WO2022098071A1 - 구개편도선에서 알츠하이머병 유발 인자로서 베타아밀로이드 단백질 검출 및 이의 이용 - Google Patents

구개편도선에서 알츠하이머병 유발 인자로서 베타아밀로이드 단백질 검출 및 이의 이용 Download PDF

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WO2022098071A1
WO2022098071A1 PCT/KR2021/015751 KR2021015751W WO2022098071A1 WO 2022098071 A1 WO2022098071 A1 WO 2022098071A1 KR 2021015751 W KR2021015751 W KR 2021015751W WO 2022098071 A1 WO2022098071 A1 WO 2022098071A1
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WO
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expression level
disease
beta
alzheimer
amyloid
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PCT/KR2021/015751
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김성원
전정호
이일환
임정연
김도현
양승호
이정은
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가톨릭대학교 산학협력단
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention relates to the detection of beta-amyloid protein as an Alzheimer's disease inducing factor in the palatine tonsil and its use, and more particularly, to diagnose Alzheimer's disease by confirming the expression of beta-amyloid and/or Staphylococcus aureus in a tonsil sample. It's about being able.
  • Degenerative brain disease is a disease that occurs in the brain among degenerative diseases that occur with aging. It is known to be caused by the death of cranial nerve cells, which are most important for information transmission in the cranial nervous system, problems with the formation or function of synapses that transmit information between cranial nerve cells and cranial nerve cells, and ideal symptoms or reduction of the electrical activity of cranial nerves. there is. Neurons in the brain and spinal cord have very diverse functions depending on their location, so depending on which part of the nerve cells are damaged and lose their function first, and what type of dysfunction progresses, they show a very diverse clinical picture. do.
  • Degenerative brain diseases can be classified by considering the main symptoms that appear and the brain regions that are involved. sclerosis; ALS) (aka Lou Gehrig's disease) and the like.
  • Dementia is a disease that mainly occurs in the elderly and is a geriatric disease whose prevalence increases dramatically with age. It is reported that there are currently about 2 million dementia patients in the United States, and in Korea as well, 8.2% of the elderly over 65 in 2000, or about 280,000, in 2005, 8.3%, or about 360,000.
  • the causes of dementia include atrophic changes in the brain, cerebrovascular disorders, inflammatory disorders of the brain, metabolic and endocrine diseases such as korsakoff syndrome, tumors, trauma, and poisoning. ) has the highest percentage.
  • AD Alzheimer's disease
  • NFT neurofibrillary tangle
  • NFT neurofibrillary tangles
  • ROS reactive oxygen species
  • biomarkers used for early diagnosis of Alzheimer's disease include brain magnetic resonance imaging, brain positron emission tomography (evaluating glucose metabolism or amyloid and tau accumulation), and cerebrospinal fluid test (measuring amyloid and tau concentrations). . These tests are very expensive or can only be performed in some large hospitals, and have limitations in that they are invasive and psychologically repulsive like cerebrospinal fluid tests. In this regard, if there is a method that can be tested using tonsil tissue, which is a simple sample, in order to predict the possibility of Alzheimer's disease at an early stage, especially in a screening test for a large number of elderly people in the community, it is very It may be useful. However, there is still no reliable method to confirm the use of tonsils in tonsils.
  • the present inventors completed the present invention by confirming that Alzheimer's disease can be diagnosed and prevented early by confirming the expression or accumulation of beta-amyloid and Staphylococcus aureus in the palatine tonsils.
  • an object of the present invention is to: a) measuring the expression level or plaque accumulation level of beta-amyloid in a tonsil sample obtained from a subject;
  • step b) information necessary for predicting the onset of Alzheimer's disease, including determining that the higher the expression level or plaque accumulation level of beta-amyloid in step a) compared to the expression level of a normal person, the higher the risk of Alzheimer's disease is to provide a way to provide
  • Another object of the present invention comprises the steps of: a) measuring the expression level or accumulation amount of beta-amyloid in the tonsil sample derived from the subject; and
  • step b) if the expression level or plaque accumulation level of beta-amyloid in step a) is high compared to the expression level of a normal person, comprising the step of determining as a target for tonsillectomy will do
  • the present invention provides the steps of: a) measuring the expression level or plaque accumulation level of beta-amyloid in a tonsil sample obtained from a subject; and
  • step b) information necessary for predicting the onset of Alzheimer's disease, including determining that the higher the expression level or plaque accumulation level of beta-amyloid in step a) compared to the expression level of a normal person, the higher the risk of Alzheimer's disease provides a way to provide
  • the present invention comprises the steps of: a) measuring the expression level of Staphylococcus aureus bacteria in the tonsil sample obtained from the subject; and
  • step b) The higher the expression level of Staphylococcus aureus in step a) compared to the expression level of a normal person, the higher the risk of Alzheimer's disease. Information necessary for predicting the onset of Alzheimer's disease provides a way to provide
  • the present invention comprises the steps of: a) measuring the expression level of Staphylococcus aureus bacteria in the tonsil sample obtained from the subject; and
  • step b) The higher the expression level of Staphylococcus aureus in step a) compared to the expression level of a normal person, the higher the risk of Alzheimer's disease. to provide.
  • the present invention comprises the steps of: a) measuring the expression level or accumulation amount of beta-amyloid in a tonsil sample derived from a subject; and
  • step b) if the expression level or plaque accumulation level of beta-amyloid in step a) is high compared to the expression level of a normal person, comprising the step of determining as a target for tonsillectomy do.
  • the present invention comprises the steps of: a) measuring the expression level or accumulation amount of beta-amyloid in a tonsil sample derived from a subject; and
  • step b) when the expression level or plaque accumulation level of beta-amyloid in step a) is high compared to the expression level of a normal person, it provides a method for predicting the risk of developing Alzheimer's disease, comprising the step of determining that the person has Alzheimer's disease.
  • the present invention comprises the steps of: a) measuring the expression level or accumulation amount of beta-amyloid in a tonsil sample derived from a subject; and
  • step b) If the expression level or plaque accumulation level of beta-amyloid in step a) is high compared to the expression level of a normal person, the method of providing information necessary for the prevention of Alzheimer's disease, comprising the step of determining a target for performing tonsillectomy to provide.
  • the method for measuring the expression level is Western blot, ELISA, radioimmunoassay, radioimmunodiffusion method, Oukteroni immunodiffusion method, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, It may be one or more selected from the group consisting of a complement fixation assay, FACS, and a protein chip method, but is not limited thereto.
  • step a) may further include measuring the expression level of Staphylococcus aureus, but is not limited thereto.
  • the beta-amyloid in step a) may colocalize with Staphylococcus aureus, but is not limited thereto.
  • the subject may be a patient with a tonsil-related disease, but is not limited thereto.
  • the tonsil-related disease may be tonsillitis or an enlarged tonsil, but is not limited thereto.
  • the tonsil sample may be tonsil tissue or tonsil stones, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a substance for detecting the expression level or accumulation amount of beta-amyloid protein; And one or more selected from the group consisting of substances for detecting the expression level of Staphylococcus aureus as a composition for predicting the risk of developing Alzheimer's disease, wherein the composition provides a composition, characterized in that the tonsils as a sample.
  • the present invention provides a substance for detecting the expression level or accumulation amount of beta-amyloid protein; And as a use for predicting the risk of developing Alzheimer's disease of a composition comprising at least one selected from the group consisting of a substance for detecting the expression level of Staphylococcus aureus, the composition is characterized in that the tonsils are used as a sample, use to provide.
  • the present invention provides a substance for detecting the expression level or accumulation amount of beta-amyloid protein; And as a use for preparing an agent for predicting the onset risk of Alzheimer's disease of a composition comprising at least one selected from the group consisting of a substance for detecting the expression level of Staphylococcus aureus, the composition is characterized by using the tonsils as a sample to provide a use.
  • the present invention provides a kit for predicting the risk of developing Alzheimer's disease comprising the composition.
  • the present invention can diagnose Alzheimer's disease through the expression of beta-amyloid and/or Staphylococcus aureus (S. aureus) in the palatine tonsil tissue, and furthermore, it can be used very effectively for the pathogenesis and treatment of Alzheimer's disease.
  • S. aureus Staphylococcus aureus
  • 2A and 2B show the expression level of beta-amyloid and Staphylococcus aureus (S. aureus) using immunofluorescence staining in 7 different tonsil tissues obtained through tonsillectomy and tissues surrounding olfactory obtained through neurosurgery. is a confirmed drawing.
  • 3A and 3B are views confirming the expression of beta-amyloid fragments by western blotting after protein extraction from seven different tonsil tissues obtained through tonsillectomy.
  • 4a to 4j show the relationship between IL-17A and IFN- ⁇ expressing T cells and beta-amyloid expression or IL-17A and IFN- ⁇ expressing T cells that regulate immune responses in 7 different tonsil tissues obtained through tonsillectomy. It is a view confirming the expression relationship of Staphylococcus aureus (S. aureus).
  • Figures 5a to 5d confirm the effect of Staphylococcus aureus (S. aureus) on beta-amyloid expression through H & E staining and immunofluorescence staining in tonsil organoids prepared based on tonsil tissue obtained through tonsillectomy. It is a drawing.
  • the scale bar of FIG. 5a represents 100 ⁇ m.
  • Figures 6a to 6f are results of H&E staining and immunofluorescence staining in human retrodifferentiated stem cell-based brain organoids
  • Figures 6a and 6b are normal organoids and Staphylococcus aureus (S. aureus)
  • the expression of beta-amyloid was confirmed in the treated organoid
  • FIGS. 6c and 6d show the expression of neuronal markers Nestin and Iba-1 in normal organoids and Staphylococcus aureus (S. aureus) fungal-treated organoids.
  • 6e is the result of H & E staining of normal organoids and Staphylococcus aureus (S. aureus) bacteria-treated organoids
  • FIG. 6f is normal organoids and Staphylococcus aureus (S. aureus) Shows the level of beta-amyloid-positive expression cells in fungal-treated organoids.
  • the rightmost scale bar in FIGS. 6A to 6D represents 20 ⁇ m, and the remaining scale bars represent 50 ⁇ m.
  • the scale bar in FIG. 6e represents 500 ⁇ m.
  • H & E staining and immunofluorescence staining in human retrodifferentiated stem cell-based brain organoids according to Staphylococcus aureus treatment concentration (10 MOI or 100 MOI), H & E staining results and beta-amyloid expression was confirmed.
  • the upper scale bar indicates 500 ⁇ m, and the lower scale bar indicates 50 ⁇ m.
