WO2017086703A1 - 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증 진단용 바이오마커 및 이를 이용한 진단 방법 - Google Patents

나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증 진단용 바이오마커 및 이를 이용한 진단 방법 Download PDF

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WO2017086703A1
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macular degeneration
related macular
diabetic retinopathy
protein
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PCT/KR2016/013235
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이철주
안희성
박성준
한기철
이지은
김종현
우세준
박규형
홍혜경
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(주)레티마크
서울대학교병원(분사무소)
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    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals

Definitions

  • the present invention relates to a biomarker for diagnosing age-related macular degeneration or diabetic retinopathy and a method for diagnosing age-related macular degeneration or diabetic retinopathy using the same.
  • Age-related macular degeneration is a disease caused by various changes in the macula of the retina with age. In developed countries, adult blindness is the leading cause and the incidence rate increases with age. In Korea, as the elderly population increases, the frequency of occurrence is expected to increase further.
  • the macula refers to the central area of nerve tissue called the retina, which is concentrated in photoreceptor cells that respond to light stimulation and is responsible for central vision.
  • Age-related macular degeneration is a disease that causes macular photoreceptor cells to disappear with age and cause visual disturbances. AMD is a degenerative disease that affects the retina, retinal pigment epithelium (RPE), Bruch's membrane and choroid.
  • RPE retinal pigment epithelium
  • AMD can be divided into dry or non-exudative forms and wet or exudative forms.
  • Non-exudative forms which account for the majority of AMD, are those in which the retina has lesions such as drusen or atrophy of the retinal pigment epithelium. It usually does not cause severe vision loss but can develop in wet form.
  • the exudative form is the development of choroidal neovascularization under the retina. The neovascularization causes exudates, bleeding, etc. in the macula, which damages the photoreceptors and thus lowers the central visual acuity, resulting in legal blindness of less than 0.1 if not treated.
  • Macular degeneration of the exudative form is very rapid and often results in rapid deterioration of vision within a few weeks.
  • Age-related macular degeneration is usually very important because early vision can't be restored once vision has started. Early detection is possible through regular ophthalmologic examinations by an ophthalmologist. If age-related macular degeneration is suspected by ophthalmologic examinations including fundus examination, ophthalmologic examinations such as fluorescein angiography and optical coherence tomography should be performed to confirm the diagnosis. Can be.
  • Treatments include laser photocoagulation, photodynamic therapy (PDT), and intravitreal injection of anti-VEGF agents.
  • Diabetic retinopathy is a diabetic eye complication that occurs when the microvessels in the retina are damaged. Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness, along with age-related macular degeneration.
  • Nonproliferative diabetic retinopathy is a diabetic retinopathy in which lesions are confined within the retina. Mainly, microvascular flow, intraretinal hemorrhage, hard exudates, retinal edema, vascular abnormalities, cotton plaques, and intraretinal microvascular abnormalities. It shows a back.
  • Proliferative diabetic retinopathy is a condition in which new blood vessels are produced and introduced into the vitreous body from the retina, which can cause severe vision disorders such as vision loss by vitreous hemorrhage and severe tractional retinal detachment. Hemorrhage, fibrosis proliferation, etc. Diabetic retinopathy can be diagnosed by fundus examination, slit lamp examination, fundus photography, fluorescein angiography, ultrasonography, or retinal electroconductivity test.
  • the age-related macular degeneration (AMD) and diabetic retinopathy (DR) has no initial subjective symptoms and is often mistaken for other causes, which makes early detection difficult and requires expensive equipment for diagnosis.
  • the diagnostic method is very inconvenient and dangerous, the test subjects are reluctant to do so. Therefore, there is a need for the development of a test method for easily and quickly diagnosing age-related macular degeneration (AMD) and diabetic retinopathy (DR).
  • ALD age-related macular degeneration
  • DR diabetic retinopathy
  • the present invention was completed by identifying a protein that can be used to easily diagnose age-related macular degeneration (AMD) and diabetic retinopathy (DR).
  • the object of the present invention is to thymosin beta-4 (TYB4), propylin-1 (Profilin-1 (PROF1), Actin (ACTB) and carbonic anhydrase 1 (Carbonic anhydrase 1: CAH1) Age-related macular degeneration (AMD) or diabetic retinopathy (DR) comprising an agent that measures the expression level of one or more proteins selected from the group consisting of or mRNA expression levels of genes encoding said proteins. )
  • TYB4 thymosin beta-4
  • Profile-1 PROF1
  • Actin Actin
  • CAH1 carbonic anhydrase 1
  • AMD Age-related macular degeneration
  • DR diabetic retinopathy
  • the present invention is to provide a kit for diagnosing age-related macular degeneration or diabetic retinopathy comprising the composition.
  • the present invention is to provide a method for providing information necessary for diagnosing age-related macular degeneration or diabetic retinopathy using the composition.
  • the present invention also provides a method for screening a substance for treating age-related macular degeneration or diabetic retinopathy.
  • One aspect of the invention is age-related macular degeneration comprising an agent for measuring the expression level of thymosin beta-4 (TYB4) protein or the mRNA expression level of the gene encoding the protein.
  • AMD thymosin beta-4
  • DR diabetic retinopathy
  • Another aspect of the present invention is for diagnosing age-related macular degeneration or diabetic retinopathy, including an agent for measuring the expression level of Profilin-1 (PROF1) protein or the mRNA expression level of a gene encoding the protein.
  • an agent for measuring the expression level of Profilin-1 (PROF1) protein or the mRNA expression level of a gene encoding the protein including an agent for measuring the expression level of Profilin-1 (PROF1) protein or the mRNA expression level of a gene encoding the protein.
  • PROF1 Profilin-1
  • compositions for diagnosing age-related macular degeneration or diabetic retinopathy comprising an agent for measuring the expression level of Actin (AcTB) protein or the mRNA expression level of a gene encoding the protein.
  • AcTB Actin
  • Another aspect of the present invention is age-related macular degeneration or diabetic retinopathy comprising an agent for measuring the expression level of a carbonic anhydrase 1 (CAH1) protein or the mRNA expression level of a gene encoding the protein. It provides a diagnostic composition.
  • CAH1 carbonic anhydrase 1
  • Another aspect of the invention is thymosin beta-4 (TYB4), propylin-1 (PROF1), Actin (ACTB) or carbonic anhydrase 1 (Carbonic anhydrase 1: It provides a composition for diagnosing age-related macular degeneration or diabetic retinopathy, comprising an agent for selecting at least two proteins in CAH1) and measuring the expression level of a plurality of selected protein groups or the mRNA expression level of a gene encoding a plurality of protein groups. .
  • TYB4 is a protein that plays an important role in the construction of the cytoskeleton. Specifically, TYB4 forms a 1: 1 complex with globular-actin and assembles and degrades the actin filaments constituting the cytoskeleton. Adjust the disassembly. It also promotes cell migration, organogenesis, tissue regeneration, angiogenesis and expression of various regulatory genes (laminin-332, fibronectin, VEGF), inflammation, wound formation, It inhibits cell death. Such TYB4 is expressed in diseases such as thyroid cancer, breast cancer and malignant melanoma, cirrhosis of the liver, rheumatoid arthritis and degenerative arthritis, and is known to recover skin or corneal wounds.
  • diseases such as thyroid cancer, breast cancer and malignant melanoma, cirrhosis of the liver, rheumatoid arthritis and degenerative arthritis, and is known to recover skin or corneal wounds.
  • PROF1 is one of the first found actin binding proteins to facilitate the assembly of spherical actin (G-actin) and filamentous actin (F-actin).
  • G-actin spherical actin
  • F-actin filamentous actin
  • This PROF1 induces vascular remodeling, nitric oxide synthase and is regulated by the Rho / ROC pathway, which is most important for phosphorylation or actin skeletal formation, and the PROF1 gene mutation is amyotrophic lateral It is known to show high expression in diseases such as sclerosis, brain tumors, breast cancer, kidney cancer and bladder cancer.
  • ACTB is one of the basic proteins that make up muscle proteins and is a double-stranded linear protein with thin filaments. Actin is an evolutionarily well-conserved protein that plays an important role in cell mobility, structure, and integrity.
  • CAH1 is a type of zinc metalloenzyme, an enzyme protein that reversibly catalyzes the hydration of carbon dioxide.
  • CAH1 is one of the intracellular homologous proteins of mammalian alpha carbonate an enzyme and is known to play an important role in maintaining pH homeostasis in vivo.
  • CHA1 is also an early marker of differentiation of erythrocytes, the second most abundant non-heme iron protein in erythrocytes.
  • CHA1 is known to increase in diabetic retinopathy vitreous that causes retinal hemorrhage and erythrocyte lysis.
  • thymosin beta 4 (TYB4), propylin-1 (PROF1), actin (ACTB) and carbonic anhydrase 1 (CAH1) are diagnosed with age-related macular degeneration or diabetic retinopathy in non-invasive samples containing blood.
  • TYB4 thymosin beta 4
  • PROF1 propylin-1
  • ACTB actin
  • CAH1 carbonic anhydrase 1
  • TYB4 may be one containing at least 90%, at least 93%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 .
  • TYB4 in the composition may be one comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • TYB4 may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • PROF1 in the composition of the present invention may be one containing at least 90%, at least 93%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • PROF1 in the composition may be one comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • PROF1 in the composition may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the ACTB may be one comprising at least 90%, at least 93%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. .
  • ACTB in the composition may be one comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • ACTB in the composition may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • CAH1 may be one containing at least 90%, at least 93%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 .
  • CAH1 in the composition may be one comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO.
  • CAH1 in the composition may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO.
  • the term "measurement of expression level of protein” refers to the presence of a marker for detecting age-related macular degeneration or diabetic retinopathy (protein) or a gene encoding the same in a biological sample to diagnose age-related macular degeneration or diabetic retinopathy. It means the process of checking whether or not and the expression level.
  • Expression level measurement or comparative analysis of the protein may include protein chip analysis, immunoassay, ligand binding assay, Matrix Assisted Laser Desorption / Ionization Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF), and Surface Enhanced Laser Desorption (SELDI-TOF).
  • radioimmunoassay radioimmunoassay, radioimmunoassay, oukteroni immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, complement fixation assay, two-dimensional electrophoresis, liquid phase chromatography-mass spectrometry (liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), liquid chromatography-Mass Spectrometry / Mass Spectrometry (LC-MS / MS), Western blotting and enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), but are not limited thereto.
  • a substance for measuring the protein expression level may be an antibody, an interaction protein, a ligand, an oligopeptide, or a peptide nucleic acid that specifically binds to the protein or fragment thereof. ), Nanoparticles, or aptamers.
  • an antibody refers to a substance that specifically binds to an antigen to produce an antigen-antibody response.
