CN113544513A

CN113544513A - 用于诊断糖尿病视网膜病变的复合生物标志物及其用途

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Publication number: CN113544513A
Application number: CN202080019161.9A
Authority: CN
Inventors: 朴晟濬; 李泳珠; 金惠林
Original assignee: Leidi Logo Co ltd
Current assignee: Leidi Logo Co ltd
Priority date: 2019-03-07
Filing date: 2020-03-06
Publication date: 2021-10-22
Also published as: EP3955001A4; KR20200107858A; US20220146531A1; AU2020232805B2; JP2022524775A; WO2020180146A1; JP7224690B2; KR102309635B1; EP3955001A1; AU2020232805A1

Abstract

本发明涉及用于诊断糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy)的复合生物标志物及其用途，更详细地，涉及由对于糖尿病视网膜病变诊断特异性的两种以上的血液生物标志物组成来提高诊断性能的用于诊断糖尿病视网膜病变的复合生物标志物。并且，涉及利用上述复合生物标志物的用于诊断糖尿病视网膜病变的组合物、诊断试剂盒及诊断糖尿病视网膜病变所需的信息提供方法。不仅确认了本发明的用于诊断糖尿病视网膜病变的复合生物标志物的灵敏度及诊断性能与其他生物标志物的组合相比更优秀，还确认了若结合复合生物标志物的蛋白质定量值和基础临床信息来进行分析，则在早期糖尿病视网膜病变中示出高诊断能力。并且，本发明的复合生物标志物可利用患者血浆简单分析，而不是利用血液蛋白质进行活组织检查，由此可有用地用于糖尿病视网膜病变的早期诊断。

Description

用于诊断糖尿病视网膜病变的复合生物标志物及其用途

技术领域

本发明涉及用于诊断糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy)的复合生物标志物及其用途，更详细地，涉及由对于糖尿病视网膜病变诊断特异性的两种以上的血液生物标志物组成来提高诊断性能的用于诊断糖尿病视网膜病变的复合生物标志物。并且，涉及利用上述复合生物标志物的用于诊断糖尿病视网膜病变的组合物、诊断试剂盒及诊断糖尿病视网膜病变所需的信息提供方法。

背景技术

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR或DMR)为在视网膜的微血管受损时表现出的糖尿病的典型并发症，与年龄相关性黄斑变性、青光眼一同为眼科三大失明疾病之一。根据韩国健康保险审查评估院，糖尿病患者从2012年的约200万名增加至2016年的约245万名，约增加21％，但糖尿病视网膜病变患者数从2012年的约26万名增加至2016年的33万6000名，增加38％，增幅大于糖尿病。

由于糖尿病导致血糖升高，持续高血糖会扰乱视网膜血管的微循环，使向眼球的后半部视网膜供给营养的血管变窄或阻塞，由此使废物堆积，从而导致出血。在该部位异常形成新血管，由此无法进行正常血管功能并引起出血，从而诱发糖尿病视网膜病变。

糖尿病视网膜病变根据严重程度分为非增殖性糖尿病视网膜病变(non-proliferative diabetic retinopathy，NPDR)和增殖性糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy，PDR)。并且，在非增殖性糖尿病视网膜病变的情况下，根据严重程度分为轻度(mild)、中度(moderate)及重度(severe)非增殖性糖尿病视网膜病变。非增殖性糖尿病视网膜病变表现出视网膜的出血、微血管瘤、棉絮斑等的症状，但好视力一直保持到很晚。在增殖性糖尿病视网膜病变中，在视网膜生成新的血管，若该血管破裂，则导致玻璃体腔严重出血，虽然会随着时间的推移被吸收，但变为纤维性组织，之后引起牵引性视网膜剥离及再出血，从而导致永久性失明。

糖尿病视网膜病变早期症状少，因此难以早期诊断，当表现出症状(视力降低、丧失焦点、眩光)时，病情已经进展，即使进行治疗(激光、玻璃体手术)，也会恶化并导致失明的患者多。但是，若在发病初期接受适当的治疗并彻底进行血糖管理，则可保持视力，对糖尿病视网膜病变的早期发现和抑制及早期治疗高危人群的需求备受关注。但是具有如下的问题，即，目前为止，确切的病因仍然未知，判断视网膜病变的进展程度的生物标志物也非常有限。

因此，本发明人发现了一种灵敏度及特异性高的血液蛋白质标志物，并试图复合利用其来提高糖尿病视网膜病变早期诊断能力，结果确认了包含MBL2(甘露糖结合蛋白C(mannose-binding protein C))、PNLIP(胰腺三酰甘油脂肪酶(pancreatictriacylglycerol lipase))、LGALS3BP(半乳糖凝集素3结合蛋白(galectin-3-bindingprotein))及IGFBP2(胰岛素样生长因子结合蛋白2(insulin like growth factorbinding protein 2))的复合生物标志物的糖尿病视网膜病变诊断效率优秀，从而完成了本发明。

发明内容

技术问题

本发明的目的在于，提供包含对于糖尿病视网膜病变诊断特异性的血液生物标志物的用于诊断糖尿病视网膜病变的复合生物标志物。

本发明的再一目的在于，提供利用上述用于诊断糖尿病视网膜病变的复合生物标志物的用于诊断糖尿病视网膜病变的组合物或诊断试剂盒。

本发明的另一目的在于，提供利用上述用于诊断糖尿病视网膜病变的复合生物标志物的诊断糖尿病视网膜病变所需的信息提供方法。

技术方案

为了实现上述目的，本发明提供用于诊断糖尿病视网膜病变的复合生物标志物，其包含MBL2(甘露糖结合蛋白C)、PNLIP(胰腺三酰甘油脂肪酶)、LGALS3BP(半乳糖凝集素3结合蛋白)及IGFBP2(胰岛素样生长因子结合蛋白2)。

在本发明的一优选实施例中，上述复合生物标志物还可包含选自由ADAMTSL2(ADAMTS样蛋白2(ADAMTS-like protein 2))、Cp(铜蓝蛋白(Ceruloplasmin))、CFH(补充因子H(complement factor H))、DDI2(蛋白质DDI1同源物2(Protein DDI1 homolog2))、FCN2(纤维蛋白胶2(Ficolin 2))、SELE(E-选择素(E-selectin))、SIGLEC14(唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素14(Sialic acid-binding Ig-like lectin 14))、THBS1(血小板反应蛋白-1(Thrombospondin-1))及ZG16B(酶原颗粒蛋白16同源物B(Zymogen granule protein16homolog B))组成的组中的一种以上的生物标志物。

并且，本发明提供用于诊断糖尿病视网膜病变的组合物，其包含用于测量用于诊断糖尿病视网膜病变的复合生物标志物的信使核糖核酸(mRNA)或蛋白质水平的制剂，上述用于诊断糖尿病视网膜病变的复合生物标志物包含MBL2(甘露糖结合蛋白C)、PNLIP(胰腺三酰甘油脂肪酶)、LGALS3BP(半乳糖凝集素3结合蛋白)及IGFBP2(胰岛素样生长因子结合蛋白2)。

在本发明的一优选实施例中，上述复合生物标志物还可包含选自由ADAMTSL2(ADAMTS样蛋白2)、Cp(铜蓝蛋白)、CFH(补充因子H)、DDI2(蛋白质DDI1同源物2)、FCN2(纤维蛋白胶2)、SELE(E-选择素)、SIGLEC14(唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素14)、THBS1(血小板反应蛋白-1)及ZG16B(酶原颗粒蛋白16同源物B)组成的组中的一种以上的生物标志物。

