KR101170369B1

KR101170369B1 - 당뇨병성 신증 진단용 바이오마커 및 이의 동정방법

Info

Publication number: KR101170369B1
Application number: KR1020090091004A
Authority: KR
Inventors: 조제열; 이인규; 안정모
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2009-09-25
Filing date: 2009-09-25
Publication date: 2012-08-01
Also published as: KR20110033484A

Abstract

본 발명은 혈장 당단백질로부터 분리한 당뇨병성 신증 마커에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 당뇨병 환자에서보다 당뇨병성 신증 환자에서 과량 발현되거나 감소하는 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 당뇨병성 신증 진단용 조성물 및 상기 단백질을 암호화하는 핵산에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함하는 당뇨병성 신증 진단용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 당뇨병성 신증 진단용 마커는 당뇨병성 신증 환자의 혈장에서 특이적으로 과량 발현하거나 급감하므로 당뇨병 환자의 신증으로의 이행 및 이 병의 예후를 평가하는데 매우 유용하다.

당뇨병성 신증, 진단, 당단백질, 바이오마커, 혈장

Description

당뇨병성 신증 진단용 바이오마커 및 이의 동정방법 {Diagnostic biomarker for Diabetic nephropathy and Identification method thereof}

본 발명은 진단용 마커에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 당뇨병성 신증 환자에서 과량 발현되거나 극심하게 감소하는 단백질에 특이적인 분자를 포함하는 당뇨병성 신증 진단용 조성물에 관한 것이다.

당뇨병성 신증 (Diabetic nephropathy, DN)은 말기 신장병 (end-stage renal disease, ESRD)의 가장 흔한 원인이며, 결절성 사구체 경화증 (Kimmelstiel-Wilson lesions) 및 모세혈관간 사구체신염을 특징으로 한다 (Ritz, E., Saudi J Kidney Dis Transpl 2006,17, 481-490). 1형 또는 2형의 당뇨병 환자들의 약 20-30%에서 신장병의 징후가 발달된다. 대부분의 ESRD는 2형 당뇨병 환자에게서 발견되는데, 왜냐하면 2형 당뇨병이 1형 당뇨병보다 훨씬 빈도가 높기 때문이다. 당뇨병 환자 중에서 당뇨병성 신증의 일부만이 말기 신장병으로 진행한다 (Molitch, M. E., DeFronzo, R. A., Franz, M. J., Keane, W. F.,et al., Diabetes Care 2003,26 Suppl 1,S 94-98). 당뇨병성 신증의 발병은 비정상적인 대사성 인자 및 혈액동력학적 인자 간의 상호작용에 기인하는 것으로 생각되는데, 그것은 당뇨병성 신증의 발달을 일으키는 공동의 경로를 활성화시켜서 당뇨병성 신증의 발달을 증가시킨다 (Parving, H. H., Kidney Int 2001, 60, 2041-2055). 또한 당뇨병성 신증은 심혈관질병 위험의 증가와도 관련이 있다 (Caramori, M. L., Mauer, M., Curr Opin Nephrol Hypertens 2003, 12, 273-282).

당뇨병성 신증이 발달함에 따라, 사구체는 계속적으로 손상되어 미세알부민뇨증이 발달하고, 몇 년 내지 몇 십 년에 거쳐 거대알부민뇨증이 발달한다 (Otu, H. H., Can, H., Spentzos, D., Nelson, R. G., et al., Diabetes Care 2007, 30, 638-643). 전통적으로 초기 당뇨병성 신증은 미세알부민뇨증으로 정의되고 (소변 내 알부민 분비 30-300mg/24h), 이후 거대알부민뇨증 (>300mg/24h)으로 진행될 수 있으며, 종국에는 말기 신장병이 된다 (Remuzzi, G., Schieppati, A., Ruggenenti, P., N Engl J Med 2002, 346, 1145-1151). 그러나 미세알부민뇨는 당뇨병성 신증의 표지자로 쓰이기에는 한계가 있는데, 미세알부민뇨와 사구체 손상 정도 간의 상관관계는 매우 가변적이기 때문이다. 또한 미세알부민뇨는 종종 당뇨병성 신증보다는 심혈관질병의 표지자로서 더 유용하다 (Fioretto, P., Mauer, M., Brocco, E., Velussi, M., et al., Diabetologia 1996, 39, 1569-1576).

현재 당뇨병성 신증에 대한 선택적인 치료방법은 아직 없는 실정이다. 그러나 이러한 당뇨병성 신증의 진행과정에서 미세알부민뇨가 출현하는 초기단계에서는 엄격한 혈당조절과 저단백식사요법으로 미세알부민뇨를 경감 혹은 다음 단계로의 진행을 억제-지연시킬 수 있는 것으로 보고되고 있다. 그러므로 당뇨병성 신증이 말기 신장병으로 진행되는 것을 막을 수 있도록 초기에 진단을 할 수 있게 하는 바이오마커의 발견이 필요하다.

최근 당뇨병성 신증 환자의 혈청이나 소변과 같은 샘플에서 바이오마커를 찾아내기 위해 프로테오믹 기술이 쓰여 왔다. 혈장 샘플은 바이오마커를 찾아내는 데는 한계가 있는데 왜냐하면 혈장 내 대부분의 특이적 단백질이 매우 낮은 농도로 존재하기 때문이다.

당단백질 농축 기술 (Glycoprotein enrichment techniques)에 의해 불필요한 혈장 단백질을 제거할 뿐 아니라 단백질의 기능성 서브셋을 농축시키는 수단이 마련될 수 있다. 또한, 당단백질은 암의 진행 및 면역 반응에서 중요한 역할을 하고, 암 예후, 진단 및 모니터링에 대한 새로운 바이오마커로서의 잠재성을 가지고 있다. 예전에 우리는 멀티-렉틴 친화성 크로마토크래피 및 액체 크로마토그래피 결합 이중 질량 스펙트로메트리 (LC-MS/MS) 기법을 사용하여 성공적으로 폐암에 대한 바이오마커를 발견한 바 있다.

당뇨병의 높은 혈당은 혈중 단백질의 비정상적인 글리케이션 (glycation)을 일으킨다고 알려져 있고 이러한 글리케이션은 비효소적인 방식으로 무작위로 일어난다. 높은 혈당과 비정상적인 글리케이션은 신장을 포함한 조직에 손상을 일으키고, 직접적으로 당뇨병성 신증을 유발한다. 게다가, MMP (matrix metalloproteinase)와 TIMP (tissue inhibitors of matrix metalloproteinase) 간 의 불균형은 신장의 손상을 일으킨다. 따라서 조직 손상이 시작되면 당단백질이 혈중으로 유출되거나 또는 조직 손상 신호가 혈중의 글리코프로테옴 프로필을 변형시킬 것이라고 가정했다. 당뇨병 환자와 당뇨병성 신증 환자에서 다른 혈장 당단백질을 찾음으로써 당뇨병성 신증의 초기에 질병을 탐지할 수 있는 도구가 마련될 수 있다.

이에 본 발명자들은 다중-렉틴 친화 칼럼을 이용하여 당뇨병성 신증 환자의 당단백질 농축 샘플로부터 혈장 글리코프로테옴을 검사하고 연구하여 당뇨병성 신증의 초기에 이 질병을 진단할 수 있는 새로운 바이오마커로 사용할 수 있는 단백질을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 혈장 당단백질로부터 동정한 당뇨병성 신증 진단용 바이오마커를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 상기 바이오 마커에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 당뇨병성 신증 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 당뇨병성 신증 환자의 혈청에서 과량 발현되거나 대폭 감소하는 당단백질에 특이적인 분자를 포함하는 당뇨병성 신증 진단용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 당뇨병성 신증 진단용 마커의 동정방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서 사용된 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 당뇨병 환자의 신증으로의 이행 여부를 확인하는 것이다.

본 발명에서 사용된 용어, "당뇨병성 신증"은 당뇨병에 의해 유발된 신장병을 의미하며, 사구체경화증(glomerulosclerosis), 혈관병소(vascular lesion) 및 세뇨관 간질성 질환(tubulointerstitial disease)을 모두 포함하나 특히 당뇨병성 사구체경화증을 의미한다.

본 발명에서 사용된 용어, "진단 마커"란 당뇨병 환자에서 특히 증가하는 물질로 신장을 손상시켜 신증으로 진행시킬 수 있는 유기 생체 분자를 말한다. 상기 유기 생체 분자로는 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나, 폴리펩타이드, 단백질, 핵산, 지질, 당지질, 당단백질 및 당 등이 포함된다. 본 발명에서는 바람직하게는, 상기 유기 생체 분자는 당단백질을 말한다.

본 발명자들은 새로운 당뇨병성 신증 진단용 마커를 규명하고자, 신증은 없 이 당뇨병만 있는 환자들의 혈장과 당뇨병성 신증이 있는 환자들 사이에서 다르게 발현되는 당단백질을 동정하였다. 이를 위해, 다중-렉틴 친화성 칼럼을 이용하여 혈장으로부터 당단백질을 분리하고, 효소처리에 의해 당단백질을 디글리코실화한 후 트립신 처리하여 펩타이드를 확보하였다. 상기에서 확보된 펩타이드를 액상 크로마토그래피로 분리하면서 이온 트랩형 질량분석기(LC-MS/MS)로 분석하였다. 상기 LC-MS/MS 데이터를 컴퓨터 프로그램을 이용하여 IPI 인간 단백질 데이터베이스에서 검색함으로써 당뇨병성 신증 환자의 혈장에 존재하는 당단백질을 규명하고 이를 신장 합병증은 없는 당뇨병 환자의 혈장에서 유래한 당단백질과 비교함으로써 당뇨병성 신증 환자의 혈액에서 특이적으로 증가하거나 감소하므로 당뇨병성 신증 진행의 바이오마커로 사용할 수 있는 당단백질을 규명하였다.