  • an antibody refers to an antibody that specifically binds to TYB4 protein, PROF1 protein, ACTB protein or CAH1 protein.
  • Antibodies of the invention include all polyclonal antibodies, monoclonal antibodies and recombinant antibodies. Such antibodies can be readily prepared using techniques well known in the art. For example, polyclonal antibodies can be prepared by methods well known in the art, including the steps of injecting the age-related macular degeneration or diabetic retinopathy marker protein antigen into an animal and collecting blood from the animal to obtain a serum comprising the antibody. Can be produced.
  • polyclonal antibodies can be prepared from any animal, such as goats, rabbits, sheep, monkeys, horses, pigs, cattle, dogs, and the like.
  • monoclonal antibodies are well known in the art by the hybridoma method (see Kohler and Milstein (1976) European Journal of Immunology 6: 511-519), or phage antibody library techniques (Clackson et al, Nature, 352). : 624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222: 58, 1-597, 1991).
  • Antibodies prepared by the above method can be isolated and purified using methods such as gel electrophoresis, dialysis, salt precipitation, ion exchange chromatography, affinity chromatography, and the like.
  • antibodies of the invention include functional fragments of antibody molecules, as well as complete forms with two full length light chains and two full length heavy chains.
  • a functional fragment of an antibody molecule means a fragment having at least antigen binding function, and includes Fab, F (ab '), F (ab') 2 and Fv.
  • the antibody of the present invention may be commercially obtained.
  • PNA Peptide Nucleic Acid
  • DNA has a phosphate-ribose sugar backbone
  • PNA has a repeated N- (2-aminoethyl) -glycine backbone linked by peptide bonds, which greatly increases binding and stability to DNA or RNA, leading to molecular biology. It is used in diagnostic analysis and antisense therapies.
  • PNAs are described in Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, Buchardt O (December 1991). "Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide". Science 254 (5037): 1497-500.
  • “Aptamers” in the present invention are oligonucleic acid or peptide molecules, the general contents of which are described in Bock LC et al., Nature 355 (6360): 5646 (1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine”. J Mol Med. 78 (8): 42630 (2000); Cohen BA, Colas P, Brent R. "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library”. Proc Natl Acad Sci USA. 95 (24): 142727 (1998).
  • the term "measurement of expression level of mRNA” refers to a process of confirming the presence and expression level of mRNA of genes encoding the diagnostic protein in a biological sample to diagnose age-related macular degeneration or diabetic retinopathy. It means to measure the quantity.
  • Analytical methods for this purpose include reverse transcriptase (RT-PCR), competitive reverse transcriptase (RT) PCR, real-time reverse transcriptase (Real-time RT-PCR), RNase protection assay (RPA). assays, Northern blotting, DNA chips, etc., but are not limited thereto.
  • a substance for measuring the expression level of mRNA of the gene encoding TYB4 protein, a substance for measuring the expression level of mRNA of the gene encoding PROF1 protein, ACTB A substance that measures the expression level of mRNA of a gene encoding a protein or a substance that measures the expression level of an mRNA of a gene encoding a CAH1 protein may be a primer, a probe, or a probe that specifically binds to the mRNA of a gene encoding each protein.
  • Antisense nucleotides Those skilled in the art will be able to easily design primers, probes or antisense nucleotides that specifically bind to the mRNA of the gene encoding the protein.
  • primer refers to a fragment that recognizes a target gene sequence, which includes primer pairs in the forward and reverse directions, but is preferably a primer pair that provides assay results with specificity and sensitivity. High specificity can be imparted when the nucleic acid sequence of the primer is a sequence that is inconsistent with the non-target sequence present in the sample so that only the target gene sequence containing the complementary primer binding site is amplified and does not cause nonspecific amplification. .
  • the term “probe” refers to a substance that can specifically bind to a target substance to be detected in a sample, and means a substance that can specifically confirm the presence of the target substance in the sample through the binding. do.
  • the type of probe is a material commonly used in the art, but is not limited.
  • the probe may be a peptide nucleic acid (PNA), a locked nucleic acid (LNA), a peptide, a polypeptide, a protein, an RNA, or a DNA. It is PNA.
  • the probes are biomaterials, including those derived from or similar to organisms or produced in vitro, for example, enzymes, proteins, antibodies, microorganisms, animal and plant cells and organs, neurons, DNA, and It may be RNA, DNA includes cDNA, genomic DNA, oligonucleotides, RNA includes genomic RNA, mRNA, oligonucleotides, examples of proteins may include antibodies, antigens, enzymes, peptides and the like.
  • antisense refers to a nucleotide base in which an antisense oligomer hybridizes with a target sequence in RNA by Watson-Crick base pairing, allowing formation of mRNA and RNA: oligomeric heterodimers typically within the target sequence. Oligomer having a sequence of and a backbone between subunits. The oligomer may have exact sequence complementarity or approximate complementarity to the target sequence.
  • Diagnosis using the composition of the present invention may include diagnosis of early age-related macular degeneration or late age-related macular degeneration. That is, the composition may be used to distinguish early age-related macular degeneration from late age-related macular degeneration.
  • early age related macular degeneration may also be termed dry age related macular degeneration or non-exudative age related macular degeneration.
  • late age-related macular degeneration may also be termed wet age-related macular degeneration or exudative age-related macular degeneration.
  • the present invention also provides a kit for diagnosing age-related macular degeneration or diabetic retinopathy, comprising the composition.
  • the kit can be prepared by conventional manufacturing methods known in the art.
  • the kit may include, for example, an antibody in freeze-dried form and a buffer, stabilizer, inert protein, and the like.
  • the kit may further comprise a detectable label.
  • detectable label means an atom or molecule that enables the specific detection of a molecule comprising a label among molecules of the same kind without a label.
  • the detectable label may be attached to an antibody, interacting protein, ligand, nanoparticle, or aptamer that specifically binds to the protein or fragment thereof.
  • the detectable label may comprise a radionuclide, a fluorophore, an enzyme.
  • the kit can be used according to various immunoassays or immunostaining methods known in the art.
  • the immunoassay or immunostaining method may include radioimmunoassay, radioimmunoprecipitation, immunoprecipitation, ELISA, capture-ELISA, inhibition or competition assay, sandwich assay, flow cytometry, immunofluorescence staining and immunoaffinity purification.
  • the kit may be reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) kit, DNA chip kit, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) kit, protein chip kit, rapid kit or multiple reaction monitoring (MRM). have.
  • RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction
  • ELISA enzyme linked immunosorbent assay
  • MRM multiple reaction monitoring
  • the kit can also be used for mass spectrometry.
  • specific amino acid residues of the protein are myristoylation, isoprenylation, prenylation, glypiationation, lipolation, acylation, alkylation, methylation, demethylation, amidation, Modifications such as ubiquitination, phosphorylation, deamidation, glycosylation, oxidation, acetylation, and the like.
  • the present invention also provides thymosin beta 4 (TYB4), propylin-1 (PROF1), actin (ACTB) and carbonic anhydrase 1 in biological samples isolated from individuals suspected of age-related macular degeneration or diabetic retinopathy. Measuring the expression level of one or more proteins selected from the group consisting of (CAH1) or mRNA expression levels of genes encoding said proteins; And determining whether the expression level of the measured protein or the mRNA expression level of the gene encoding the protein is increased compared to the level measured in the control sample. The information necessary for diagnosing age-related macular degeneration or diabetic retinopathy is included. Provide a way to provide.
  • a biological sample refers to tissue, cells, blood, serum, plasma, saliva, cerebrospinal fluid, or urine that differ in protein or gene expression levels due to age-related macular degeneration or diabetic retinopathy.
  • the same sample and the like preferably means blood, plasma, serum, eye cells, eye tissues, ophthalmic water or anterior water.
  • the information necessary for diagnosing age-related macular degeneration may include information on whether the subject is an early age-related macular degeneration patient or a late age-related macular degeneration patient.
  • the information necessary for diagnosing diabetic retinopathy may include information on whether the subject is a proliferative retinopathy patient or a non-proliferative retinopathy patient.
  • the protein level can be measured by the immunoassay or immunostaining described above.
  • the method may also be practiced in the form of a microchip or automated microarray system capable of detecting TYB4, PROF1, ACTB or CAH1 proteins or fragments thereof in a sample.
  • the protein levels include multiple reaction monitoring (MRM), parallel reaction monitoring (PRM), sequential windowed data independent acquisition of the total high-resolution (SWATH), and selected reaction monitoring (SRM). ) Or immuno multiple reaction monitoring (iMRM).
  • MRM is a method of determining the exact fraction of a substance, breaking it out on a mass spectrometer, then selecting a particular ion from a broken ion once more and obtaining the number using a continuously connected detector.
  • MRM is a method of determining the exact fraction of a substance, breaking it out on a mass spectrometer, then selecting a particular ion from a broken ion once more and obtaining the number using a continuously connected detector.
  • the protein or fragment thereof may be quantified using a mass spectrometer in blood samples of normal individuals and individuals suspected of age-related macular degeneration.
  • the mRNA level can be measured by RT-PCR, competitive RT-PCR, quantitative RT-PCR, RNase protection assay, Northern blot, or DNA chip.
  • the method includes comparing the measured level with a control sample to determine whether the amount has increased compared to the control sample. If a biological sample isolated from a subject suspected of age-related macular degeneration or diabetic retinopathy is determined to have increased levels of TYB4, PROF1, ACTB or CAH1 protein compared to the control sample, the subject may have age-related macular degeneration or diabetic retinopathy. It can be diagnosed as. In addition, since the expression level of protein and mRNA in a typical biological sample often has a positive correlation, the subject is age-related even when it is determined that the TYB4, PROF1, ACTB or CAH1 mRNA level is increased compared to the control sample. It can be diagnosed as having macular degeneration or diabetic retinopathy.
  • another aspect of the present invention is the expression level of at least one protein selected from the group consisting of thymosin beta 4 (TYB4), propylin-1 (PROF1), actin (ACTB) and carbonic anhydrase 1 (CAH1) or Incubating by adding a test substance to a cell sample in which the mRNA expression level of the gene encoding the protein is increased compared to the control group; And confirming whether the selected one or more protein levels or mRNA levels thereof in the incubated cells are reduced compared to before incubation.
  • TYB4 thymosin beta 4
  • PROF1 propylin-1
  • ACTB actin
  • CAH1 carbonic anhydrase 1
  • the control may be cells derived from an individual without age-related macular degeneration or diabetic retinopathy.
  • the control may be cells derived from individuals without age-related macular degeneration and diabetic retinopathy.
  • a composition for diagnosing age-related macular degeneration or diabetic retinopathy, a diagnostic kit, or a method for providing information necessary for diagnosis is a new immunological diagnostic tool using plasma of a patient. It can be conveniently analyzed in plasma without using, and can be useful for early diagnosis of age-related macular degeneration or diabetic retinopathy.