在本发明的再一优选实施例中，用于测量上述复合生物标志物的信使核糖核酸水平的制剂可以为与上述生物标志物的基因特异性结合的引物对、探针或反义核苷酸。

在本发明的另一优选实施例中，用于测量上述复合生物标志物的蛋白质水平的制剂还可包含与上述蛋白质或肽片段特异性结合的抗体、相互作用蛋白、配体、纳米粒子(nanoparticles)或适配体(aptamer)。

并且，本发明提供包含上述用于诊断糖尿病视网膜病变的组合物的用于诊断糖尿病视网膜病变的试剂盒。

在本发明的一优选实施例中，上述试剂盒可以为逆转录聚合酶链反应(RT-PCR，Reverse transcription polymerase chain reaction)试剂盒、脱氧核糖核酸(DNA)芯片试剂盒、酶联免疫吸附测定(ELISA，Enzyme linked immunosorbent assay)试剂盒、蛋白芯片试剂盒、快速(rapid)试剂盒或多反应监测(MRM，Multiple reaction monitoring)试剂盒。

并且，本发明提供用于诊断糖尿病视网膜病变的信息提供方法，其包括：步骤(a)，利用患者的生物学试样测量包含MBL2(甘露糖结合蛋白C)、PNLIP(胰腺三酰甘油脂肪酶)、LGALS3BP(半乳糖凝集素3结合蛋白)及IGFBP2(胰岛素样生长因子结合蛋白2)的用于诊断糖尿病视网膜病变的复合生物标志物的信使核糖核酸或蛋白质水平；以及步骤(b)，与对照组试样比较上述信使核糖核酸或蛋白质表达水平。

在本发明的再一优选实施例中，上述用于诊断糖尿病视网膜病变的信息提供方法还可包含选自由患者的年龄、身体质量指数(BMI，body mass index)、是否吸烟、糖化血红蛋白(Hb1Ac)检测结果、是否进行胰岛素治疗、是否患有高血压、是否患有高血脂及是否患有心血管疾病组成的组中的一种以上的临床信息来与对照组进行比较。

在本发明的另一优选实施例中，上述用于诊断糖尿病视网膜病变的信息提供方法还可包括如下的步骤，即，若复合生物标志物的基因表达水平或蛋白质表达水平与对照组相比增加，则判断为糖尿病视网膜病变。

在本发明的还有一优选实施例中，上述信使核糖核酸表达水平测量可利用逆转录酶聚合酶反应、竞争性逆转录酶聚合酶反应、实时逆转录酶聚合酶反应、RNA酶保护分析法、诺瑟杂交或脱氧核糖核酸芯片来执行。

在本发明的又一优选实施例中，上述蛋白质表达水平测量可利用多反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)、平行反应监测(parallel reaction monitoring，PRM)、连续窗口数据独立获取总高分辨率(sequential windowed data independentacquisition of the total high-resolution，SWATH)、选择反应监测(selectedreaction monitoring，SRM)或免疫多反应监测(immuno multiple reaction monitoring，iMRM)来执行。

在本发明的又一优选实施例中，上述步骤(b)的分析可通过统计学分析方法执行。

在本发明的又一优选实施例中，上述统计学分析方法可选自由线性或非线性回归分析方法、线性或非线性分类(classification)分析方法、逻辑回归分析方法(logisticregression)、方差分析(Analysis of Variance，ANOVA)、神经网络分析方法、遗传分析方法、支持向量机分析方法、层次分析或聚类分析方法、使用决策树的层次算法或核主成分(Kernel principal component)分析方法、马尔可夫毯(Markov Blanket)分析方法、回归特征消除(recursive feature elimination)或基于熵的回归特征消除分析方法、前向浮动搜索(floating search)或后向浮动搜索(floating search)分析方法及它们的组合组成的组中。

发明的效果

在本发明的用于诊断糖尿病视网膜病变的复合生物标志物中，不仅确认了灵敏度及诊断性能与其他生物标志物的组合相比更优秀，还确认了若结合复合生物标志物的蛋白质定量值与基础临床信息来进行分析，则在早期糖尿病视网膜病变中示出高诊断能力。并且，本发明的复合生物标志物可利用患者血浆简单分析，而不是利用血液蛋白质进行活组织检查，由此可有用地用于糖尿病视网膜病变的早期诊断。

附图说明

图1为结合复合生物标志物的蛋白质定量值与总糖尿病视网膜病变患者的基础临床信息并通过逻辑回归模型(A部分)及T-检验(B部分)进行统计处理后分析的数据(DMR：糖尿病视网膜病变，Non DMR：非糖尿病视网膜病变)。

图2为结合复合生物标志物的蛋白质定量值与非增殖性糖尿病视网膜病变患者的基础临床信息并通过逻辑回归模型(A部分)及T-检验(B部分)进行统计处理后分析的数据(NPDR：非增殖性糖尿病视网膜病变，Non DMR：非糖尿病视网膜病变)。

图3为结合复合生物标志物的蛋白质定量值与增殖性糖尿病视网膜病变患者的基础临床信息并通过逻辑回归模型(A部分)及T-检验(B部分)进行统计处理后分析的数据(PDR：增殖性糖尿病视网膜病变，Non DMR：非糖尿病视网膜病变)。

图4为结合复合生物标志物的蛋白质定量值与每个阶段的非增殖性糖尿病视网膜病变患者的基础临床信息并通过T-检验进行统计处理后分析的数据。

图4的A部分为比较非糖尿病视网膜病变(Non DMR)及轻度非增殖性糖尿病视网膜病变(mild NPDR)的数据，图4的B部分为比较非糖尿病视网膜病变(Non DMR)及中度糖尿病视网膜病变(moderate NPDR)的数据，图4的C部分为比较非糖尿病视网膜病变(Non DMR)及重度糖尿病视网膜病变(sever NPDR)的数据。

图5为结合在本发明中确认的13个生物标志物中的根据MLB2、IGFBP2、LGALS3BP及PNLIP组合(组合1)以及ADAMTSL2、CP、DDI、FCN2、SIGLEC14、SELE、THBS1、ZG16B及CFH组合(组合2)的蛋白质定量值与总糖尿病视网膜病变患者的基础临床信息并通过逻辑回归模型进行统计处理后分析的数据。

具体实施方式

以下，详细说明本发明。

在一方面，本发明涉及包含MBL2(甘露糖结合蛋白C)、PNLIP(胰腺三酰甘油脂肪酶)、LGALS3BP(半乳糖凝集素3结合蛋白)及IGFBP2(胰岛素样生长因子结合蛋白2)的用于诊断糖尿病视网膜病变的复合生物标志物。

在本发明中使用的术语“诊断”是指确认病理状态的存在或特征。出于本发明的目的，诊断为确定糖尿病视网膜病变是否发病。

在本发明中使用的术语“用于诊断的生物标志物”包括与正常对照组(并未患有糖尿病视网膜病变的个体)相比，在患有糖尿病视网膜病变的个体中示出基因表达水平或蛋白质表达水平显著增加或减少的状态的如多肽或核酸(例：信使核糖核酸等)、脂质、糖脂、糖蛋白、糖(单糖类、二糖类、寡糖类等)的有机生物分子等。

糖尿病视网膜病变根据进展程度分为早期非增殖性糖尿病视网膜病变(NPDR)和晚期增殖性糖尿病视网膜病变(PDR)。非增殖性糖尿病视网膜病变具有血管发育失败的特征。增殖性糖尿病视网膜病变的血管发育等其机制不同，非增殖性糖尿病视网膜病变不一定发展为增殖性糖尿病视网膜病变，因此，即使作为用于诊断增殖性糖尿病视网膜病变的生物标志物周知的生物标志物也不一定用作用于诊断非增殖性糖尿病视网膜病变的生物标志物。