본 발명의 일 실시예에서는 신증이 없는 당뇨병 환자와 신증이 있는 당뇨병 환자로부터 각각 6종의 혈액 시료를 수득하고 이를 원심분리하여 혈장 시료를 확보하였다. 상기에서 수득한 혈장 시료로부터 다중-렉틴 친화성 칼럼을 이용하여 당단백질을 분리하고 아세톤 침전에 의해 농축시켰다.

본 발명의 일 실시예에서는 다중-컬럼 친화성 칼럼에 의해 수득된 용출액 (농축된 당단백질) 및 관류 분획 (flow-through fraction)을 대상으로 쿠마시 염색 (coomassie straining) 및 겔코드 (GelCode) 당단백질 염색을 수행하여 다중-렉틴 친화성 칼럼에 의한 당단백질의 분리 효율을 확인한 결과 다중-렉틴 친화성 칼럼에 의해 혈장 내 당단백질이 농축되었음을 확인할 수 있었다.

이에 본 발명자들은 상기에서 수득한 농축된 혈청 당단백질을 효소처리하고, 인-겔 소화에 의해 펩타이드 혼합물을 수득하였다. 상기에서 수득한 펩타이드 혼합물을 LC-MS/MS 분석하여 당뇨병 환자에 비해 당뇨병성 신증 환자에서 특이적으로 증가하거나 발현된 43개의 단백질 및 당뇨병성 신증 환자에서 특이적으로 감소한 40개의 단백질을 동정하였다.

상기 43개의 상향 조정된 단백질 중 일부는 당뇨병성 신증 환자의 혈청 또는 혈장에서, 당뇨병성 신증의 표지자로 사용할 수 있을 것이라고 보고 된 것들이다. 그 예로는 알부민, 폰 빌레브란트 인자 전구체 (VWF, von Willebrand factor precursor), 혈장 레티놀-결합 단백질 전구체 (RBP-4, Plasma retinol-binding protein precursor), 아포리포단백질 C III 전구체 (APOC3, Apolipoprotein C-III precursor), 비타민 D 결합 단백질 전구체(GC, Vitamin D-binding protein precursor), 루미칸 전구체 등이 있다. 이들 이외의 단백질들은 아직까지 당뇨병성 신증에 대한 표지인자 또는 바이오마커로서 알려져 있지 않다. 따라서 본 발명자들에 의해 규명된 다른 당단백질들은 새로운 당뇨병성 신증 진단 마커로 사용될 수 있다.

따라서 본 발명은 표 4에 나타낸 미오신 반응성 면역글로불린 중쇄 가변 영역 단편 (Myosin-reactive immunoglobulin heavy chain variable region fragment), 세포외 기질 단백질 1 전구체 (EMP1, Extracellular matrix protein 1 precursor), 데스모플라킨의 이소폼 DPI (DSP, Isoform DPI of Desmoplakin), 49 kDa protein (IPI 00180956), Ig 중쇄 V III 영역 VH26 전구체 (IGHV2, Ig heavy chain V-III region VH26 precursor), 혈청 아밀로이드 A-4 단백질 전구체 (SAA- 4, Serum amyloid A-4 protein precursor), 테트라넥틴 전구체 (CLEC3B, Tetranectin precursor), Ig 카파쇄 V IV 영역 STH 유사체 (IGKV4-1, Similar to Ig kappa chain V-IV region STH), C-반응성 단백질 전구체의 이소폼 1 (CRP, Isoform 1 of C-reactive protein precursor), 결합 플라코글로빈 (JUP, Junction plakoglobin), E3 유비퀴틴-단백질 리가아제 UBR1의 이소폼 1 (UBR1, Isoform 1 of E3 ubiquitin-protein ligase UBR1), 보체 인자 H-관련 단백질 4 전구체 (CFHR4, Complement factor H-related protein 4 precursor), 소 프롤린-풍부 단백질 2G (SPRR2G, Small proline-rich protein 2G), IGKC 단백질, 카르복시펩티다제 B2 전구체의 이소폼 2 (CPB2, Isoform 2 of Carboxypeptidase B2 precursor), 응고 인자 V (F5, Coagulation factor V), SCC-112 단백질, 콜라겐 알파-1(VI) 쇄 전구체 (COL6A1, Collagen alpha-1(VI) chain precursor), 이팝소리아신 (RP1-14N1.3, Ifapsoriasin), 피불린-1 전구체의 이소폼 C (FBLN1, Isoform C of Fibulin-1 precursor), 프로콜라겐 C 엔도펩티다제 인핸서 1 전구체 (PCOLCE, Procollagen C-endopeptidase enhancer 1 precursor), 히스톤-리신 N-메틸트랜스퍼라제의 이소폼 1 H3 리신-9 specific 5 (EHMT1, Isoform 1 of Histone-lysine N-methyltransferase, H3 lysine-9 specific 5), IgG Fc-결합 단백질 전구체 (FCGBP, IgG Fc-binding protein precursor), ATP-결합 카세트 서브 패밀리 B 멤버 9 전구체의 이소폼 2 (ABCB9, Isoform 2 of ATP-binding cassette sub-family B member 9 precursor), 36 kDa 단백질 (IPI 00790690), 글리세랄데히드-3-포스페이트 디히드로게나제 (GAPDH, Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), 단백질 S100-A8, DNA-의존성 단백질 키나아제 촉매 서브유닛의 이소폼 1 (PRKDC, Isoform 1 of DNA-dependent protein kinase catalytic subunit), 데스모글린-1 전구체 (DSG1, Desmoglein-1 precursor), 덤시딘 전구체(DCD, Dermcidin precursor), 바소린 전구체 (VASN, Vasorin precursor), 설프히드릴 옥시다제 1 전구체의 이소폼 1 (QSOX1, Isoform 1 of Sulfhydryl oxidase 1 precursor), IGLV3-25 단백질, SNC66 단백질 (IGHA1), 보체 인자 H-관련 단백질 3 전구체 (CFHR3, Complement factor H-related protein 3 precursor) 및 베타-Ala-His 디펩티다제 전구체 (CNDP1, Beta-Ala-His dipeptidase precursor)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 단백질로서, 당뇨병성 신증에서 발현이 증가되는 것을 특징으로 하는, 당뇨병성 신증 진단용 바이오마커 단백질에 관한 것이다.

또한, 본 발명의 하향 조정된 40개의 단백질은 아직까지 당뇨병성 신증에서 특이적으로 감소한다고 보고되지 않았다. 그러므로 이 단백질들은 새로운 당뇨병성 신증의 진단 마커로서 쓰일 수 있다.