  • Figure 1 shows the results of measuring the normalized peak area value of TYB4 in the plasma of normal people, plasma of early AMD patients and plasma of late AMD patients using the LC-MRM method.
  • Figure 2 shows the results of measuring the normalized peak area value of PROF1 in the plasma of normal people, plasma of early AMD patients and plasma of late AMD patients using the LC-MRM method.
  • Figure 3 shows the results of measuring the normalized peak area value of ACTB using the LC-MRM method in the plasma of normal people, the plasma of early AMD patients and the plasma of late AMD patients.
  • Figure 4 shows the results of measuring the normalized peak area value of CAH1 using the LC-MRM method in the plasma of normal people, the plasma of early AMD patients and the plasma of late AMD patients.
  • Figure 5 shows the results of measuring the normalized peak area values of TYB4, PROF1, ACTB, and CAH1 using the LC-MRM method in the plasma of normal people and the plasma of AMD patients.
  • FIG. 6 shows ROC curves using normalized peak area values of TYB4, PROF1, ACTB, and CAH1 in plasma of normal subjects and plasma of AMD patients.
  • Figure 7 shows the results of assaying the difference in each protein expression level with age.
  • Figure 8 shows the results of confirming the expression pattern of PROF1 using the immunoblotting method in the plasma of normal people, the plasma of early AMD patients and the plasma of late AMD patients.
  • Figure 9 shows the results of statistical processing by quantifying the PROF1 concentration measured by the immunoblotting.
  • Figure 10 shows the results of measuring the normalized peak area value of TYB4 in the plasma of normal people, plasma of PDR patients and plasma of NPDR patients using the LC-MRM method.
  • Figure 11 shows the results of measuring the normalized peak area value of PROF1 in the plasma of normal people, plasma of PDR patients and plasma of NPDR patients using the LC-MRM method.
  • Figure 12 shows the results of measuring the normalized peak area value of ACTB using the LC-MRM method in the plasma of normal people, plasma of PDR patients and plasma of NPDR patients.
  • Figure 13 shows the results of measuring the normalized peak area of CAH1 in the plasma of normal people, plasma of PDR patients and plasma of NPDR patients using the LC-MRM method.
  • FIG. 14 shows the results of measuring normalized peak area values of TYB4, PROF1, ACTB, and CAH1 using the LC-MRM method in the plasma of normal people and the plasma of DR patients.
  • FIG. 15 shows ROC curves using normalized peak area values of TYB4, PROF1, ACTB, and CAH1 in plasma of normal subjects and plasma of DR patients.
  • the characteristics of the normal group and AMD disease group to be analyzed are summarized in Table 1 below.
  • Statistical values were analyzed between groups.
  • One-way analysis of variance (ANOVA) for the three groups showed a p-value of 0.987, indicating no statistically significant difference.
  • ANOVA One-way analysis of variance
  • the Mann-whitney test was performed on two randomly selected groups of three. As a result, p value was 0.783 in normal and all AMD disease group, p value was 0.991 in normal and early AMD disease group, p value was 0.717 in normal and late AMD disease group and early AMD disease group. In the late AMD disease group, the p value was 0.830, indicating that there was no bias due to the characteristics of the analyte.
  • Example 1.1 60 mM of each of the normal group obtained in Example 1.1, 21 patients with early age-related macular degeneration, and 43 patients with late age-related macular degeneration were treated with 10 mM after adding urea to 7 M.
  • 2-carbosylethyltrisphosphine Tris (2-carboxyethyl) -phosphine
  • iodoacetamide was added to 15 mM for alkylation and reacted for 1 hour at room temperature under dark conditions, so that the mass ratio of plasma protein and wako enzyme was 100: 1.
  • Rice seed enzyme was added and reacted at room temperature for 4 hours.
  • the plasma samples of 20 patients with age-related macular degeneration disease were collected and the plasma samples of 20 healthy groups without disease were combined and LC-MS / MS was performed by four-dimensional separation.
  • a first protein separation method six proteins, albumin, immunoglobulin A, immunoglobulin G, transferrin, trypsin inhibitor, and heptoglybin, which occupy most of the serum, were removed using a Top-6 MARS column (Agilent).
  • the protein was divided into five fractions according to size using gel-eluted liquid fractionation entrapment electrophoresis (GELFrEE 8100 fractionation system). Each fraction was digested into peptide fragments using trypsin according to the method of Example 1.2.
  • a third peptide separation method five fractions were separated according to isoelectric point using OFFGEL fractionator (Agilent) and further divided into 14 fractions.
  • OFFGEL fractionator Agilent
  • a reverse phase MAGIC C18aq column (12 cm ⁇ 75 ⁇ m, Eksigent MDLC system) was used as a fourth separation method, and the LTQ Obitrap Mass Spectrometer (Thermo Scientific) LC-MS / MS The spectrum was obtained. G-test was used to statistically analyze the difference in the number of spectra between two samples.
  • the number of peptide spectra of TYB4 was 2 in the normal group and 11 in the AMD disease group (G-value: 6.360), PROF1 was 0 in the normal group and 13 in the AMD disease group (G-value: 15.235), ACTB was 7 in the normal group and 29 in the AMD disease group (G-value: 14.211), 11 CAH1 in the normal group and 23 in the AMD disease group (G-value: 4.311).
  • p-value was less than 0.05, which showed statistically significant difference.
  • the four proteins, which differed significantly in spectral numbers, were quantified more precisely by multiple reaction monitoring (MRM) analysis.
  • MRM multiple reaction monitoring
  • a representative peptide having a characteristic charge-to-mass ratio (m / z) for four target proteins was selected (Q1 transition) and the fragmentation ions generated by breaking the peptide by an electrical shock.
  • the highest intensity ion (Q3) was selected.
  • One or more sensitive peptides were measured for each protein and the synthesized peptides were injected into the mass spectrometer based on this to obtain an optimized value of fragmentation energy per transition. Of these, three or more higher fragmentation ions were selected based on intensity (Table 2).
  • Solution A 99.9% distilled water, 0.1% formic acid
  • solution B 99.9% acetonitrile, 0.1% formic acid
  • the column was equilibrated by flowing the mixed solvent at a concentration of 5% B for 10 minutes, and then 1.0 ⁇ l of the peptide sample was injected directly into the analytical column without passing through a trap column. After injecting the sample, the 5% B solvent was further flowed for 5 minutes, followed by eluting the peptide while increasing the concentration of Solution B by 1% per minute for a total of 45 minutes from 5% B to 50% B.
  • a triple quadrupole mass spectrometer QTrap 5500 (SCIEX) was used to monitor the transition of each selected protein in MRM mode.
  • An ion voltage of 2200 volts was used and the resolution at Quadruple 1 (Q1) and Quadruple 3 (Q3) was set in units.
  • the dwell time for the transition was set to 20 milliseconds so that the total cycle time was 2.5 seconds. 25 units of nebulizing gas were used and the heater temperature was set to 150 ° C.
  • each sample was digested with beta-galactosidase peptides from residues E.
  • MAGI1 membrane-associated guanylate kinase
  • coagulation factor XIIIa F13A
  • inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1 ITIH1
  • KNG1 kininogen-1
  • SERPINA1 alpha-1-antitrypsin
  • the extracted ion chromatogram (XIC) values for the representative peptides of these seven proteins were divided by the median of the peak area values of the XIC of each peptide of raw values in a total of 124 serum, and then at seven peptides per sample. The median value was defined as the final normalization factor and the XIC value of the target peptide was divided by the final normalization factor.
  • Statistical analysis was performed between normal and diseased groups using normalized values. Area under the curve (AUC) values are shown for AMD at the 95% confidence level.
  • Statistical differences of TYB4 in plasma between the three groups were compared by a total of three independent t-tests of the two different groups.
  • the p-value between the normal and early AMD disease groups was less than 0.001
  • the p-value between the normal and late AMD disease groups was less than 0.001
  • the p-value between the early and late AMD disease groups was 0.006.
  • the area under the curve of the receiver operating characteristic (ROC) analysis curve based on the measurement of TYB4 between the normal and AMD disease groups was 0.936 (FIG. 1).
  • Statistical difference of PROF1 in plasma among three groups was analyzed by the same method as TYB4.
  • the p-value between the normal and early AMD disease group was 0.001 or less, and the p-value between the normal and late AMD disease group was 0.001 or less, which was statistically significant.
  • the p-value between the early and late AMD disease group was 0.051 did not show a statistically significant difference.
  • the area value under the curve of the receiver manipulation characterization curve based on the measurement of PROF1 between the normal and AMD disease groups was 0.960 (FIG. 2).
  • CAH1 in plasma among the three groups were analyzed by the same method as TYB4.
  • the p-value between the normal and early AMD disease group was 0.908, showing no statistically significant difference, but the p-value between the normal and late AMD disease group was less than 0.001, and the p-value between the early and late AMD disease group was Less than 0.001 showed statistically significant difference.
  • the area under the curve of the receiver manipulation characterization curve was 0.714 based on the measurement of CAH1 between the normal and AMD disease groups (FIG. 4).
  • FIG. 5 shows independent t-test results based on the quantitative differences in four proteins TYB4, PROF1, ACTB, and CAH1 in the plasma of 60 healthy and 64 diseased AMD. All four proteins showed a p-value less than 0.05, showing a statistically significant difference.
  • the AUC value of TYB4 was 0.949
  • the AUC value of PROF1 was 0.960
  • the AUC value of ACTB was 0.949
  • the AUC value of CAH1 was 0.714.
  • Plasma proteins isolated by electrophoresis were transferred to PVDF membrane at 90 V, 200 mA in a buffer containing 50 mM Tris HCL, 130 mM glycine, 0.05% SDS and 12.5% methanol, and the transferred membrane was transferred to It was reacted for 30 minutes in a TBST (Tris-buffered saline with Tween 20) buffer containing 5% skim milk. Thereafter, the PVDF membrane and the antibody against PROF1 (ab124904, 1: 2000, Abcam) were reacted at 4 ° C. for 16 hours, washed three times with TBST, and rabbit IgG-binding with rabbit immunoglobulin of anti-PROF 1.
  • TBST Tris-buffered saline with Tween 20
  • HRP (1: 3000, Cell signaling) was reacted at 25 ° C. for 1 hour, and then washed three times with TBST. Subsequently, the PVDF membrane was reacted with a Clarity Western Enhanced Chemiluminescence (BIO-RAD) substrate, and colored using a chemiluminescence imaging system (Davinch-ChemiTM), and then the respective protein concentrations were confirmed.
  • BIO-RAD Clarity Western Enhanced Chemiluminescence
  • Davinch-ChemiTM chemiluminescence imaging system
  • Figure 9 shows the results of statistical processing by quantifying the PROF1 concentration measured by the immunoblotting of Figure 8.