  • the present invention comprises the steps of: a) measuring the expression level or plaque accumulation level of beta-amyloid in a tonsil sample obtained from a subject; and
  • step b) information necessary for predicting the onset of Alzheimer's disease, including determining that the higher the expression level or plaque accumulation level of beta-amyloid in step a) compared to the expression level of a normal person, the higher the risk of Alzheimer's disease provides a way to provide
  • the present invention comprises the steps of: a) measuring the expression level or accumulation amount of beta-amyloid in a tonsil sample derived from a subject; and
  • step b) if the expression level or plaque accumulation level of beta-amyloid in step a) is high compared to the expression level of a normal person, comprising the step of determining as a target for tonsillectomy do.
  • the present invention comprises the steps of: a) measuring the expression level of Staphylococcus aureus bacteria in the tonsil sample obtained from the subject; and
  • step b) The higher the expression level of Staphylococcus aureus in step a) compared to the expression level of a normal person, the higher the risk of Alzheimer's disease. Information necessary for predicting the onset of Alzheimer's disease provides a way to provide
  • 'beta amyloid' is one of the major pathological features of Alzheimer's disease, and is a major component of extracellular neurogenic plaques.
  • the beta amyloid may be a beta amyloid oligomer of 15 kDa, but is not limited thereto.
  • 'Staphylococcus aureus' is a gram-positive conditionally aerobic clot-forming cocci that normally colonizes in the nose and skin of healthy humans. Approximately 20% to 30% of the population colonizes with Staphylococcus aureus at any given time point.
  • Staphylococcus aureus bacteria sometimes also referred to as "staff”, “staff. aureus” or “S. aureus”, are bacteria that cause mild infections (e.g., pimples, boils) and systemic infections. It is known as an opportunistic pathogen.
  • the tonsil sample may be tonsil tissue or tonsil stones, but is not limited thereto.
  • tonsil stones refer to yellow granules generated by the accumulation of fragments of epithelial tissue in the tonsils and tonsils.
  • tonsil stones can be easily collected from the tonsils without anesthesia, excision, or surgery, so it is expected that Alzheimer's disease can be easily identified.
  • amyloid beta in the brain starts 15 to 20 years before the onset of clinical symptoms such as dementia or forgetfulness. and can slow or prevent its progression at an early stage. In addition, it can be identified as a patient with Alzheimer's disease in which brain amyloid beta does not accumulate, and treatment strategies for these patients can be different.
  • step a) may further include measuring the expression level of Staphylococcus aureus, but is not limited thereto.
  • beta-amyloid in step a) may colocalize with Staphylococcus aureus, but is not limited thereto.
  • the expression level of beta-amyloid and/or Staphylococcus aureus was confirmed (Examples 1 and 2), Staphylococcus aureus It was confirmed that Reus bacteria colocalized around or inside the beta-amyloid plaque (Example 2).
  • the mucous glands decrease due to atrophy (aging process) of the mucous membranes in the upper respiratory tract, particularly in the nose.
  • atrophy aging process
  • the mucociliary clearnace which cleans the bacteria, viruses, and molds in the nose, also significantly decreases.
  • Decreased mucus clearance can lead to ascending infections that reverse the flow of mucus from pathogens in the upper respiratory tract, particularly in the palatine tonsils in people with enlarged tonsils.
  • the frequency of Staphylococcus aureus was highest in the periolfactory pathway (the space around the olfactory nerve leading to the cribriformplate) or the peritrigeminal pathway (passage around the sensory nerve branch) through the olfactory mucosal epithelium. That is, the present inventors have proven for the first time this hypothesis that an inflammatory response occurs due to a brain infection of Staphylococcus aureus, and a degenerative brain disease occurs due to the accumulation of beta-amyloid protein, a by-product of this inflammatory process.
  • 'protein' is used interchangeably with 'polypeptide' or 'peptide', for example, refers to a polymer of amino acid residues as commonly found in proteins in a natural state.
  • measuring the expression level of the protein in the present invention means measuring the expression (ie, measuring the presence or absence of expression), or measuring the level of qualitative and quantitative change of the protein
  • the measurement can be carried out without limitation, including both qualitative (analysis) and quantitative methods.Types of qualitative and quantitative methods for measuring protein levels are well known in the art. , and the experimental methods described herein are included in this.Specific protein level comparison method for each method is well known in the art. Therefore, the detection of the target protein is the detection of the presence of the target protein, or the increase of the protein expression level (up control) or decrease (down regulation).
  • the meaning of 'increased expression (or high expression)' of a protein means that unexpressed is expressed (that is, undetected is detected) or that it is relatively overexpressed (ie, detected amount) relative to a normal level. means more).
  • the meaning of opposite terms can be understood by those skilled in the art to have opposite meanings according to the above definition.
  • a 'probe' refers to a polynucleotide such as RNA or DNA having a length of several to several hundred base pairs, which can specifically bind to mRNA or cDNA (complementary DNA) of a specific gene. It means a fragment of , and it is labeled so that the presence or absence of the target mRNA or cDNA to bind to, the amount of expression, etc. can be confirmed.
  • a probe complementary to the mRNA of the target protein is subjected to hybridization with a sample of the subject to measure the mRNA expression level of the target protein, thereby transferring fatty acids in the placenta and embryonic tissues or mothers such as preeclampsia.
  • the primer or probe may be chemically synthesized using a phosphoramidite solid support synthesis method or other well-known methods.
  • the primer or probe can be variously modified according to methods known in the art within the range that does not interfere with the hybridization of the target protein with the mRNA. Examples of such modifications include methylation, encapsulation, substitution of one or more homologues of natural nucleotides, and modifications between nucleotides, such as uncharged linkages such as methyl phosphonates, phosphotriesters, phosphoroamidates, carbamates, etc. ) or charged linkages (eg, phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.), and fluorescence or enzymatic binding of a labeling material.
  • the term 'antibody' refers to a specific protein molecule directed against an antigenic site.
  • Antibodies for use in the present invention include monoclonal or polyclonal antibodies, immunologically active fragments (eg, Fab or (Fab)2 fragments), antibody heavy chains, humanized antibodies, antibody light chains, genetically engineered single chain Fv molecules, It may be a chimeric antibody or the like.
  • the polyclonal antibody can be produced by injecting the biomarker protein antigen of the present invention into an animal and collecting blood from the animal to obtain a serum containing the antibody.
  • Such antibodies can be prepared using various warm-blooded animals such as horses, cattle, goats, sheep, dogs, chickens, turkeys, rabbits, mice or rats.
  • Monoclonal antibodies are also known by fusion methods (Kohler and Milstein, European J. Immmnunol. 6:511-519, 1976), recombinant DNA methods (US Pat. No. 4816567) and phage antibody libraries (Clackson et al., Nature, 352, 624-628, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 58:1-597, 1991).
  • the term 'aptamer' refers to a single-stranded nucleic acid (DNA, RNA, or modified nucleic acid) having a stable tertiary structure as a substance capable of specifically binding to an analyte to be detected in a sample. , it is possible to specifically confirm the presence of the target protein in the sample.
  • the aptamer is synthesized by determining the sequence of an oligonucleotide having a selective and high binding affinity for the target protein to be identified, and then the 5' or 3' end of the oligonucleotide is applied to the aptamer.
  • -SH, -COOH, -OH or NH 2 It may be made by transforming it, but is not limited thereto.
  • diagnosing Alzheimer's disease means determining whether there is a possibility of developing Alzheimer's disease in a patient, whether the likelihood of developing Alzheimer's disease is relatively high, or whether Alzheimer's disease has already occurred.
  • the method of the present invention can be used to delay the onset of or prevent the onset of Alzheimer's disease through special and appropriate management as a patient with a high risk of developing Alzheimer's disease for any specific patient.
  • the method of the present invention can be used clinically to determine treatment by diagnosing Alzheimer's disease at an early stage and selecting the most appropriate treatment method.
  • 'predicting Alzheimer's disease onset means determining whether there is a possibility of developing Alzheimer's disease, a relatively high probability of onset, or whether Alzheimer's disease has already occurred for a target subject. For the purpose of this, it may be to determine the presence or high possibility of Alzheimer's disease, or whether Alzheimer's disease has already occurred.
  • predicting the risk of onset by selecting a person with a high risk of onset of Alzheimer's disease, it is possible to provide a treatment method and the like for delaying the onset of the disease through appropriate measures in the early stage.
  • beta-amyloid protein or Staphylococcus aureus is a known protein
  • the antibody used in the present invention can be prepared by a conventional method widely known in the field of immunology using the protein as an antigen.
  • the beta-amyloid protein used as the antigen of the antibody according to the present invention may be naturally extracted or synthesized, or it may be prepared by a recombinant method based on a DNA sequence.
  • a nucleic acid encoding beta-amyloid protein is inserted into an appropriate expression vector, and a host cell is cultured to express beta-amyloid protein in the transformant transformed with the recombinant expression vector, and then the beta-amyloid protein is obtained from the transformant. It can be obtained by recovering the protein.
  • polyclonal antibodies can be produced by injecting a beta amyloid protein antigen into an animal and collecting blood from the animal to obtain a serum containing the antibody.
  • Such antibodies can be prepared using various warm-blooded animals such as horses, cattle, goats, sheep, dogs, chickens, turkeys, rabbits, mice or rats.
  • Monoclonal antibodies are also known by fusion methods (Kohler and Milstein, European J. Immmnunol. 6:511-519, 1976), recombinant DNA methods (US Pat. No. 4816567) and phage antibody libraries (Clackson et al., Nature, 352, 624-628, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 58:1-597, 1991).
  • protein detection in the present invention is not particularly limited, but for example, it can be detected or measured using an antibody that specifically binds to the protein.
  • protein detection in the present invention is not limited thereto, but includes, for example, Western blot, enzyme immunoassay (ELISA), radioimmunoassay, radioimmunodiffusion method, Oukteroni immunodiffusion method, rocket immunoelectrophoresis, immunostaining method ( Any one selected from the group consisting of immunohistochemical staining, immunocytochemical staining, immunofluorescence staining, etc.), immunoprecipitation assay, complement fixation assay, fluorescence activated cell sorter (FACS), surface plasmon resonance (SPR), or protein chip. may be due to
  • the subject sample may be tonsil tissue.
  • the tonsils are organs located in the back of the nose and in the throat. They are rich in lymphocytes and are the organs that carry out the immune function of our body.
  • the tonsils may be palatine tonsils (palatine tonsils), but is not limited thereto.
  • the palatine tonsils are tonsils on the roof of the mouth, and as a kind of lymph node, they are mainly active in children and are known to play a role in preventing infections such as respiratory tract.
  • the term 'tonsillectomy' refers to the removal of tonsils by surgery when daily life becomes inconvenient due to enlarged tonsils, particularly palatine tonsils.
  • both palatine tonsils are excised using an electric cauterizer, and adenoids in the nasopharynx are excised using an endoscopic microcutter.