따라서 본 발명은 표 5에 나타낸 만노즈 결합 단백질 C 전구체 (MBL2, Mannose-binding protein C precursor), 액틴 사이토플라스믹 1 (ACTB, Actin cytoplasmic 1), 호르네린 (HRNR, Hornerin), 비오티니다제 전구체 (BTD, Biotinidase precursor), 도파민 베타-히드록실라제 전구체 (DBH, Dopamine beta-hydroxylase precursor), 칼륨 채널 서브패밀리 H 멤버 4 (KCNH4, Potassium voltage-gated channel subfamily H member 4), 만난 결합 렉틴 세린 프로테아제 2 전구체의 이소폼 1 (MASP2, Isoform 1 of Mannan-binding lectin serine protease 2 precursor), 감마-글루타밀 히드롤라제 전구체 (GGH, Gamma-glutamyl hydrolase precursor), 멜라노트랜스페린 전구체의 이소폼 1 (MFI2, Isoform 1 of Melanotransferrin precursor), 페투인-B 전구체 (FETUB, Fetuin-B precursor), 프로페르딘 전구체 (CFP, Properdin precusor), Ig 카파쇄 V I 영역 AG (Ig kappa chain V-I region AG), 면역글로불린 중쇄 가변 영역 (IPI00477804), 성장 억제 단백질 12 (LTF, Growth-inhibiting protein 12), WW 도메인 결합 단백질 11 (WBP11, WW domain-binding protein 11), 아밀로이드 람다 6 경쇄 가변 영역 SAR 단편 (Amyloid lambda 6 light chain variable region SAR Fragment), 단백질 HEG 동족체 1 전구체의 이소폼 1 (HEG1, Isoform 1 of Protein HEG homolog 1 precursor), Ig 중쇄 V III 영역 TIL, RRP5 단백질 동족체 (PDCD11, RRP5 protein homolog), 혈소판 당단백질 Ib 알파쇄 전구체 (GP1BA, Platelet glycoprotein Ib alpha chain precursor), 필라민-C의 이소폼 1 (FLNC, Isoform 1 of Filamin-C), 비타민-K 의존성 단백질 C 전구체 (PROC, Vitamin K-dependent protein C precursor), Ig 중쇄 V III 영역 BRO, 아연 핑거 단백질 291 (ZNF291, Zinc finger protein 291), 센트로좀-결합 단백질 350 (CEP350, Centrosome-associated protein 350), H53_GS1 단편, 셀레노프로틴 P 전구체 (SEPP1, Selenoprotein P precursor), 디스패치드 A(DISP1, Dispatched A), 겔소린 전구체의 이소폼 1 (GSN, Isoform 1 of Gelsolin precursor), 인슐린양 성장 인자-결합 단백질 2 전구체 (IGFBP2, Insulin-like growth factor-binding protein 2 precursor), Ig 카파쇄 V III 영역 HAH 전구체 (IGKV3-20, Ig kappa chain V-III region HAH precursor), 키니노겐-1 전구체의 이소폼 LMW (KNG1, Isoform LMW of Kininogen-1 precursor), 미오신 반응성 면역글로불린 중쇄 가변 영역 단편 (IPI 00384407), 38 kDa 단백질 (IPI00008669), Ig 람다쇄 V-III 영역 SH, 아포리포단백질 (LPA, Apolipoprotein), 보체 성분 C8 알파쇄 전구체 (C8A, Complement component C8 alpha chain precursor), 보체 성분 C8 베타쇄 전구체 (C8B, Complement component C8 beta chain precursor), 헤파린 코팩터 2 전구체 (SERPIND1) 및 보체 C5 전구체 (C5)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 단백질로서, 당뇨병성 신증에서 발현이 감소되는 것을 특징으로 하는, 당뇨병성 신증 진단용 바이오마커 단백질에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 당뇨병성 신증에서 하향 조정된 상기 40개의 단백질을 당뇨병성 신증의 진단에 활용될 수 있으며, 구체적으로 미오신 반응성 면역글로불린 중쇄 가변 영역 단편(Myosin-reactive immunoglobulin heavy chain variable region fragment), 세포외 기질 단백질 1 전구체 (EMP1, Extracellular matrix protein 1 precursor), 데스모플라킨의 이소폼 DPI (DSP, Isoform DPI of Desmoplakin), 49 kDa 단백질 (IPI 00180956), Ig 중쇄 V-III 영역 VH26 전구체 (IGHV2, Ig heavy chain V-III region VH26 precursor), 혈청 아밀로이드 A-4 단백질 전구체 (SAA-4, Serum amyloid A-4 protein precursor), 테트라넥틴 전구체 (CLEC3B, Tetranectin precursor), Ig 카파쇄 V-IV 영역 STH 유사체 (IGKV4-1, Similar to Ig kappa chain V-IV region STH), C-반응성 단백질 전구체의 이소폼 1 (CRP, Isoform 1 of C-reactive protein precursor), 결합 플라코글로빈 (JUP, Junction plakoglobin), E3 유비퀴틴-단백질 리가아제 UBR1의 이소폼 1 (UBR1, Isoform 1 of E3 ubiquitin-protein ligase UBR1), 보체 인자 H-관련 단백질 4 전구체 (CFHR4, Complement factor H-related protein 4 precursor), 소 프롤린-풍부 단백질 2G (SPRR2G, Small proline-rich protein 2G), IGKC 단백질, 카르복시펩티다제 B2 전구체의 이소폼 2 (CPB2, Isoform 2 of Carboxypeptidase B2 precursor), 응고 인자 V (F5, Coagulation factor V), SCC-112 단백질, 콜라겐 알파-1(VI)쇄 전구체 (COL6A1, Collagen alpha-1(VI) chain precursor), 이팝소리아신 (RP1-14N1.3, Ifapsoriasin), 피불린-1 전구체의 이소폼 C (FBLN1, Isoform C of Fibulin-1 precursor), 프로콜라겐 C-엔도펩티다제 인핸서 1 전구체 (PCOLCE, Procollagen C-endopeptidase enhancer 1 precursor), 히스톤-리신 N-메틸트랜스퍼라제의 이소폼 1 H3 리신-9 특정 5 (EHMT1, Isoform 1 of Histone-lysine N-methyltransferase, H3 lysine-9 specific 5), IgG Fc-결합 단백질 전구체 (FCGBP, IgG Fc-binding protein precursor), ATP-결합 카세트 서브 패밀리 B 멤버 9 전구체의 이소폼 2 (ABCB9, Isoform 2 of ATP-binding cassette sub-family B member 9 precursor), 36 kDa 단백질 (IPI 00790690), 글리세랄데히드-3-포스페이트 디히드로게나제 (GAPDH, Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), 단백질 S100-A8, DNA-의존성 단백질 키나아제 촉매 서브유닛의 이소폼 1 (PRKDC, Isoform 1 of DNA-dependent protein kinase catalytic subunit), 데스모글린-1 전구체 (DSG1, Desmoglein-1 precursor), 덤시딘 전구체(DCD, Dermcidin precursor), 바소린 전구 체 (VASN, Vasorin precursor), 설프히드릴 옥시다제 1 전구체의 이소폼 1 (QSOX1, Isoform 1 of Sulfhydryl oxidase 1 precursor), IGLV3-25 단백질, SNC66 단백질 (IGHA1), 보체 인자 H-관련 단백질 3 전구체 (CFHR3, Complement factor H-related protein 3 precursor) 및 베타-Ala-His 디펩티다제 전구체 (CNDP1, Beta-Ala-His dipeptidase precursor)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 단백질에 특이적으로 결합하는 분자를 포함하는 당뇨병성 신증 진단용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명의 하향 조정된 40개의 단백질은 아직까지 당뇨병성 신증에서 특이적으로 감소한다고 보고되지 않았다. 그러므로 이 단백질들은 새로운 당뇨병성 신증의 진단 마커로서 쓰일 수 있다. 따라서 본 발명은 표 5에 나타낸 만노즈 결합 단백질 C 전구체 (MBL2, Mannose-binding protein C precursor), 액틴 사이토플라스믹 1 (ACTB, Actin cytoplasmic 1), 호르네린 (HRNR, Hornerin), 비오티니다제 전구체 (BTD, Biotinidase precursor), 도파민 베타-히드록실라제 전구체 (DBH, Dopamine beta-hydroxylase precursor), 칼륨 채널 서브패밀리 H 멤버 4 (KCNH4, Potassium voltage-gated channel subfamily H member 4), 만난 결합 렉틴 세린 프로테아제 2 전구체의 이소폼 1 (MASP2, Isoform 1 of Mannan-binding lectin serine protease 2 precursor), 감마-글루타밀 히드롤라제 전구체 (GGH, Gamma-glutamyl hydrolase precursor), 멜라노트랜스페린 전구체의 이소폼 1 (MFI2, Isoform 1 of Melanotransferrin precursor), 페투인-B 전구체 (FETUB, Fetuin-B precursor), 프로페르딘 전구체 (CFP, Properdin precusor), Ig 카파쇄 V-I 영역 AG (Ig kappa chain V-I region AG), 면역글로불린 중쇄 가변 영역 (IPI 00477804), 성장 억제 단백질 12 (LTF, Growth-inhibiting protein 12), WW 도메인 결합 단백질 11 (WBP11, WW domain-binding protein 11), 아밀로이드 람다 6 경쇄 가변 영역 SAR 단편 (Amyloid lambda 6 light chain variable region SAR Fragment), 단백질 HEG 동족체 1 전구체의 이소폼 1 (HEG1, Isoform 1 of Protein HEG homolog 1 precursor), Ig 중쇄 V-III 영역 TIL, RRP5 단백질 동족체 (PDCD11, RRP5 protein homolog), 혈소판 당단백질 Ib 알파쇄 전구체 (GP1BA, Platelet glycoprotein Ib alpha chain precursor), 필라민-C의 이소폼 1 (FLNC, Isoform 1 of Filamin-C), 비타민-K 의존성 단백질 C 전구체 (PROC, Vitamin K-dependent protein C precursor), Ig 중쇄 V-III 영역 BRO, 아연 핑거 단백질 291 (ZNF291, Zinc finger protein 291), 센트로좀-결합 단백질 350 (CEP350, Centrosome-associated protein 350), H53_GS1 단편, 셀레노프로틴 P 전구체 (SEPP1, Selenoprotein P precursor), 디스패치드 A (DISP1, Dispatched A), 겔소린 전구체의 이소폼 1 (GSN, Isoform 1 of Gelsolin precursor), 인슐린양 성장 인자 결합 단백질 2 전구체 (IGFBP2, Insulin-like growth factor-binding protein 2 precursor), Ig 카파쇄 V-III 영역 HAH 전구체 (IGKV3-20, Ig kappa chain V-III region HAH precursor), 키니노겐-1 전구체의 이소폼 LMW (KNG1, Isoform LMW of Kininogen-1 precursor), 미오신 반응성 면역글로불린 중쇄 가변 영역 단편 (IPI 00384407), 38 kDa 단백질 (IPI 00008669), Ig 람다쇄 V-III 영역 SH, 아포리포단백질 (LPA, Apolipoprotein), 보체 성분 C8 알파쇄 전구체 (C8A, Complement component C8 alpha chain precursor), 보체 성분 C8 베타쇄 전구체 (C8B, Complement component C8 beta chain precursor), 헤파린 코팩터 2 전구체 (SERPIND1) 및 보체 C5 전구체(C5)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 단백질에 특이적으로 결합하는 분자를 포함하는 당뇨병성 신증 진단용 조성물을 제공한다.

한편, 생물학적 시료 중에서 특정 단백질의 존재여부는 시료를 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시켜 항원-항체 복합체의 형성여부를 측정함으로써 확인할 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어 "항원-항체 복합체"란 생물학적 시료 중의 특정 단백질과 이를 특이적으로 인지하는 항체의 결합물을 의미한다.

본 발명에서 사용된 용어 "생물학적 시료" 또는 "시료"는 혈액 및 생물학적 기원의 기타 액상 시료를 말한다. 바람직하게는, 상기 생물학적 시료 또는 시료는 전혈, 혈장, 혈청 또는 조직액일 수 있다. 상기 시료는 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간으로부터 수득될 수 있다. 상기 시료는 검출에 사용하기 전에 전처리할 수 있다. 예를 들어, 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 시료로부터 핵산 및 단백질을 분리하여 검출에 사용할 수 있다.

본 발명에서 "항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명에 사용되는 항체는 단클론 또는 다클론 항체, 면역학적으로 활성인 단편(예를 들어, Fab 또는 (Fab)₂ 단편), 항체 중쇄, 인간화 항체, 항체 경쇄, 유전자 조작된 단일쇄 Fν 분자, 키메릭 항체 등일 수 있다.

표 4 및 표 5에 나타낸 단백질들은 공지된 단백질이므로 본 발명에 사용되는 항체는 상기 공지된 단백질을 항원으로 하여 면역학 분야에서 널리 알려져 있는 통상의 방법으로 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 항체의 항원으로서 사용되는 단백질은 천연에서 추출하거나 합성될 수 있으며 DNA 서열을 기초로 하여 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다. 유전자 재조합 기술을 이용할 경우 단백질을 코딩하는 핵산을 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 재조합 발현 벡터로 형질 전환된 형질 전환체에서 목적으로 하는 단백질이 발현되도록 숙주 세포를 배양한 후 형질 전환체로부터 목적으로 하는 단백질을 회수함으로써 수득될 수 있다.