  • the concentrations indicated in the immunoblotting results were quantified and shown graphically in Figure 9a.
  • FIG. 9B shows the measured concentration of PROF1 in a receiver-operational characteristic (ROC) graph.
  • the area under the ROC curve (AUC) of PROF1 was 0.808, indicating that the assay was sensitive and accurate. From the above results, it was confirmed that by using an antibody that selectively recognizes PROF1 in plasma, subjects showing a relatively increased concentration of PROF1 protein compared to the normal group can be diagnosed as age-related macular degeneration.
  • Example 2 Experiments were performed in the same manner as in Example 1 using the plasma of patients with diabetic retinopathy (DR).
  • DR diabetic retinopathy
  • Table 3 The characteristics of the normal group and the DR disease group to be analyzed are summarized in Table 3 below. Statistical values were analyzed between groups.
  • the normal, proliferative diabetic retinopathy group (PDR group), and the non-proliferative diabetic retinopathy group (NPDR group) in each protein were age-based. Divided into two groups; Low age normal group (Y-control) and high age normal group (O-control); Low age PDR group (Y-PDR) and high age PDR group (O-PDR); And low age NDPR group (Y-NDPR), high age NDPR group (O-NDPR).
  • Blood sample pretreatment, selection of transitions, LC and MRM analysis, and data analysis were performed in the same manner as described in Example 1.
  • Statistical differences in TYB4 expression levels in plasma were compared through a total of three independent t-tests between two different groups of normal, PDR, and NPDR groups.
  • the p value between the normal group and the PDR group was 0.002
  • the p value between the normal group and the NPDR group was 0.014.
  • the p-value between the PDR and NPDR groups was 0.197, which was not statistically significant.
  • the area value under the curve of the receiver manipulation characterization curve based on the measurement of TYB4 between the normal and DR disease groups was 0.895 (FIG. 10).
  • FIG. 14 shows the independent t-test results for the quantitative differences in the four proteins TYB4, PROF1, ACTB, and CAH1 in the plasma of 60 healthy and 40 diabetic retinopathy patients. All four proteins showed a p-value less than 0.05, showing a statistically significant difference.
  • Fig. 15 shows the result of performing receiver operation characteristics based on this data. The AUC value of TYB4 was 0.895, the AUC value of PROF1 was 0.873, the AUC value of ACTB was 0.953, and the AUC value of CAH1 was 0.653.

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Abstract

일 양상에 따른, 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증 진단용 조성물, 진단용 키트, 또는 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법은, 환자의 혈장을 이용하는 새로운 면역학적 진단 도구로서, 민감도가 우수할 뿐만 아니라 생검을 이용하지 않고 혈장을 대상으로 간편하게 분석할 수 있어, 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증의 조기 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증 진단용 바이오마커 및 이를 이용한 진단 방법
본 발명은 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증 진단용 바이오마커 및 이를 이용하여 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증을 진단하는 방법에 관한 것이다.
나이관련 황반변성(age-related macular degeneration: AMD)은 나이가 들면서 망막의 황반부에 여러 가지 변화가 동반되어 생기는 질병이다. 선진국에서는 성인 실명의 가장 주된 원인이며 나이가 증가함에 따라 발생율이 증가한다. 우리나라에서도 앞으로 노인 인구가 증가함에 따라서 그 발생 빈도는 더욱 증가하리라 예상된다. 황반은 망막이라고 하는 신경 조직의 중심 부위를 말하는데, 빛 자극에 반응하는 광수용체 세포가 밀집되어 있어서 중심 시력을 담당한다. 나이가 들어감에 따라 황반부 광수용체 세포가 소실되어 시력 장애를 일으키는 질환을 나이관련 황반변성이라 한다. AMD는 망막, 망막색소상피층(RPE), Bruch's membrane, 맥락막에 영향을 미치는 퇴행성 질병이다.
AMD는 건성 또는 비삼출성 형태와 습성 또는 삼출성 형태로 나눌 수 있다. AMD의 대부분을 차지하는 비삼출성 형태는 망막에 드루젠이나 망막색소상피의 위축과 같은 병변이 생긴 경우를 말한다. 이는 보통 심한 시력상실을 유발하지는 않지만 습성 형태로 발전할 수 있다. 삼출성 형태는 망막 밑에 맥락막 신생혈관이 자라는 경우이다. 이러한 신생혈관은 황반부에 삼출물, 출혈 등을 일으켜서 광수용체를 손상시키고 그에 따라 중심시력을 저하시켜, 치료를 하지 않을 경우 대부분 0.1 이하의 법적 실명을 초래한다. 삼출성 형태의 황반변성은 진행속도가 매우 빨라서 수 주 안에 시력이 급속히 나빠지는 경우가 많다. 나이관련 황반변성은 일반적으로 일단 시력장애가 시작되면 이전의 시력을 회복할 수 없는 경우가 많으므로 조기 발견이 매우 중요하다. 조기 발견은 안과의사에 의한 정기적인 안과검진을 통해서 가능하며 안저검사를 포함한 안과적 검진으로 나이관련 황반변성이 의심되면, 형광안저혈관조영술, 빛간섭단층촬영 등의 안과 정밀검사들을 시행하여 확진할 수 있다. 치료방법에는 레이저광응고술(photocoagulation), 광역학요법(photodynamic therapy, PDT), anti-VEGF 제재의 유리체강내 주입 방법이 있다.
당뇨망막병증(diabetic retinopathy: DR)은 망막의 미세혈관이 손상되었을 때에 나타나는, 당뇨로 생기는 눈의 합병증이다. 전세계적으로 당뇨망막병증은 나이관련 황반변성과 함께 실명 원인 중 높은 비중을 차지하고 있다. 비증식성 망막증(nonproliferative diabetic retinopathy: NPDR)은 병변이 망막내에 국한되어 있는 당뇨망막병증으로, 주로 미세혈관류, 망막내 출혈, 경성 삼출물, 망막부종, 혈관 이상, 면화반, 및 망막내 미세혈관이상 등의 소견을 보인다. 증식성 망막증(proliferative diabetic retinopathy: PDR)은 망막에서 초자체로 신생혈관이 생성, 유입되어 초자체 출혈 및 심한 견인성 망막박리에 의해 시력 상실 등 심각한 시력 장애를 초래할 수 있는 상태로, 망막 신생혈관, 초자체 출혈, 섬유조직 증식 등의 소견을 보인다. 당뇨망막병증은 안저 검사, 세극등 검사, 안저사진촬영, 형광안저조영술, 초음파검사, 또는 망막전위도검사 등으로 진단할 수 있다.
상기 나이관련황반변성(AMD) 및 당뇨망막병증(DR)은 초기 자각 증상이 없고, 다른 원인으로 오인하는 경우가 많기 때문에 초기 발견이 어려울 뿐만 아니라 진단을 위해서는 고가의 장비가 필요하다는 문제점이 있다. 또한 상기의 진단 방법은 수행 방법이 매우 불편하고 위험성이 있어서, 피검자들이 이를 꺼려하는 실정이다. 따라서, 간편하고 신속하게 나이관련황반변성(AMD) 및 당뇨망막병증(DR) 여부를 진단할 수 있는 검사방법의 개발이 요구되고 있다.
본 발명자들은 나이관련황반변성(AMD) 및 당뇨망막병증(DR)의 조기 진단에 유용한 마커를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 나이관련황반변성(AMD) 및 당뇨망막병증(DR)에서 특이적으로 증가하는 단백질을 발굴하고, 이를 이용하여 나이관련황반변성(AMD) 및 당뇨망막병증(DR)을 간편하게 진단할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 티모신 베타 4(Thymosin beta-4: TYB4), 프로필린-1(Profilin-1: PROF1), 액틴(Actin: ACTB) 및 탄산무수화효소 1(Carbonic anhydrase 1: CAH1)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질의 발현 수준 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 나이관련 황반변성(age-related macular degeneration: AMD) 또는 당뇨망막병증(diabetic retinopathy: DR) 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증 진단용 키트를 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 이용하여 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 일 양상은 티모신 베타 4(Thymosin beta-4: TYB4) 단백질의 발현 수준 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 나이관련 황반변성(age-related macular degeneration: AMD) 또는 당뇨망막병증(diabetic retinopathy: DR) 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양상은 프로필린-1(Profilin-1: PROF1) 단백질의 발현 수준 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양상은 액틴(Actin: ACTB) 단백질의 발현 수준 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양상은 탄산무수화효소 1(Carbonic anhydrase 1: CAH1) 단백질의 발현 수준 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양상은 티모신 베타 4(Thymosin beta-4: TYB4), 프로필린-1(Profilin-1: PROF1), 액틴(Actin: ACTB) 또는 탄산무수화효소 1(Carbonic anhydrase 1: CAH1) 중 2 이상의 단백질을 선택하여 선택된 복수의 단백질군의 발현 수준 또는 복수의 단백질군을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증 진단용 조성물을 제공한다.
TYB4는 세포골격(cytoskeleton)의 구성에 중요한 역할을 담당하는 단백질로서 구체적으로, 구형 액틴(globular-actin)과 1:1 복합체를 형성하고, 세포골격을 구성하는 액틴 필라멘트의 조립(assembly), 분해(disassembly)를 조절한다. 또한 세포 이동(migration), 기관 생성(organogenesis), 조직 재생(regeneration), 혈관생성(angiogenesis) 및 다양한 조절 유전자(laminin-332, fibronectin, VEGF) 등의 발현을 촉진시키거나, 염증, 상처 형성, 세포사멸 등을 저해한다. 이러한 TYB4는 갑상선암, 유방암 및 악성흑색종, 간경화, 류마티스 및 퇴행성 관절염 등의 질병에서 발현되며, 피부 또는 각막 상처 등의 복구능이 알려져 있다.
PROF1은 첫 번째로 발견된 액틴 결합단백질 중 하나로서 구형 액틴(G-actin)과 필라멘트형 액틴(F-actin)의 조립(assembly)을 촉진시킨다. PROF1가 고농도로 존재할 경우 액틴 중합반응(polymerization)이 저해되고, 반대로 PROF1이 저농도로 존재할 경우 증가된다. 이러한 PROF1은 혈관 리모델링, 산화질소합성효소(Nitric oxide synthase)를 유도하고, 인산화(phosphorylation) 또는 액틴 골격형성에 가장 중요한 Rho/ROC 경로에 의해 조절되며, PROF1 유전자 돌연변이는 근위축성 측상경화증(amyotrophic lateral sclerosis)을 일으키거나, 뇌종양, 유방암, 신장암, 방광암 등의 질병에서 높은 발현 양상을 보인다고 알려져 있다.
ACTB은 근육 단백질을 이루는 기본 단백질 중 하나로, 얇은 필라멘트를 이루고 있는 이중나선의 선형 단백질이다. 액틴은 진화적으로 잘 보존되어 있는 단백질로써 세포이동(mobility), 구조(structure) 및 보존(integrity)에 매우 중요한 기능을 한다.