本发明的复合生物标志物可特异性诊断非增殖性糖尿病视网膜病变及增殖性糖尿病视网膜病变两者，尤其，可诊断非增殖性糖尿病视网膜病变的初期阶段。

本发明的特征在于，上述复合生物标志物还包含选自由ADAMTSL2(ADAMTS样蛋白2)、Cp(铜蓝蛋白)、CFH(补充因子H)、DDI2(蛋白质DDI1同源物2)、FCN2(纤维蛋白胶2)、SELE(E-选择素)、SIGLEC14(唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素14)、THBS1(血小板反应蛋白-1)及ZG16B(酶原颗粒蛋白16同源物B)组成的组中的一种以上的生物标志物。

ADAMTSL2(ADAMTS样蛋白2)为带有血小板凝血酶敏感蛋白结构域的解聚素与金属蛋白酶(ADAMTS，a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs)样蛋白亚家族的成员，是与细胞表面和细胞外基质结合的糖蛋白。ADAMTSL2与潜在转化生长因子β结合蛋白1(LTBP1，latent transforming growth factor beta binding protein1)相互作用，LTBP1蛋白参与作为调节细胞的生长及分裂的重要生长因子的TGF-β1的储存，因此，ADAMTSL2调节TGF-β1的可用性。并且，ADAMTSL2在癌组织中表达，因此用作用于诊断癌症的生物标志物。

在本发明中，优选地，上述ADAMTSL2可包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，但还可以包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相同90％以上、93％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列。

Cp(铜蓝蛋白)为在血液中运输铜的主要蛋白质，在铁代谢中起到重要作用。在健康的人的血浆中，约95％以上的铜以铜蓝蛋白(Ceruloplasmin)形态存在。

在本发明中，优选地，上述Cp可包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，但还可以包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列相同90％以上、93％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列。

CFH(补充因子H)为调节补体激活来在维持免疫反应时起到重要作用的糖蛋白。与细胞表面的相同糖链结构结合来起到防止补体激活及扩增的补体抑制剂作用。

在本发明中，优选地，上述CFH可包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，但还可以包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列相同90％以上、93％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列。

DDI2(蛋白质DDI1同源物2)为内部肽裂解酶，激活参与细胞生长及脱氧核糖核酸复制调节的核呼吸因子1(Nrf1，nuclear respiratory factor 1)来补偿蛋白酶体异常引起的蛋白质降解(degradation)。

在本发明中，优选地，上述DDI2可包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，但还可以包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列相同90％以上、93％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列。

FCN2(纤维蛋白胶2)为一种寡聚凝集素，由短的N末端部分-胶原(collagen)样结构域和纤维蛋白原(fibrinogen)样结构域组成。主要在肝中表达，与细菌细胞壁的N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamin)结合来起到如甘露糖结合(mannose binding)蛋白的调理素(opsonin)作用，以在补体系统的凝集素途径中起重要作用而周知。

在本发明中，优选地，上述FCN2可包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，但还可以包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列相同90％以上、93％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列。

IGFBP2(胰岛素样生长因子结合蛋白2)与胰岛素样生长因子(Insulin likegrowthfactor，IGF)结合来调节细胞内各种过程，由此调节血管生成(angiogenesis)。并且，在各种癌症(前列腺癌及乳腺癌等)中促进癌细胞的生长而周知。

在本发明中，优选地，上述IGFBP2可包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，但还可以包含与SEQ ID NO:6的氨基酸序列相同90％以上、93％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列。

LGALS3BP(半乳糖凝集素3结合蛋白)为被LGALS3BP基因编码的蛋白质，与Mac-2(人巨噬细胞相关凝集素(human macrophage-associated lectin))及半乳糖凝集素1(galectin 1)特异性结合。LGALS3BP以在癌症患者及感染人类免疫缺陷病毒(HIV)的患者血清中增加而周知，参与关于自然杀伤(NK，natural killer)细胞及淋巴因子激活杀伤(LAK，lymphokine-activated killer)细胞毒性的免疫反应。

在本发明中，优选地，上述LGALS3B可包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，但还可以包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列相同90％以上、93％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列。

MBL2(甘露糖结合蛋白C)还称为甘露糖结合凝集素(Mannose-binding lectin，MBL)或甘露聚糖结合蛋白(mannan-binding protein，MBP)。MBL2具有寡聚结构(400kDa～700kDa)，由包含由约30kDa组成的3个相同肽链的亚基组成。通过对于感染的反应，在肝中生成，属于称为急性期蛋白的诸多因素中的一部分。

在本发明中，优选地，上述MBL2可包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，但还可以包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列相同90％以上、93％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列。

PNLIP(胰腺三酰甘油脂肪酶)为水解甘油三酯的酯键的脂肪分解酶家族，是在胰腺分泌的酶。PNLIP通过胰管系统分泌到十二指肠，因此，以血清内浓度低而周知，若如胰腺炎或胰腺癌等胰腺功能极度紊乱，则包括PNLIP的胰腺酶分泌到血清中，因此，以通过测量PNLIP血清浓度来诊断急性胰腺炎而周知。

在本发明中，优选地，上述PNLIP可包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，还可以包含与SEQ ID NO:9的氨基酸序列相同90％以上、93％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列。

SELE(E-选择素)还以CD62抗原样家族成员E(CD62E，CD62 antigen-like familymember E)、内皮-白细胞粘附分子1(ELAM-1，endothelial-leukocyte adhesion molecule1)或白细胞-内皮细胞粘附分子2(LECAM2，leukocyte-endothelial cell adhesionmolecule 2)周知，是在白细胞介素1β、肿瘤坏死因子、脂多糖类激活的血管内皮细胞以4小时至12小时为峰值一同表达、诱导的细胞粘附分子。SELE在炎症组织内的血管内皮细胞中强烈表达，介导中性粒细胞和单核细胞在血管内皮细胞上的滚动现象，从而促进这些细胞向炎症部位浸润。还参与癌细胞与血管内皮细胞粘附而周知。

在本发明中，优选地，上述SELE可包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，但还可以包含与SEQ ID NO:10的氨基酸序列相同90％以上、93％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列。

SIGLEC14(唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素14)为SIGLEC(唾液酸结合免疫球蛋白型凝集素(Sialic acid-binding immunoglobulin-type lectins))的亚家族之一，SIGLEC为与唾液酸结合的细胞表面蛋白，主要在免疫细胞的表面中表达。SIGLEC与唾液酸的蛋白质相互作用起到打开或关闭免疫系统的开关作用，癌细胞也以利用SIGLEC-唾液酸反应来获取免疫反应的抵抗性而周知。

在本发明中，优选地，上述SIGLEC14可包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列，但还可以包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列相同90％以上、93％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列。

THBS1(血小板反应蛋白-1)为血小板反应蛋白家族(thrombospondinfamily)之一，是抑制心血管生成和肿瘤生成的糖蛋白。以与纤溶酶原(plasminogen)、尿激酶(urokinase)、基质金属蛋白酶(MMP)、凝血酶(thrombin)及组织蛋白酶(cathepsin)等的与血管生成相关的蛋白酶结合来调节内皮细胞的粘附、迁移、生长而周知。

在本发明中，优选地，上述THBS1可包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，但还可以包含与SEQ ID NO:12的氨基酸序列相同90％以上、93％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列。

ZG16B(酶原颗粒蛋白16同源物B)为胰腺癌上调因子(PAUF，pancreaticadenocarcinoma upregulated factor)，以与碳水化合物结合并激活内部上皮细胞、血管生成及通透性(permeability)而周知。

在本发明中，优选地，上述ZG16B可包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列，但还可以包含与SEQ ID NO:13的氨基酸序列相同90％以上、93％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列。