예를 들어, 다클론 항체는 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 항체는 말, 소, 염소, 양, 개, 닭, 칠면조, 토끼, 마우스 또는 래트와 같은 여러 온혈 동물을 이용하여 제조할 수 있다.

단클론 항체도 공지된 융합방법 (fusion method) (Kohler and Milstein, European J. Immnunol. 6:511-519 1976), 재조합 DNA 방법 (미국특허 제4816567호) 및 파지 항체 라이브러리 (Clackson et al., Nature, 352, 624-628, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 58:1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다.

본 발명의 진단용 조성물은 단백질에 특이적인 항체 이외에 면역학적 분석에 사용되는 당 업계에 공지된 시약을 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 면역학적 분석은 항원과 항체의 결합을 측정할 수 있는 있는 방법이라면 모두 포함될 수 있다. 이러한 방법들은 당 분야에 공지되어 있으며 예를 들어, 면역세포화학 및 면역조직 화학, 방사선 면역 분석법 (radioimmunoassays), 효소결합면역법 (ELISA: Enzyme Linked Immunoabsorbent assay), 면역 블롯 (immunoblotting), 파아르 분석법 (Farr assay), 면역침강, 라텍스 응집, 적혈구 응집, 비탁계법, 면역확산법, 카운터-전류 전기영동법, 단일 라디칼 면역확산법, 면역크로마토그래피법, 단백질 칩 및 면역형광법이 있다.

면역학적 분석에 사용되는 시약으로는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제가 포함된다. 또한, 표지물질이 효소인 경우에는 효소활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다.

상기에서 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지는 항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정가능하게 하며, 이의 예로는 효소, 형광물질, 리간드, 발광물, 미소입자 (microparticle), 레독스 분자 및 방사성 동위원소 등을 사용할 수 있다. 효소로는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라아제, 글리코즈 옥시다아제, 헥소키나제, 말레이트 디하이드로게나아제, 글루코스-6-인산디하이드로게나아제, 인버타아제 등을 사용할 수 있다. 형광물로는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, 플루오르신이소티옥시아네이트 등을 사용할 수 있다. 리간드로는 바이오틴 유도체 등이 있으며, 발광물로는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있다. 미소입자로는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있고 레독스 분자로는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논 등이 있다. 방사성 동위원소로는 ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ³⁶Cl, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁹⁰Y, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁸⁶Re 등이 있다. 그러나 상기 예시된 것들 외에 면역학적 분석법에 사용할 수 있는 것이라면 어느 것이라도 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 마커 단백질의 존재여부를 확인할 수 있는 방법으로는 본 발명의 마커 단백질에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 이용할 수 있다.

따라서 본 발명은 표 4 및 표 5에 나타낸 단백질에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 포함하는 당뇨병성 신증 진단용 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기의 당뇨병성 신증 진단용 조성물을 이용한 당뇨병성 신증 진단방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 진단용 조성물은 진단의 신속도 및 편리성을 높이기 위해, 적합한 담체 또는 지지체상에 공지된 다양한 방법을 이용하여 고정화된 상태로 제공될 수 있다(Antibodies: A Labotory Manual, Harlow ＆ Lane; Cold SpringHarbor, 1988). 적합한 담체 또는 지지체의 예로는 아가로스, 셀룰로즈, 니트로셀룰로즈, 덱스트란, 세파덱스, 세파로즈, 리포솜, 카르복시메틸 셀룰로즈, 폴리아크릴아미드, 폴리스테린, 반려암, 여과지, 이온교환수지, 플라스틱 필름, 플라스틱 튜브, 유리, 폴리아민-메틸 비닐-에테르-말레산 공중합체, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레산 공중합체, 나일론, 컵, 플랫 팩(flat packs) 등 이 포함된다. 그 외의 다른 고체 기질로는 세포 배양 플레이트, ELISA 플레이트, 튜브 및 폴리머성 막이 있다. 상기 지지체는 임의의 가능한 형태, 예를 들어 구형(비드), 원통형(시험관 또는 웰 내면), 평면형(시트, 시험 스트립)을 가질 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 당뇨병성 신증 진단용 조성물은 진단용 키트 또는 마이크로어레이 형태로 제공될 수 있다.

상기 진단용 키트로는 예를 들면, 시료 중의 특정 단백질을 검출하기 위해 면역크로마토그래피법을 기초로 하는 측방 유동 검정 키트 (lateral flow assay kit)의 형태로 제공될 수 있다. 측방 유동 검정 키트는 시료가 적용되는 샘플패드 (sample pad), 탐지용 항체가 코팅되어 있는 방출패드 (releasing pad), 시료가 이동하여 분리되고 항원-항체 반응이 일어나는 전개용 막 (예를 들어 니트로셀룰로스) 또는 스트립, 그리고 흡수패드 (absorption pad)로 이루어져 있다.

상기 마이크로어레이는 일반적으로 특정 시약으로 처리된 슬라이드 글라스 표면 위에 항체를 부착하여 항원-항체 반응에 의해 상기 항체에 특이적으로 부착하는 단백질을 검출할 수 있도록 하는 것이다.

본 발명은 표 4에 나타낸 미오신 반응성 면역글로불린 중쇄 가변 영역 단편 (Myosin-reactive immunoglobulin heavy chain variable region fragment), 세포외 기질 단백질 1 전구체 (EMP1, Extracellular matrix protein 1 precursor), 데스모플라킨의 이소폼 DPI (DSP, Isoform DPI of Desmoplakin), 49 kDa 단백질 (IPI 00180956), Ig 중쇄 V-III 영역 VH26 전구체 (IGHV2, Ig heavy chain V-III region VH26 precursor), 혈청 아밀로이드 A-4 단백질 전구체 (SAA-4, Serum amyloid A-4 protein precursor), 테트라넥틴 전구체 (CLEC3B, Tetranectin precursor), Ig 카파쇄 V-IV 영역 STH 유사체 (IGKV4-1, Similar to Ig kappa chain V-IV region STH), C-반응성 단백질 전구체의 이소폼 1 (CRP, Isoform 1 of C-reactive protein precursor), 결합 플라코글로빈 (JUP, Junction plakoglobin), E3 유비퀴틴-단백질 리가아제 UBR1의 이소폼 1 (UBR1, Isoform 1 of E3 ubiquitin-protein ligase UBR1), 보체 인자 H-관련 단백질 4 전구체 (CFHR4, Complement factor H-related protein 4 precursor), 소 프롤린-풍부 단백질 2G (SPRR2G, Small proline-rich protein 2G), IGKC 단백질, 카르복시펩티다제 B2 전구체의 이소폼 2 (CPB2, Isoform 2 of Carboxypeptidase B2 precursor), 응고 인자 V (F5, Coagulation factor V), SCC-112 단백질, 콜라겐 알파-1(VI) 쇄 전구체 (COL6A1, Collagen alpha-1(VI) chain precursor), 이팝소리아신 (RP1-14N1.3, Ifapsoriasin), 피불린-1 전구체의 이소폼 C (FBLN1, Isoform C of Fibulin-1 precursor), 프로콜라겐 C 엔도펩티다제 인핸서 1 전구체 (PCOLCE, Procollagen C-endopeptidase enhancer 1 precursor), 히스톤-리신 N-메틸트랜스퍼라제의 이소폼 1 H3 리신-9 특정 5 (EHMT1, Isoform 1 of Histone-lysine N-methyltransferase, H3 lysine-9 specific 5), IgG Fc-결합 단백질 전구체 (FCGBP, IgG Fc-binding protein precursor), ATP-결합 카세트 서브 패밀리 B 멤버 9 전구체의 이소폼 2 (ABCB9, Isoform 2 of ATP-binding cassette sub-family B member 9 precursor), 36 kDa 단백질 (IPI 00790690), 글리세랄데히드-3-포스페이트 디히드로게나제 (GAPDH, Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), 단백질 S100-A8, DNA-의존성 단백질 키나아제 촉매 서브유닛의 이소폼 1 (PRKDC, Isoform 1 of DNA-dependent protein kinase catalytic subunit), 데스모글린-1 전구체 (DSG1, Desmoglein-1 precursor), 덤시딘 전구체(DCD, Dermcidin precursor), 바소린 전구체 (VASN, Vasorin precursor), 설프히드릴 옥시다제 1 전구체의 이소폼 1 (QSOX1, Isoform 1 of Sulfhydryl oxidase 1 precursor), IGLV3-25 단백질, SNC66 단백질(IGHA1), 보체 인자 H-관련 단백질 3 전구체 (CFHR3, Complement factor H-related protein 3 precursor) 및 베타-Ala-His 디펩티다제 전구체 (CNDP1, Beta-Ala-His dipeptidase precursor)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 단백질을 암호화하는 핵산에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함하는 당뇨병성 신증 진단용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 표 5에 나타낸 만노즈 결합 단백질 C 전구체 (MBL2, Mannose-binding protein C precursor), 액틴 사이토플라스믹 1 (ACTB, Actin cytoplasmic 1), 호르네린 (HRNR, Hornerin), 비오티니다제 전구체 (BTD, Biotinidase precursor), 도파민 베타-히드록실라제 전구체 (DBH, Dopamine beta-hydroxylase precursor), 칼륨 채널 서브패밀리 H 멤버 4 (KCNH4, Potassium voltage-gated channel subfamily H member 4), 만난 결합 렉틴 세린 프로테아제 2 전구체의 이소폼 1 (MASP2, Isoform 1 of Mannan-binding lectin serine protease 2 precursor), 감마-글루타밀 히드롤라제 전구체 (GGH, Gamma-glutamyl hydrolase precursor), 멜라노트랜스페린 전구체의 이소폼 1 (MFI2, Isoform 1 of Melanotransferrin precursor), 페투인-B 전구체 (FETUB, Fetuin-B precursor), 프로페르딘 전구체 (CFP, Properdin precusor), Ig 카파쇄 V-I 영역 AG (Ig kappa chain V-I region AG), 면역글로불린 중쇄 가변 영역 (IPI00477804), 성장 억제 단백질 12 (LTF, Growth-inhibiting protein 12), WW 도메인 결합 단백질 11 (WBP11, WW domain-binding protein 11), 아밀로이드 람다 6 경쇄 가변 영역 SAR 단편 (Amyloid lambda 6 light chain variable region SAR Fragment), 단백질 HEG 동족체 1 전구체의 이소폼 1 (HEG1, Isoform 1 of Protein HEG homolog 1 precursor), Ig 중쇄 V-III 영역 TIL, RRP5 단백질 동족체 (PDCD11, RRP5 protein homolog), 혈소판 당단백질 Ib 알파쇄 전구체 (GP1BA, Platelet glycoprotein Ib alpha chain precursor), 필라민-C의 이소폼 1 (FLNC, Isoform 1 of Filamin-C), 비타민-K 의존성 단백질 C 전구체 (PROC, Vitamin K-dependent protein C precursor), Ig 중쇄 V III 영역 BRO, 아연 핑거 단백질 291 (ZNF291, Zinc finger protein 291), 센트로좀-결합 단백질 350 (CEP350, Centrosome-associated protein 350), H53_GS1 단편, 셀레노프로틴 P 전구체 (SEPP1, Selenoprotein P precursor), 디스패치드 A (DISP1, Dispatched A), 겔소린 전구체의 이소폼 1 (GSN, Isoform 1 of Gelsolin precursor), 인슐린양 성장 인자-결합 단백질 2 전구체 (IGFBP2, Insulin-like growth factor-binding protein 2 precursor), Ig 카파쇄 V-III 영역 HAH 전구체 (IGKV3-20, Ig kappa chain V-III region HAH precursor), 키니노겐-1 전구체의 이소폼 LMW (KNG1, Isoform LMW of Kininogen-1 precursor), 미오신 반응성 면역글로불린 중쇄 가변 영역 단편 (IPI 00384407), 38 kDa 단백질 (IPI00008669), Ig 람다쇄 V-III 영역 SH, 아포리포단백질 (LPA, Apolipoprotein), 보체 성분 C8 알파쇄 전구체 (C8A, Complement component C8 alpha chain precursor), 보체 성분 C8 베타쇄 전구체 (C8B, Complement component C8 beta chain precursor), 헤파린 코팩터 2 전구체 (SERPIND1) 및 보체 C5 전구체 (C5)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 단백질을 암호화하는 핵산에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함하는 당뇨병성 신증 진단용 조성물을 제공한다.