  • Tonsillectomy can be used to prevent degenerative brain diseases, particularly Alzheimer's disease, that can occur in the aging process in advance, and can be used in adults or the elderly in the sense of removing the reservoir of pathogens, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a substance for detecting the expression level or accumulation amount of beta-amyloid protein; And one or more selected from the group consisting of substances for detecting the expression level of Staphylococcus aureus as a composition for predicting the risk of developing Alzheimer's disease, wherein the composition provides a composition, characterized in that the tonsils as a sample.
  • the detecting substance may be a probe, antibody, or aptamer specific for beta-amyloid or Staphylococcus aureus, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a substance for detecting the expression level or accumulation amount of beta-amyloid protein; And as a use for predicting the risk of developing one or more Alzheimer's disease selected from the group consisting of a substance for detecting the expression level of Staphylococcus aureus, the composition is characterized in that the tonsils as a sample, provides a use.
  • the present invention provides a substance for detecting the expression level or accumulation amount of beta-amyloid protein; And as a use for preparing one or more Alzheimer's disease risk predictors selected from the group consisting of substances for detecting the expression level of Staphylococcus aureus, the composition is characterized in that the tonsils are used as a sample, use to provide.
  • the present invention provides a kit for predicting the risk of developing Alzheimer's disease comprising the composition.
  • the kit of the present invention includes a substance for detecting the expression level or accumulation amount of the beta-amyloid protein of the present invention; And it may further include tools and/or reagents known in the art used for immunological analysis in addition to substances for detecting the expression level of Staphylococcus aureus.
  • any method capable of measuring antigen-antibody binding may be included.
  • Such methods include, for example, immunocytochemistry and immunohistochemistry, radioimmunoassays, Enzyme Linked Immunoabsorbent assay (ELISA), immunoblotting, Parar assay ( Farr assay), immunoprecipitation, latex aggregation, hemagglutination, nephrocytometry, immunodiffusion, counter-current electrophoresis, single-radical immunodiffusion, protein chip and immunofluorescence.
  • Tools and/or reagents used in immunological assays include suitable carriers or supports, labels capable of producing a detectable signal, solubilizing agents, and detergents.
  • the labeling material when it is an enzyme, it may include a substrate capable of measuring enzyme activity and a reaction terminator.
  • the antigen included in the kit of the present invention may be immobilized on a suitable carrier or support using various methods as disclosed in the literature (Antibodies: A Laboratories Manual, Harlow &Lane; Cold Spring Harbor, 1988), and a suitable carrier
  • the support include agarose, cellulose, nitrocellulose, dextran, sephadex, sepharose, liposome, carboxymethyl cellulose, polyacrylamide, polyesterin, gabbro, filter paper, ion exchange resin, plastic film, plastic tube, glass , polyamine-methyl vinyl-ether-maleic acid copolymers, amino acid copolymers, ethylene-maleic acid copolymers, nylon, cups, flat packs, and the like.
  • Other solid substrates include cell culture plates, ELISA plates, tubes, and polymeric membranes.
  • the support may have any possible shape, for example spherical (bead), cylindrical (test tube or well inner surface), planar (sheet, test strip).
  • Labels capable of generating a detectable signal enable qualitative or quantitative measurement of the formation of antigen-antibody complexes, such as enzymes, fluorescent substances, ligands, luminescent substances, microparticles, redox molecules and radioactive substances. Isotopes and the like can be used. Enzymes include ⁇ -glucuronidase, ⁇ -D-glucosidase, urease, peroxidase, alkaline phosphatase, acetylcholinesterase, glycose oxidase, hexokinase, malate dehydrogenase, glucose-6 -Phosphate dehydrogenase, invertase, etc. can be used.
  • fluorescein, isothiocyanate, rhodamine, phycoerythrine, phycocyanin, allophycocyanin, fluorescein isothioxyanate, and the like can be used.
  • Ligands include biotin derivatives, and luminescent materials include acridinium esters, luciferin, and luciferase.
  • Microparticles include colloidal gold and colored latex, and redox molecules include ferrocene, ruthenium complex, viologen, quinone, Ti ion, Cs ion, diimide, 1,4-benzoquinone, hydroquinone, and the like.
  • any one that can be used in an immunological assay may be used.
  • beta-amyloid peptide-specific monoclonal antibody 6E10 (beta-amyloid antibody (6E10, 1:100; BioLegend, 803002)) was used. It was evaluated whether the expression of beta-amyloid, a major causative protein of Alzheimer's disease, was confirmed in human tonsils through immunofluorescence staining.
  • the level of beta-amyloid expression was observed through H&E staining of tissue samples and immunofluorescence staining using beta-amyloid antibody. Specifically, the tissue body fixed in 4% paraformaldehyde was embedded in paraffin to make a block, sectioned to a thickness of 4-5 ⁇ m, and subjected to a deparaffin process, followed by H&E staining and immunofluorescence staining. In order to examine the expression of beta-amyloid, the deparaffinized section was treated with 97% formic acid for 3 minutes, washed 3 times with PBS, and then treated with 1% ordinary goat serum at room temperature for 1 hour to block non-specific binding.
  • Amyloid antibody (6E10, 1:100; BioLegend, 803002) was treated at room temperature for 1 hour, washed with PBS, and a secondary antibody (Alexa Fluor 594-conjugate or 488-conjugate) with fluorescence attached to the primary antibody was added. treated and reacted at room temperature for 1 hour. The reaction was washed with PBS, mounted with a mounting solution, and then the expression level of beta-amyloid was analyzed by immunofluorescence staining using confocal microscopy. DAPI stands for 4',6-diamidino-2-phenylindole for counting staining.
  • beta-amyloid was deposited around the tonsils and lymph nodes in the palatine tonsil tissues of different ages and genders.
  • H&E staining of the tissue it was confirmed through H&E staining of the tissue that it exhibited a lamellar surface epithelium with a multilayer structure.
  • beta-amyloid peptide-specific monoclonal antibody 6E10 and Staphylococcus aureus-specific antibody was used to evaluate how beta-amyloid deposition and bacterial expression appear in human tonsils through immunofluorescence staining.
  • beta-amyloid protein expression and Staphylococcus aureus expression were confirmed in 7 palatine tonsil tissues of different ages and sexes, and Staphylococcus aureus was found in some tissues. It was confirmed that the amyloid was present around or inside the plaque.
  • the tissue obtained by tonsillectomy was ground using RIPA buffer (Thermo Fisher Scientific) to extract proteins, and the expression of soluble beta-amyloid protein in the tissue was confirmed by Western blot method. After electrophoresis using NuPAGE 4-12% (w/v) and 12% (w/v) Bis-Tris Protein Gels (Thermo Fisher Scientific), it was transferred to a nitrocellulose membrane having a 1 ⁇ m pore size. To block non-specific binding, the membrane was blocked with 5% (w/v) milk and incubated at 4°C for 24 hours using beta-amyloid antibody (6E10, 1:100; BioLegend, 803002).
  • beta-amyloid antibody (6E10, 1:100; BioLegend, 803002
  • beta-amyloid protein fragments of various sizes exist in the palatine tonsil tissues of different ages and sexes.
  • oligomers important for beta-amyloid toxicity size of about 15 kDa
  • T cell cytokine expression was analyzed in 7 different palatine tonsil tissues. Specifically, mononuclear cells from each tissue were isolated and stained with fluorescent conjugated monoclonal antibodies such as CD4, IFN- ⁇ , and IL17A, and IFN- ⁇ and IL17A produced from T cells were analyzed using FACS.
  • TMC tonsil mononuclear cells
  • TMC was washed 3 times with sterile PBS and placed in RPMI-1640 medium containing 10% FBS in the presence of GolgiPlug (BD Bioscience), phorbol-12-myristate- Cells were stimulated with 13-acetate (PMA, 50 ng/ml) for 4 hours. And after staining the cells with fluorochrome-labeled CD3 (Biolegend), CD4 (Biolegend) and CD8 (Biolegend) antibodies at 4 ° C. for 30 minutes, the cells were fixed and permeabilized, and labeled with a fluorochrome. was stained with an antibody.
  • IFN- ⁇ and IL-17A cells were resuspended in FACS buffer at 4 °C for 1 hour and obtained through FACS CantoII (BD Biosciences) using DIVA software. All data were analyzed using FlowJo software (FlowJo, LLC, Franklin Lakes, NJ).
  • the small isolated tissue is embedded in matrigel, placed in a cell culture dish, and various grwoth factors are added to advanced DMEM/F12 medium in an incubator at 37°C, 5% CO 2 environment. cultured.
  • Staphylococcus aureus isolated from the patient was treated in a tonsil organoid culture medium prepared using human palatine tonsil tissue and cultured for more than 5 days, and then analyzed by H&E staining and immunofluorescence staining. H&E staining and immunofluorescence staining were performed using the same method as in the above-described Examples.
  • beta-amyloid protein when compared to normal tonsil organoids, the expression of beta-amyloid protein was increased in the fungal-treated organoid, and it was observed that the beta-amyloid protein and the fungus were also expressed.
  • Example 6 Confirmation of expression relationship between beta-amyloid protein and Staphylococcus aureus (S. aureus) in human induced pluripotent stem cell (iPSC)-based brain organoids
  • Staphylococcus aureus present in the palatine tonsils actually infects the brain through the periolfactory route (the space around the olfactory nerve that progresses to the cribriformplate) or the peritrigeminal route (the passage around the sensory nerve branch) and causes Alzheimer's disease
  • brain organoids were prepared with dedifferentiated stem cells, and Staphylococcus aureus was treated thereto.
  • 9 ⁇ 10 3 or 1 ⁇ 10 4 dedifferentiated stem cells induced from human blood were mixed with mTeSR TM medium, and then dispensed in U-bottom 96-well plates, respectively.
  • the seeded cells were induced as spheroids for about 7 days in an incubator at 37° C., 5% CO 2 condition. Thereafter, for the formed spheroids, differentiation was induced for about 5-7 days using a differentiation medium containing N2 supplement, and MEM NEAA (Non-Essential Amino Acids). The medium was changed every 3 to 4 days until a fully mature organoid form was obtained.
  • a shaker was put in an incubator and cultured at a speed of 70 rpm at 37 ° C.
  • Staphylococcus aureus isolated from the patient in a brain organoid culture prepared using human dedifferentiated stem cells was treated at a concentration of 10 MOI for 2 to 3 hours, and analyzed by H&E staining and immunofluorescence staining. H&E staining and immunofluorescence staining were performed using the same method as in the above-described Examples.
