KR101804624B1 - 콧물 시료를 이용한 뇌신경 질환의 진단용 조성물 - Google Patents

콧물 시료를 이용한 뇌신경 질환의 진단용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 분리된 콧물 시료에서의 베타 아밀로이드 올리고머(beta amyloid oligomer)의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 뇌신경 질환 진단용 조성물, 진단용 키트 및 상기 콧물 시료로부터 베타 아밀로이드 올리고머를 검출하는 방법에 관한 것이다. 또한, 베타 아밀로이드 올리고머의 발현수준의 변화를 측정하는 단계를 포함하는 뇌신경 질환 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

Description

콧물 시료를 이용한 뇌신경 질환의 진단용 조성물{Composition for diagnosing neurological disease using nasal mucus}
본 발명은 분리된 콧물 시료에서의 베타 아밀로이드 올리고머(beta amyloid oligomer)의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 뇌신경 질환 진단용 조성물, 진단용 키트 및 상기 콧물 시료로부터 베타 아밀로이드 올리고머를 검출하는 방법에 관한 것이다. 또한, 베타 아밀로이드 올리고머의 발현수준의 변화를 측정하는 단계를 포함하는 뇌신경 질환 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
전 세계적으로 평균수명이 늘어나고 노인 인구가 증가하는 고령화 사회로 되면서 알츠하이머병으로 대표되는 노인성 치매, 뇌졸중 또는 파킨슨병과 같은 뇌신경 질환의 발병률이 크게 증가하고 있다. 보건사회연구원 조사 통계에 따르면 우리나라의 노인 인구는 2000년에 7%를 넘어 고령사회에 진입한 이래 2003년 397만 명으로 노인 인구의 비율이 8.3%에 이르렀고 2019년에는 14.4%에 이르러 완전고령사회에 진입할 것으로 예견되고있다.
상기 뇌신경 질환들은 특정 뇌세포의 사멸 또는 퇴화가 일시적 또는 오랜 기간에 걸쳐 진행하는 것이 특징인데, 한번 죽은 뇌세포는 재생이 되지 않기 때문에 결국 치명적인 뇌기능의 손실로 이어진다. 특히, 인지기능, 감각기능, 운동기능, 전신기능의 진행성 저하를 수반하는 뇌기능 부전은 결국 성격과 행동의 변화를 가져오고, 환자들이 스스로 자신을 돌볼 수 없는 지경에 이르게 한다.
특히 뇌신경 질환 중 하나인 알츠하이머는 신경세포의 퇴화 및 이로 인한 인지, 기억능력의 상실을 가져오는 대표적인 퇴행성 뇌질환으로, 오래 지속될 경우 여타 합병증으로 사망에 이르게 된다.
최근 알츠하이머 질환이 급속하게 증가하는 추세에 있어, 조기진단, 예방 및 치료에 대한 필요성이 시급한 실정이나, 현재까지 알츠하이머 질환의 진단은 신경심리학적인 검사(예를 들어, Short Form of Geriatric Depression Scale(GDS) 또는 mini-mental state examination(MMSE))나 특화된 MRI 촬영과 같은 많은 시간과 경비가 소요되는 방법들만이 가능하였다.
예를 들어, 기존의 알츠하이머병 진단 방법으로, 고해상도 뇌영상 촬영장치를 이용한 뇌영상 촬영 기법이 있다. 뇌영상 촬영기법을 통하여 알츠하이머병의 조기 진단방법은 알츠하이머병 의심환자를 대상으로 뇌 촬영을 통해 베타 아밀로이드 단백질의 이상축적 정도를 측정하고 환자들의 사후 뇌조직 검시 결과와의 비교분석을 통해 뇌영상 촬영장치의 정밀도를 연구한다. 하지만 이러한 영상기반 진단방법은 환자에게 고비용을 요구할뿐만 아니라, 이미 뇌수축 또는 손상이 진행된 상태에서 판별이 이루어지므로 병의 탐지가 늦게 된다.
또 다른 대표적 진단 방법으로는 척수액을 진단하는 것으로서 뇌척수 내의 베타 아밀로이드 단백질 양의 변화를 측정한다. 하지만 뇌척수 검사방법 자체가 환자에게는 너무나 고통스러운 방법이라고 알려져 있으며, 검사시 위험성이 동반된다는 점이 단점으로 지적되고 있다.