但是，没有可将上述生物标志物用于诊断糖尿病视网膜病变的现有技术，尤其，完全没有可利用MBL2、PNLIP、LGALS3BP及IGFBP2的复合生物标志物来提高糖尿病视网膜病变的诊断性能的技术。

在再一方面，本发明涉及用于诊断糖尿病视网膜病变的组合物，其包含用于测量用于诊断糖尿病视网膜病变的复合生物标志物的信使核糖核酸或蛋白质水平的制剂，上述用于诊断糖尿病视网膜病变的复合生物标志物包含MBL2(甘露糖结合蛋白C)、PNLIP(胰腺三酰甘油脂肪酶)、LGALS3BP(半乳糖凝集素3结合蛋白)及IGFBP2(胰岛素样生长因子结合蛋白2)。

本发明的特征在于，上述组合物还包含选自由ADAMTSL2(ADAMTS样蛋白2)、Cp(铜蓝蛋白)、CFH(补充因子H)、DDI2(蛋白质DDI1同源物2)、FCN2(纤维蛋白胶2)、SELE(E-选择素)、SIGLEC14(唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素14)、THBS1(血小板反应蛋白-1)及ZG16B(酶原颗粒蛋白16同源物B)组成的组中的一种以上的生物标志物。

本发明的特征在于，用于测量上述复合生物标志物的信使核糖核酸水平的制剂为与上述生物标志物的基因特异性结合的引物对、探针或反义核苷酸，上述基因的核酸信息在GeneBank等周知，因此普通技术人员可基于上述序列设计这些引物对、探针或反义核苷酸。

在本发明中使用的术语“测量信使核糖核酸表达水平”是指为了诊断糖尿病视网膜病变，在从糖尿病视网膜病变怀疑患者分离的生物学试样中确认用于诊断糖尿病视网膜病变的基因的信使核糖核酸存在与否和表达程度的过程，用于测量信使核糖核酸的量。

在本发明中使用的术语“引物”为识别靶基因序列的片段，包括正向及反向的引物对，优选地，为提供具有特异性及灵敏度的分析结果的引物对。引物的核酸序列为与存在于试样中的非靶序列不一致的序列，当其为仅扩增包含互补引物结合位点的靶基因序列且不诱发非特异性扩增的引物时，可赋予高特异性。

在本发明中使用的术语“探针”是指可与试样中的所要检测的靶物质特异性结合的物质，是指可通过上述结合特异性确认试样中的靶物质的存在的物质。探针的种类为本领域通常使用的物质，并无限制，优选地，可以为肽核酸(PNA，peptide nucleic acid)、锁核酸(LNA，locked nucleic acid)、肽、多肽、蛋白质、核糖核酸或脱氧核糖核酸，最优选为肽核酸。更具体地，上述探针为生物物质，包括源自生物材料或与其相似或者在体外制造的，例如，可包括酶、蛋白质、抗体、微生物、动植物细胞及器官、神经细胞、脱氧核糖核酸及核糖核酸，脱氧核糖核酸包括互补脱氧核糖核酸(cDNA)、基因组脱氧核糖核酸、寡核苷酸，核糖核酸包括基因组核糖核酸、信使核糖核酸、寡核苷酸，作为蛋白质的例包括抗体、抗原、酶、肽等。

在本发明中使用的术语“反义”是指反义寡聚体通过Watson-Crick碱基对的形成与核糖核酸中的靶序列杂交，通常在靶序列中允许形成信使核糖核酸与核糖核酸:寡聚异源双链，具有核苷酸碱基的序列及亚基间骨架的寡聚体。寡聚体可具有对于靶序列的精确的序列互补性或近似互补性。

本发明的特征在于，用于测量上述复合生物标志物的蛋白质水平的制剂为与上述蛋白质或肽片段特异性结合的抗体、相互作用蛋白、配体、纳米粒子或适配体。

在本发明中使用的术语“测量蛋白质表达水平”是指为了诊断糖尿病视网膜病变，在生物学试样中确认从用于诊断糖尿病视网膜病变的基因中表达的蛋白质的存在与否及表达程度的过程。

在本发明中使用的术语“抗体”是指与抗原特异性结合来引起抗原-抗体反应的物质。出于本发明的目的，抗体是指与本发明的用于诊断糖尿病视网膜病变的复合生物标志物特异性结合的抗体。本发明的抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体及重组抗体。上述抗体可利用本领域公知的技术来容易制备。例如，多克隆抗体可通过包括向动物注射上述糖尿病视网膜病变生物标志物蛋白抗原并从动物采血来获取包含抗体的血清的过程的本领域公知的方法生产。这种多克隆抗体可通过山羊、兔、羊、猴、马、猪、牛、狗等的任意动物制备。并且，单克隆抗体可利用本领域公知的杂交瘤法(参照hybridoma method；Kohler andMilstein,European Journal of Immunology 6:511-519,1976)或噬菌体抗体文库技术(参照Clackson et al,Nature,352:624-628,1991；Marks et al,J.Mol.Biol.,222:58,1-597,1991)来制备。通过上述方法制备的抗体可利用凝胶电泳、透析、盐沉淀、离子交换层析、亲和层析等的方法来分离、纯化。并且，本发明的抗体不仅包括具有2个全长轻链及2个全长重链的完整形态，还包括抗体分子的功能性片段。抗体分子的功能性片段是指至少具有抗原结合功能的片段，包括Fab、F(ab')、F(ab')₂及Fv等。并且，本发明的抗体可通过商业途径获取。

在本发明中使用的术语“肽核酸”是指与脱氧核糖核酸或核糖核酸相似的人工合成聚合物。脱氧核糖核酸具有磷酸核糖骨架，然而，肽核酸具有通过肽键连接的重复的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸骨架，由此，对于脱氧核糖核酸或核糖核算的结合力和稳定性大大增加，由此用于分子生物学、诊断分析及反义治疗法。肽核酸在文献(Nielsen PE et al,Science,254(5037):1497-500,1991)中详细公开。

在本发明中，“适配体”为寡核酸或肽分子，适配体的通用内容详细在文献(BockLC et al.,Nature,355(6360):5646,1992；Hoppe-Seyler F and Butz K,J Mol Med.,78(8):42630,2000；Cohen BA et al.,Proc Natl Acad Sci USA.,95(24):142727,1998)中详细公开。

在另一方面，本发明涉及包含上述用于诊断糖尿病视网膜病变的组合物的用于诊断糖尿病视网膜病变的试剂盒。

上述试剂盒可通过本领域周知的常规制备方法制备。例如，上述试剂盒可包含冻干形态的抗体和缓冲液、稳定剂、失活蛋白质等。

上述试剂盒还可包含可检测的生物标志物。术语“可检测的生物标志物”是指在没有标志物的同一类分子中特异性检测包含生物标志物的原子或分子。上述可检测的生物标志物可粘附在上述蛋白质或与其片段特异性结合的抗体、相互作用蛋白、配体、纳米粒子或适配体。上述可检测的生物标志物可包括放射性物质(radionuclide)、荧光团(fluorophore)、酶(enzyme)。

上述试剂盒可根据本领域周知的各种免疫分析法或免疫染色法利用。上述免疫分析法或免疫染色法可包括放射免疫测定、放射免疫沉淀、免疫沉淀、酶联免疫吸附测定、捕获-酶联免疫吸附测定、抑制或竞争测定、夹心测定、流式细胞术、免疫荧光染色及免疫亲和纯化。优选地，上述试剂盒可以为逆转录聚合酶链反应试剂盒、脱氧核糖核酸芯片试剂盒、酶联免疫吸附测定试剂盒、蛋白芯片试剂盒、快速试剂盒或多反应监测。