CAH1은 아연 금속효소(zinc metalloenzyme)의 한 종류로 가역적으로 이산화탄소의 수화 작용을 촉매하는 기능을 수행하는 효소 단백질이다. CAH1은 포유동물의 알파 탄산무수화효소의 세포 내 동형 단백질 중 하나로써 생체 내의 pH 항상성 유지에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 또한 CHA1은 적혈구의 분화 초기 마커, 적혈구에서 두 번째로 풍부한 비헴철 단백질이다. 망막출혈 및 적혈구 용해를 일으키는 당뇨망막병증 유리체에서 CHA1가 증가한다고 알려져 있다.
하지만, 혈액을 포함하는 비침습적 시료에서 상기 티모신 베타 4(TYB4), 프로필린-1(PROF1), 액틴(ACTB) 및 탄산무수화효소 1(CAH1)가 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증 진단을 위한 바이오마커로 사용될 수 있음을 개시한 종래 기술은 전혀 알려진 바가 없다.
본 발명의 조성물에서 TYB4는 서열번호 1의 아미노산 서열과 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 조성물에서 TYB4는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 조성물에서 TYB4는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있다.
본 발명의 조성물에서 PROF1은 서열번호 2의 아미노산 서열과 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 조성물에서 PROF1은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 조성물에서 PROF1은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 조성물에서 ACTB은 서열번호 3의 아미노산 서열과 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 조성물에서 ACTB은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 조성물에서 ACTB은 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 조성물에서 CAH1은 서열번호 4의 아미노산 서열과 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 조성물에서 CAH1은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 조성물에서 CAH1은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명에 사용된 용어, "단백질의 발현 수준 측정"이란 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증 진단용 마커(단백질) 또는 이를 암호화하는 유전자의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정을 의미한다. 상기 단백질의 발현 수준 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏팅 및 ELISA(enzyme linked immunosorbent assay) 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증 진단용 조성물에서 상기 단백질 발현 수준을 측정하는 물질은 상기 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 올리고펩타이드, PNA(peptide nucleic acid), 나노입자, 또는 압타머일 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "항체"는 항원과 특이적으로 결합하여 항원-항체 반응을 일으키는 물질을 가리킨다. 본 발명의 목적상, 항체는 TYB4 단백질, PROF1 단백질, ACTB 단백질 또는 CAH1 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다. 본 발명의 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 상기 항체는 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 다클론 항체는 상기 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증 마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 과정을 포함하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물로부터 제조될 수 있다. 또한, 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method; Kohler 및 Milstein(1976) European Journal of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리 기술(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991 참조)을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 2개의 전장의 경쇄 및 2개의 전장의 중쇄를 갖는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다. 또한 본 발명의 항체는 상업적으로 입수한 것일 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "PNA(Peptide Nucleic Acid)"는 인공적으로 합성된, DNA 또는 RNA와 비슷한 중합체를 가리킨다. DNA는 인산-리보스당 골격을 갖는데 반해, PNA는 펩타이드 결합에 의해 연결된 반복된 N-(2-아미노에틸)-글리신 골격을 가지며, 이로 인해 DNA 또는 RNA에 대한 결합력과 안정성이 크게 증가되어 분자 생물학, 진단 분석 및 안티센스 치료법에 사용되고 있다. PNA는 문헌[Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, Buchardt O(December 1991). "Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide". Science 254(5037): 1497-500]에 상세하게 개시되어 있다.
본 발명에서 "앱타머"는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 문헌[Bock LC et al., Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R. "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24): 142727(1998)]에 상세하게 개시되어 있다.
본 발명에 사용된 용어 "mRNA의 발현 수준 측정"이란 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 상기 진단용 단백질을 암호화하는 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정하는 것을 의미한다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증 진단용 조성물에 있어서, TYB4 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 물질, PROF1 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 물질, ACTB 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 물질 또는 CAH1 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 물질은 각각의 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 포함한다. 당업자라면 이를 바탕으로 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 용이하게 디자인할 수 있을 것이다.
본 발명에서 사용된 용어 "프라이머"는 표적 유전자 서열을 인지하는 단편으로서, 정방향 및 역방향의 프라이머 쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료 내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성이 부여될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "프로브"란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid), 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, RNA 또는 DNA 일 수 있으며, 가장 바람직하게는 PNA이다. 보다 구체적으로, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체 외에서 제조된 것을 포함하는 것으로, 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩타이드 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "안티센스"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적서열 내에서 전형적으로 mRNA와 RNA:올리고머 헤테로이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드 염기의 서열 및 서브유닛간 백본을 갖는 올리고머를 의미한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다.
본 발명의 상기 조성물을 이용한 진단은 초기 나이관련 황반변성 또는 후기 나이관련 황반변성에 대한 진단을 포함할 수 있다. 즉, 상기 조성물은 초기 나이관련 황반변성과 후기 나이관련 황반변성을 구별하는 용도로 이용될 수 있다. 용어 “초기 나이관련 황반변성”은 건성 나이관련 황반변성 또는 비삼출성 나이관련 황반변성으로도 명명될 수 있다. 용어 “후기 나이관련 황반변성”은 습성 나이관련 황반변성 또는 삼출성 나이관련 황반변성으로도 명명될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증 진단용 키트를 제공한다. 상기 키트는 당업계에 알려져 있는 통상의 제조방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 키트는 예를 들면, 동결 건조 형태의 항체와 완충액, 안정화제, 불활성 단백질 등을 포함할 수 있다.
상기 키트는 검출가능한 표지를 더 포함할 수 있다. 용어 "검출가능한 표지"는 표지가 없는 동일한 종류의 분자들 중에서 표지를 포함하는 분자를 특이적으로 검출하도록 하는 원자 또는 분자를 의미한다. 상기 검출가능한 표지는 상기 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 나노입자, 또는 압타머에 부착된 것일 수 있다. 상기 검출가능한 표지는 방사종(radionuclide), 형광원(fluorophore), 효소(enzyme)를 포함할 수 있다.
상기 키트는 당업계에 알려진 다양한 면역분석법 또는 면역염색법에 따라 이용될 수 있다. 상기 면역분석법 또는 면역염색법은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA, 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석, 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 키트는 RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(multiple reaction monitoring)인 것일 수 있다.
또한, 상기 키트는 질량분석에 이용될 수 있다. 이 경우, 상기 단백질의 특정 아미노산 잔기는 미리스토일화(myristoylation), 이소프레닐화, 프레닐화, 글리피칸화(glypiation), 리포일화(lipoylation), 아실화, 알킬화, 메틸화, 탈메틸화, 아미드화, 유비퀴틴화, 인산화, 탈아미드화, 글리코실화, 산화, 또는 아세틸화 등과 같은 변형을 가질 수 있다.
또한, 본 발명은 또한 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증이 의심되는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 티모신 베타 4(TYB4), 프로필린-1(PROF1), 액틴(ACTB) 및 탄산무수화효소 1(CAH1)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질의 발현 수준 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 단백질의 발현 수준 또는 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준이 대조군 시료에서 측정된 수준에 비해 증가하였는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
상기 방법에서 “생물학적 시료”(biological sample)란 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증 발병에 의해 단백질 발현 수준 또는 유전자 발현 수준이 차이가 나는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 의미하며, 바람직하게는 혈액, 혈장, 혈청, 안구 세포, 안구 조직, 안방수 또는 전방수를 의미한다.
상기 나이관련 황반변성 진단에 필요한 정보는 상기 개체가 초기 나이관련 황반변성 환자인지 여부 또는 후기 나이관련 황반변성 환자인지 여부에 대한 정보를 포함할 수 있다. 상기 당뇨망막병증 진단에 필요한 정보는 상기 개체가 증식성 망막증 환자인지 여부 또는 비증식성 망막증 환자인지 여부에 대한 정보를 포함할 수 있다.
상기 단백질 수준은 전술된 면역분석법 또는 면역염색법에 의해 측정될 수 있다. 또한, 상기 방법은 시료에서 TYB4, PROF1, ACTB 또는 CAH1 단백질 또는 이의 단편을 검출할 수 있는 마이크로칩 또는 자동화된 마이크로어레이 시스템의 형태로 실시될 수 있다.
상기 단백질 수준은 다중 반응 모니터링(multiple reaction monitoring: MRM), 병행 반응 모니터링(parallel reaction monitoring: PRM), sequential windowed data independent acquisition of the total high-resolution(SWATH), 선택 반응 모니터링(selected reaction monitoring: SRM) 또는 면역 다중 반응 모니터링(immuno multiple reaction monitoring: iMRM)을 이용하여 측정될 수도 있다. MRM은 물질의 정확한 단편을 결정하여 이를 질량분석기에서 깬 후, 한 번 깨진 이온 중 특정 이온을 한 번 더 선택하여 연속적으로 연결된 검출기를 이용하여 그 수를 얻는 방법이다. MRM 방법을 이용하는 경우, 정상인 개체와 나이관련 황반변성이 의심되는 개체의 혈액 시료에서 해당 단백질 또는 그의 단편을 질량분석기를 이용하여 정량할 수 있다.
상기 mRNA 수준은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR, 정량적 RT-PCR, RNase 보호 분석법, 노던 블롯, 또는 DNA 칩에 의해 측정될 수 있다.
상기 방법은 측정된 수준을 대조군 시료와 비교하여, 그 양이 대조군 시료에 비해 증가하였는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증이 의심되는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 TYB4, PROF1, ACTB 또는 CAH1 단백질 수준이 대조군 시료에 비해 증가한 것으로 결정된 경우, 상기 개체는 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증을 갖는 것으로 진단될 수 있다. 또한, 일반적인 생체 시료에서 단백질과 mRNA의 발현량이 양(positive)의 상관관계를 갖는 경우가 많으므로 TYB4, PROF1, ACTB 또는 CAH1 mRNA 수준이 대조군 시료에 비해 증가한 것으로 결정된 경우에도, 상기 개체는 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증을 갖는 것으로 진단될 수 있다.
나아가, 본 발명의 다른 양상은 티모신 베타 4(TYB4), 프로필린-1(PROF1), 액틴(ACTB) 및 탄산무수화효소 1(CAH1)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질의 발현 수준 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준이 대조군에 비해 증가된 세포 시료에 시험물질을 가하여 인큐베이션시키는 단계; 및 상기 인큐베이션시킨 세포에서 상기 선택된 하나 이상의 단백질 수준 또는 그의 mRNA 수준이 인큐베이션 전에 비해 감소되는지를 확인하는 단계를 포함하는 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막벽증 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 대조군은 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증을 갖지 않는 개체로부터 유래된 세포일 수 있다. 상기 대조군은 나이관련 황반변성 및 당뇨망막병증을 갖지 않는 개체로부터 유래된 세포일 수 있다.
