）、（89）和（90）。

接在，通过减压浓缩对各试样（88）、（89）和（90）进行浓缩（91），使其不完全干燥固化，得到体积为40μL的试样（92）、（93）和（94）。

（中和工序的实施）

然后，在各试样（92）、（93）和（94）中加入1M Tris缓冲液（未调节pH）（95）960μL，中和甲酸，得到体积为1mL的测定用试样（96）、（97）和（98）。

（测定工序的实施）

使用用于测定β淀粉样蛋白的ELISA的测定试剂盒进行测定（和光纯药公司生产，Human/Rat β Amyloid42 ELISA Kit wako，High-Sensitive，商品编号292-64501和Human/Rat β Amyloid40 ELISAKit wako II，商品编号294-64701）。在进行测定之前，使用Aβ42和Aβ40的标准溶液或上述制备的原液，将Aβ42制备为0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20pM，将Aβ40制备为1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50、100pM，来制备用于制作校正曲线的溶液。制备后，在上述测定试剂盒的微量滴定板中分别加入用于制作校正曲线的溶液和各测定用试样1mL。

然后，按照测定试剂盒的使用说明，实施测定。测定后，使用校正曲线，算出各测定用试样中所含的Aβ42和Aβ40的浓度。进行体积校正后，评价对于各试样中所含的Aβ42量和Aβ40量的回收率。

（测定结果）

图10表示上述测定结果。根据该测定结果，在任意试样中，回收率均止于24%左右。在添加增溶剂前对样品（81）进行浓缩的第一浓缩工序中，使试样完全干燥固化或者不完全干燥固化，在回收率上都不存在显著差异，回收率很低。如实施例4所示可以判断，在添加增溶剂之前实施第一浓缩工序的情况下，为了提高Aβ的回收率、即提高测定灵敏度，预先在样品处理容器中添加甲酸等添加剂比在第一浓缩工序中避免试样完全干燥固化更为重要。

产业上的可利用性

根据本发明的Aβ测定方法，即使对样品进行浓缩也能够将Aβ保持在可溶化状态，因而能够准确地确定以低浓度含有Aβ的溶液中的Aβ的量。因此，能够测定例如存在于鼻清洗液中的极其微量的Aβ，能够用于阿尔茨海默氏病的早期体外诊断。

符号说明

11：棉棒；12：试管；13：样品；14：添加甲酸：15：添加SAC；16：添加有甲酸和SAC的试样；17：棉棒的脱水；18：添加甲酸和SAC后除去棉棒后的试样；19：浓缩；20：浓缩至体积为40μL的试样；21：添加1M Tris缓冲液；22：测定用试样；31：样品；32：试管；33：添加甲酸：34：添加SAC；35：添加有甲酸和SAC的试样；36：浓缩；37：浓缩至体积为40μL的试样；38：添加1M Tris缓冲液；39：测定用样品；41：样品；42：试管；43：浓缩；44：完全干燥固化的试样；45：未完全干燥固化的试样；46：添加甲酸；47：添加甲酸后的试样；48、50：添加1M Tris缓冲液；49：测定用试样；51：测定用试样；61：样品；62：试管；63：添加剂；64：添加有添加剂的试样；65、69：浓缩；66：浓缩后的未完全干燥固化的试样；67：添加甲酸；68：添加有甲酸的试样；70：第二浓缩后的未完全干燥固化的试样；71：添加1M Tris缓冲液；72：测定用试样；81：样品；82：试管；83、91：浓缩；84第一浓缩后的完全干燥固化的试样；85：冻结干燥后的试样；86：第一浓缩后的未完全干燥固化的试样；87：添加甲酸；88、88、89：添加甲酸后的试样；92、93、94：第二浓缩后的未完全干燥固化的试样；95：添加1M Tris缓冲液；96、97、98：测定用试样；101：样品准备工序；102：浓缩工序；103：中和工序；104：测定工序；111：样品处理容器准备工序；112：样品准备工序；113：第一浓缩工序；114：第二浓缩工序；115：中和工序；116：测定工序。

Claims (12)

1.一种β淀粉样蛋白的测定方法，其特征在于，包括：

样品准备工序，在样品处理容器中加入可能含有β淀粉样蛋白的样品；

浓缩工序，在所述样品处理容器中的所述样品中添加能够使β淀粉样蛋白溶液化的增溶剂得到混合物，通过对该混合物实施浓缩操作，不使所述样品干燥固化，降低所述样品中含有的溶剂的量；

中和工序，中和在所述浓缩工序中获得的样品处理液中的所述增溶剂；和

测定工序，基于抗原抗体反应，确定经过所述中和后的样品处理液中可能含有的β淀粉样蛋白的量。

2.如权利要求1所述的β淀粉样蛋白的测定方法，其特征在于：

还包括在所述样品准备工序之前，在样品处理容器中加入添加剂的样品处理容器准备工序，所述添加剂含有至少具有羧基或磺基的任一种基团的有机酸。

3.一种β淀粉样蛋白的测定方法，其特征在于，包括：

样品处理容器准备工序，在样品处理容器中加入添加剂，所述添加剂含有至少具有羧基或磺基的任一种基团的有机酸；

样品准备工序，在所述样品处理容器中加入可能含有β淀粉样蛋白的样品；

第一浓缩工序，将所述样品处理容器内的所述样品浓缩；

第二浓缩工序，在通过所述第一浓缩工序浓缩后的样品中，添加能够使β淀粉样蛋白溶液化的增溶剂，通过浓缩操作，降低所述样品中含有的溶剂的量；

中和工序，中和在所述第二浓缩工序中获得的样品处理液中的所述增溶剂；和

测定工序，基于抗原抗体反应，确定经过所述中和后的样品处理液中可能含有的β淀粉样蛋白的量。

4.如权利要求1或3所述的β淀粉样蛋白的测定方法，其特征在于：所述增溶剂是甲酸。

5.如权利要求2或3所述的β淀粉样蛋白的测定方法，其特征在于：所述添加剂含有甲酸和s-烯丙基-l-半胱氨酸。

6.如权利要求1或3所述的β淀粉样蛋白的测定方法，其特征在于：所述样品处理容器含有封闭剂。

7.如权利要求6所述的β淀粉样蛋白的测定方法，其特征在于：

所述封闭剂含有牛血清白蛋白。

8.如权利要求1或3所述的β淀粉样蛋白的测定方法，其特征在于：所述样品处理容器具有抑制β淀粉样蛋白吸附的内壁表面。

9.如权利要求3所述的β淀粉样蛋白的测定方法，其特征在于：

在所述第一浓缩工序中，不使β淀粉样蛋白不溶化而进行浓缩。

10.如权利要求1或3所述的β淀粉样蛋白的测定方法，其特征在于：所述样品是体液。

11.如权利要求1或3所述的β淀粉样蛋白的测定方法，其特征在于：所述样品是将机体组织清洗而得到的清洗液。

12.如权利要求11所述的β淀粉样蛋白的测定方法，其特征在于：

所述机体组织是鼻粘膜。