并且，上述试剂盒可用于质谱分析。在此情况下，上述蛋白质的特定氨基酸残基可具有肉豆蔻酰基化(myristoylation)、异戊二烯化、异戊烯化、糖基磷脂酰肌醇化(glypiation)、脂酰化(lipoylation)、酰化、烷基化、甲基化、脱甲基化、酰胺化、泛素化、磷酸化、脱酰胺化、糖基化、氧化或乙酰化等的修饰。

在还有一方面，本发明涉及用于诊断糖尿病视网膜病变的信息提供方法，其包括：步骤(a)，利用患者的生物学试样测量由MBL2(甘露糖结合蛋白C)、PNLIP(胰腺三酰甘油脂肪酶)、LGALS3BP(半乳糖凝集素3结合蛋白)及IGFBP2(胰岛素样生长因子结合蛋白2)组成的用于诊断糖尿病视网膜病变的复合生物标志物的信使核糖核酸或蛋白质水平；以及步骤(b)，与对照组试样比较上述信使核糖核酸或蛋白质表达水平。

本发明的特征在于，上述步骤(a)的复合生物标志物还包含选自由ADAMTSL2(ADAMTS样蛋白2)、Cp(铜蓝蛋白)、CFH(补充因子H)、DDI2(蛋白质DDI1同源物2)、FCN2(纤维蛋白胶2)、SELE(E-选择素)、SIGLEC14(唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素14)、THBS1(血小板反应蛋白-1)及ZG16B(酶原颗粒蛋白16同源物B)组成的组中的一种以上的生物标志物。

在上述方法中，“生物学试样(biological sample)”是指由于糖尿病视网膜病变的发病而使蛋白质表达水平或基因表达水平具有差异的组织、细胞、血液、血清、血浆、唾液、脑脊液或尿液等试样等，优选为血液、血浆、血清。

上述用于诊断糖尿病视网膜病变的信息提供方法还包含选自由患者的年龄、身体质量指数、糖化血红蛋白检测结果、是否进行胰岛素治疗、是否吸烟、是否患有高血压、是否患有高血脂及是否患有心血管疾病组成的组中的一种以上的临床信息。

并且，用于诊断糖尿病视网膜病变的信息提供方法还可包括如下的步骤，即，若复合生物标志物的基因表达水平或蛋白质表达水平与对照组相比增加，则判断为糖尿病视网膜病变。

上述步骤(a)的信使核糖核酸表达水平测量可利用与上述复合生物标志物的基因特异性结合的引物对、探针或反义核苷酸来测量及比较。

上述信使核糖核酸表达水平测量或比较分析方法可使用逆转录酶聚合酶反应、竞争性逆转录酶聚合酶反应、实时逆转录酶聚合酶反应、RNA酶保护分析法、诺瑟杂交或脱氧核糖核酸芯片等，但本发明并不局限于此。可通过上述测量方法确认正常对照组中的信使核糖核酸表达量和糖尿病视网膜病变患者的信使核糖核酸表达量，可通过比较它们的表达量来诊断或预测糖尿病视网膜病变是否发病。

上述步骤(a)的蛋白质表达水平测量可利用与蛋白质或肽片段特异性结合的抗体、相互作用蛋白、配体、纳米粒子或适配体来测量及比较。

蛋白质表达水平测量或比较分析方法具有蛋白质芯片分析、免疫测定、配体结合测定、基质解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF，Matrix Desorption/Ionization Time ofFlight Mass Spectrometry)分析、表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱(SELDITOF，Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight MassSpectrometry)分析、放射免疫分析、放射免疫扩散、奥克特洛尼免疫扩散(Ouchterlonyimmunodiffusion)、火箭免疫电泳、组织免疫染色、补体固定分析、二维电泳分析、液相色谱-质谱(liquid chromatography-Mass Spectrometry，LC-MS)、液相色谱-质谱/质谱(LCMS/MS，liquid chromatography-Mass Spectrometry/Mass Spectrometry)、蛋白质印迹及酶联免疫吸附测定(ELISA，enzyme linked immunosorbentassay)等，但并不局限于此。

更优选地，在本发明中，还可利用多反应监测、平行反应监测、连续窗口数据独立获取总高分辨率、选择反应监测或免疫多反应监测来测量。

上述多反应监测为如下的方法：确定物质的精确片段，在质谱仪将其破碎后，再次从破碎的离子中选择特定离子，并利用连续连接的检测器获取数量。当利用多反应监测方法时，在正常个体、怀疑糖尿病视网膜病变的个体的血液试样中可利用质谱仪定量相应蛋白质或其片段。

在上述步骤(b)的分析中，为了提高诊断的准确率，可通过使用统计学方法或算法来分析，可利用选自由线性或非线性回归分析方法、线性或非线性分类分析方法、逻辑回归分析方法、方差分析、神经网络分析方法、遗传分析方法、支持向量机分析方法、层次分析或聚类分析方法、使用决策树的层次算法或核主成分分析方法、马尔可夫毯分析方法、回归特征消除或基于熵的回归特征消除分析方法、前向浮动搜索或后向浮动搜索分析方法及它们的组合组成的组中的分析方法。在本发明中，作为上述统计学方法，优选使用逻辑回归分析方法，但并不局限于此。

在本发明的具体一实例中，为了定量分析血浆蛋白质组学中的用于诊断糖尿病视网膜病变的生物标志物，分析了155个血浆试样(表1)，利用多反应监测分析由IGFBP2(胰岛素样生长因子结合蛋白2)、ADAMTSL2(ADAMTS样蛋白2)、CFH(补充因子H)、Cp(铜蓝蛋白)、DDI2(蛋白质DDI1同源物2)、FCN2(纤维蛋白胶2)、LGALS3BP(半乳糖凝集素3结合蛋白)、MBL2(甘露糖结合蛋白C)、PNLIP(胰腺三酰甘油脂肪酶)、SELE(E-选择素)、SIGLEC14(唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素14)、THBS1(血小板反应蛋白-1)及ZG16B(酶原颗粒蛋白16同源物B)组成的13个生物标志物。如表2所示，为了定量分析，筛选对于各个生物标志物的肽，并利用SIS执行多反应监测质谱定量(MRM-MS)分析。

在本发明的具体再一实例中，当结合复合生物标志物组结果与临床信息时，为了确认诊断能力提高效果，利用逻辑回归模型输入生物标志物表达量转换信息及临床信息转换程度来推测分类为糖尿病视网膜病变的概率。如表3所示，基于临床信息+MBL2+PNLIP+LGALS3BP+IGFBP2，一一添加对于ADAMTSL2、Cp、DDI2、FCN2、SELE、SIGLEC14、THBS1、ZG16B及CFH的表达程度并分析的结果，确认了随着生物标志物的数量的增加，糖尿病视网膜病变的诊断能力提高。

并且，如图1至图3及表4所示，利用逻辑回归模型结合对于上述13个生物标志物的蛋白质定量值与基础临床信息来进行统计处理的结果，确认了对于正常组和糖尿病视网膜病变(第一阶段(STAGE1)，AUC＝0.863)、正常组和非增殖性糖尿病视网膜病变(第二阶段(STAGE2)，AUC＝0.848)及正常组和增殖性糖尿病视网膜病变(第三阶段(STAGE3)，AUC＝0.879)的诊断能力优秀。

并且，如图4所示，通过T-检验确认了，在非增殖性糖尿病视网膜病变的多个阶段中，与正常组相比，各个阶段的诊断能力优秀。

在本发明的具体另一实例中，确认了诊断性能是否根据生物标志物的组合示出差异。如图5所示，确认了13个靶中的MBL2、PNLIP、LGALS3BP及IGFPB2的组合(组合1，AUC＝0.783)具有与其他9个蛋白质即ADAMTSL2、Cp、FCN2、DDI2、SELE、SIGLEC14、THBS1、ZG16B及CFH组合(组合2，AUC＝0.713)相比具有更高的诊断能力。