일 양상에 따른, 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증 진단용 조성물, 진단용 키트, 또는 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법은, 환자의 혈장을 이용하는 새로운 면역학적 진단 도구로서, 민감도가 우수할 뿐만 아니라 생검을 이용하지 않고 혈장을 대상으로 간편하게 분석할 수 있어, 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증의 조기 진단에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 정상인의 혈장, 초기 AMD 환자의 혈장 및 후기 AMD 환자의 혈장에서 LC-MRM 방법을 이용하여 TYB4의 정규화 피크 넓이 값을 측정한 결과를 나타낸다.
도 2는 정상인의 혈장, 초기 AMD 환자의 혈장 및 후기 AMD 환자의 혈장에서 LC-MRM 방법을 이용하여 PROF1의 정규화 피크 넓이 값을 측정한 결과를 나타낸다.
도 3은 정상인의 혈장, 초기 AMD 환자의 혈장 및 후기 AMD 환자의 혈장에서 LC-MRM 방법을 이용하여 ACTB의 정규화 피크 넓이 값을 측정한 결과를 나타낸다.
도 4는 정상인의 혈장, 초기 AMD 환자의 혈장 및 후기 AMD 환자의 혈장에서 LC-MRM 방법을 이용하여 CAH1의 정규화 피크 넓이 값을 측정한 결과를 나타낸다.
도 5는 정상인의 혈장과 AMD 환자의 혈장 혈장에서 LC-MRM 방법을 이용하여 TYB4, PROF1, ACTB, 및 CAH1의 정규화 피크 넓이 값을 측정한 결과를 나타낸다.
도 6은 정상인의 혈장과 AMD 환자의 혈장 혈장에서의 TYB4, PROF1, ACTB, 및 CAH1의 정규화 피크 넓이 값을 이용한 ROC 곡선을 나타낸다.
도 7은 연령에 따른 각 단백질 발현 수준의 차이를 검정한 결과를 나타낸다.
도 8은 정상인의 혈장, 초기 AMD 환자의 혈장 및 후기 AMD 환자의 혈장에서 면역블랏팅 방법을 이용하여 PROF1 발현양상을 확인한 결과를 나타낸다.
도 9는 상기 면역블랏팅에 의해 측정된 PROF1 농도를 수치화 하여 통계 처리한 결과를 나타낸다.
도 10은 정상인의 혈장, PDR 환자의 혈장 및 NPDR 환자의 혈장에서 LC-MRM 방법을 이용하여 TYB4의 정규화 피크 넓이 값을 측정한 결과를 나타낸다.
도 11는 정상인의 혈장, PDR 환자의 혈장 및 NPDR 환자의 혈장에서 LC-MRM 방법을 이용하여 PROF1의 정규화 피크 넓이 값을 측정한 결과를 나타낸다.
도 12은 정상인의 혈장, PDR 환자의 혈장 및 NPDR 환자의 혈장에서 LC-MRM 방법을 이용하여 ACTB의 정규화 피크 넓이 값을 측정한 결과를 나타낸다.
도 13은 정상인의 혈장, PDR 환자의 혈장 및 NPDR 환자의 혈장에서 LC-MRM 방법을 이용하여 CAH1의 정규화 피크 넓이 값을 측정한 결과를 나타낸다.
도 14는 정상인의 혈장과 DR 환자의 혈장에서 LC-MRM 방법을 이용하여 TYB4, PROF1, ACTB, 및 CAH1의 정규화 피크 넓이 값을 측정한 결과를 나타낸다.
도 15은 정상인의 혈장과 DR 환자의 혈장에서의 TYB4, PROF1, ACTB, 및 CAH1의 정규화 피크 넓이 값을 이용한 ROC 곡선을 나타낸다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 나이관련 황반변성 환자의 혈장 바이오마커 동정
1.1. 환자 선정
혈장 프로테옴 중 바이오마커의 정량적 검증을 위하여 총 124개의 혈장 시료를 분석하였다. 분석 대상인 정상군 및 AMD 질환군의 특성을 하기 표 1에 요약하였다. 각 군 간 특성값을 통계 분석하였다. 3개군에 대한 일원분산분석(ANOVA)를 수행한 결과 p값이 0.987으로 나타나 통계적으로 유의미한 차이를 보이지 않았다. 또한, 3개군 중 임의로 선택된 2개군에 대하여 만-위트너 검정(Mann-whitney test)을 수행하였다. 그 결과, 정상군과 전체 AMD 질환군의 경우 p값이 0.783, 정상군과 초기 AMD 질환군의 경우 p값이 0.991, 정상군과 후기 AMD 질환군의 경우 p값이 0.717, 초기 AMD 질환군과 후기 AMD 질환군의 경우 p값이 0.830으로 나타나, 분석 대상의 특성으로 인한 편향(bias)이 없다는 것을 확인하였다.
특성 정상군 AMD 질환군
Early(초기) Late(후기)
총 수 60 21 43
평균연령(연령범위) 73.2(70-82) 73.2(64-80) 73.3(52-84)
성별(남자수, 여자수) 29, 31 9, 12 23, 20
1.2. 혈액 시료 전처리
상기 실시예 1.1에서 얻은 정상군 60명, 초기 나이관련 황반변성 환자 21명, 및 후기 나이관련 황반변성 환자 43명의 각 혈장 1.5 ㎕에 7 M이 되도록 요소(urea)를 첨가한 후 10 mM이 되도록 2-카르보실에틸트리스포스파인(Tris(2-carboxyethyl)-phosphine)을 첨가하고 25℃에서 1시간 동안 반응시켜 이황화결합을 환원시켰다. 그 후, 알킬화를 위해 15 mM이 되도록 아이오도아세트아미드(iodoacetamide)를 가하여 암조건 하에 실온에서 1시간 동안 반응시키고, 여기에 혈장 단백질과 라이스씨(wako) 효소의 질량 비율이 100:1이 되도록 라이스씨 효소를 넣고 실온에서 4시간 동안 반응시켰다. 그 후, 50 mM 트리스(Tris)로 10배 희석하고 시퀀싱이 가능한 수준의 트립신(Promega)을 단백질과 트립신의 질량 비율이 50:1이 되도록 첨가하여 37℃에서 16시간 동안 반응시켜 펩티드 절편으로 분해하였다. 0.3%가 되도록 포름산 용액을 가하여 pH 2.0 이하로 산성화시키고 트립신 반응을 멈추게 하였다. 여기에 내부 표준 물질인 E.coli 유래의 분해된 베타-갈락토시다아제 펩티드 혼합물(SCIEX) 150 fmol을 첨가한 후, 액체 크로마토그래피-다중 반응 모니터링(liquid chromatography-multiple reaction monitoring: LC-MRM)을 이용하여 분석하였다.
1.3. 트랜지션(transition)의 선정
나이관련 황반변성 질환을 갖는 환자 20명의 혈장을 모아 합한 시료와 질환을 갖지 않는 정상군 20명의 혈장을 모아 합한 시료에 대하여 각각 4차원 분리방법으로 LC-MS/MS를 수행하였다. 첫 번째 단백질 분리방법으로서, Top-6 MARS 컬럼(Agilent)을 이용하여 혈청의 대부분을 차지하는 6종 단백질인 알부민, 면역글로불린 A, 면역글로불린 G, 트랜스페린, 트립신 저해제 및 헵토글리빈을 제거하였다. 두 번째 단백질 분리방법으로서, gel-eluted liquid fractionation entrapment electrophoresis(GELFrEE 8100 fractionation system)을 이용하여 단백질을 크기에 따라 5개 분획으로 나누었다. 실시예 1.2의 방법에 따라 각 분획에 대하여 트립신을 이용하여 펩티드 절편으로 분해하였다. 세 번째 펩티드 분리방법으로서, OFFGEL fractionator(Agilent)를 이용하여 5개 분획에 대해 등전점에 따라 분리하여 각각 14개 분획으로 더 세분하였다. 시료 당 총 70개로 세분된 분획에 대하여, 네 번째 분리방법으로서 역상 MAGIC C18aq 컬럼(12 ㎝×75 ㎛, Eksigent MDLC system)을 이용하였고, LTQ Obitrap 질량분석기(Thermo Scientific) LC-MS/MS를 통해 스펙트럼을 얻었다. G-test를 이용하여 두 시료 간 스펙트럼 개수의 차이를 통계적으로 분석하였다.
그 결과, TYB4의 펩티드 스펙트럼의 수는 정상군에서 2개, AMD 질환군에서 11개이고(G-value: 6.360), PROF1은 정상군에서 0개, AMD 질환군에서 13개이며(G-value: 15.235), ACTB은 정상군에서 7개, AMD 질환군에서 29개이고(G-value: 14.211), CAH1은 정상군에서 11개, AMD 질환군에서 23개(G-value: 4.311)로 나타났다. p값은 0.05 이하로 통계적으로 유의미한 차이를 보였다. 스펙트럼 수에서 유의미하게 차이가 나는 이 4종 단백질에 대해 다중 반응 모니터링(multiple reaction monitoring: MRM) 분석을 통해 더 정밀하게 정량하였다.
MRM 분석을 수행하기 위해 4개의 타겟 단백질에 대해 특징적인 전하대 질량비(m/z)를 갖는 대표 펩티드를 선정하고(Q1 transition), 이 펩티드를 전기적인 충격으로 깨서 발생하는 단편화 이온(fragmentation ion) 중 가장 강도가 높은 이온(Q3)을 선정하였다. 각 단백질 당 감도 높은 1개 이상의 펩티드를 측정하고 이를 기초로 합성된 펩티드를 질량분석기에 주입하여 각 트랜지션 당 파편화 에너지의 최적화 값을 얻었다. 이 중 강도를 기준으로 3개 이상의 상위 단편화 이온을 선택하였다(표 2).