그 외 알츠하이머 질환의 진단을 위한 다른 방법으로, tau 단백질의 농도를 측정하는 방법, 신경아교원섬유 산성 단백질(glial fibrillary acidic protein, GFAP)-항체를 검출하는 방법 등의 생화학적 방법들이 제안되었으나, 진단의 간편성과 정확도 등의 문제가 제기되고 있다(미국등록특허 제4,666,829호; 국제공개특허 제89/06242호; 미국등록특허 제 5,231,000호 등).
이러한 배경하에, 본 발명자들은 간편하고 정확하게 뇌신경 질환을 진단할 수 있는 방법을 찾기 위해 예의 노력한 결과, 올리고머 형태의 베타 아밀로이드가 수용성 물질임에 착안하여, 타액 중 콧물에 녹아있는 베타 아밀로이드 올리고머의 발현수준을 분석함으로써 뇌신경 질환의 조기 진단이 비침습적이고 간편한 방식으로 이루어질 수 있도록 하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 분리된 콧물 시료에서의 베타 아밀로이드 올리고머(beta amyloid oligomer)의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 뇌신경 질환 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 뇌신경 질환 진단용 조성물을 포함하는, 뇌신경 질환 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 뇌신경 질환을 진단하는데 필요한 정보를 제공하기 위하여, 분리된 콧물 시료로부터 베타 아밀로이드 올리고머를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 분리된 콧물 시료에 뇌신경 질환 치료제 후보물질을 처리하기 전과 처리한 후의 베타 아밀로이드 올리고머의 발현수준의 변화를 측정하는 단계를 포함하는, 뇌신경 질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일구현예는 분리된 콧물 시료에서의 베타 아밀로이드 올리고머(beta amyloid oligomer)의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 뇌신경 질환 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, “베타 아밀로이드 올리고머(beta amyloid oligomer)”는 베타 아밀로이드의 저중합체로서 베타 아밀로이드가 12개 이상 20개 이하로 중합된 것일 수 있다. 신경세포 사이에 집적되어 신호전달이 이루어지는 연결부위인 시냅스의 장애를 일으켜 기억·인지 기능을 떨어뜨리게 된다.
베타 아밀로이드는 아밀로이드 단백질 전구체(APP)에서 유래된 39-43개의 아미노산 잔기로 구성된 폴리펩타이드이다. 아밀로이드 단백질 전구체(APP)는 β-, γ-분해효소(β-, γ-secretase) 중 β-분해효소에 의하여 베타아밀로이드 40 또는 42(Aβ40 또는 Aβ42) 단량체(monomer)가 된 후 집적하여 올리고머(oligomer)를 형성하고 이 올리고머의 집적으로 피브릴(fibril)의 단계를 거치게 된다. 이러한 여러 단계의 베타아밀로이드 중에서 올리고머가 되는 상태부터 뇌에 강한 신경 독성을 나타내어 뇌세포를 사멸시키는 것으로 알려져 있다. 베타 아밀로이드의 유전자 서열 및 아미노산 서열은 공지된 유전자 데이터베이스를 통해 쉽게 확인할 수 있다. 예를 들어, 인간 베타 아밀로이드의 유전자 서열은 NCBI 등록번호 NM_001013018.1, 이의 아미노산 서열은 NP_001013036.1로 각각 등록되어 있다.
보다 상세하게, 본 발명의 일 실시예에서는 정상 콧물 시료, 알츠하이머 환자의 콧물 시료를 이용하여 베타 아밀로이드 올리고머의 발현수준을 측정하였으며, 특히 정상 콧물 시료에서의 베타 아밀로이드 올리고머의 발현수준이 증가되어 있음을 관찰하였다. 이로부터 본 발명자들은 콧물 시료에서의 베타 아밀로이드 올리고머를 측정하여 알츠하이머 등 베타 아밀로이드 관련 뇌신경 질환을 진단할 수 있음을 확인하였다.
본 발명에서 용어, “단백질의 발현수준”이란 세포 내에서 유전자로부터 단백질로 발현되는 수준을 말하며, 단백질의 발현수준을 관찰함으로써 세포 내의 mRNA 수준과 세포 내에서 발현되는 단백질 수준의 직접적인 상관관계를 나타내지 못하는 mRNA를 표적으로 하는 연구의 한계를 보완할 수 있다. 본 발명에서는 베타 아밀로이드 올리고머의 발현수준을 관찰함으로써 뇌신경 질환의 진단이 용이하게 이루어질 수 있도록 하였다.