프라이머를 이용한 특정 핵산의 검출은 PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 목적 유전자의 서열을 증폭한 다음 당 분야에 공지된 방법으로 유전자의 증폭여부를 확인함으로써 수행될 수 있다. 또한, 프로브를 이용한 특정 핵산의 검출은 적합한 조건하에서 시료 핵산을 프로브와 접촉시킨 후 하이브리드화되는 핵산의 존재여부를 확인함으로써 수행될 수 있다.

상기 "프라이머"란 짧은 자유 수산화기를 가지는 핵산서열로서 상보적인 템플리트와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플리트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산서열을 말한다. 본 발명의 프라이머는 예를 들면, 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법과 같은 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다.

상기 "프로브"는 mRNA와 특이적으로 결합할 수 있는 수개 내지 수백 개의 염기로 이루어진 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어 특정 mRNA의 존재유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드 프로브, 단쇄 DNA 프로브, 이중쇄 DNA 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고 비오틴, FITC, 로다민, DIG 등으로 표지되거나 방사선 동위 원소 등으로 표지될 수 있다.

또한, 상기 프로브는 검출 가능한 물질 예를 들면, 적합한 신호를 제공하고 충분한 반감기를 갖는 방사성 표지로 표지할 수 있다. 표지된 프로브는 문헌 (Sambook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Mannual, 1989)에 공지된 바와 같은 고체 지지체 상의 핵산에 하이브리드화시킬 수 있다.

상기 프로브나 프라이머를 이용하여 특정 핵산을 검출할 수 있는 방법으로는 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 중합효소 연쇄반응 (PCR), DNA 시퀀싱, RT-PCR, 프라이머 연장법 (Nikiforeov et al., Nucl Acids Res 22, 4167-4175, 1994), 올리고뉴클레오타이드 연장 분석 (Nickerson et al., Pro Nat Acad Sci USA, 87, 8923-8927, 1990), 대립형질 특이적 PCR법 (Rust et al., Nucl Acids Res, 6, 3623-3629, 1993), RNase 불일치 절단 (RNase mismatch cleavage, Myers et al., Science, 230, 1242-1246, 1985), 단일가닥 입체 다형화 (single strand conformation lymorphism, Orita et al., Pro Nat Acad Sci USA, 86, 2766-2770, 1989), SSCP 및 헤테로두플렉스 동시 분석법 (Lee et al., Mol Cells, 5:668-672, 1995), 변성 구배 젤 전기영동 (DGGE, Cariello et al., Am J Hum Genet, 42, 726-734, 1988), 변성 고압 액체 크로마토그래피 (Underhill et al., Genome Res, 7, 996-1005, 1997), 혼성화 반응, DNA 칩 등이 있다. 상기 혼성화 반응의 예로는 노던 하이브리다이제이션 (Maniatis T. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Habor Laboratory, NY, 1982), 인시츄 하이브리다이제이션 (Jacquemier et al., Bull Cancer, 90:31-8, 2003) 및 마이크로어레이 (Macgregor, Expert Rev Mol Diagn 3:185-200, 2003) 방법 등이 있다.

상기 본 발명의 당뇨병성 신증 진단용 조성물은 상술한 핵산을 검출하는 방법에 일반적으로 사용되는 시약을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, PCR 반응에 요구되는 dNTP (deoxynulceotide triphosphate), 내열성 중합효소 (polymerase), 염화마그네슘 등의 금속이온염이 포함할 수 있으며, 시퀀싱에 요구되는 dNTP, 시쿼나제 (sequenase) 등을 포함할 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 당뇨병성 신증 진단용 조성물은, 예를 들면 이에 한정되지는 않지만 본 발명의 마커 유전자에 대하여 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함하는 RT-PCR 키트, 본 발명의 마커 유전자의 cDNA 또는 올리고뉴클레오타이드가 부착된 기판을 포함하는 DNA 칩 등과 같은 진단용 키트 또는 마이크로어레이의 형태로 제공될 수 있다.

또한, 다른 관점으로서 본 발명은

(a) 다중-렉틴 친화성 컬럼을 이용하여 체액 시료 중 당단백질을 분리하는 단계;

(b) 상기 (a) 단계의 분리된 당단백질을 아세톤 침전에 의해 농축하는 단계;

(c) 상기 (b) 단계에서 농축된 당단백질에 효소를 처리하여 디글리코실화하는 단계;

(d) 상기 (c) 단계에서 디글리코시화된 단백질을 SDS-PAGE하는 단계;

(e) 인-겔 트립신 소화에 의해 펩타이드를 수득하는 단계;

(f) 상기 (e) 단계의 펩타이드를 LC-MS/MS로 분석하여 당뇨병 환자에 비해서 당뇨병성 신증 환자에서 다량 발현하거나 감소한 단백질을 동정하는 단계를 포함하는 당뇨병성 신증 진단 마커의 동정 방법을 제공한다. 바람직하게는 상기 체액은 혈액 또는 조직액이고, 더욱 바람직하게는 혈장이다.

바람직하게는 상기 (f) 단계는 질량분석기기에서 MRM(multiple reaction monitoring: 다중반응 모니터링) 또는 SRM(selective reaction monitoring; 선택반응 모니터링) 방법을 적용하여 펩타이드의 전구체 이온과 전이 이온(transition ion)의 질량분석기기 상의 피크를 이용하여 당뇨병 환자에 비해서 당뇨병성 신증 환자에서 다량 발현하거나 감소한 단백질을 정량적으로 분석하고 동정하는 것을 특징으로 하는 당뇨병성 신증 진단 마커의 동정방법을 제공한다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 당뇨병성 신증 진단용 마커는 당뇨병성 신증 환자의 혈액에서 특이적으로 과량 발현되거나 감소하므로 당뇨병성 신증으로의 진행, 예후 및 치료 상태를 평가하는데 매우 유용하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 당뇨병 대조군 및 당뇨병성 신증 환자로부터의 혈장 시료의 단계적 선택

신증은 없는 2형 당뇨병 환자들 (대조군, 남자 23명) 및 신증을 동반한 2형 당뇨병 환자들 (당뇨병성 신증, 남자 14명)로부터 혈액 및 소변 시료를 채취하였 다. 시료들은 밤새 절식한 후에 오전에 채취하였다. 이 연구에 대한 프로토콜은 경북대학교 병원 생명안전윤리위원회에 의해 인증 받았으며 37명의 환자 모두로부터 고지에 입각한 동의서를 받았다. 헤파린 처리된 전혈 시료를 4℃에서 2,000 rpm으로 15분간 원심분리하여 혈장시료를 분리하고 사용시까지 -70℃에 보관하였다. 소변 시료도 원심분리하여 세포 잔여물을 제거하고 4℃에서 12시간 동안 투석 (molecular-porous membrane tubing, 6-8,000 Da cutoff, Spectrumlabs USA)하여 염을 제거하였다. 이 시료들은 플라스틱 소변 시료통에 넣고 -70℃에서 사용 시까지 보관하였다.