서열 ID 유전자명 트립신 절편 표적이온 표적 m/z
Target SEQ 1 TYB4 NPLPSK 2y3 328.192/331.198
Target SEQ 2 PROF1 STGGAPTFNVTVTK 2y9 690.362/503.782
Target SEQ 3 ACTB AGFAGDDAPR 2y6 488.728/630.284
Target SEQ 4 CAH1 VLDALQAIK 2y7 485.8/758.441
Normalization SEQ 1 MAGI1 HGPATGPQGVPEVR 3b9 467.913/803.379
Normalization SEQ 2 F13A DGTHVVENVDATHIGK 3y15 564.616/526.274
Normalization SEQ 3 ITIH1 AAISGENAGLVR 2y9 579.317/902.469
Normalization SEQ 4 KNG1 TVGSDTFYSFK 2y9 626.298/1051.473
Normalization SEQ 5 Clusterin ELDESLQVAER 2y5 644.823/602.326
Normalization SEQ 6 SERPINA1 LSITGTYDLK 2y7 555.806/797.404
Normalization SEQ 7 Prothrombin ETAASLLQAGYK 2y6 626.333/679.377
Spiked SEQ 1 BGAL_ECOLI GDFQFNISR 2y4 542.265/489.278
Spiked SEQ 2 BGAL_ECOLI TLFISR 2y4 368.721/522.304
Spiked SEQ 3 BGAL_ECOLI IDPNAWVER 2y7 550.28/436.225
1.4. LC 및 MRM
LC는 nanoLC-Ultra 2D plus(Eksigent)를 사용하였다. 직경 3 ㎛, 기공 크기(pore size) 120 Å의 C18 수지(resin)로 이루어진 길이 15 cm, 내경 75 ㎛의 silica capillary를 칩 형태로 만든 컬럼을 사용하여 펩티드를 분리하였다. 용액 A(99.9% 증류수, 0.1% 포름산)와 용액 B(99.9% 아세토니트릴, 0.1% 포름산)를 적절한 비율로 섞어 용매로 사용하였고 유속은 300 nl/분이었다. 5%B의 농도로 섞은 용매를 10분간 흐르게 하여 컬럼을 평형상태로 만든 후, 펩티드 시료 1.0 ㎕를 트랩 컬럼(trap column)을 거치지 않고 분석용 컬럼으로 직접 주입하였다. 시료 주입 후 5%B 용매를 5분간 더 흐르게 하였고 뒤이어 5%B에서 50%B까지 총 45분 동안 용액 B의 농도를 분당 1%씩 증가시키면서 펩티드를 용출하였다.
질량 분석에서는 삼중 사극자 질량분석기인 QTrap 5500(SCIEX) 장비를 이용하여 각 선정 단백질의 트랜지션에 대해 MRM 모드로 모니터링을 하였다. 2200 볼트의 이온 전압을 사용하고 및 Quadruple 1(Q1)과 Quadruple 3(Q3)에서의 해상능을 유닛(unit)으로 설정하였다. 트랜지션에 대한 체류 시간(dwell time)을 20 밀리초로 설정하여 총 사이클 시간이 2.5초가 되도록 설정하였다. 25 unit의 분무 가스(nebulizing gas)를 사용하고 히터 온도를 150℃로 설정하였다. 배치(batch) 간 변이를 보정하기 위해 각 시료에 내부 표준 물질인 E.coli 유래의 분해된 베타-갈락토시다아제 펩티드(beta-galactosidase peptides, 잔기 954-962, GDFQFNISR, 잔기 848-854, TLFISR, 잔기 802-810, IDPNAWVER) 150 fmol을 스파이킹 하고 동시에 모니터링 하였다. MS 구동 시간은 LC와 시간 동조로 50분 동안 진행하며 MS 및 LC는 Analyst 1.5.2를 사용하여 구동하였다.
1.5. 데이터 분석
혈청 중 타겟 단백질의 양을 비교하기 위해서, 내인성(endogenous) 혈청 단백질 중 군 간 차이를 보이지 않고 보정 가능한 정규화 인자(normalization factor)인 새로운 7개 혈장 단백질을 찾았다. 이 7개 단백질은 막 관련 구아닐레이트 키나아제(membrane-associated guanylate kinase: MAGI1), 응고 인자 13a(coagulation factor XIIIa: F13A), 인터-알파-트립신 억제인자 중연쇄 H1(inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1: ITIH1), 키니노겐-1(kininogen-1: KNG1), 클러스테린(clusterin), 알파-1-앤트립신(alpha-1-antitrypsin: SERPINA1) 및 프로트롬빈(prothrombin)이다.
이 7개 단백질의 대표 펩티드에 대한 이온 추출 크로마토그램(extracted ion chromatogram: XIC) 값을 총 124개의 혈청 중 raw 값의 각 펩티드의 XIC의 피크 면적 값의 중앙값으로 나눈 후 각 시료당 7개의 펩티드에서 중앙값을 구한 것을 최종 정규화 인자로 정의하고 타겟 펩티드의 XIC 값을 최종 정규화 인자로 나누어 주었다. 정규화된 값을 이용하여 정상군과 질환군 간 통계 분석을 실시하였다. 곡선 아래 면적(AUC) 값은 95% 신뢰 레벨에서 AMD에 대해서 나타내었다.
3개군 간 혈장 중 TYB4의 통계적 차이를 서로 다른 2군의 총 3번의 독립적인 t-검정을 통해 비교하였다. 정상군과 초기 AMD 질환군 간의 p값은 0.001 이하이고, 정상군과 후기 AMD 질환군 간의 p값은 0.001 이하이며, 초기 AMD 질환군과 후기 AMD 질환군 간의 p값은 0.006으로 나타나, 세 경우 모두 통계적으로 유의미한 차이를 보였다. 정상군과 AMD 질환군 간의 TYB4의 측정치를 기준으로 한 수신자 조작 특성(receiver operating characteristic: ROC) 분석 곡선의 곡선 아래 면적 값은 0.936이었다(도 1).
3개군 간 혈장 중 PROF1의 통계적 차이를 TYB4와 같은 방법으로 분석하였다. 정상군과 초기 AMD 질환군 간의 p값은 0.001 이하이고, 정상군과 후기 AMD 질환군 간의 p값은 0.001 이하로 나타나 통계적으로 유의미한 차이를 보였지만, 초기 AMD 질환군과 후기 AMD 질환군 간의 p값은 0.051로 나타나 통계적으로 유의미한 차이를 보이지 않았다. 정상군과 AMD 질환군 간의 PROF1의 측정치를 기준으로 한 수신자 조작 특성 분석 곡선의 곡선 아래 면적 값은 0.960이었다(도 2).
3개군 간 혈장 중 ACTB의 통계적 차이를 TYB4와 같은 방법으로 분석하였다. 정상군과 초기 AMD 질환군 간의 p값은 0.001 이하이고, 정상군과 후기 AMD 질환군 간의 p값은 0.001 이하로 나타나 통계적으로 유의미한 차이를 보였지만, 초기 AMD 질환군과 후기 AMD 질환군 간의 p값은 0.111로 나타나 통계적으로 유의미한 차이를 보이지 않았다. 정상군과 AMD 질환군 간의 ACTB의 측정치를 기준으로 한 수신자 조작 특성 분석 곡선의 곡선 아래 면적 값은 0.949였다(도 3).
3개군 간 혈장 중 CAH1의 통계적 차이를 TYB4와 같은 방법으로 분석하였다. 정상군과 초기 AMD 질환군 간의 p값은 0.908로 나타나 통계적으로 유의미한 차이를 보이지 않았지만, 정상군과 후기 AMD 질환군 간의 p값은 0.001 이하이고, 초기 AMD 질환군과 후기 AMD 질환군 간의 p값은 0.001 이하로 나타나 통계적으로 유의미한 차이를 보였다. 정상군과 AMD 질환군 간의 CAH1의 측정치를 기준으로 수신자 조작 특성 분석 곡선의 곡선 아래 면적 값은 0.714였다(도 4).
도 5는 정상군 60명과 AMD 질환군 64명의 혈장 중 4개의 단백질 TYB4, PROF1, ACTB, 및 CAH1의 양적 차이에 의한 독립적인 t-검정결과이다. 4개의 단백질 모두 p값이 0.05보다 작은 것으로 나타나 통계적으로 유의미한 차이를 보였다.
도 6은 도 5의 데이터를 기준으로 수신자 조작 특성을 수행한 값이다. TYB4의 AUC 값은 0.949, PROF1의 AUC 값은 0.960, ACTB의 AUC 값은 0.949, CAH1의 AUC 값은 0.714였다.
1.6. 면역블랏팅
새로운 정상군 50명, 초기 나이관련 황반변성 환자 50명, 후기 나이관련 황반변성 환자 50명으로부터 각각 혈장 시료 2 ㎕를 수집하고, PBS로 25배 희석하여 얻은 30 ㎕와 2% SDS 및 2% 베타 머캅토에탄올(beta mercaptoethanol)이 포함된 50 mM Tris-HCL(pH 6.8) 완충용액을 혼합한 후, 15% SDS 폴리아크릴아마이드 겔을 이용하여 전기영동을 수행하였다. 전기영동에 의해 분리된 혈장 단백질을 50 mM Tris HCL, 130 mM 글리신, 0.05% SDS 및 12.5% 메탄올이 포함된 완충용액 내에서 90 V, 200 mA의 조건에서 PVDF 멤브레인으로 전이시키고, 전이된 멤브레인을 5% 탈지분유(skim milk)가 함유된 TBST(Tris-buffered saline with Tween 20) 완충용액에서 30분간 반응시켰다. 이후, PVDF 멤브레인과 PROF1에 대한 항체(ab124904, 1:2000, Abcam)를 4 ℃에서 16시간 동안 반응시킨 다음, TBST로 3회 세척하였고, 항-PROF 1의 래빗 면역글로불린과 결합하는 래빗 IgG-HRP(1:3000, Cell signaling) 25 ℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 다시 TBST로 3회 세척하였다. 이어서 상기 PVDF 멤브레인을 Clarity Western ECL(enhanced chemiluminescence, BIO-RAD) substrate와 반응시키고, chemiluminescence imaging system (Davinch-ChemiTM)을 이용하여 발색시킨 후 각각의 단백질 농도를 확인하였다.
도 8은 정상군(Healthy, H), 초기 황반변성 환자군(Early AMD, E), 후기 황반변성 환자군(Late AMD, L), 통합(pooling)된 후기 황반변성 환자(Control, C)의 혈장 단백질 시료를 각각 전기영동 한 후, 항-PROF1 항체로 면역블랏팅을 수행한 결과를 나타낸다.
도 9는 도 8의 면역블랏팅에 의해 측정된 PROF1 농도를 수치화 하여 통계 처리한 결과를 나타낸다. 면역블랏팅 결과에서 나타난 농도를 수치화하여, 도 9a에 그래프로 나타내었다. 그 결과 PROF1은 정상군에 비하여 초기 황반변성 환자군에서 3.4배, 후기 황반변성 환자군에서 7.3배 증가함을 확인할 수 있었다. 도 9b는 측정된 PROF1의 농도를 수용자-조작 특성(ROC) 그래프로 나타낸 것이다. PROF1의 AUC(area under the ROC curve)는 0.808로 상기 분석이 민감성과 정확성을 갖추고 있음을 알 수 있었다. 상기 결과로부터 혈장 내 PROF1을 선택적으로 인식하는 항체를 사용함으로써, 정상군과 비교하여 상대적으로 증가한 PROF1 단백질의 농도를 나타내는 피시험자를 나이관련 황반변성 환자로 진단할 수 있음을 확인하였다.