以下，通过实施例更加详细地说明本发明。

这些实施例仅用于例示本发明，不应解释为本发明的范围局限于这些实施例，这对本技术领域的普通技术人员而言是显而易见的。

实施例1：选择糖尿病视网膜病变患者及采集血浆

获得盆唐首尔大学医院的临床试验审查委员会的批准来采集糖尿病视网膜病变患者的血浆试样。为了生物标志物的定量检测，利用血浆蛋白质组学分析了共155个血浆试样，在下述表1示出作为分析对象的正常组(Non DMR)及糖尿病视网膜病变(DMR)疾病组的临床特征。

表1

试样临床信息

实施例2：选择肽及利用多反应监测质谱定量分析肽

2-1：选择肽及设计合成肽

在本发明中，作为用于诊断糖尿病视网膜病变的生物标志物，筛选了如下的13个：IGFBP2(胰岛素样生长因子结合蛋白2)、ADAMTSL2(ADAMTS样蛋白2)、CFH(补充因子H)、Cp(铜蓝蛋白)、DDI2(蛋白质DDI1同源物2)、FCN2(纤维蛋白胶2)、LGALS3BP(半乳糖凝集素3结合蛋白)、MBL2(甘露糖结合蛋白C)、PNLIP(胰腺三酰甘油脂肪酶)、SELE(E-选择素)、SIGLEC14(唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素14)、THBS1(血小板反应蛋白-1)及ZG16B(酶原颗粒蛋白16同源物B)。

为了对于上述生物标志物进行多反应监测分析，选择对于13个生物标志物的蛋白质特异性的具有荷质比(m/z)的代表性肽(Q1)，在通过电击破坏该肽来产生的碎片离子(fragmentation ion)中，选择强度最高的离子(Q3)。

测量每个蛋白质的灵敏度高的一种以上的肽，基于此注入至质谱仪来获得每个转换的破碎能量优化值，基于强度选择了3个以上的顶级碎片离子(表2)。

表2

13个生物标志物的顶级碎片离子

为了确认定量，利用了与13个蛋白质相对应的稳定同位素标记标准(SIS，Stable-isotope labeled standard)肽，利用通过校准确认线性的实验来确定加标重肽(spikedheavy peptide)的浓度。SIS肽为将肽C-末端的赖氨(Lys，K)或精氨酸(Arg，R)氨基酸中的12C和14N取代为13C和15N的肽。这与血液中存在的内源性肽(endogenous peptide)具有质量值的差异，但具有相同的序列，因此，肽疏水性(hydrophobicity)相同，由此在层析谱上以相同的保留时间(retention time，RT)洗脱。

2-2：预处理血浆试样及多反应监测质谱定量分析

直接使用在上述实施例1中获取的各个血浆，或者为了更精确的蛋白质定量，实施去除以高丰度(high abundant)存在的14种蛋白质(白蛋白(Albumin)、免疫球蛋白G(IgG)、抗胰蛋白酶(Antitrypsin)、免疫球蛋白A(IgA)、转铁蛋白(Transferrin)、触珠蛋白(Haptoglobin)、纤维蛋白原(Fibrinogen)、α2-巨球蛋白(Alpha2-Macroglobulin)、α1-酸性糖蛋白(Alpha1-Acid glycoprotein)、免疫球蛋白M(IgM)、载脂蛋白AI(ApolipoproteinAI)、载脂蛋白AII(Apolipoprotein AII)、补体C3(Complement C3)、运甲状腺素蛋白(Transthyretin))的消耗过程(depletion)。当执行消耗时，按照制造公司的方法利用高丰度蛋白质分离系统(MARS，Multiple affinity removal system，Agilent，美国)柱来去除14种蛋白质，洗脱剩余少量存在的蛋白质来用于分析。向该洗脱的耗损试样添加尿素(urea)以成为8M，之后，添加2-羰基乙基三膦(Tris(2-carboxyethyl)-phosphine，TECP)以成为80mM，并添加2-氯乙酰胺(2-chloroacetamide)以成为320mM，在25℃的温度下反应1小时来将二硫键还原及烷基化。对其，加入水稻酶来使血浆蛋白与水稻(wako)酶的质量比成为100∶1，并在室温条件下反应4小时。之后，利用50mM的Tris(pH8.0)溶液稀释10倍，并添加能够进行测序的水平的胰蛋白酶(Promega)来使蛋白质与胰蛋白酶的质量比成为50∶1，在37℃的温度下反应12小时以上来分解为肽片段。添加甲酸(formic acid)溶液以成为0.3％，将pH值酸化至2.0以下，并停止胰蛋白酶反应。

在此，进行脱盐，通过在上述实施例2-1中确定的内部标准物质(SIS肽)添加(spiking)重标记(heavy-labeled)肽，由此进行多反应监测分析。与Nano ultra 2D plus(Eksigent)结合，利用作为三重四极杆质谱仪的QTarp 5500(SCIEX)设备以预定多反应监测(scheduled MRM)模式监测各选择蛋白质的转换。

具体地，使用5500伏的离子电压，并将Q1(四极杆1(Quadruple1))和Q3(四极杆3(Quadruple 3))中的分辨率设定为一个单元(unit)。将转换设置为使得总循环时间为1.5秒。使用20个单元(unit)的雾化气体(nebulizing gas)，将加热器的温度设置为350℃。为了校正批次(batch)之间的变异，向每个试样加入内部标准物质，并同时监测。

2-3：数据分析

利用Skyline(McCoss lab，University of Washington，美国)处理原始数据(rawdata)来计算转换的峰值面积。对于内部标准物质肽(内源性/重标记肽(endogenous/heavylabeled peptide))使用峰值面积来比较相对浓度。利用由此测量的结果值生成T-检验(T-test)及接受者操作特征下的面积(AUROC，Area under the receiver operatingcharacteristic)数值，来测量各蛋白肽的疾病预测力(predictive ability)，为了确认结合复合生物标志物组结果与临床信息的预测力，利用逻辑回归分析(logisticregression)模型输入上述表达量转换信息及上述表1的临床信息转换程度，由此推测分类为糖尿病视网膜病变的概率。使用MedCal ver 17.1(MedCalc)来执行所有统计分析。

在上述临床信息反映通过门诊确保的通过身高和体重计算的身体质量指数、是否吸烟、是否患有高血脂、是否患有高血压、是否患有心血管疾病、糖化血红蛋白数值。其中，使用存在或不存在的信息转换为是＝1、否＝0(禁烟＝0.5)来反映。

实施例3：确认根据结合复合生物标志物组结果与临床信息的诊断能力的提高

在本发明中，当结合13个复合生物标志物组结果与临床信息时，为了确认诊断能力的提高效果，利用逻辑回归模型输入生物标志物表达量转换信息及临床信息转换程度，由此推测分类为糖尿病视网膜病变的概率。

表3

确认根据复合生物标志物结合数的糖尿病视网膜病变诊断性能

1.临床信息，2.LGALS3BP，3.MBL2，4.IGFBP2，5.PNLIP，6.ZG16B，7.DDI2，8.FCN2，9.THBS1，10.SIGLEC14，11.CP，12.ADAMTSL2，13.SELC，14.CFH

表4

确认根据结合复合生物标志物组与临床信息的诊断能力

C：临床信息，P：蛋白质定量信息，Com：临床信息及蛋白质定量信息的整合，AUC：曲线下面积(Area Under the Curve)，SE：标准误差(Standard Error)(Delong et al.，1988)，95％CI：95％的置信区间(Confidence Interval)