우선 알부민뇨의 정도를 판단하기 위해서 총 37명의 남자 2형 당뇨병 환자 로부터 소변을 채취하여 알부민 농도를 검사하였다. 소변의 알부민/크레아티닌 비율 (mg/g)에 따라 환자들을 2형 당뇨병 대조군 (이하, 대조군)과 2형 당뇨병성 신증군 (이하, 신증군)으로 나누었다. 37명의 환자 중에서 22명의 환자 (대조군 13명, 신증군 9명)를 추가 분석을 위해 선택하고, 고혈압이나 망막증과 같은 다른 합병증이 있는 환자들은 제외하였다. 1D-SDS-PAGE 및 쿠마시 염색을 통해 총 22명의 소변의 단백질을 검사한 후에 최종적으로 각 군에서 6명의 환자들의 혈장 시료를 선택하였다 (도 1).

시료가 선택된 환자들 (대조군 6, 신증군 6)의 임상적 데이터는 표 1에 나타내었다. 소변 알부민/크레이티닌 비는 신증군에서 대조군에 비해 현저히 높았다 (P < 0.05). HbA1c 값은 양 그룹에서 정상 범위보다 높았지만 신증군에서의 값이 대조군에서보다 훨씬 높았다. 혈청 크레이티닌값도 대조군에 비해 신증군에서 더 높은 경향이 있었지만, 그 차이는 유의적이지 않았다. 혈청 알부민, 혈청 총 콜레스테롤, HDL 콜레스테롤, LDL 콜레스테롤, 트리글리세라이드 및 헤모글로빈 수치는 유의적으로 다르지 않았다. 절식 후 혈당은 정상 범위보다 높았지만 두 그룹 간에 유의적 차이를 보이지는 않았다.

2형 당뇨병 환자 및 당뇨병성 신증 환자의 임상 데이터

	정상범위	DC	DN
평균나이(년)		59.8±6.1	64.7±3.3
성별 (남/여)		남	남
절식 후 혈당(mg/dL)	70~110	128.8±41.7	126.5±80.1
HbA1c (%)	4~6.5	6.7±0.7	8.6±0.9*
혈청 알부민(g/dL)	3.2~4.8	4.4±0.2	4.2±0.5
혈청 크레아티닌(mg/dL)	0.9~1.5	0.9±0.2	1.5±0.8
혈청 총 콜레스테롤 (mg/dL)	125~200	157.3±16.3	136.8±23.2
HDL 콜레스테롤 (mg/dL)	>35	47.5±15.3	40.5±8.9
LDL 콜레스테롤 (mg/dL)	<130	105.7±10.2	85.2±23.2
트리글리세라이드(mg/dL)	<200	84.5±27.9	118.2±55.9
헤모글로빈 (g/dL)	13~18	14.4±0.7	13.0±1.9
소변 알부민/크레아티닌 비 (mg/24 h)	<30	11.4±4.9	451.2±493.9*

상기 데이터는 다르게 표시되지 않았다면 평균±SD이다. *P ＜ 0.05

<실시예 2> 혈장 당단백질의 분리, 농축 및 프로테오믹 분석

전혈 시료로부터 혈장 시료를 준비했다 (대조군 6, 신증군 6). 혈장 당단백질은 멀티-렉틴 친화성 크로마토그래피로 추출하였고 SDS-PAGE/쿠마시 염색을 통해 분석했다 (도 2(A)).

2.1 혈장으로부터 분리한 당단백질의 분리 및 농축

당단백질의 농축을 위해서 자칼린 (AIL), 콘카나발린 A (Con), 스노드롭 렉틴 (GNA), 렌즈콩 렉틴 (lentil lectin, LCH), 다릅나무 렉틴 (maackia amurensis lectin, MAL), 땅콩 아글루티닌 (peanut agglutinin, PNA), 엘더베리 렉틴 (SNA) 및 맥아 아글루티닌 (wheat germ agglutinin, WGA)으로 채워진 다중-렉틴 친화성 칼럼 (Qiagen, USA)을 사용하였다. ConA, GNA, 및 LCH는 N-글리코실화 단백질에 결합하고, MAL, SNA, 및 WGA는 시알산을 포함하는 단백질에 결합하며, AIL 및 PNA O-글리코실화 단백질에 결합한다. 결합 완충액을 칼럼에 부어서 평형에 이르게 한 다음, 실시예 1에서 준비한 혈장(50 ㎕)을 프로테아제 길항제가 첨가된 결합 완충액 500㎕에 희석시켜서 칼럼에 넣고 500 rpm에서 2분간 원심분리하여 관류 분획을 얻었다. 용출 완충액을 첨가하고 원심분리하여 용출액을 얻은 후에 침전시키고 아세톤으로 탈염하였다.

2.2 쿠마시 블루 및 겔코드 당단백질 염색

상기 시료들을 전기영동으로 분리하였다. 겔을 H₂O로 5분간 세 번 세척하고 상온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들면서 Bio-Safe 쿠마시 염색 용액 (Coomassie G250 Stain; Bio-Rad)으로 염색하였다. 2차 증류수 내에 겔을 넣고 30분 동안 배양한 후에 10분간 2차 증류수로 3번 세척했다. 멀티렉틴 크로마토그래피의 효율을 검사하기 위해서 겔코드 키트 (PIERCE)를 사용하여 당단백질을 염색하였다. 상기 겔을 50% 메탄올에서 30분간 배양하고 3% 아세트산 용액으로 10분간 씻은 후, 산화 용액에서 15분간 배양한 다음 3% 아세트산으로 5분간 씻었다. 겔코드 당단백질 염색 시약을 첨가해서 겔을 부드럽게 15분간 흔들어준 후 3% 아세트산과 증류수로 씻었다.

2.3 인-겔 트립신 절단

공지된 방법 (Heo, S. H., Lee, S. J., Ryoo, H. M., Park, J. Y., Cho, J. Y., Proteomics 2007, 7, 4292-4302)으로 인-겔 트립신 절단 (digestion)을 수행했다.

쿠마시 염색 겔로부터 단백질 밴드를 제거하고 75 mM 중탄산암모늄/40% 에탄올(1:1) 용액에서 배양하여 탈색시켰다. 5 mM DTT/25 mM 중탄산암모늄으로 60℃에서 30분간 처리하여 탈황하였다. 그 다음 실온에서 30분간 55 mM의 이오도아세토아미드로 알킬화하였다. 이렇게 처리된 겔 조각들은 100% ACN으로 건조시켰다. 그 다음 겔 조각들을 20㎍/ml의 변형 시퀀싱 등급 트립신 (Roche Applied Science)을 함유하는 10 ㎕의 25 mM 중탄산암모늄 완충액으로 재수화시키고 37℃에서 밤새 배양하였다. 0.1% 포름산을 이용하여 트립신 펩타이드 혼합액을 겔로부터 용출시켰다.

겔코트 당단백질 염색을 이용했을 때, 용출 분획 내의 단백질의 염색이 관류 분획에서보다 명백히 진했다 (도 2B). 쿠마시 염색 겔 밴드의 트립신 작용 펩타이드를 LC-MS/MS로 분석하였다.

2.4 LC-ESI-MS/MS 분석

NSI 소스 (San Jose, CA)가 구비된 Thermo Finnigan's ProteomeX workstation LTQ linear ion trap MS (Thermo Electron, San Jose, CA, USA)를 이용하여 종래 알려진 방법 (Heo, S. H., Lee, S. J., Ryoo, H. M., Park, J. Y., Cho, J. Y., Proteomics 2007, 7, 4292-4302)으로 LC-MS/MS 분석을 수행하였다.

상기 인-겔 소화 후 얻어진 12 ml의 펩타이드 시료를 펩타이드 트랩 카트리지 (Agilent, Palo Alto, CA)에 주입하고 로딩시켰다. 세공 크기 300 Å인 C18로 충전된 10 cm 역상 PicoFrit 칼럼 상에서 로딩된 펩타이드를 용출시키고, 구배 용출액을 분리했다. 이동상은 H₂O (A) 및 ACN (B)으로 구성되었으며 둘 다 0.1%v/v의 포름산을 포함했다. 유속은 200 nL/min으로 유지시켰다. 농도 구배는 2% B에서 시작하여 50분 후에는 60% B에 도달하였으며, 그 다음 5분 동안 80% B, 그리고 마지막 15분 동안 100% A에 이르렀다. Data-dependent acquisition (m/z 400-1800)을 작동시키고 각각 서베이 MS 스캔을 한 후 동력 배출 옵션을 켠 상태로 30초간 MS/MS 스캔을 5회 실시하였다. 스프레이 전압은 1.9 kV였고 이온 이동 튜브의 온도는 195℃로 맞추었다. 표준화 충돌 에너지는 35%로 맞췄다.

<실시예 3>

3-1. 데이터 분석

SEQUEST 알고리즘을 사용하여 Sorcerer 프로그램으로 이중 질량 스펙트럼을 해석하였고, 그 다음 Scaffold 프로그램을 사용하였다. 직각 필터링 기준 (95.0% 초과 펩타이드 확률 및 각 단백질에 대해 적어도 2개의 동정된 펩타이드가 맞을 것)을 사용해서 최종 데이터 세트를 마련했다.

이중 질량 스펙트럼을 추출하고, 전하 상태를 풀고 (deconvolution), Sorcerer 3.4 beta 2 (Sorcerer software 3.10.4, Sorcerer Web interface 2.2.0 r334 및 Trans-Proteomic Pipeline 2.9.5)을 이용하여 비이소토프화 (deisotope) 했다. 모든 MS/MS 시료를 SEQUEST (ThermoFinnigan, SanJose,CA;version v.27,rev.11)를 사용하여 분석하였다. SEQUEST는 semiTrypsin을 소화효소로 간주하여 ipiHuman 3.29 데이터베이스 (IPI ver. 3.29, 69,965 entries)를 검색하도록 설정되었다. SEQUEST 검색 변수들은 1.00 Da의 분획 이온 질량 오차 및 1.5 Da의 부모 이온 오차로 설정되었다. 메티오닌의 산화 및 시스테인의 이오도아세타미드 변형을 고정 변형으로 지정화하였다. 위양성 통계 (false-positive statistics)를 개선하기 위해서 Sorcerer 프로그램에서 데이터 검색 과정을 수행하는 동안 데코이 (decoy) 옵션을 선택했고 그에 의해 노이즈 효과를 줄임으로써 품질을 향상시켰다.