실시예 2: 당뇨망막병증 환자의 혈장 바이오마커 동정
1.1. 환자 특성 검정
당뇨망막병증(DR) 환자의 혈장을 이용하여 실시예 1과 동일하게 실험을 수행하였다. 분석 대상인 정상군 및 DR 질환군의 특성을 하기 표 3에 요약하였다. 각 군 간 특성값을 통계 분석하였다.
연령에 따른 각 단백질 수준의 경향을 파악하기 위해, 각 단백질에서 정상군, 증식성 당뇨망막병증 질환군(PDR 군), 및 비증식성 당뇨망막병증 질환군(NPDR 군)을 중앙값을 기준으로 연령에 따라 두 개의 집단으로 나누었다; 저연령 정상군(Y-control) 및 고연령 정상군(O-control); 저연령 PDR 군(Y-PDR) 및 고연령 PDR 군(O-PDR); 및 저연령 NDPR 군(Y-NDPR), 고연령 NDPR 군(O-NDPR). 도 7에 나타낸 바와 같이, 정상군(n=60)에서 저연령 정상군과 고연령 정상군 간 TYB4의 정규화 피크 넓이 값을 만-위트너 검정을 통해 분석한 결과, 연령에 따른 차이가 통계적으로 유의미하지 않았다(p값 > 0.05). PDR 군(n=20) 및 NPDR 군(n=20)에 대해서도 위와 같은 방법으로 검정한 결과, 연령에 따른 차이가 통계적으로 유의미하지 않았다. PROF1 및 ACTB의 경우에도 TYB4와 동일한 결과를 나타내어, TYB4, PROF1 및 ACTB의 발현 수준이 연령에 의해 영향받지 않는다는 것을 확인하였다. 성별에 있어서도 PDR 군과 정상군 간 p값이 1.000이고 NPDR 군과 정상군 간 p값이 1.0으로 나타나, 통계적으로 유의미한 차이를 보이지 않았다.
특성 정상군 DR 질환군
PDR(증식성) NPDR(비증식성)
총 수 60 20 20
평균연령(연령범위) 73.2(70-82) 57.7(45-76) 60.5(37-78)
성별(남자수, 여자수) 29, 31 10, 10 9, 11
실시예 1에 기재된 방법과 동일하게 혈액 시료 전처리, 트랜지션의 선정, LC 및 MRM 분석, 및 데이터 분석을 수행하였다. 정상군, PDR 군, 및 NPDR 군 중 서로 다른 2개군 간 총 3번의 독립적인 t-검정을 통해 혈장 중 TYB4 발현 수준의 통계적 차이를 비교하였다. 정상군과 PDR 군 간의 p값은 0.002이고, 정상군과 NPDR 군 간의 p값은 0.014으로 통계적으로 유의미한 차이를 보였다. PDR 군과 NPDR 군 간의 p값은 0.197으로 통계적으로 유의미한 차이를 보이지 않았다. 정상군과 DR 질환군 간의 TYB4의 측정치를 기준으로 한 수신자 조작 특성 분석 곡선의 곡선 아래 면적 값은 0.895이었다(도 10).
위 3개군 간 혈장 중 PROF1의 통계적 차이를 TYB4와 같은 방법으로 분석하였다. 정상군과 PDR 군 간의 p값은 0.001이고, 정상군과 NPDR 군 간의 p값은 0.001으로 통계적으로 유의미한 차이를 보였다. PDR 군과 NPDR 군 간의 p값은 0.194으로 통계적으로 유의미한 차이를 보이지 않았다. 정상군과 DR 질환군 간의 PROF1의 측정치를 기준으로 한 수신자 조작 특성 분석 곡선의 곡선 아래 면적 값은 0.873이었다(도 11).
위 3개군 간 혈장 중 ACTB의 통계적 차이를 TYB4와 같은 방법으로 분석하였다. 정상군과 PDR 군 간의 p값은 0.002이고, 정상군과 NPDR 군 간의 p값은 0.005으로 통계적으로 유의미한 차이를 보였다. PDR 군과 NPDR 군 간의 p값은 0.2352으로 통계적으로 유의미한 차이를 보이지 않았다. 정상군과 DR 질환군 간의 ACTB의 측정치를 기준으로 한 수신자 조작 특성 분석 곡선의 곡선 아래 면적 값은 0.953였다(도 12).
위 3개군 간 혈장 중 CAH1의 통계적 차이를 TYB4와 같은 방법으로 분석하였다. 정상군과 PDR 군 간의 p값은 0.171으로 통계적으로 유의미한 차이를 보이지 않았다. 정상군과 NPDR 군 간의 p값은 0.033으로 통계적으로 유의미하였다. PDR 군과 NPDR 군 간의 p값은 0.620으로 통계적으로 유의미한 차이를 보이지 않았다. 정상군과 DR 질환군 간의 CAH1의 측정치를 기준으로 수신자 조작 특성 분석 곡선의 곡선 아래 면적 값은 0.653이었다(도 13).
도 14는 정상군 60명과 당뇨망막병증 질환군 40명의 혈장 중 4개의 단백질 TYB4, PROF1, ACTB, 및 CAH1의 양적 차이에 대한 독립적인 t-검정 결과를 나타낸다. 4개의 단백질 모두 p값이 0.05보다 작은 것으로 나타나 통계적으로 유의미한 차이를 보였다. 도 15은 이 데이터를 기준으로 수신자 조작 특성을 수행한 결과를 나타낸다. TYB4의 AUC 값은 0.895, PROF1의 AUC 값은 0.873, ACTB의 AUC 값은 0.953, CAH1의 AUC 값은 0.653이었다.

Claims (15)

  1. 티모신 베타 4(Thymosin beta-4: TYB4), 프로필린-1(Profilin-1: PROF1), 액틴(Actin: ACTB) 및 탄산무수화효소 1(Carbonic anhydrase 1: CAH1)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질의 발현 수준 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 나이관련 황반변성(age-related macular degeneration: AMD) 또는 당뇨망막병증(diabetic retinopathy: DR) 진단용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 단백질 수준을 특정하는 물질이 상기 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 올리고펩타이드, PNA(peptide nucleic acid), 나노입자 또는 압타머를 포함하는 것을 특징으로 하는 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증 진단용 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 mRNA 수준을 측정하는 물질이 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증 진단용 조성물.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 진단이 초기 나이관련 황반변성 또는 후기 나이관련 황반변성에 대한 진단을 포함하는 것인 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증 진단용 조성물.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 티모신 베타 4(TYB4)가 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것인 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증 진단용 조성물.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 프로필린-1(PROF1)가 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 것인 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증 진단용 조성물.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 액틴(ACTB)가 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 것인 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증 진단용 조성물.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 탄산무수화효소 1(CAH1)가 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 것인 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증 진단용 조성물.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는, 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증 진단용 키트.
  10. 제 9항에 있어서,
    검출 가능한 표지를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증 진단용 키트.
  11. 제 9항에 있어서,
    상기 키트가 RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(multiple reaction monitoring) 키트인 것을 특징으로 하는 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증 진단용 키트.
  12. 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증이 의심되는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 티모신 베타 4(TYB4), 프로필린-1(PROF1), 액틴(ACTB) 및 탄산무수화효소 1(CAH1)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질의 발현 수준 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    상기 측정된 단백질의 발현 수준 또는 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준이 대조군 시료에서 측정된 수준에 비해 증가하였는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 안구 세포, 안구 조직, 안방수 및 전방수로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  14. 제 12항에 있어서,
    상기 진단에 필요한 정보는 개체가 초기 나이관련 황반변성 환자인지 여부 또는 후기 나이관련 황반변성 환자인지 여부에 대한 정보를 포함하는 것을 특징으로 하는 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막병증 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  15. 티모신 베타 4(TYB4), 프로필린-1(PROF1), 액틴(ACTB) 및 탄산무수화효소 1(CAH1)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질의 발현 수준 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준이 대조군에 비해 증가된 세포 시료에 시험물질을 가하여 인큐베이션시키는 단계; 및
    상기 인큐베이션시킨 세포에서 상기 선택된 하나 이상의 단백질 수준 또는 그의 mRNA 수준이 인큐베이션 전에 비해 감소되는지를 확인하는 단계를 포함하는 나이관련 황반변성 또는 당뇨망막벽증 치료용 물질의 스크리닝 방법.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113544513A (zh) * 2019-03-07 2021-10-22 雷帝标志有限公司 用于诊断糖尿病视网膜病变的复合生物标志物及其用途
EP3936869A4 (en) * 2019-03-07 2022-12-21 Reti Mark Co., Ltd. COMPOSITE MARKER FOR DIAGNOSIS OF AGE-RELATED MACULAR DE GENERATION AND ITS USE

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20140117772A (ko) * 2013-03-26 2014-10-08 한국과학기술연구원 나이관련 황반변성 진단용 마커 및 이를 이용한 나이 관련 황반 변성 진단 방법

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20140117772A (ko) * 2013-03-26 2014-10-08 한국과학기술연구원 나이관련 황반변성 진단용 마커 및 이를 이용한 나이 관련 황반 변성 진단 방법

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEN, X. ET AL.: "Diabetes mellitus and risk of age-related macular degeneration: a systematic review and meta-analysis", PLOS ONE, vol. 9, no. 9, September 2014 (2014-09-01), pages 1 - 12, XP055598338, DOI: 10.1371/journal.pone.0108196 *
GIBSON: "Diabetic retinopathy and age-related macular degeneration in the US", AMERICAN JOURNAL OF PREVENTIVE MEDICINE, vol. 43, no. 1, 2012, pages 48 - 54, XP028493116, DOI: doi:10.1016/j.amepre.2012.02.028 *
KIM: "Identification of vinculin as a potential plasma marker for age-related macular degeneration", INVESTIGATIVE OPHTHALMOLOGY AND VISUAL SCIENCE, vol. 55, no. 11, 2014, pages 7166 - 7176, XP055598335, DOI: 10.1167/iovs.14-15168 *
WANG: "Intraocular expression of thymosin beta 4 in proliferative diabetic retinopathy", ACTA OPHTHALMOLOGICA, vol. 89, no. 5, 2011, pages e396 - e403, XP055598336, DOI: 10.1111/j.1755-3768.2011.02114.x *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113544513A (zh) * 2019-03-07 2021-10-22 雷帝标志有限公司 用于诊断糖尿病视网膜病变的复合生物标志物及其用途
EP3936869A4 (en) * 2019-03-07 2022-12-21 Reti Mark Co., Ltd. COMPOSITE MARKER FOR DIAGNOSIS OF AGE-RELATED MACULAR DE GENERATION AND ITS USE
EP3955001A4 (en) * 2019-03-07 2022-12-21 Reti Mark Co., Ltd. COMPOSITE MARKER FOR THE DIAGNOSIS OF DIABETIC RETINOPATHY AND USE THEREOF

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