如表3所示，基于临床信息+MBL2+PNLIP+LGALS3BP+IGFBP2，一一添加对于ADAMTSL2、Cp、FCN2、DDI2、SELE、SIGLEC14、THBS1、ZG16B及CFH的表达程度来分析的结果，确认了随着生物标志物的数的增加，糖尿病视网膜病变的诊断能力(AUC)提高。

并且，如图1至图3及表4所示，利用逻辑回归模型结合对于上述13个生物标志物的蛋白质定量值与基础临床信息来进行统计处理的结果，确认了对于正常组和糖尿病视网膜病变(第一阶段(STAGE 1)，AUC＝0.863)、正常组和非增殖性糖尿病视网膜病变(第二阶段(STAGE 2)，AUC＝0.848)及正常组和增殖性糖尿病视网膜病变(第三阶段(STAGE 3)，AUC＝0.879)的诊断能力优秀。

并且，如图4所示，通过T-检验确认了，与正常组相比，非增殖性糖尿病视网膜病变的各个阶段的诊断能力优秀。

实施例4：确认根据生物标志物的组合的糖尿病视网膜病变诊断性能

在本发明中，确认了糖尿病视网膜病变的诊断性能是否根据13个生物标志物的组合存在差异。在13个生物标志物中，分为MBL2、PNLIP、LGALS3BP及IGFBP2组合和ADAMTSL2、Cp、FCN2、DDI2、SELE、SIGLEC14、THBS1、ZG16B及CFH组合来执行分析，与上述实施例3的第一阶段(STAGE 1)相同地，与临床信息一同执行分析。

如图5所示，在13个生物标志物中，确认了MBL2、PNLIP、LGALS3BP及IGFB P2的组合(组合1，AUC＝0.784)与其他9个蛋白质即ADAMTSL2、Cp、FCN2、DDI2、SELE、SIGLEC14、THBS1、ZG16B及CF组合(组合2，AUC＝0.713)相比示出更高的诊断能力。

产业上的可利用性

在本发明中提供的用于诊断糖尿病视网膜病变的复合生物标志物与其他生物标志物的组合相比具有优秀的灵敏度及诊断性能，若结合复合生物标志物的蛋白质定量值与基础临场信息来进行分析，则在早期糖尿病视网膜病变中示出高诊断能力，因此可有用地用于糖尿病视网膜病变的早期诊断。