본 발명에서 용어, “뇌신경 질환”은 뇌신경세포의 구조적 퇴화, 순환기 장애 등 다른 성인병에 기인한 2차적 증상, 또는 교통사고, 산업재해, 일산화탄소 중독 등 다양한 물리적, 기계적 요인에 의하여 뇌가 손상을 입으면 일어날 수 있으며, 신경세포 내외에 걸친 단백질의 비정상적 축적과 그에 따른 단백질 응집 및 침착에 의해 발생할 수 있다.
구체적으로 상기 뇌신경 질환은 퇴행성 뇌신경 질환일 수 있으며, 보다 구체적으로 알츠하이머 병(Alzheimer’s disease, J Alzheimers Dis. 2010;19(1):311-23. 「Alzheimer's disease and the amyloid-beta peptide」), 파킨슨 병(Parkinson’s disease, 「Striatal beta-amyloid deposition in Parkinson disease with dementia」), 헌팅턴 병(Huntington's disease, Neurobiology of Aging 27 (2006) 570?575,「Common mechanisms of amyloid oligomer pathogenesis in degenerative disease」), 루게릭 병(Amyotrophic lateral sclerosis, PLoS ONE. 01/2011; 6(8):e23600.「Soluble beta-amyloid precursor protein is related to disease progression in amyotrophic lateral sclerosis.」), 니만-픽 병(Nieman-Pick disease, J. Biol. Chem. 2001, 276:4454-4460. 「Accumulation and Aggregation of Amyloid b-Protein in Late Endosomes of Niemann-Pick Type C Cells」) 및 뇌졸중(stroke, J Neural Transm. 2005 Oct;112(10):1371-9., 「Circulating beta amyloid protein is elevated in patients with acute ischemic stroke.」)으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며 베타 아밀로이드가 집적되어 발생하는 뇌 질환이면 적용될 수 있다. 가장 구체적으로, 알츠하이머 질환일 수 있다.
본 발명은 후술하는 일 실시예에 의해 뒷받침되는 바와 같이, 비침습적 시료인 콧물 시료를 이용하여 베타 아밀로이드 올리고머의 발현 수준을 측정하여 뇌신경 질환을 진단할 수 있음을 확인함으로써 조기 진단이 어려운 뇌신경 질환을 보다 간편하게 비침습적으로 고통 없이 진단하여 치료할 수 있도록 하였다.
본 발명에서, “분리된 콧물 시료에서의 베타 아밀로이드 올리고머(beta amyloid oligomer)의 발현수준을 측정하는 제제”는 베타 아밀로이드 단백질, 이의 올리고머 또는 집적체를 검출하여 이의 양을 측정할 수 있는 제제를 말한다. 구체적으로, 베타 아밀로이드 올리고머에 특이적인 항체 또는 이에 결합할 수 있는 앱타머 등이 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, “항체”란 항원성 부위에 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 상기 마커 단백질인 베타 아밀로이드 올리고머에 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 단일클론항체, 다클론항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.
단일클론항체는 당해 분야에 널리 공지된 하이브리도마 방법(Kohler 및 Milstein (1976) European journal og Immunology 6:511-519), 또는 파지 항체 라이브러리(Clarkson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991)기술을 이용하여 제조될 수 있다.
다클론항체는 상기한 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다. 또한, 본 발명의 항체에는 키메라 항체, 인간화 항체, 인간항체 등의 특수항체도 포함된다.
나아가, 본 발명에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등을 예시할 수 있다.
이러한 항체를 이용하여 콧물 시료 내 베타 아밀로이드 올리고머의 발현수준을 측정하기 위한 방법으로는, 콧물 시료에 상기 항체를 처리하여 항원-항체 복합체의 생성 정도를 확인할 수 있는 방법이라면 제한없이 사용할 수 있다. 상기 “항원-항체 복합체”란 베타 아밀로이드 올리고머와 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.
예를 들어, 웨스턴블롯(Western blot), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorecence Activated Cell Sorter, FACS), 또는 단백질 칩(protein chip) 등을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서, “앱타머”란 특정 물질에 대해 높은 특이성과 친화도를 가지는 단일가닥 DNA(ssDNA) 또는 RNA 를 말한다. 앱타머는 특정 물질에 대한 친화도가 매우 높고 안정하고, 비교적 단순한 방법으로 합성할 수 있으며, 결합력을 높이기 위해 다양한 변형이 가능하고, 세포, 단백질, 및 작은 유기물질까지도 표적물질이 될 수 있기 때문에, 그 특이성 및 안정성이 이미 개발되어 있는 항체에 비해 매우 높은 특징이 있다.