  • Antibodies used were as follows: anti-Nestin (1:500, Santa Cruz Biotechnology Inc., SC-23927), anti- ⁇ -III tubulin (1:500, BioLegend, 801201), anti-Iba-1 (1: 500; Wako, Osaka, Japan)
  • beta-amyloid protein was increased in the organoids treated with Staphylococcus aureus compared to normal brain organoids, and beta-amyloid protein and Staphylococcus Aureus was observed to be expressed together.
  • Example 7 Staphylococcus aureus (S. aureus) Concentration-dependently increased expression of beta-amyloid, an Alzheimer's disease-inducing factor Confirmation
  • Example 6 Staphylococcus aureus isolated from a patient was treated with a 10 or 100 MOI concentration for 2 to 3 hours in a brain organoid culture prepared using human retrodifferentiated stem cells, and H&E It was analyzed by staining and immunofluorescence staining. H&E staining and immunofluorescence staining were performed using the same method as in the above-described Examples.
  • the organoid form was larger in the organoid treated with 100 MOI Staphylococcus aureus than in the brain organoid treated with Staphylococcus aureus at a concentration of 10 MOI. It was confirmed that the modified, beta-amyloid protein expression was observed to increase.
  • degenerative brain diseases that may occur in the aging process can be prevented in advance through tonsillectomy, which converts the size of the tonsils in children born with tonsillar hypertrophy into the original structure that is flat on the pharyngeal mucosa. In the sense of removal, it is expected that tonsil surgery can be used in adults and the elderly as well.
  • the present invention can diagnose Alzheimer's disease through the expression of beta-amyloid and / or Staphylococcus aureus (S. aureus) in the palatine tonsil tissue, and furthermore, it is very effectively utilized in the pathogenesis and treatment of Alzheimer's disease. There is availability.

Abstract

본 발명은 구개편도선에서 알츠하이머병 유발인자로서 베타아밀로이드 단백질 검출 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 편도선 시료에서 베타아밀로이드 및/또는 스타필로코커스 아우레우스의 발현을 확인함으로써 알츠하이머병을 진단할 수 있음에 관한 것이다. 본 발명은 구개편도선 조직에서 베타아밀로이드 및/또는 스타필로코커스 아우레우스의 발현을 통해 알츠하이머병을 진단할 수 있고 나아가 알츠하이머병의 발병 기전 및 치료에도 매우 효과적으로 활용될 수 있다.

Description

구개편도선에서 알츠하이머병 유발 인자로서 베타아밀로이드 단백질 검출 및 이의 이용
본 발명은 구개편도선에서 알츠하이머병 유발인자로서 베타아밀로이드 단백질 검출 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 편도선 시료에서 베타아밀로이드 및/또는 스타필로코커스 아우레우스의 발현을 확인함으로써 알츠하이머병을 진단할 수 있음에 관한 것이다.
본 출원은 2020년 11월 3일에 출원된 한국특허출원 제10-2020-0144932호 및 2021년 10월 28일에 출원된 한국특허출원 제10-2021-0145842호에 기초한 우선권을 주장하며, 해당 출원의 명세서 및 도면에 개시된 모든 내용은 본 출원에 원용된다.
퇴행성 뇌질환 (degenerative brain disease)은 나이가 들어감에 따라 발생하는 퇴행성 질환 중 뇌에서 발생하는 질환으로, 현재까지 알려지지 않은 원인에 의해 뇌와 척수의 특정 뇌세포군이 서서히 그 기능을 잃고 뇌세포의 수가 감소하며, 뇌신경계의 정보 전달에 가장 중요한 뇌신경 세포의 사멸, 뇌신경 세포와 뇌신경 세포 사이의 정보를 전달하는 시냅스의 형성이나 기능상의 문제, 뇌신경의 전기적 활동성의 이상적 증상이나 감소로 인해 야기되는 것으로 알려져 있다. 뇌와 척수의 신경세포 들은 그 위치에 따라 매우 다양한 기능을 하고 있어 어느 부위의 신경세포들이 먼저 손상되고 기능을 잃어가는가에 따라, 또 이러한 기능장애가 어떤 형태로 진행되는가에 따라 매우 다양한 임상 양상을 보이게 된다.
퇴행성 뇌질환은 나타나는 주요 증상과 침범되는 뇌 부위를 고려하여 구분할 수 있는데, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 헌팅톤병(Huntington's disease), 다발성경화증, 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis; ALS) (일명 루게릭병(Lou Gehrig's disease) 등이 포함된다.
치매는 노인에게 주로 발생하는 질병으로 나이가 들수록 유병률이 극적으로 증가하는 노인성 질환이다. 미국은 현재 약 200만 명의 치매환자가 있는 것으로 보고되어 있고, 한국도 마찬가지로 2000년 65세 이상 노인의 8.2%인 약 28만 명에서 2005년 8.3%인 약 36만 명에 이르고 있다. 치매를 일으키는 원인으로 뇌의 위축성 변화, 뇌 혈관장애, 뇌의 염증성 장애, korsakoff 증후군과 같은 대사성, 내분비 질환, 종양, 외상, 중독 등이 있으며 이중 뇌위축성 변화에 의한 노년성 치매(Alzheimer's disease, AD)가 가장 높은 비율을 차지하고 있다.
알츠하이머병(Alzheimer's Disease, AD)의 병리학적 특징은 대뇌겉질(cerebral cortex)과 해마(hippocampus)에서 과인산화된 타우(tau) 단백질이 응집되어 나타나는 신경섬유덩어리(neurofibrillary tangle, NFT)와 신경 세포 밖에 축적된 아밀로이드 베타 단백질(amyloid beta peptide Aβ)이 주성분인 노인반이 있다. Aβ 단백질은 신경전달물질인 아세틸콜린을 만드는 대뇌 부분과 대뇌피질의 신경세포를 파괴하여 아세틸콜린의 활성 상태를 감소시키며, 활성산소종(reactive oxygen species :ROS)을 생성하여 산화적 손상을 유발함으로써 신경세포 사멸을 일으키는 것으로 알려져 있다. 또한 산화적 세포사멸뿐만 아니라 염증에 관련하는 기전이 뇌세포 손상을 일으키는 주요한 원인이 된다.
한편, 알츠하이머 질환을 초기에 진단하기 위해 이용되는 생체 마커로는 뇌자기공명영상 촬영, 뇌양전자방출단층촬영(포도당 대사 혹은 아밀로이드, 타우 축적 평가), 뇌척수액검사 (아밀로이드 및 타우 농도 측정) 등이 있다. 이러한 검사는 매우 고가이거나 일부 대형병원에서만 시행할 수 있다는 문제점, 그리고 뇌척수액검사처럼 침습적이고 심리적 거부감이 높다는 한계점이 있다. 이러한 면에서 간편 시료인 편도선 조직을 이용하여 검사가 가능한 방법이 존재한다면, 조기에 알츠하이머 질환의 발병 가능성을 예측하기 위해, 특히 지역사회에서 많은 수의 노인을 대상으로 하는 스크리닝(선별) 검사에서 매우 유용하게 이용될 수 있을 것이다. 하지만 아직 신뢰성 있게 이용할 수 있는 편도선에서 확인할 수 있는 방법은 전무한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 구개편도선 내 베타아밀로이드 및 스타필로코커스 아우레우스 균의 발현 또는 축적을 확인함으로써 알츠하이머병을 조기에 진단하고 예방할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 a) 피검체로부터 수득한 편도선 시료에서 베타아밀로이드의 발현 수준 또는 플라크 축적 수준을 측정하는 단계; 및
b) 상기 a) 단계에서의 베타아밀로이드의 발현 수준 또는 플라크 축적 수준이 정상인의 발현량과 비교하여 높을수록, 알츠하이머병에 걸릴 위험이 높은 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병의 발병 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 a) 피검체 유래의 편도선 시료에서 베타아밀로이드의 발현량 또는 축적량을 측정하는 단계; 및
b) 상기 a) 단계에서의 베타아밀로이드의 발현 수준 또는 플라크 축적 수준이 정상인의 발현량과 비교하여 높으면, 편도선 절제술 대상으로 판정하는 단계를 포함하는, 편도선 절제술 대상 선정에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기한 본 발명의 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 a) 피검체로부터 수득한 편도선 시료에서 베타아밀로이드의 발현 수준 또는 플라크 축적 수준을 측정하는 단계; 및
b) 상기 a) 단계에서의 베타아밀로이드의 발현 수준 또는 플라크 축적 수준이 정상인의 발현량과 비교하여 높을수록, 알츠하이머병에 걸릴 위험이 높은 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병의 발병 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 a) 피검체로부터 수득한 편도선 시료에서 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 균의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
b) 상기 a) 단계에서의 스타필로코커스 아우레우스의 발현 수준이 정상인의 발현량과 비교하여 높을수록, 알츠하이머병에 걸릴 위험이 높은 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병의 발병 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 a) 피검체로부터 수득한 편도선 시료에서 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 균의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
b) 상기 a) 단계에서의 스타필로코커스 아우레우스의 발현 수준이 정상인의 발현량과 비교하여 높을수록, 알츠하이머병에 걸릴 위험이 높은 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병의 발병 위험도 예측 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 a) 피검체 유래의 편도선 시료에서 베타아밀로이드의 발현량 또는 축적량을 측정하는 단계; 및
b) 상기 a) 단계에서의 베타아밀로이드의 발현 수준 또는 플라크 축적 수준이 정상인의 발현량과 비교하여 높으면, 편도선 절제술 대상으로 판정하는 단계를 포함하는, 편도선 절제술 대상 선정에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 a) 피검체 유래의 편도선 시료에서 베타아밀로이드의 발현량 또는 축적량을 측정하는 단계; 및
b) 상기 a) 단계에서의 베타아밀로이드의 발현 수준 또는 플라크 축적 수준이 정상인의 발현량과 비교하여 높으면, 알츠하이머병에 걸린 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병의 발병 위험도 예측 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 a) 피검체 유래의 편도선 시료에서 베타아밀로이드의 발현량 또는 축적량을 측정하는 단계; 및
b) 상기 a) 단계에서의 베타아밀로이드의 발현 수준 또는 플라크 축적 수준이 정상인의 발현량과 비교하여 높으면, 편도선 절제술 수행 대상으로 판정하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병의 예방에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 발현 수준을 측정하기 위한 방법은 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 및 단백질 칩 방법으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현에에서, 상기 a) 단계는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 균의 발현 수준을 측정하는 것을 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 a) 단계의 베타아밀로이드는 스타필로코커스 아우레우스와 공존(colocalization)하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 피검체는 편도선 관련 질환의 환자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 편도선 관련 질환은 편도선염 또는 편도선 비대증일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 편도선 시료는 편도선 조직 또는 편도결석일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 베타아밀로이드 단백질의 발현량 또는 이의 축적량을 검출하는 물질; 및 스타필로코커스 아우레우스의 발현량을 검출하는 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 알츠하이머 병의 발병 위험도 예측용 조성물로서, 상기 조성물은 편도선을 시료로 하는 것을 특징으로 하는, 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 베타아밀로이드 단백질의 발현량 또는 이의 축적량을 검출하는 물질; 및 스타필로코커스 아우레우스의 발현량을 검출하는 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 조성물의 알츠하이머 병의 발병 위험도 예측 용도로서, 상기 조성물은 편도선을 시료로 하는 것을 특징으로 하는, 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 베타아밀로이드 단백질의 발현량 또는 이의 축적량을 검출하는 물질; 및 스타필로코커스 아우레우스의 발현량을 검출하는 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 조성물의 알츠하이머 병의 발병 위험도 예측제를 제조하기 위한 용도로서, 상기 조성물은 편도선을 시료로 하는 것을 특징으로 하는, 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 알츠하이머 병의 발병 위험도 예측용 키트를 제공한다.