<110> 雷帝标志有限公司

<120> 用于诊断糖尿病视网膜病变的复合生物标志物及其用途

<130> SOP115682

<150> KR 10-2019-0026302

<151> 2019-03-07

<160> 34

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 951

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ADAMTS-like protein 2

<400> 1

Met Asp Gly Arg Trp Gln Cys Ser Cys Trp Ala Trp Phe Leu Leu Val

1 5 10 15

Leu Ala Val Val Ala Gly Asp Thr Val Ser Thr Gly Ser Thr Asp Asn

20 25 30

Ser Pro Thr Ser Asn Ser Leu Glu Gly Gly Thr Asp Ala Thr Ala Phe

35 40 45

Trp Trp Gly Glu Trp Thr Lys Trp Thr Ala Cys Ser Arg Ser Cys Gly

50 55 60

Gly Gly Val Thr Ser Gln Glu Arg His Cys Leu Gln Gln Arg Arg Lys

65 70 75 80

Ser Val Pro Gly Pro Gly Asn Arg Thr Cys Thr Gly Thr Ser Lys Arg

85 90 95

Tyr Gln Leu Cys Arg Val Gln Glu Cys Pro Pro Asp Gly Arg Ser Phe

100 105 110

Arg Glu Glu Gln Cys Val Ser Phe Asn Ser His Val Tyr Asn Gly Arg

115 120 125

Thr His Gln Trp Lys Pro Leu Tyr Pro Asp Asp Tyr Val His Ile Ser

130 135 140

Ser Lys Pro Cys Asp Leu His Cys Thr Thr Val Asp Gly Gln Arg Gln

145 150 155 160

Leu Met Val Pro Ala Arg Asp Gly Thr Ser Cys Lys Leu Thr Asp Leu

165 170 175

Arg Gly Val Cys Val Ser Gly Lys Cys Glu Pro Ile Gly Cys Asp Gly

180 185 190

Val Leu Phe Ser Thr His Thr Leu Asp Lys Cys Gly Ile Cys Gln Gly

195 200 205

Asp Gly Ser Ser Cys Thr His Val Thr Gly Asn Tyr Arg Lys Gly Asn

210 215 220

Ala His Leu Gly Tyr Ser Leu Val Thr His Ile Pro Ala Gly Ala Arg

225 230 235 240

Asp Ile Gln Ile Val Glu Arg Lys Lys Ser Ala Asp Val Leu Ala Leu

245 250 255

Ala Asp Glu Ala Gly Tyr Tyr Phe Phe Asn Gly Asn Tyr Lys Val Asp

260 265 270

Ser Pro Lys Asn Phe Asn Ile Ala Gly Thr Val Val Lys Tyr Arg Arg

275 280 285

Pro Met Asp Val Tyr Glu Thr Gly Ile Glu Tyr Ile Val Ala Gln Gly

290 295 300

Pro Thr Asn Gln Gly Leu Asn Val Met Val Trp Asn Gln Asn Gly Lys

305 310 315 320

Ser Pro Ser Ile Thr Phe Glu Tyr Thr Leu Leu Gln Pro Pro His Glu

325 330 335

Ser Arg Pro Gln Pro Ile Tyr Tyr Gly Phe Ser Glu Ser Ala Glu Ser

340 345 350

Gln Gly Leu Asp Gly Ala Gly Leu Met Gly Phe Val Pro His Asn Gly

355 360 365

Ser Leu Tyr Gly Gln Ala Ser Ser Glu Arg Leu Gly Leu Asp Asn Arg

370 375 380

Leu Phe Gly His Pro Gly Leu Asp Met Glu Leu Gly Pro Ser Gln Gly

385 390 395 400

Gln Glu Thr Asn Glu Val Cys Glu Gln Ala Gly Gly Gly Ala Cys Glu

405 410 415

Gly Pro Pro Arg Gly Lys Gly Phe Arg Asp Arg Asn Val Thr Gly Thr

420 425 430

Pro Leu Thr Gly Asp Lys Asp Asp Glu Glu Val Asp Thr His Phe Ala

435 440 445

Ser Gln Glu Phe Phe Ser Ala Asn Ala Ile Ser Asp Gln Leu Leu Gly

450 455 460

Ala Gly Ser Asp Leu Lys Asp Phe Thr Leu Asn Glu Thr Val Asn Ser

465 470 475 480

Ile Phe Ala Gln Gly Ala Pro Arg Ser Ser Leu Ala Glu Ser Phe Phe

485 490 495

Val Asp Tyr Glu Glu Asn Glu Gly Ala Gly Pro Tyr Leu Leu Asn Gly

500 505 510

Ser Tyr Leu Glu Leu Ser Ser Asp Arg Val Ala Asn Ser Ser Ser Glu

515 520 525

Ala Pro Phe Pro Asn Val Ser Thr Ser Leu Leu Thr Ser Ala Gly Asn

530 535 540

Arg Thr His Lys Ala Arg Thr Arg Pro Lys Ala Arg Lys Gln Gly Val

545 550 555 560

Ser Pro Ala Asp Met Tyr Arg Trp Lys Leu Ser Ser His Glu Pro Cys

565 570 575

Ser Ala Thr Cys Thr Thr Gly Val Met Ser Ala Tyr Ala Met Cys Val

580 585 590

Arg Tyr Asp Gly Val Glu Val Asp Asp Ser Tyr Cys Asp Ala Leu Thr

595 600 605

Arg Pro Glu Pro Val His Glu Phe Cys Ala Gly Arg Glu Cys Gln Pro

610 615 620

Arg Trp Glu Thr Ser Ser Trp Ser Glu Cys Ser Arg Thr Cys Gly Glu

625 630 635 640

Gly Tyr Gln Phe Arg Val Val Arg Cys Trp Lys Met Leu Ser Pro Gly

645 650 655

Phe Asp Ser Ser Val Tyr Ser Asp Leu Cys Glu Ala Ala Glu Ala Val

660 665 670

Arg Pro Glu Glu Arg Lys Thr Cys Arg Asn Pro Ala Cys Gly Pro Gln

675 680 685

Trp Glu Met Ser Glu Trp Ser Glu Cys Thr Ala Lys Cys Gly Glu Arg

690 695 700

Ser Val Val Thr Arg Asp Ile Arg Cys Ser Glu Asp Glu Lys Leu Cys

705 710 715 720

Asp Pro Asn Thr Arg Pro Val Gly Glu Lys Asn Cys Thr Gly Pro Pro

725 730 735

Cys Asp Arg Gln Trp Thr Val Ser Asp Trp Gly Pro Cys Ser Gly Ser

740 745 750

Cys Gly Gln Gly Arg Thr Ile Arg His Val Tyr Cys Lys Thr Ser Asp

755 760 765

Gly Arg Val Val Pro Glu Ser Gln Cys Gln Met Glu Thr Lys Pro Leu

770 775 780

Ala Ile His Pro Cys Gly Asp Lys Asn Cys Pro Ala His Trp Leu Ala

785 790 795 800

Gln Asp Trp Glu Arg Cys Asn Thr Thr Cys Gly Arg Gly Val Lys Lys

805 810 815

Arg Leu Val Leu Cys Met Glu Leu Ala Asn Gly Lys Pro Gln Thr Arg

820 825 830

Ser Gly Pro Glu Cys Gly Leu Ala Lys Lys Pro Pro Glu Glu Ser Thr

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Cys Phe Glu Arg Pro Cys Phe Lys Trp Tyr Thr Ser Pro Trp Ser Glu

850 855 860

Cys Thr Lys Thr Cys Gly Val Gly Val Arg Met Arg Asp Val Lys Cys

865 870 875 880

Tyr Gln Gly Thr Asp Ile Val Arg Gly Cys Asp Pro Leu Val Lys Pro

885 890 895

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Lys Val Asn Leu Cys Gly His Trp Tyr Tyr Ser Lys Ala Cys Cys Arg

930 935 940

Ser Cys Arg Pro Pro His Ser

945 950

<210> 2

<211> 1065

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Ceruloplasmin

<400> 2

Met Lys Ile Leu Ile Leu Gly Ile Phe Leu Phe Leu Cys Ser Thr Pro

1 5 10 15

Ala Trp Ala Lys Glu Lys His Tyr Tyr Ile Gly Ile Ile Glu Thr Thr

20 25 30

Trp Asp Tyr Ala Ser Asp His Gly Glu Lys Lys Leu Ile Ser Val Asp

35 40 45

Thr Glu His Ser Asn Ile Tyr Leu Gln Asn Gly Pro Asp Arg Ile Gly

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Arg Leu Tyr Lys Lys Ala Leu Tyr Leu Gln Tyr Thr Asp Glu Thr Phe

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Arg Thr Thr Ile Glu Lys Pro Val Trp Leu Gly Phe Leu Gly Pro Ile

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<220>

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<220>

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<220>

<223> CFH peptide

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<220>

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<220>

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<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PNLIP peptide

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<213> Artificial Sequence

<220>

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<400> 31

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

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<400> 32

Glu Gly Gly Glu Phe Thr Cys Arg

1 5

<210> 33

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> THBS1 peptide

<400> 33

Gly Gly Val Asn Asp Asn Phe Gln Gly Val Leu Gln Asn Val Arg

1 5 10 15

<210> 34

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ZG16B peptide

<400> 34

Tyr Phe Ser Thr Thr Glu Asp Tyr Asp His Glu Ile Thr Gly Leu Arg

1 5 10 15

Claims

1.一种用于诊断糖尿病视网膜病变的复合生物标志物，其特征在于，包含MBL2、PNLIP、LGALS3BP及IGFBP2。

2.根据权利要求1所述的用于诊断糖尿病视网膜病变的复合生物标志物，其特征在于，上述复合生物标志物还包含选自由ADAMTSL2、Cp、CFH、DDI2、FCN2、SELE、SIGLEC14、THBS1及ZG16B组成的组中的一种以上的生物标志物。

3.一种用于诊断糖尿病视网膜病变的组合物，其特征在于，包含用于测量用于诊断糖尿病视网膜病变的复合生物标志物的信使核糖核酸或蛋白质水平的制剂，上述用于诊断糖尿病视网膜病变的复合生物标志物包含MBL2、PNLIP、LGALS3BP及IGFBP2。

4.根据权利要求3所述的用于诊断糖尿病视网膜病变的组合物，其特征在于，上述组合物还包含用于测量选自由ADAMTSL2、Cp、CFH、DDI2、FCN2、SELE、SIGLEC14、THBS1及ZG16B组成的组中的一种以上的生物标志物的信使核糖核酸或蛋白质水平的制剂。

5.根据权利要求3所述的用于诊断糖尿病视网膜病变的组合物，其特征在于，用于测量上述复合生物标志物的信使核糖核酸水平的制剂为与上述生物标志物的基因特异性结合的引物对、探针或反义核苷酸。

6.根据权利要求3所述的用于诊断糖尿病视网膜病变的组合物，其特征在于，用于测量上述复合生物标志物的蛋白质水平的制剂为与上述生物标志物的蛋白质或肽片段特异性结合的抗体、相互作用蛋白、配体、纳米粒子或适配体。

7.一种用于诊断糖尿病视网膜病变的试剂盒，其特征在于，包含权利要求3至6中任一项所述的用于诊断糖尿病视网膜病变的组合物。

8.根据权利要求7所述的用于诊断糖尿病视网膜病变的试剂盒，其特征在于，上述试剂盒为逆转录聚合酶链反应试剂盒、脱氧核糖核酸芯片试剂盒、酶联免疫吸附测定试剂盒、蛋白芯片试剂盒、快速试剂盒或多反应监测试剂盒。

9.一种用于诊断糖尿病视网膜病变的信息提供方法，其特征在于，包括：

步骤(a)，利用患者的生物学试样测量权利要求1或2所述的用于诊断糖尿病视网膜病变的复合生物标志物的信使核糖核酸或蛋白质水平；以及

步骤(b)，与对照组试样比较上述信使核糖核酸或蛋白质表达水平。

10.根据权利要求9所述的用于诊断糖尿病视网膜病变的信息提供方法，其特征在于，上述用于诊断糖尿病视网膜病变的信息提供方法还包含选自由患者的年龄、身体质量指数、是否吸烟、糖化血红蛋白检测结果、是否进行胰岛素治疗、是否患有高血压、是否患有高血脂及是否患有心血管疾病组成的组中的一种以上的临床信息来与对照组进行比较。

11.根据权利要求9所述的种用于诊断糖尿病视网膜病变的信息提供方法，其特征在于，上述用于诊断糖尿病视网膜病变的信息提供方法还包括步骤(c)，若复合生物标志物的基因表达水平或蛋白质表达水平与对照组相比增加，则判断为糖尿病视网膜病变。