본 발명의 앱타머는 베타 아밀로이드 올리고머에 특이적으로 결합할 수 있는 것이라면 제한되지 않으며, 앱타머에 사용되는 염기는 특별한 언급이 없는 한, A, G, C, U 이들의 deoxy 형태의 염기들로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
또한, 상기 앱타머는, 안정성 증진을 위하여, 5' 말단 부위, 중간 부위, 3' 말단 부위, 또는 양 말단 부위에 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG), idT(inverted deoxythymidine), LNA(Locked Nucleic Acid), 2'-메톡시 뉴클레오사이드, 2'-아미노 뉴클레오사이드, 2'F-뉴클레오사이드, 아민 링커, 티올 링커 및 콜레스테롤로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 것이 결합되어 변형된 것일 수 있다.
상기 idT(inverted deoxythymidine)는 일반적으로 뉴클레아제에 대한 내성이 약한 앱타머의 뉴클레아제에 의한 분해를 막기 위하여 사용되는 분자 중 하나로서, 핵산단위체는 앞 단위체의 3’-OH와 다음 단위체의 5’-OH와 결합하여 사슬을 이루지만, idT는 앞 단위체의 3’-OH와 다음 단위체의 3’-OH를 결합하여 3’-OH가 아닌 5’-OH가 노출이 되도록 인위적인 변화를 가함으로써 뉴클레아제의 일종인 3’엑소뉴클레아제(3’exonuclease)에 의한 분해를 억제하는 효과를 일으키는 분자이다.
또 다른 본 발명의 일구현예는, 상기 뇌신경 질환의 진단용 조성물을 포함하는 뇌신경 질환의 진단용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 키트는 콧물 시료 내 베타 아밀로이드 올리고머의 발현수준을 측정할 수 있는 제제뿐만 아니라, 발현수준 분석에 적합한 한 종류 이상의 조성물, 용액 또는 장치를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 검출 라벨로 표지된 2차 항체, 및 발색 기질 등을 포함할 수 있다.
상기 “베타 아밀로이드 올리고머의 발현수준을 측정할 수 있는 제제”는 특별히 이에 제한되지는 않으나, 베타 아밀로이드 올리고머와 특이적으로 결합할 수 있는 항체, 앱타머 등이 사용될 수 있으며, 상기 제제를 포함하는 단백질 칩의 형태로 상기 키트에 포함될 수 있다.
아울러, 상기 항체 또는 앱타머를 검출할 수 있는 2차 항체를 추가로 포함할 수도 있는데, 상기 2차 항체는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 단백질 칩에 결합할 수 있는 베타 아밀로이드 올리고머와 결합할 수 있고 형광물질, 방사선 동위원소 등으로 표지되어 사용될 수 있다.
구체적인 일례로, 뇌신경 질환 진단용 키트는 ELISA 키트, 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 구현하기 위하여, ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트일 수 있다. ELISA 키트는 상기 단백질들에 대한 특이적인 항체 또는 앱타머를 포함할 수 있다. 항체는 베타 아밀로이드 올리고머에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단일클론항체, 다클론항체 또는 재조합 항체일 수 있다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체 또는 앱타머를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromopores), 효소 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
이 외에도, 상기 키트는 웨스턴블롯(Western blot), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorecence Activated Cell Sorter, FACS), 또는 단백질 칩(protein chip) 등을 구현하기 위한 키트일 수 있으며, 각 분석 방법에 적합한 부가적인 구성을 추가로 포함할 수 있다. 이 분석 방법들을 통하여, 항원-항체 복합체 형성량을 비교함으로써 뇌신경 질환을 진단 할 수 있으며, 이에 맞추어 환자를 적절히 치료할 수 있다. 보다 구체적으로, 분리된 콧물 시료로부터 베타 아밀로이드 올리고머를 검출할 수 있는 단백질 칩을 구현한 키트일 수 있다.
구체적으로, 본 발명에서 사용될 수 있는 단백질 칩은, 측정하고자 하는 콧물 시료를 주입하여, 크기에 따라 분리한 후, 양성 대조군으로 콧물에 반드시 존재하는 단백질(예를 들어, flunc 단백질)을 측정하는 정상 시료 추출 부분(트랙) 및 특정 크기(병인을 나타내는 크기의 베타 아밀로이드 올리고머)의 추출하는 병리 시료 추출 부분(트랙)으로 구분하고 특정 크기의 단백질만을 선택하여, 이를 항체와 항원-항체 반응을 시킨 후, 2차 항원에 표지된 형광물질, 방사선 동위원소 등에 의해 나타나는 발광 신호를 측정하여 베타 아밀로이드 올리고머를 확인함으로써 뇌신경 질환 여부를 진단하는데 사용할 수 있다.