본 발명은 구개편도선 조직에서 베타아밀로이드 및/또는 스타필로코커스 아우레우스(S. aureus)의 발현을 통해 알츠하이머병을 진단할 수 있고 나아가 알츠하이머병의 발병 기전 및 치료에도 매우 효과적으로 활용될 수 있다.
도 1은 편도절제술을 통해 얻어진 편도 조직에서 면역형광염색법을 이용해 베타아밀로이드 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2a 및 도 2b는 편도절제술을 통해 얻어진 7개의 서로 다른 편도 조직 및 신경외과 수술을 통해 얻어진 olfactory 주변 조직에서 면역형광염색법을 이용해 베타아밀로이드와 스타필로코커스 아우레우스 (S. aureus)의 발현 정도를 확인한 도면이다.
도 3a 및 도 3b는 편도절제술을 통해 얻어진 7개의 서로 다른 편도 조직에서 단백질 추출 후 베타아밀로이드 fragment 발현을 웨스턴 블럿 방법으로 확인한 도면이다.
도 4a 내지 도 4j는 편도절제술을 통해 얻어진 7개의 서로 다른 편도 조직에 면역반응을 조절하는 IL-17A 및 IFN-γ 발현 T cell과 베타아밀로이드 발현 관계 또는 IL-17A 및 IFN-γ 발현 T cell과 스타필로코커스 아우레우스 (S. aureus)의 발현 관계를 확인한 도면이다.
도 5a 내지 도 5d는 편도절제술을 통해 얻어진 편도 조직을 기반으로 제작된 편도 오가노이드에서 H&E 염색 및 면역형광염색법을 통해 베타아밀로이드 발현에 대한 스타필로코커스 아우레우스 (S. aureus)의 효과를 확인한 도면이다. 도 5a의 Scale bar는 100 μm를 나타냄.
도 6a 내지 도 6f는 사람 역분화 줄기세포 기반 뇌 오가노이드에서 H&E 염색 및 면역형광염색법을 수행한 결과로서, 도 6a 및 도 6b는 정상 오가노이드 및 스타필로코커스 아우레우스 (S. aureus) 균 처리 오가노이드에서 베타아밀로이드의 발현을 확인한 것이며, 도 6c 및 도 6d는 정상 오가노이드 및 스타필로코커스 아우레우스 (S. aureus) 균 처리 오가노이드에서 신경세포 마커인 Nestin 및 Iba-1의 발현을 확인한 것이며, 도 6e는 정상 오가노이드 및 스타필로코커스 아우레우스 (S. aureus) 균 처리 오가노이드를 H&E 염색한 결과이며, 도 6f는 정상 오가노이드 및 스타필로코커스 아우레우스 (S. aureus) 균 처리 오가노이드에서 베타아밀로이드 양성 발현 세포 수준을 나타낸 것이다. 도 6a 내지 도 6d의 가장 오른쪽 Scale bar는 20 μm, 나머지 Scale bar는 50 μm를 나타냄. 도 6e의 Scale bar는 500 μm를 나타냄.
도 7은 스타필로코커스 아우레우스 균 처리 농도(10 MOI 또는 100 MOI)에 따른 사람 역분화 줄기세포 기반 뇌 오가노이드에서 H&E 염색 및 면역형광염색법을 수행한 결과로서, H&E 염색 결과 및 베타아밀로이드의 발현을 확인한 것이다. 상단 Scale bar는 500 μm, 하단 Scale bar는 50 μm를 나타냄.
본 발명은 a) 피검체로부터 수득한 편도선 시료에서 베타아밀로이드의 발현 수준 또는 플라크 축적 수준을 측정하는 단계; 및
b) 상기 a) 단계에서의 베타아밀로이드의 발현 수준 또는 플라크 축적 수준이 정상인의 발현량과 비교하여 높을수록, 알츠하이머병에 걸릴 위험이 높은 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병의 발병 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 a) 피검체 유래의 편도선 시료에서 베타아밀로이드의 발현량 또는 축적량을 측정하는 단계; 및
b) 상기 a) 단계에서의 베타아밀로이드의 발현 수준 또는 플라크 축적 수준이 정상인의 발현량과 비교하여 높으면, 편도선 절제술 대상으로 판정하는 단계를 포함하는, 편도선 절제술 대상 선정에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 a) 피검체로부터 수득한 편도선 시료에서 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 균의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
b) 상기 a) 단계에서의 스타필로코커스 아우레우스의 발현 수준이 정상인의 발현량과 비교하여 높을수록, 알츠하이머병에 걸릴 위험이 높은 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병의 발병 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명에서, '베타 아밀로이드(β amyloid)'는 알츠하이머 병의 주요 병리학적 특징 중 하나로, 세포 외 신경성 플라크의 주요 구성 요소이다. 본 발명에 있어서, 상기 베타 아밀로이드는 15kDa의 베타 아밀로이드 올리고머일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, '스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)'는 통상적으로 건강한 인간의 코 및 피부에서 콜로니화하는 그람 양성 조건적 호기성 응괴 형성 구균이다. 인구의 대략 20% 내지 30%는 임의의 주어진 시점에서 스타필로코커스 아우레우스로 콜로니화된다. 종종 "스타프", "스타프. 아우레우스" 또는 "에스. 아우레우스"로서도 지칭되는 스타필로코커스 아우레우스 세균은 경미한 감염(예를 들면, 뾰루지, 종기) 및 전신 감염을 야기하는 기회감염성 병원체로서 알려져 있다.
현재까지 베타아밀로이드 플라크의 축적의 검출은 알츠하이머성 치매환자의 사후 뇌 조직검사에 의해 확인되었고 알츠하이머성 치매를 확진했다. 최근 뇌영상으로 뇌 아밀로이드베타의 축적을 확인할 수 있는 PIB-PET 등의 기술이 개발되었으나 이는 매우 고가의 검사이고 일부 대학병원에서만 시행할 수 있는 고가의 장비이며 환자에게도 여러 불편을 준다. 따라서, 편도선 시료에서 베타아밀로이드 및/또는 스타필로코커스 아우레우스를 검출함으로써 간단하게 알츠하이머병을 확인할 수 있는 본원에 따른 방법은 그 중요성이 매우 크다.
본 발명에서, 상기 편도선 시료는 편도선 조직 또는 편도결석일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 편도결석이란 편도와 편도 내에서 상피 조직의 파편이 축적되어 생기는 노란 알갱이를 의미한다. 편도결석을 시료로 하는 경우, 편도선와에서 마취, 절제 또는 수술 없이 간편하게 채취가 가능하므로, 간단하게 알츠하이머병을 확인할 수 있을 것으로 기대된다.
뇌 아밀로이드 베타의 축적은 치매나 건망증 등의 임상적 증상이 나타나기 15~20년 전부터 시작되므로 임상적 증상이 없거나 또는 경미한 임상적 증상을 나타내는 환자의 경우에는 편도선 조직 검사를 통해 알츠하이머병을 조기 진단할 수 있고 조기에 그 진행을 늦추거나 막을 수 있다. 또한 뇌 아밀로이드 베타가 축적되지 않은 알츠하이머병 환자로 확인할 수 있어, 이러한 환자에 대한 치료전략을 달리 할 수 있다.
따라서, 상기 a) 단계는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 균의 발현 수준을 측정하는 것을 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 a) 단계의 베타아밀로이드는 스타필로코커스 아우레우스와 공존(colocalization)하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서는 편도선 절제술을 통해 사람의 구개편도조직을 채취한 뒤 베타아밀로이드 및/또는 스타필로코커스 아우레우스의 발현 수준을 확인하였으며(실시예 1 및 2), 스타필로코커스 아우레우스 균이 베타아밀로이드 플라크 주변 또는 내부에 공존(colocalization)하는 것을 확인하였다(실시예 2).
또한, 연령의 증가에 따라 상기도, 특히 코 안의 점막의 위축(노화 과정)으로 인하여 점맥분비샘이 감소하게 된다. 그에 따라 약 1리터 정도의 콧물이 자동으로 비인두 쪽으로 흐르면서 코 안의 균, 바이러스, 곰팡이 등을 청소함으로써 일정한 상재균을 유지하는 점액청소능(mucociliary clearnace) 또한 현저히 감소한다. 점액청소능의 감소로 상기도, 특히 편도선비대증을 갖고 있는 사람의 구개편도선 내 병원균으로부터 점액의 흐름을 역행하는 상행 감염(acending infection)이 일어날 수 있다. 그에 따라 후각점막상피를 통한 periolfactory 경로(cribriformplate(사골판)로 진행하는 olfactory nerve 주위의 공간)이나 peritrigeminal 경로(감각신경분지 주변 통로)에서 스타필로코커스 아우레우스의 빈도가 가장 높았다. 즉, 스타필로코커스 아우레우스의 뇌 감염으로 인한 염증반응이 발생하고 이 염증 과정의 부산물인 베타 아밀로이드 단백질의 축적으로 인한 퇴행성 뇌질환이 발생한다는 이러한 가설을 본 발명자들은 최초로 입증하였다.
본 발명에서, '단백질'은 '폴리펩타이드(polypeptide)' 또는 '펩타이드(peptide)'와 호환성 있게 사용되며, 예컨대, 자연 상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다.