모든 데이터는 평균ㅁSE로 나타내었다. 평균값은 ANOVA 및 post-hoc Tukey's test로 분석하였다. 통계적 유의성은 P < 0.05로 설정하였다.

3-2. 단백질 동정의 기준

Scaffold (version Scaffold-02_04_00, Proteome Software Inc., Portland, OR)를 이용하여 MS/MS 기초 펩타이드 및 단백질 동정을 확인했다. 단백질 예측 알고리즘 (Protein Prophet algorithm) (Keller, A., Nesvizhskii, A. I., Kolker, E., Aebersold, R., Anal Chem 2002, 74, 5383-5392)에 명시된 바와 같이 95.0% 이상의 확률로 확립되고 적어도 2개의 동정된 펩타이드를 포함할 때 단백질 동정을 인정했다. 단백질 확률은 단백질 예측 알고리즘으로 정하였다. 유사한 펩타이드를 포함하고 단독으로 MS/MS 분석에 기초해서는 분화될 수 없는 단백질은 절약 원칙 (principles of parsimony)을 만족시키기 위해 그룹화하였다. 펩타이드 위양성률 (FPR)은 스캐폴드 소프트웨어를 사용하여 계산하였다. 각 전하 상태에 대하여, FPRi,=[(95%의 확률에서 부정확하게 지정된 수)/(부정확하게 지정된 총 수)]*100를 계산하기 위해서 부정확한 지정에 대해 표를 만들었는데, 여기서 i는 전하 상태이다. 단백질 예측 알고리즘에 따라 95%의 확률로 단백질과 연관되고, 적어도 2개의 펩타이드가 단백질 서열과 일치하며 단백질 예측 알고리즘에 기초하여 각각 95%의 확률을 가질 때 단백질 인정이 정확한 것으로 간주하였다. FPR은 각 전하 상태에 대한 값들의 합이다. 단백질을 동정한 후에 각 데이터 세트들을 ProtAn X로 감산 분석하였다. 잠재적인 N- 및 O-결합 글리코실화 위치를 통계적으로 분석하기 위해 NetNGlyc 1.0 및 NetOGlyc 3.1을 사용하였다.

표 2는 각 사람으로부터 얻은 혈장 시료로부터 동정된 단백질의 수 및 데코이 데이터베이스를 사용하여 측정한 펩타이드 위양성률 (FPR)을 보여준다. FPR은 알고리즘-특정 역치 및 가정된 정확한 펩타이드 동정의 수를 이용하여 계산하였다. 각 군에서 계산된 단백질은 대조군 (DC)에서 164개, 신증군 (DN)에서 174개였다. NetNGlyc 1.0 및 NetOGlyc 3.1 프로그램을 사용하여 동정된 단백질의 약 89%가 N- 또는 O-결합 글리코실화 위치를 가지는 것으로 예측되었다 (표 3). 이 결과는 다중-렉틴 크로마토그래피 및 LC-MS/MS 분석이 혈장 시료의 당단백질 분석에 아주 적합함을 보여준다.

멀티-렉틴 친화성 크로마토그래피 농축 혈장 당단백질 시료를 LC-MS/MS 분석에 의해 동정한 단백질의 수

	DC1	DC2	DC3	DC4	DC5	DC6	DN1	DN2	DN3	DN4	DN5	DN6
동정된 단백질의 수 ^a	111	101	114	127	108	109	97	124	127	111	110	100
펩타이드 위양성율(%) ^b	1.22	1.23	1.33	1.07	1.18	1.13	1.50	1.35	1.26	1.05	1.07	1.08

a, 단백질의 동정에 양성으로 되기 위해서는 단백질 당 최소한 2개의 펩타이드를 필요로 한다 (95% 신뢰도).

b, 위양성률의 계산은 실시예에서 설명하였다.

예상 글리코실화 단백질의 총 수 및 퍼센티지

	동정된 단백질	예상 N-결합 글리코실화 위치	예상 O-결합 글리코실화 위치	총 예상 당단백질의 수	N.D ^* .	전체 동정된 단백질 중 예상 당단백질의 퍼센티지
DC	164	432	582	146	18	89
DN	174	456	530	154	20	89

* N.D: 글리코실화 위치 탐지되지 않음.

3.3. 대조군과 비교한 신증군 환자에서의 혈장 당단백질 발현의 차이

대조군 및 신증군 환자의 시료로부터 동정된 혈장 당단백질을 비교 분석하였다. 양 그룹의 혈장에 공통된 단백질이 139개가 있었다. 총 43개의 단백질에서 펩타이드 히트 수가 신증군이 대조군에 비해서 2배 높았다 (표 4). 이와 달리 40개의 단백질은 대조군에서 신증군보다 펩타이드 히트 수가 2배 높았다 (표 5). 상향 조정 (up-regulated) 또는 하향 조정 (down-regulated)된 단백질들은 그것들의 예상 세포 위치에 따라서 세포 외, 막 또는 핵 단백질로 분류하였다 (도 3A). 이러한 단백질들은 또한 생물학적 과정 (도 3B) 및 분자 기능 (도 3C)에 따라 분류하였다. 생물학적 과정 중에서 세포 유착, 급성기 반응 및 혈액 응고와 관련된 염증 반응 단백질들은 당뇨성 신증 환자에서 더 높았고, 반면에 보체 활성 및 세포성 방어 반응을 매개하는 면역 반응 단백질은 전체에 비해 감소했다 (도 4A). 분자 기능에서, 당뇨성 신증 환자의 대부분의 상향 또는 하향 조정된 단백질들은 결합 기능을 가졌는데, 항원, ATP, 무기질 및 지질 결합 기능을 포함한다 (도 4B).

당뇨병성 신증에서 상향 조정된 단백질들

IPI 번호	유전자 기호	단백질 명칭	DN 평균 범위 (%)	DC 펩타이드 (히트) 평균	DN 펩타이드 (히트) 평균	*DC/DN 배수
IPI00783024	-	미오신 반응성 면역글로불린 중쇄 가변 영역(단편)	14.5	0	6.7	-
IPI00003351	ECM1	세포외 기질 단백질 1 전구체	12.8	0	2.2	-
IPI00013933	DSP	데스모플라킨의 이소폼 DPI	5.0	0	2.2	-
IPI00180956	-	49 kDa 단백질	11.1	0	1.8	-
IPI00220120	IGHV2	Ig 중쇄V-III 영역 VH26 전구체	18.8	0	1.5	-
IPI00022420	RBP4	혈장 레티놀-결합 단백질 전구체	9.2	0	1.3	-
IPI00019399	SAA4	혈청 아밀로이드 A-4 단백질 전구체	15.4	0	1.3	-
IPI00009028	CLEC3B	테트라넥틴 전구체	10.4	0	1.0	-
IPI00026197	IGKV4-1	Ig 카파쇄 V-IV 영역 STH 유사체	20.0	0	0.8	-
IPI00555812	GC	비타민 D-결합 단백질 전구체	8.9	0	0.8	-
IPI00022389	CRP	C-반응성 단백질 전구체의 이소폼 1	12.1	0	0.8	-
IPI00554711	JUP	결합 플라코글로빈	5.9	0	0.8	-
IPI00217405	UBR1	E3 유비퀴틴 단백질 리가아제 UBR1의 이소폼 1	0.7	0	0.7	-
IPI00021578	CFHR4	보체인자 H-연관 단백질4 전구체	11.8	0	0.7	-
IPI00021857	APOC3	아포리포단백질 C-III 전구체	19.2	0	0.7	-
IPI00000849	SPRR2G	소 프롤린-풍부 단백질 2G	30.1	0	0.7	-
IPI00845354	IGKC	IGKC 단백질	14.5	0	0.5	-
IPI00293057	CPB2	카르복시펩티다제 B2 전구체의 이소폼 2	8.6	0	0.5	-
IPI00022937	F5	응고인자V	1.1	0	0.5	-
IPI00303063	SCC-112	SCC-112 단백질	1.7	0	0.5	-
IPI00291136	COL6A1	콜라겐 알파-1(VI) 쇄 전구체	2.4	0	0.5	-
IPI00397801	RP1-14N1.3	이프랍소리아신	2.1	0	0.5	-
IPI00296537	FBLN1	피불린-1 전구체의 이소폼 C	2.8	0	0.5	-
IPI00299738	PCOLCE	프로콜라겐 C-엔도펩티다제 인핸서 1 전구체	7.1	0	0.5	-
IPI00015526	EHMT1	히스톤-리신 N-메틸트랜스퍼라제의 이소폼 1, H3 리신-9 특정5	3.4	0	0.3	-
IPI00242956	FCGBP	IgGFc-결합 단백질 전구체	0.2	0	0.3	-
IPI00216589	ABCB9	ATP-결합 카세트 서브패밀리 B 멤버 9 전구체의 이소폼 2	8.7	0	0.3	-
IPI00790690	-	36 kDa 단백질	17.6	0	0.3	-
IPI00219018	GAPDH	글리세랄데히드-3-포스페이트 디히드로게나제	7.5	0	0.3	-
IPI00007047	S100A8	단백질 S100-A8	11.8	0	0.3	-
IPI00296337	PRKDC	DNA-의존성 단백질 키나아제 촉매 서브유닛의 이소폼 1	1.0	0	0.3	-
IPI00025753	DSG1	데스모글린-1 전구체	1.5	0	0.3	-
IPI00027547	DCD	덤시딘 전구체	10.0	0	0.3	-
IPI00216773	ALB	ALB 단백질	6.3	0.8	9.0	10.8
IPI00023014	VWF	폰 빌레브란트 인자 전구체	2.1	0.5	2.2	4.3
IPI00395488	VASN	바소린 전구체	4.3	0.5	1.5	3.0
IPI00003590	QSOX1	설프히드릴 옥시다제 1 전구체의 이소폼 1	5.8	0.5	1.3	2.7
IPI00550162	IGLV3-25	IGLV3-25 단백질	12.0	0.3	0.8	2.5
IPI00020986	LUM	루미칸 전구체	7.1	0.7	1.7	2.5
IPI00383164	IGHA1	SNC66 단백질	6.4	1.0	2.5	2.5
IPI00027507	CFHR3	보체인자H-관련 단백질3 전구체	8.0	1.5	3.3	2.2
IPI00022434	ALB	혈청 알부민	47.7	122.5	252.5	2.1
IPI00064667	CNDP1	베타-Ala-His 디펩티다제 전구체	8.9	0.5	1.0	2.0

* DC/DN 배수: 평균DC 펩타이드 히트를 평균 DN 펩타이드 히트로 나눈 수.