이와 같은 단백질 칩의 모식도는 도 8에 나타난 바와 같다. 이와 같은 칩은 양성 대조군과 동시에 측정하여, 위양성 없이 정확한 측정이 가능하며, 비침습적이고 조기진단이 가능하다.
본 발명의 또 다른 일구현예는 뇌신경 질환을 진단하는데 필요한 정보를 제공하기 위하여, 분리된 콧물 시료로부터 베타 아밀로이드 올리고머를 검출하는 방법에 관한 것이다.
보다 상세하게, 뇌신경 질환 의심 환자의 시료에서 베타 아밀로이드 올리고머의 발현 정도를 측정하고, 이를 정상 대조군에서의 베타 아밀로이드 올리고머의 발현 정도와 비교함으로써 해당 환자의 실제 뇌신경 질환인지 여부를 진단할 수 있다. 이때, 뇌신경 질환으로 의심되는 환자의 베타 아밀로이드 올리고머 발현 정도가 정상 대조군의 베타 아밀로이드 올리고머 발현 정도보다 증가한 것으로 측정되는 경우, 해당 환자가 뇌신경 질환 환자인 것으로 진단할 수 있다. 구체적으로, 상기 뇌신경 질환은 알츠하이머 병(Alzheimer’s disease), 파킨슨 병(Parkinson’s disease), 헌팅턴 병(Huntington's disease), 루게릭 병(Amyotrophic lateral sclerosis), 니만-픽 병(Nieman-Pick disease) 및 뇌졸중(stroke)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 콧물 시료에서 단백질을 분리하는 과정은 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있으며, 단백질 수준은 앞서 언급한 다양한 항원-항체 복합체 측정 방법으로 측정할 수 있다.
구체적으로, 상기 단백질 발현수준의 측정은 베타 아밀로이드 올리고머에 특이적인 항체를 이용하여 수행될 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 항체는 베타 아밀로이드 올리고머에 특이적인 단일클론항체 또는 다클론항체일 수 있으며, 나아가 항원결합활성을 보유하는 항체의 기능적 단편일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 구체적으로, 콧물 시료로부터 베타 아밀로이드 올리고머를 검출하는 방법으로서 웨스턴블롯(Western blot), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorecence Activated Cell Sorter, FACS), 또는 단백질 칩(protein chip) 등을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 뇌신경 질환은 앞서 설명한 바와 같다.
또 다른 일구현예로서, 본 발명은 분리된 콧물 시료에 뇌신경 질환 치료제 후보물질을 처리하는 단계, 및 상기 시료에서 상기 후보물질을 처리하기 전과 처리한 후의 베타 아밀로이드 올리고머의 발현수준의 변화를 측정하는 단계를 포함하는, 뇌신경 질환 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명에서는 뇌신경 질환 치료제 후보물질을 처리한 분리된 콧물 시료에 대하여 베타 아밀로이드 올리고머의 발현 수준의 변화를 측정함으로써, 해당 뇌신경 질환 치료제 후보물질의 치료 효과를 측정하여 뇌신경 질환 치료제를 스크리닝 할 수 있다. 예를 들어, 뇌신경 질환 치료제 후보물질의 처리에 따라 베타 아밀로이드 올리고머의 발현이 감소되는 경우, 해당 후보물질을 뇌신경 질환 치료제로 선별할 수 있다.
또한, 상기 뇌신경 질환은 앞서 설명한 바와 같다.
본 발명은 분리된 콧물 시료에서의 베타 아밀로이드 올리고머 발현 수준을 측정함으로써 뇌신경질환 여부를 조기에 진단할 수 있을 뿐만 아니라, 특히 콧물 시료를 이용하여 비침습적이고 간편한 방법을 통해 진단이 가능하도록 한다.
도 1은 정상 동물 모델 및 알츠하이머 동물 모델 각각에서 베타 아밀로이드 올리고머 발현수준에 대한 면역조직화학 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 정상 동물 모델 및 알츠하이머 동물 모델 각각에서 베타 아밀로이드 올리고머 발현수준에 대한 웨스턴블롯 분석 결과를 나타낸 이미지이다.