본 발명에서, '검출'은 목적하는 물질(본 발명에서의 마커 단백질의 존재(발현) 여부를 측정 및 확인하는 것, 또는 목적하는 물질의 존재 수준(발현 수준)의 변화를 측정 및 확인하는 것을 모두 포함하는 의미이다. 같은 맥락에서, 본 발명에서 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 것은 발현 여부를 측정하는 것(즉, 발현 유무를 측정하는 것), 또는 상기 단백질의 질적, 양적 변화 수준을 측정하는 것을 의미한다. 상기 측정은 정성적인 방법(분석)과 정량적인 방법을 모두 포함하여 제한 없이 수행될 수 있다. 단백질 수준의 측정에 있어서 정성적 방법과 정량적 방법의 종류는 당업계에 잘 알려져 있으며, 본 명세서에서 기술한 실험법들이 이에 포함된다. 각 방법 별로 구체적 단백질 수준 비교 방식은 당업계에 잘 알려져 있다. 따라서 상기 목적 단백질 검출은 목적 단백질의 존재 여부 검출, 또는 상기 단백질 발현량의 증가(상향 조절) 또는 감소(하향 조절)를 확인하는 것을 포함하는 의미이다.
본 발명에서, 단백질의 '발현 증가(또는 고발현)'라는 의미는 발현되지 않던 것이 발현된 것(즉, 검출되지 않던 것이 검출된 것) 또는 정상적인 수준보다 상대적으로 과발현된 것(즉, 검출량이 많아지는 것)을 의미한다. 이의 반대적 용어의 의미는 당업자라면 상기 정의에 준하여, 반대의미를 가지는 것으로 이해 가능하다.
본 발명에서, '프로브(probe)'는 특정 유전자의 mRNA나 cDNA(complementary DNA)에 특이적으로 결합할 수 있는 짧게는 수개 내지 길게는 수백 개의 염기(base pair) 길이의 RNA 또는 DNA 등 폴리뉴클레오티드의 단편을 의미하며, 표지(labeling)되어 있어서 결합하는 대상 mRNA나 cDNA의 존재 유무, 발현양 등을 확인할 수 있다. 본 발명의 목적을 위해서는 목적 단백질의 mRNA에 상보적인 프로브를 피검체의 시료와 혼성화 반응(hybridization)을 수행하여 목적 단백질의 mRNA의 발현양을 측정함으로써 태반 및 배아 조직에서 지방산 이동 또는 자간전증 등의 모체의 이상에 이용할 수 있다. 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 기술에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 본 발명에서 상기 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트(phosphoramidite) 고체지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 또한 프라이머 또는 프로브는 목적 단백질의 mRNA와의 혼성화를 방해하지 않는 범위에서 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 다양하게 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 그리고 형광 또는 효소를 이용한 표지 물질(labeling material)의 결합 등이 있다.
본 발명에서, '항체'란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명에 사용되는 항체는 단클론 또는 다클론 항체, 면역학적으로 활성인 단편(예를 들어, Fab 또는 (Fab)2 단편), 항체 중쇄, 인간화 항체, 항체 경쇄, 유전자 조작된 단일쇄 Fν 분자, 키메릭 항체 등일 수 있다. 예를 들어, 다클론 항체는 본 발명의 바이오마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 항체는 말, 소, 염소, 양, 개, 닭, 칠면조, 토끼, 마우스 또는 래트와 같은 여러 온혈 동물을 이용하여 제조할 수 있다.
단클론 항체도 공지된 융합방법(fusion method)(Kohler and Milstein, European J. Immnunol. 6:511-519, 1976), 재조합 DNA 방법(미국특허 제4816567호) 및 파지 항체 라이브러리(Clackson et al., Nature, 352, 624-628, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 58:1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다.
본 발명에서, ‘앱타머’란 시료 내의 검출하고자 하는 분석물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질로 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지는 단일 가닥 핵산(DNA, RNA, 또는 변형 핵산)을 의미하는 것으로, 특이적으로 시료 내의 표적 단백질의 존재를 확인할 수 있다. 앱타머의 제조는 일반적인 앱타머의 제조 방법에 따라, 확인하고자 하는 표적 단백질에 대해 선택적이고 높은 결합력을 가지는 올리고뉴클레오티드의 서열을 결정하여 합성한 후, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단이나 3' 말단을 앱타머 칩의 관능기에 결합할 수 있도록, -SH, -COOH, -OH 또는 NH2로 변형을 시킴으로써 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, "알츠하이머병 진단" 이란 환자에 대하여 알츠하이머병이 발병할 가능성이 있는지, 알츠하이머병이 발병할 가능성이 상대적으로 높은지, 또는 알츠하이머병이 이미 발병하였는지 여부를 판별하는 것을 의미한다. 본 발명의 방법은 임의의 특정 환자에 대한 알츠하이머병 발병 위험도가 높은 환자로써 특별하고 적절한 관리를 통하여 발병 시기를 늦추거나 발병하지 않도록 하는데 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 알츠하이머병을 조기에 진단하여 가장 적절한 치료방식을 선택함으로써 치료를 결정하기 위해 임상적으로 사용될 수 있다.
본 발명에서, '알츠하이머병 발병 예측'이란, 목적하는 대상체에 대하여 알츠하이머병이 발병할 가능성이 있는지, 발병 가능성이 상대적으로 높은지 또는 이미 알츠하이머병이 발병 하였는지 여부를 판별하는 것을 의미하는 것으로, 본 발명의 목적 상 알츠하이머병의 발병 가능성이 존재 또는 높거나, 이미 알츠하이머병이 발병한 경우를 판별하는 것일 수 있다. 이와 같이, 발병 위험성을 예측함으로써 알츠하이머병의 발병 위험성이 높은 사람을 선별함으로써, 초기에 적절한 조치를 통해 발병 시기를 늦추는 치료 방법 등을 제공할 수 있다.
베타 아밀로이드 단백질 또는 스타필로코커스 아우레우스 균은 공지된 단백질이므로 본 발명에 사용되는 항체는 단백질을 항원으로 하여 면역학 분야에서 널리 알려져 있는 통상의 방법으로 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 항체의 항원으로서 사용되는 베타 아밀로이드 단백질은 천연에서 추출하거나 합성될 수 있으며 DNA 서열을 기초로 하여 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다. 유전자 재조합 기술을 이용할 경우 베타 아밀로이드 단백질을 코딩하는 핵산을 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체에서 베타 아밀로이드 단백질이 발현되도록 숙주 세포를 배양한 후 형질전환체로부터 베타 아밀로이드 단백질을 회수함으로써 수득될 수 있다.
예를 들어, 다클론 항체는 베타 아밀로이드 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 항체는 말, 소, 염소, 양, 개, 닭, 칠면조, 토끼, 마우스 또는 래트와 같은 여러 온혈 동물을 이용하여 제조할 수 있다.
단클론 항체도 공지된 융합방법(fusion method)(Kohler and Milstein, European J. Immnunol. 6:511-519, 1976), 재조합 DNA 방법(미국특허 제4816567호) 및 파지 항체 라이브러리(Clackson et al., Nature, 352, 624-628, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 58:1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다.
본 발명에서 단백질의 검출은 당업계에 공지된 단백질 발현 수준 측정법에 의한 것이라면 그 방법이 특별히 제한되지 않으나, 일례로 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 검출 또는 측정할 수 있다. 구체적으로 본 발명에서 단백질 검출은, 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 웨스턴 블랏, 효소면역분석법(ELISA), 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 면역염색법(면역조직화학 염색, 면역세포화학염색 및 면역형광염색 등 포함), 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS(Fluorescence activated cell sorter), SPR(surface plasmon resonance) 또는 단백질칩으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나에 의한 것일 수 있다.
본 발명에서, 상기 피검체 샘플은 편도선(Tonsil) 조직일 수 있다. 편도선이란 목안, 코 뒷부분에 위치한 기관으로 림프구가 풍부하여 우리 몸의 면역기능을 수행하는 기관이다.
본 발명에서, 상기 편도선은 구개편도(입천장편도, palatine tonsil)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 구개편도는 입천장에 있는 편도로, 일종의 림프절로써 주로 소아에서 활동이 왕성하며, 호흡기 등의 감염에 대해 예방하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서, '편도선절제술(tonsillectomy)'이란 편도, 특히 구개편도가 비대해져 일상 생활이 불편할 경우 수술로써 편도를 절제하는 것을 말한다. 일반적으로 전기 소작기를 이용하여 양측 구개편도를 절제하며 내시경 하 미세절삭기를 이용하여 비인두의 아데노이드를 절제한다. 편도선 절제술을 통하여 노화 과정에서 발생할 수 있는 퇴행성 뇌질환, 특히 알츠하이머병을 미리 예방할 수 있고, 병원균의 저장소를 제거하는 의미에서 성인이나 노인에서도 편도선 수술이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 베타아밀로이드 단백질의 발현량 또는 이의 축적량을 검출하는 물질; 및 스타필로코커스 아우레우스의 발현량을 검출하는 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 알츠하이머 병의 발병 위험도 예측용 조성물로서, 상기 조성물은 편도선을 시료로 하는 것을 특징으로 하는, 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 상기 검출하는 물질은 베타아밀로이드 또는 스타필로코커스 아우레우스에 특이적인 프로브, 항체, 또는 앱타머일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 베타아밀로이드 단백질의 발현량 또는 이의 축적량을 검출하는 물질; 및 스타필로코커스 아우레우스의 발현량을 검출하는 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 알츠하이머 병의 발병 위험도 예측 용도로서, 상기 조성물은 편도선을 시료로 하는 것을 특징으로 하는, 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 베타아밀로이드 단백질의 발현량 또는 이의 축적량을 검출하는 물질; 및 스타필로코커스 아우레우스의 발현량을 검출하는 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 알츠하이머 병의 발병 위험도 예측제를 제조하기 위한 용도로서, 상기 조성물은 편도선을 시료로 하는 것을 특징으로 하는, 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 알츠하이머 병의 발병 위험도 예측용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 본 발명의 베타아밀로이드 단백질의 발현량 또는 이의 축적량을 검출하는 물질; 및 스타필로코커스 아우레우스의 발현량을 검출하는 물질 이외에 면역학적 분석에 사용되는 당 업계에 공지된 도구 및/또는 시약을 추가로 포함할 수 있다.
상기에서 면역학적 분석은 항원과 항체의 결합을 측정할 수 있는 있는 방법이라면 모두 포함될 수 있다. 이러한 방법들은 당 분야에 공지되어 있으며 예를 들어, 면역세포화학 및 면역조직화학, 방사선 면역 분석법(radioimmunoassays), 효소결합면역법(ELISA: Enzyme Linked Immunoabsorbent assay), 면역 블롯(immunoblotting), 파아르 분석법(Farr assay), 면역침강, 라텍스 응집, 적혈구 응집, 비탁계법, 면역확산법, 카운터-전류 전기영동법, 단일 라디칼 면역확산법, 단백질 칩 및 면역형광법이 있다.
면역학적 분석에 사용되는 도구 및/또는 시약으로는 적합한 담체 또는 지지체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제가 포함된다. 또한, 표지물질이 효소인 경우에는 효소활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다.