당뇨병성 신증에서 하향 조정된 단백질들

IPI 번호	유전자 기호	단백질 명칭	DC 평균 범위 (%)	DC 펩타이드 (히트) 평균	DN 펩타이드 (히트) 평균	DN/ DC 배수
IPI00004373	MBL2	만노즈 결합 단백질C 전구체	40.4	2.2	0	-
IPI00021439	ACTB	액틴 사이토플라스믹1	6.1	1.5	0	-
IPI00398625	HRNR	호메린	1.3	1.5	0	-
IPI00218413	BTD	비오티니다제 전구체	6.5	1.2	0	-
IPI00171678	DBH	도파민 베타-히드록실라제 전구체	4.3	1.0	0	-
IPI00017522	KCNH4	칼륨 채널 서브패밀리 H 멤버 4	1.6	0.8	0	-
IPI00294713	MASP2	만난 결합 렉틴 세린 프로테아제 2 전구체의 이소폼 1	2.9	0.7	0	-
IPI00023728	GGH	감마-글루타밀 히드롤라제 전구체	8.5	0.7	0	-
IPI00029275	MFI2	멜라노트랜스페린 전구체의 이소폼 1	1.8	0.7	0	-
IPI00005439	FETUB	페투인-B 전구체	5.5	0.7	0	-
IPI00021364	CFP	프로페르딘 전구체	5.7	0.5	0	-
IPI00387022	-	Ig 카파쇄V-I 영역 AG	25	0.5	0	-
IPI00477804	-	면역글로불린 중쇄 가변 영역	14.3	0.5	0	-
IPI00298860	LTF	성장 억제 단백질 12	1.3	0.5	0	-
IPI00170786	WBP11	WW 도메인 결합 단백질11	10.0	0.5	0	-
IPI00386839	-	아밀로이드 람다 6 경쇄 가변 영역 SAR (단편)	32.8	0.5	0	-
IPI00297263	HEG1	단백질 HEG 동족체 1 전구체의 이소폼 1	3.8	0.3	0	-
IPI00382478	-	Ig 중쇄 V-III 영역 TIL	16.5	0.3	0	-
IPI00400922	PDCD11	RRP5 단백질 동족체	1.8	0.3	0	-
IPI00011255	GP1BA	혈소판 당단백질 Ib 알파쇄 전구체	4.2	0.3	0	-
IPI00178352	FLNC	필라민-C의 이소폼 1	1.4	0.3	0	-
IPI00021817	PROC	비타민 K-의존성 단백질C 전구체	2.6	0.3	0	-
IPI00382480	-	Ig 중쇄V-III 영역 BRO	35	0.3	0	-
IPI00307114	ZNF291	아연 핑거 단백질291	1.6	0.3	0	-
IPI00103595	CEP350	센트로좀-관련 단백질 350	0.2	0.3	0	-
IPI00307702	-	H53_GS1 (단편)	7.8	0.3	0	-
IPI00029061	SEPP1	셀레노프로틴 P 전구체	11.0	0.3	0	-
IPI00172479	DISP1	디스패치드 A	3.2	0.3	0	-
IPI00026314	GSN	겔소린 전구체의 이소폼 1	2.4	0.3	0	-
IPI00297284	IGFBP2	인슐린양 성장인자-결합 단백질 2 전구체	3.7	0.3	0	-
IPI00030205	IGKV3-20	Ig 카파쇄 V-III 영역 HAH 전구체	15.8	5.7	0.5	11.3
IPI00215894	KNG1	키니노겐-1 전구체의 이소폼 LMW	7.0	7.3	0.8	8.8
IPI00384407	-	미오신-반응성 면역글로불린 중쇄 가변영역(단편)	15.9	1.7	0.5	3.3
IPI00008669	-	38 kDa 단백질	11.7	3.2	1.0	3.2
IPI00382436	-	Ig 람다쇄V-III 영역 SH	13.9	1.0	0.3	3.0
IPI00029168	LPA	아포리포단백질	1.3	4.0	1.5	2.7
IPI00011252	C8A	보체성분 C8 알파쇄 전구체	6.9	11.5	4.3	2.7
IPI00294395	C8B	보체성분C8 베타쇄 전구체	7.6	4.8	2.0	2.4
IPI00292950	SERPIND1	헤파린 코팩터 2 전구체	10.0	15.0	7.2	2.1
IPI00032291	C5	보체C5 전구체	7.1	29.7	15.0	2.0

* DN/DC 배수: 평균DN 펩타이드 히트를 평균 DC 펩타이드 히트로 나눈 수.

<실시예 4> LC-MS/MS 데이터 검증

LC-MS/MS 데이터를 검증하기 위해서, 신증군 및 대조군으로부터의 각각 9개의 시료를 웨스턴 블로팅하여 루미칸, 바소린 및 RBP-4의 값을 분석하였다 (도 5A).

20 μg의 조 혈장을 12% SDS-PAGE로 분리하였다. 전기영동 후에 단백질을 니트로셀룰로오스 막 (Whatman, Germany)으로 이동시켰고, 루미칸 (lumican), 바소린 (vasorin) 및 RBP-4을 검출했다. 상기 막을 항-루미칸 항체, 항-인간 바소린 항체 (R&D, MN, USA, 1:1000 희석), 또는 항 RBP-4 항체 (AbFRONTIER, Seoul,Korea, 1:1000 희석)와 함께 4℃에서 밤새 배양하였다. 항-염소 IgG (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA, 1:1,500 희석) 또는 항-마우스 IgG (Stressgen, MI, USA, 1:1000 희석)가 결합된 호스래디시 퍼옥시다제와 함께 상온에서 1시간 동안 배양하였다. ECL PLUS 웨스턴 블롯 분석 시스템 (Amersham Biosciences, UK)을 이용하여 면역 반응 단백질을 탐지하였다. 밴드의 두께는 Scion Image (Scion, Frederick, MD)로 사진촬영하여 측정하였다 (도 5B). Scion Image를 이용하여 눈금 격자 슬라이드를 측정하였고, 250 μm의 거리는 733 픽셀과 동일하게 계산하였다.

신증군에서 대조군에 비해 루미칸, 바소린 및 RBP-4가 높은 수준으로 발현된 것을 알 수 있다. 대조군에 비해 신증군에서 루미칸, 바소린 및 RBP-4 밴드의 평균 농도는 각각 3.3, 1.8 및 1.7배였다. 이 결과는 루미칸, 바소린 및 RBP-4가 당뇨병성 신증을 예측하고 이 병의 진행을 모니터링하기에 적합한 마커임을 보여준다.

도 1은 SDS-PAGE 및 쿠마시 염색을 통해 분석된 소변 시료의 단백질 프로필이다. 단백질 프로필은 혈장 시료 분석을 위한 시료 선택을 위해 쓰였다.

DC, 당뇨병 환자의 소변 DN, 당뇨병성 신증 환자의 소변

도 2는 인간의 혈장으로부터 당단백질의 분리를 나타낸 도면이다. 멀티-렉틴 친화성 칼럼 용출물 및 관류 분획으로부터 얻어진 단백질은 SDS-PAGE로 분리하였고 쿠마시 블루(CBB)(A) 및 겔코드 당단백질 염색(B)으로 염색하였다.

도 3은 당뇨병성 신증과 연관된 단백질의 분포 및 분류를 나타낸 도면이다. (A) 세포 분포 프로필, (B) 생물학적 과정 프로필, (C) 분자 기능 프로필.

도 4는 당뇨병성 신증에서 상향 조정 및 하향 조정된 단백질 간의 생물학적 과정 및 분자 기능의 비교를 나타낸 도면이다. (A) 생물학적 과정 프로필의 비교, (B) 분자 기능 프로필의 비교.

도 5는 웨스턴 블롯 및 덴시토메트리 분석을 통한 루미칸, 바소린 및 RBP-4 발현 수준의 검증을 나타낸 도면이다. (A) 대조군(9) 및 신증군(9)으로부터의 개별 조 혈장 시료를 항-루미칸 항체(1:1000 희석), 항-바소린 항체(1:1000 희석), 및 항-RBP-4 항체(1:1000 희석)을 이용하여 웨스턴 블롯 분석에 사용하였다. (B) 웨스턴 블롯의 밴드의 두께는 Scion Image를 이용하여 측정하였다. 데이터의 점들은 각 환자를 나타내며, 선은 중간값을 가리킨다.

Claims

바소린 또는 바소린 전구체에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 당뇨병성 신증 진단용 조성물.
바소린 또는 바소린 전구체를 암호화하는 핵산에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함하는 당뇨병성 신증 진단용 조성물.
제1항 또는 제2항의 조성물을 포함하는 당뇨병성 신증 진단용 키트.
제1항 또는 제2항의 조성물을 포함하는 당뇨병성 신증 진단용 마이크로어레이.
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