도 3은 정상인과 인지장애 판정을 받은 환자 콧물 시료에서의 베타 아밀로이드 올리고머의 발현 수준을 웨스턴블롯을 통해 확인한 결과를 나타낸 이미지이다.
도 4는 정상인과 GDS 검사를 통해 인지장애 판정을 받은 환자 콧물 시료에서의 베타 아밀로이드 올리고머의 발현 수준의 경향을 분석한 그래프이다.
도 5는 정상인과 MMSE 검사를 통해 인지장애 판정을 받은 환자 콧물 시료에서의 베타 아밀로이드 올리고머의 발현 수준의 경향을 분석한 그래프이다.
도 6은 정상인과 인지장애 판정을 받은 환자 콧물 시료에서의 전체 단백질을 나타낸 사진이고, 발현 양상의 차이가 있다고 판별하여 분석한 단백질 밴드는 네모칸으로 표시하였다.
도 7은 정상인과 인지장애 판정을 받은 환자 콧물 시료에서의 발현 양상에 차이가 있는 단백질을 분석한 결과를 나타낸 목록이다.
도 8은 콧물 시료에서의 베타 아밀로이드 올리고머의 검출을 수행할 수 있는 단백질 칩의 모식도이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 알츠하이머 동물 모델에서의 베타 아밀로이드 올리고머의 증가 확인
정상 마우스 동물 모델 및 알츠하이머 마우스 동물 모델 각각에 대하여, 월령 6개월 및 14개월인 마우스 동물 모델에서 베타 아밀로이드 올리고머의 발현 수준을 알아보기 위하여 후각 상피에서의 베타 아밀로이드 올리고머에 대한 면역분석화학(immunochemistry) 및 웨스턴블롯(western blot)을 수행하였다. 수컷 마우스를 사용하였으며, 6개월령의 마우스 동물 모델의 경우 정상 및 알츠하이머 마우스 모델 각각 7마리씩 사용하였으며, 14개월령의 마우스 동물 모델의 경우 정상 마우스 9마리, 알츠하이머 마우스 8마리를 사용하였다.
면역분석화학 수행을 위하여, 대상 후각 상피 조직을 파라핀을 이용하여 고정시킨 후, 얇게 절편으로 자르고 파라핀 제거 및 재수화반응을 시킨다. 구체적으로, 상기 절편에 자일린(xylene)을 3분씩 2번 가한 후, 자일린과 100% 에탄올이 1:1로 혼합된 용액을 3분 동안 가하였다. 이후 100%, 95%, 70% 및 50% 에탄올을 순차적으로 각각 3분씩 절편에 가한 후 차가운 물로 헹구었다.
이후, 시트르산나트륨 용액(10mM Sodium Citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0)에서 5분간 끓이고, TBS로 절편을 5분씩 3번 세척하였다. 이후 3% 당나귀 혈청(donkey serum)이 포함된 TBS로 상온에서 1시간 동안 블로킹(blocking) 시킨 후, 절편을 닦아냈다. 이후 3% BSA가 포함된 TBS에서 1차 항체인 항-Aβ 올리고머를 1:500으로 4℃에서 밤새 반응시켰다. 이후, TBS 용액으로 5분씩 3번 세척하고, 0.3% H2O2 가 포함된 TBS와 15분간 반응시켰다. 이후 horseradish peroxidase(HRP)가 연결된 2차 항체를 1:500으로 1시간 동안 상온에서 반응시키고, 현미경으로 관찰한 후 통계화하여 그래프로 나타내었다.
도 1에 나타난 바와 같이, 면역분석화학 실험을 통해 베타 아밀로이드 올리고머가 정상 마우스 모델에서보다 알츠하이머 질환 모델에서 현저히 증가한 것을 확인할 수 있었다.