본 발명의 키트에 포함되는 항원은 바람직하게는 적합한 담체 또는 지지체에 문헌에 개시된 바와 같은 다양한 방법을 이용하여 고정될 수 있으며(Antibodies: A Labotory Manual, Harlow ＆ Lane;Cold SpringHarbor, 1988), 적합한 담체 또는 지지체의 예로는 아가로스, 셀룰로즈, 니트로셀룰로즈, 덱스트란, 세파덱스, 세파로즈, 리포솜, 카복시메틸 셀룰로즈, 폴리아크릴아미드, 폴리스테린, 반려암, 여과지, 이온교환수지, 플라스틱 필름, 플라스틱 튜브, 유리, 폴리아민-메틸 비닐-에테르-말레산 공중합체, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레산 공중합체, 나일론, 컵, 플랫 팩(flat packs) 등이 포함된다. 그 외의 다른 고체 기질로는 세포 배양 플레이트, ELISA 플레이트, 튜브 및 폴리머성 막이 있다. 상기 지지체는 임의의 가능한 형태, 예를 들어 구형(비드), 원통형(시험관 또는 웰 내면), 평면형(시트, 시험 스트립)을 가질 수 있다.
검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지는 항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정가능하게 하며, 이의 예로는 효소, 형광물질, 리간드, 발광물질, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사성 동위원소 등을 사용할 수 있다. 효소로는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라아제, 글리코즈 옥시다아제, 헥소키나제, 말레이트 디하이드로게나아제, 글루코스-6-인산디하이드로게나아제, 인버타아제 등을 사용할 수 있다. 형광물질로는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, 플루오르신이소티옥시아네이트 등을 사용할 수 있다. 리간드로는 바이오틴 유도체 등이 있으며, 발광물질로는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있다. 미소입자로는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있고 레독스 분자로는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논 등이 있다. 그러나 상기 예시된 것들 외에 면역학적 분석법에 사용할 수 있은 것이라면 어느 것이라도 사용할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본 발명의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 사람 구개편도조직에서 베타아밀로이드 발현 확인
편도선 절제술을 통해 사람 구개편도조직을 채취한 후, 파라핀이 내장된 샘플을 제작하고 베타아밀로이드 펩타이드 특이적인 단일 클론 항체 6E10(베타아밀로이드 항체 (6E10, 1:100; BioLegend, 803002))을 이용하여 면역형광 염색을 통해 사람 편도조직에서 알츠하이머병의 주요 원인 단백질인 베타아밀로이드 발현이 확인되는지를 평가하였다.
조직 샘플을 H&E 염색과 베타아밀로이드 항체를 이용한 면역형광염색을 통해 베타아밀로이드 발현 정도를 관찰하였다. 구체적으로, 4% 파라포름알데히드에 고정된 조직체를 파라핀에 포매하여 블록을 만들고 4-5 ㎛ 두께로 섹션하여 탈파라핀(deparaffin) 과정을 거친 후 H&E 염색과 면역형광염색을 실시하였다. 베타아밀로이드 발현을 알아보기 위해 탈파라핀 과정을 거친 파라핀 섹션을 97% 포름산으로 3분을 처리하고 PBS로 3차례 세척 후 1％ 보통 염소 세럼을 상온에서 1시간 동안 처리하여 비특이적 binding을 블로킹한 후 베타아밀로이드 항체 (6E10, 1:100; BioLegend, 803002)를 상온에서 1시간 처리, PBS로 세정 하고, 1차 항체에 대한 형광이 붙은 2차 항체 (Alexa Fluor 594-컨쥬게이트 또는 488-컨쥬게이트)를 처리하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 상기 반응물을 PBS로 세정을 하고, 마운팅 (mounting) 용액으로 마운팅을 한 후 공초점현미경(confocal microscopy)을 사용하여 베타아밀로이드 발현 정도를 면역형광염색법으로 분석하였다. DAPI는 counting staining용으로 4',6-diamidino-2-phenylindole를 의미한다.
도 1의 환자 특징
나이 성별 편도선질환
#1 7 여 편도염증
#2 49 여 편도염증
#3 52 여 편도염증
#4 53 여 편도염증
도 1에 나타난 바와 같이, 서로 다른 연령 및 성별의 구개편도조직 내의 편도선과 림프절 주변에서 베타아밀로이드가 침착되어 있는 것을 확인하였다. 또한, 조직의 H&E 염색을 통해 다층 구조의 층상 표면 상피를 나타냄을 확인하였다.
실시예 2. 사람 구개편도조직에서 베타아밀로이드 및 스타필로코커스 아우레우스 (S. aureus) 발현 확인
편도선 절제술을 통해 사람 구개편도조직을 채취한 후, 파라핀이 내장된 샘플을 제작하고 베타아밀로이드 펩타이드 특이적인 단일 클론 항체 6E10 및 스타필로코커스 아우레우스 균 특이적인 항체(anti-staphylococcus aureus, Abcam)를 이용하여 면역형광 염색을 통해 사람 편도조직에서 베타아밀로이드 침착 및 균 발현이 어떻게 나타나는지를 평가하였다.
도 2a의 환자 특징
나이 성별 편도선질환
#1 9 여 편도염증
#2 11 남 편도염증
#3 16 여 편도염증
#4 43 여 편도염증
#5 7 여 편도염증
#6 8 여 편도염증
#7 8 남 편도염증
도 2a에 나타난 바와 같이, 서로 다른 연령 및 성별의 7개 구개편도조직에서 베타아밀로이드 단백질 발현 및 스타필로코커스 아우레우스 균 발현을 확인하였고 그 중 일부 조직에서 스타필로코커스 아우레우스 균이 베타아밀로이드 플라크 주변 또는 내부에 존재하는 것을 확인하였다.
뿐만 아니라, 도 2b에 나타난 바와 같이 나이가 많은 뇌종양 환자의 후각 점막 상피 조직(olfactory mucosal epithelium tissue) 주변에서 채취한 조직을 이용해 면역형광 염색을 실시한 결과 베타아밀로이드 단백질 발현 및 스타필로코커스 아우레우스 균 발현이 높게 나타났으며 균의 발현이 베타아밀로이드 단백질이 침착된 부분에서 관찰되는 것을 확인하였다.
실시예 3. 사람 구개편도조직에서 베타아밀로이드 단백질 단편 (fragment)의 발현 확인
편도선 절제술을 통해 사람 구개편도조직을 채취 한 후, RIPA lysis buffer를 이용해 조직으로부터 단백질을 추출하고 웨스턴 블롯팅 방법을 이용해 구개편도조직에서 베타아밀로이드 단백질 단편의 발현 양상을 확인하였다.
편도선 절제술로 얻은 조직을 RIPA 버퍼 (Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 조직을 갈아 단백질을 추출한 후 조직에서 용해성(soluble) 베타아밀로이드 단백질 발현을 웨스턴 블롯 방법으로 확인하였다. NuPAGE 4-12% (w/v) and 12% (w/v) Bis-Tris Protein Gels (Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 전기영동을 실시한 후 1 μm 기공 사이즈의 니트로셀룰로스 막으로 트랜스퍼 하였다. 비특이적 결합을 블록킹하기 위하여 막을 5% (w/v) 밀크로 블로킹 하고 베타아밀로이드 항체 (6E10, 1:100; BioLegend, 803002)를 이용하여 4℃에서 24시간 배양하였다. Tween 20이 포함된 TBS 용액 (TBST)으로 3회 세척한 후 1차 항체에 대한 HRP가 붙은 2차 항체를 이용하여 상온에서 1시간 반응시키고 TBST 용액으로 3회 세척 후 ECL (enhanced chemiluminescence) detection reagents (Thermo Fisher Scientific)를 이용해 단백질 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 3a 및 도 3b에 나타난 바와 같이, 서로 다른 연령 및 성별의 구개편도 조직에 다양한 크기의 베타아밀로이드 단백질 단편들이 존재하는 것을 확인하였으며 그 중에서도 베타아밀로이드 독성에 중요한 올리고머 (약 15kDa 크기)의 발현이 개체마다 다르다는 것을 확인하였다.
실시예 4. 사람 구개편도조직에서 베타아밀로이드 단백질 및 스타필로코커스 아우레우스 (S. aureus) 발현과 T cell 관계 확인
편도선 절제술을 통해 사람 구개편도조직을 채취 한 후, 7개의 서로 다른 구개편도 조직에서 세포 내 T 세포 사이토카인 발현을 분석하였다. 구체적으로, 각 조직의 단핵세포를 분리한 후 CD4, IFN-γ, IL17A 등의 형광 접합 단일 클론 항체로 염색하고 FACS를 이용하여 T 세포에서 생산된 IFN-γ, IL17A을 분석하였다.
편도선 절제술로 얻은 7 개의 조직을 잘게 잘라서 10 % FBS가 포함된 RPMI-1640 배지에 넣고 세포 스트레이너를 이용하여 세포를 얻고 Ficoll-HypaqueTM를 사용하여 밀도 구배 원심 분리 방법으로 편도 단핵 세포 (TMC)만을 분리하였다.
멸균된 PBS로 TMC를 3 회 세척하고 10 % FBS가 포함된 RPMI-1640 배지에 담아 GolgiPlug (BD Bioscience)의 존재하에 이오노마이신 (500 ng /ml)이 추가된 포르볼-12-미리스테이트-13-아세테이트 (PMA, 50ng /ml)로 4시간 동안 세포에 자극을 주었다. 그리고 플루오로크롬(fluorochrome)이 표지된 CD3 (Biolegend), CD4 (Biolegend) 및 CD8 (Biolegend) 항체를 4 ℃에서 30 분 동안 세포에 염색한 후 세포를 고정 및 투과(permeabilized)시키고, 형광 색소 표지된 항체로 염색하였다. IFN-γ, IL-17A을 4 ℃에서 1 시간 동안 세포를 FACS buffer에 재현탁하고 DIVA 소프트웨어를 사용하여 FACS CantoⅡ (BD Biosciences)를 통해 획득하였다. 모든 데이터는 FlowJo 소프트웨어 (FlowJo, LLC, Franklin Lakes, NJ)를 사용하여 분석하였다.
도 4a 내지 도 4j에 나타난 바와 같이, T 세포의 활성이 높을수록 베타아밀로이드 발현이 높거나 균의 발현이 높다는 결과를 확인할 수 있었다. 따라서, T 세포의 활성 정도와 베타아밀로이드 단백질 발현 또는 스타필로코커스 아우레스 균의 발현이 관계되어 있음을 확인하였다.