또한, 웨스턴블롯 수행을 위해, 우선 동결 보관되어 있던 대상 조직을 프로테아제 억제제(protease inhibitor)가 포함된 cell lysis 버퍼(buffer)를 넣고 4℃에서 30분 반응시켰다. 반응시킨 혼합액을 원심분리기를 이용하여 30분 동안 13,000 rpm으로 분리한 다음 상층액만 추출하고, 조직으로부터 추출된 단백질을 12% SDS polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)를 이용하여 단백질들을 분리하였다. 분리된 단백질들을 nitrocellulose membrane(Schleicher & Schuell, Dassel, Germany)에 옮기고, 이를 블로킹 버퍼[1% skim milk가 포함된 TBS-T(10mM Tris-HCl, 0.15 M NaCl; pH 7.4)]로 상온에서 1시간 동안 블로킹시켰다. 블로킹이 끝난 후 TBS-T 버퍼로 10분 동안 3번 membrane을 세척한 다음 1차 항체와 반응시켰다. 1차 항체로는 polyclonal rabbit Anti-Aβ-올리고머(Millipore AB9234)(1:1000)를 3% BSA가 함유된 TBS-T 버퍼에 혼합하여 4℃에서 6시간 반응시킨 후, 2차 항체는 horseradish peroxidase(HRP)가 연결된 항-rabbit IgG(1:5000) 를 상온에서 2시간 동안 반응하였다. 각 반응은 모두 TBS-T를 이용하여 15분간 3회 세척하여 비 특이반응을 제거하였으며, ECL(Amersham)을 이용하여 확인하였으며, 이를 통계화하여 그래프로 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 6개월령 및 14개월령 모두에서 정상 마우스 모델보다 알츠하이머 질환 모델에서 베타 아밀로이드 올리고머가 증가한 것을 확인할 수 있었다.
상기 면역분석화학 및 웨스턴블롯 실험을 통해 베타 아밀로이드 올리고머가 동일한 나이의 정상 마우스 모델에서보다 알츠하이머 질환 모델에서 170% 이상 증가함을 나타내었으며, 이로부터 베타 아밀로이드 올리고머가 알츠하이머 질환의 조기 진단에 있어서 중요한 마커가 될 수 있음을 확인하였다(도 1 및 도 2).
실시예 2. 콧물 시료에서의 베타 아밀로이드 올리고머의 검출
실시예 2-1. 베타 아밀로이드 올리고머의 발현 수준 분석
올리고머 형태의 베타 아밀로이드는 수용성 물질이므로 타액에 녹아있는 부분을 분석함으로써 알츠하이머 환자의 조기 진단이 가능할 수 있음에 착안하여, 정상인과 인지장애 판정을 받은 환자로부터 채취한 콧물 시료에서의 베타 아밀로이드 올리고머의 발현 수준을 분석하였다.
구체적으로, 경도성 인지장애 검사(MCI)를 통해 치매 초기로 추정되는 100 여명의 환자와 정상인 중 정상인 7명 및 인지장애 판정을 받은 10명, 총 17명을 선별하여 웨스턴블롯을 통해 베타 아밀로이드 올리고머의 발현 수준을 분석하였다.
웨스턴블롯을 수행하기 위하여 우선 동결 보관되어 있던 환자 샘플을 프로테아제 억제제가 포함된 cell lysis 버퍼에 넣고 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. 반응시킨 혼합액을 원심분리기를 이용하여 30분 동안 13,000 rpm으로 분리한 다음 상층액만 추출하고, 조직으로부터 추출된 단백질을 12% SDS-PAGE를 이용하여 단백질들을 분리하였다. 분리된 단백질들을 nitrocellulose membrane(Schleicher & Schuell, Dassel, Germany)에 옮기고, 이를 블로킹 버퍼[1% skim milk가 포함된 TBS-T(10mM Tris-HCl, 0.15 M NaCl; pH 7.4)]로 상온에서 1시간 동안 블로킹시켰다. 블로킹이 끝난 후 TBS-T 버퍼로 10분 동안 3번 membrane을 세척한 다음 1차 항체와 반응시켰다. 1차 항체로는 polyclonal rabbit Anti-Aβ-oligomer(Millipore AB9234)(1:1000)를 3% BSA가 함유된 TBS-T 버퍼에 혼합하여 4℃에서 6시간 반응시킨 후, 2차 항체는 HRP가 연결된 항-rabbit IgG(1:5000)를 상온에서 2시간 동안 반응하였다. 각 반응은 모두 TBS-T를 이용하여 15분간 3회 세척하여 비 특이반응을 제거하였으며, ECL(Amersham)을 이용하여 확인하였다.
상기 실험을 통하여 55 KDa인 베타 아밀로이드의 발현이 정상인에 비해 인지장애 판정을 받은 환자의 콧물 시료에서 증가 되어 있음을 확인하였다. 특히, 베타 아밀로이드 올리고머를 나타내는 25 KDa과 78 KDa에서의 밴드는 인지장애 판정을 받은 환자의 콧물에서만 나타남을 확인할 수 있었다(도 3).
실시예 2-2. 베타 아밀로이드 올리고머의 발현 수준의 경향 분석
정상인과 인지장애 판정을 받은 환자로부터 채취한 콧물 시료에서의 베타 아밀로이드 올리고머의 발현 수준의 경향을 분석하였다.
구체적으로, 실시예 2-1에서 사용한 시료들 중, GDS 검사 또는 MMSE 검사를 통해 인지장애 판정을 받은 환자들을 각각 구분하여 웨스턴블롯을 통해 베타 아밀로이드 올리고머의 발현 수준을 분석하였고, 이후 경향을 분석하였다.
그 결과, 정상인에 비해 인지장애 판정을 받은 환자에서 55 KDa, 25 KDa 및 78 KDa의 베타 아밀로이드의 발현 수준이 높아지는 경향을 확인하였다(도 4 및 도 5).
상기 결과를 통해, 콧물 시료에 포함된 올리고머 형태의 베타 아밀로이드가 알츠하이머병 스크리닝과 조기진단에 매우 유용한 지표가 될 수 있음을 확인하였다.
실시예 2-3. 알츠하이머병의 지표로서의 베타 아밀로이드 올리고머의 확인
상시 실시예 2-1 및 2-2에서 확인한 것처럼, 정상인과 인지장애 판정을 받은 환자군의 콧물에서의 베타 아밀로이드의 발현의 수준은 확실한 차이가 있었다. 이에, 정상인과 인지장애 환자의 콧물 시료에 포함된 모든 단백질들 중에서 발현 양상의 차이를 보이는 단백질이 베타 아밀로이드인지 확인하고자 프로테오믹스 기반 바이오마커 분석을 수행하였다.
SDS-PAGE를 통해 질량에 따라 단백질을 분리한 후, SYPRO Ruby stain(detection limit 2~10 ng)을 사용하여 gel 안에서 구현된 단백질의 band를 염색하였다. 이후, 스캔한 gel 이미지를 분석하여 비교함으로써 발현의 증가 또는 감소를 확인하였고, 발현의 차이를 분석하였다. 이미지 분석을 통해 발현 양상의 차이가 있다고 판별한 단백질 밴드를 채취하여 트립신(Trypsin)을 이용하여 분해함으로써 펩타이드를 획득하였고, MALDI-TOF MS(Matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry)를 통해 펩타이드의 질량을 확인함으로써 서열을 확보한 후, web 상의 database(peptideSearch: http://www.mann.embl-heidelberg.de/Services/PeptideSearch/FR_sequenceOnlyForm.html)와 비교하여 단백질의 정체를 확인하였다.
발현 양상의 차이를 확인한 결과를 도 6에 나타내었고, 발현 정도의 차이를 나타내는 밴드를 분석한 결과는 하기 표 1 및 도 7에 나타내었다. 표 1의 결과를 통해 분석한 밴드 내에 베타 아밀로이드 단백질이 존재한다는 것을 확인할 수 있었고, 이로써 정상인과 인지장애 환자의 콧물 시료에 포함된 모든 단백질들 중에서 발현 양상의 차이를 보이는 단백질은 베타 아밀로이드임을 확인하였다.
% cov. Accessions Names Contrib. Conf. Sequence
33.33 sp|P05067.3|A4
_HUMAN		 ABPP, Amyloid beta A4 protein OS=Homo sapiens GN=KRT9 PE=1 SV=3 0.380907 91.21 LVFFAEDVGSNK
(% cov.: percent of coverage, Contrib.: contribution, Conf.: configuration)
상기 결과들을 통해, 콧물에 녹아있는 베타 아밀로이드 올리고머의 발현 정도를 분석함으로써 알츠하이머 환자를 비침습적 방법을 통해 고통 없이 간편하게 진단할 수 있음을 알 수 있었다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (13)

  1. 삭제
  2. 삭제
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  5. 삭제
  6. (a) 분리된 콧물 시료로부터 전처리 없이 베타 아밀로이드가 12개 이상 20개 이하로 중합된 베타 아밀로이드 올리고머를 검출하는 단계; 및
    (b) 상기 베타 아밀로이드 올리고머의 발현수준이 정상 대조군 대비 증가하는 경우 알츠하이머 병으로 판단하는 단계를 포함하는, 알츠하이머 병을 진단하는데 필요한 정보를 제공하는 방법으로서,
    상기 검출은 베타 아밀로이드 올리고머에 특이적인 항체를 이용하여 수행되는 것인 방법.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제6항에 있어서, 상기 검출은 웨스턴블롯(Western blot), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorecence Activated Cell Sorter, FACS), 또는 단백질 칩(protein chip)을 이용하여 수행되는 것인 방법.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
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