실시예 5. 사람 편도조직 기반 오가노이드에서 베타아밀로이드 단백질과 스타필로코커스 아우레우스 (S. aureus) 발현 관계 확인
편도선 절제술을 통해 사람 구개편도조직을 채취 한 후, 작게 분리한 조직을 matrigel에 내장하여 세포배양접시에 담고 advanced DMEM/F12 배지에 다양한 grwoth factor 들을 넣어 37℃, 5% CO2 환경의 배양기에서 배양하였다. 사람 구개편도조직을 이용하여 제작된 편도 오가노이드 배양액에 환자에서 분리한 스타필로코커스 아우레우스 균을 처리하고 5일 이상 배양한 후 H&E 염색 및 면역형광염색으로 분석하였다. H&E 염색 및 면역형광염색 방법은 상술된 실시예들과 동일한 방법을 사용하였다.
도 5a에 나타난 바와 같이, 스타필로코커스 아우레우스 균을 처리 후, H&E 염색으로 인간 편도 오가노이드의 형태를 관찰하였을 때, 균을 처리하지 않은 상태에서 배양된 편도 오가노이드와 달리, 균을 처리한 경우 편도 오가노이드 조직학적 손상이 관찰되었다.
도 5b 내지 도 5d에 나타난 바와 같이, 정상 편도 오가노이드와 비교했을 때 균을 처리한 오가노이드에서 베타아밀로이드 단백질 발현이 증가하였으며, 베타아밀로이드 단백질과 균이 함께 발현하는 것이 관찰되었다.
실시예 6. 사람 유도만능줄기세포(역분화 줄기세포, iPSC) 기반 뇌 오가노이드에서 베타아밀로이드 단백질과 스타필로코커스 아우레우스 (S. aureus) 발현 관계 확인
구개편도선에 존재하는 스타필로코커스 아우레우스 균이 periolfactory 경로(cribriformplate(사골판)로 진행하는 olfactory nerve 주위의 공간)나 peritrigeminal 경로(감각신경분지 주변 통로)를 통해 실제 뇌에 감염되어 알츠하이머병을 유발하는지 확인하기 위하여, 역분화 줄기세포로 뇌 오가노이드를 제작하고, 그에 스타필로코커스 아우레우스 균을 처리하였다.
먼저, 인간의 혈액에서 유도한 역분화 줄기세포 9 × 103개 또는 1 × 104개를 mTeSRTM 배지와 섞은 후, U 바텀(bottom) 96-well 플레이트에 각각 분주하였다. 분주된 세포는 37℃, 5 % CO2 조건의 배양기에서 약 7일간 스페로이드로 유도되었다. 그 후, 형성된 스페로이드에 대하여, N2 supplement, 및 MEM NEAA(Non-Essential Amino Acids)가 포함된 분화 배지를 이용하여 약 5-7일간 분화를 유도하였다. 완전한 성숙된 오가노이드 형태가 될 때까지 배지를 3 내지 4일마다 교환해주었다. 또한, 셰이커(shaker)를 배양기에 넣어 70 rpm의 속도로 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 약 30 내지 40일간 배양하였다 (대한민국 등록특허 10-2285600호 참고). 사람 역분화 줄기세포를 이용하여 제작된 뇌 오가노이드 배양액에 환자에서 분리한 스타필로코커스 아우레우스 균을 10 MOI 농도로 2시간 내지 3시간 동안 처리하고, H&E 염색 및 면역형광염색으로 분석하였다. H&E 염색 및 면역형광염색 방법은 상술된 실시예들과 동일한 방법을 사용하였다. 사용한 항체는 다음과 같다: anti-Nestin (1:500, Santa Cruz Biotechnology Inc., SC-23927), anti-β-III tubulin (1:500, BioLegend, 801201), anti-Iba-1 (1:500; Wako, Osaka, Japan)
도 6a, 도 6b, 및 도 6e에 나타난 바와 같이, 정상 뇌 오가노이드와 비교했을 때 스타필로코커스 아우레우스 균을 처리한 오가노이드에서 베타아밀로이드 단백질 발현이 증가하였으며, 베타아밀로이드 단백질과 스타필로코커스 아우레우스 균이 함께 발현하는 것이 관찰되었다.
또한, 도 6c 및 도 6d에 나타난 바와 같이, 정상 뇌 오가노이드와 비교했을 때 스타필로코커스 아우레우스 균을 처리한 오가노이드에서 신경세포 관련 마커인 Nestin 및 β-tubulin Ⅲ 발현이 감소되었으며 염증세포 마커인 Iba-1의 발현이 증가되는 것을 확인하였다.
또한, 도 6e에 나타난 바와 같이, 균을 처리한 오가노이드는 정상 오가노이드와 비교하여 형태가 크게 변형되는 것을 확인하였다.
실시예 7. 스타필로코커스 아우레우스 (S. aureus) 농도에 의존적으로 증가되는 알츠하이머병 유발 인자인 베타아밀로이드의 발현 확인
실시예 6과 동일한 방법으로 사람 역분화 줄기세포를 이용하여 제작된 뇌 오가노이드 배양액에 환자에서 분리한 스타필로코커스 아우레우스 균을 10 또는 100 MOI 농도로 2시간 내지 3시간 동안 처리하고, H&E 염색 및 면역형광염색으로 분석하였다. H&E 염색 및 면역형광염색 방법은 상술된 실시예들과 동일한 방법을 사용하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 10 MOI 농도의 스타필로코커스 아우레우스 균을 처리한 뇌 오가노이드보다 100 MOI 스타필로코커스 아우레우스 균을 처리한 오가노이드에서 오가노이드의 형태가 더 크게 변형되는 것을 확인하였으며, 베타아밀로이드 단백질 발현이 증가하는 것이 관찰되었다.
상기 결과들을 기초로 구개편도선에 존재하는 스타필로코커스 아우레우스 균이 실제 뇌에 감염되어 알츠하이머 병을 유발하는 것을 명확히 확인하였다.
즉, 구개편도선 내에 다량으로 존재하는 병원균인 스타필로코커스 아우레우스가 야기했던 염증반응의 결과로 구개편도선 내에 베타아밀로이드의 축적이 야기되며, 베타아밀로이드의 축적으로 인하여 알츠하이머병이 발생하는 것으로 판단된다.
따라서, 본 발명을 통하여, 편도선비대증을 갖고 태어난 소아의 편도선의 크기를 인두점막에 편편한 원래 구조로 변환시키는 편도선 절제술을 통하여 노화 과정에서 발생할 수 있는 퇴행성 뇌질환을 미리 예방할 수 있고, 병원균의 저장소를 제거하는 의미에서 성인이나 노인에서도 편도선 수술이 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명은 구개편도선 조직에서 베타아밀로이드 및/또는 스타필로코커스 아우레우스(S. aureus)의 발현을 통해 알츠하이머병을 진단할 수 있고 나아가 알츠하이머병의 발병 기전 및 치료에도 매우 효과적으로 활용있어, 산업상 이용가능성이 있다.

Claims (20)

  1. a) 피검체로부터 수득한 편도선 시료에서 베타아밀로이드의 발현 수준 또는 플라크 축적 수준을 측정하는 단계; 및
    b) 상기 a) 단계에서의 베타아밀로이드의 발현 수준 또는 플라크 축적 수준이 정상인의 발현량과 비교하여 높을수록, 알츠하이머병에 걸릴 위험이 높은 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병의 발병 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 발현 수준을 측정하기 위한 방법은 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 및 단백질 칩 방법으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 a) 단계는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 균의 발현 수준을 측정하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 a) 단계의 베타아밀로이드는 스타필로코커스 아우레우스와 공존(colocalization)하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 피검체는 편도선 관련 질환의 환자인 것을 특징으로 하는, 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 편도선 관련 질환은 편도선염 또는 편도선 비대증인 것을 특징으로 하는, 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 편도선 시료는 편도선 조직 또는 편도결석인 것을 특징으로 하는, 방법.
  8. a) 피검체 유래의 편도선 시료에서 베타아밀로이드의 발현량 또는 축적량을 측정하는 단계; 및
    b) 상기 a) 단계에서의 베타아밀로이드의 발현 수준 또는 플라크 축적 수준이 정상인의 발현량과 비교하여 높으면, 편도선 절제술 대상으로 판정하는 단계를 포함하는, 편도선 절제술 대상 선정에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 발현 수준을 측정하기 위한 방법은 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 및 단백질 칩 방법으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 방법.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 a) 단계는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 균의 발현 수준을 측정하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 피검체는 편도선 관련 질환의 환자인 것을 특징으로 하는, 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 편도선 관련 질환은 편도선염 또는 편도선 비대증인 것을 특징으로 하는, 방법.
  13. a) 피검체로부터 수득한 편도선 시료에서 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 균의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    b) 상기 a) 단계에서의 스타필로코커스 아우레우스의 발현 수준이 정상인의 발현량과 비교하여 높을수록, 알츠하이머병에 걸릴 위험이 높은 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병의 발병 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 발현 수준을 측정하기 위한 방법은 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 및 단백질 칩 방법으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 방법.
  15. a) 피검체 유래의 편도선 시료에서 베타아밀로이드의 발현량 또는 축적량을 측정하는 단계; 및
    b) 상기 a) 단계에서의 베타아밀로이드의 발현 수준 또는 플라크 축적 수준이 정상인의 발현량과 비교하여 높으면, 알츠하이머병에 걸린 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병의 발병 위험도 예측 방법.
  16. a) 피검체로부터 수득한 편도선 시료에서 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 균의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    b) 상기 a) 단계에서의 스타필로코커스 아우레우스의 발현 수준이 정상인의 발현량과 비교하여 높을수록, 알츠하이머병에 걸릴 위험이 높은 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병의 발병 위험도 예측 방법.
  17. 베타아밀로이드 단백질의 발현량 또는 이의 축적량을 검출하는 물질; 및 스타필로코커스 아우레우스의 발현량을 검출하는 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 알츠하이머 병의 발병 위험도 예측용 조성물로서,
    상기 조성물은 편도선을 시료로 하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  18. 베타아밀로이드 단백질의 발현량 또는 이의 축적량을 검출하는 물질; 및 스타필로코커스 아우레우스의 발현량을 검출하는 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 조성물의 알츠하이머 병의 발병 위험도 예측 용도로서,
    상기 조성물은 편도선을 시료로 하는 것을 특징으로 하는, 용도.
  19. 베타아밀로이드 단백질의 발현량 또는 이의 축적량을 검출하는 물질; 및 스타필로코커스 아우레우스의 발현량을 검출하는 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 조성물의 알츠하이머 병의 발병 위험도 예측제를 제조하기 위한 용도로서,
    상기 조성물은 편도선을 시료로 하는 것을 특징으로 하는, 용도.
  20. 제17항의 조성물을 포함하는 알츠하이머 병의 발병 위험도 예측용 키트.
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KR20150144283A (ko) * 2014-06-13 2015-12-24 재단법인대구경북과학기술원 콧물 시료를 이용한 뇌신경 질환의 진단용 조성물

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