KR100792630B1

KR100792630B1 - 당뇨병성 신증 진단용 바이오 마커

Info

Publication number: KR100792630B1
Application number: KR1020060063108A
Authority: KR
Inventors: 김현정; 김찬화; 김미령; 조은희
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2006-07-05
Filing date: 2006-07-05
Publication date: 2008-01-09

Abstract

본 발명은 혈액을 이용한 제2형 당뇨병성 신증 환자의 조기진단 및 진행정도 판단용 마커로 사용 될 수 있는 단백질 개발에 관한 것으로서, 당뇨병 환자의 혈액에서 보다 당뇨병성 신증 환자의 혈액에서 그 양이 감소되어지는 바이오 마커 단백질과 이를 이용한 당뇨병에서 당뇨병성 신증의 조기진단 및 진행정도를 미리 예견하는 키트에 관한 것이다. 또한 그 양이 감소되어진 단백질은 당뇨병성 신증 치료제의 제제로써도 그 가치가 인정되는 바이다.

본 발명에 따르면, 사람의 혈액으로부터 당뇨병성 신증 환자의 발병여부 및 당뇨병에서 당뇨병성 신증의 조기진단 및 진행정도를 확인하여 그 증상의 경도를 파악할 수도 있다. 또한 본 발병의 바이오마커 단백질을 기초로 제조된 단일클론항체는 immunoassay 키트(ELISA, antibody coated tube test, lateral-flow test, potable biosensor)에 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 당뇨병성 신증에 있어 당뇨병에서 당뇨병성 신증의 조기진단 및 진행정도를 판단하고, 치료용 목적으로는 신약 개발에 사용되어 질수 있다.

Description

당뇨병성 신증 진단용 바이오 마커{Bio-marker for diagnosing diabetic nephropathy}

도 1a는 제2형 당뇨병 환자의 혈액에서 보다 미세단백뇨를 가지고있는 제2형 당뇨병성 신증 환자의 혈액에서 감소 및 증가한 단백질을 나타내는 2-D 전기영동 이미지이고,

도 1b는 제2형 당뇨병 환자의 혈액에서 보다 만성신부전증을 가지고 있는 제2형 당뇨병성 신증 환자의 혈액에서 감소 및 증가한 단백질을 나타내는 2-D 전기영동 이미지이고,

도 2는 도1a과 도2b에 나타난 단백질들을 상세하게 보여주는 확대 이미지이고 (Normo: 당뇨병 환자, Micro: 미세단백뇨 환자, CRF: 만성신부전증 환자),

도 3a 내지 도 3t는 c-type lectin domain family 3 member B, Apolipoprotein CIII, Retinol binding protein 4, Proapo-A-I protein, Ficolin 3 precursor, Vitamin D binging protein precursor, Histidine-rich glycoprotein, Complement factor H-related 1, Haptoglobin-related protein precursor, Hemopexin precursor, Complement factor I light chain, Sex hormone-binding globulin, Apolipoprotein E, Plasma glutathione peroxidase precursor, Pigment epithelium-derived factor, Complement component C4B3, Complex-forming glycoprotein HC, Adiponectin precursor, Beta 2-microglobulin, 및 Complement component C4A의 ESI-Q-TOF/MS/MS 결과이다.

도 4a는 당뇨병성 신증 환자의 혈액에서 동정된 단백질인 plasma glutathione peroxidase를 western blot을 한 실험 결과 이미지이고,

도 4b는 도 4a의 상대적인 강도를 나타낸 결과이고,

도 5는 당뇨병 환자 100명 및 미세단백뇨 환자 96명의 혈액으로 plasma glutathione peroxidase를 ELISA를 한 실험 결과이다.

본 발명은 당뇨병 환자가 당뇨병에서 당뇨병성 합병증의 일종인 당뇨병성 신증의 조기진단 및 중증으로의 진행 때 바이오마커로 사용 될 수 있는 단백질 개발에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 합병증이 없는 당뇨병 환자의 혈액에서보다 당뇨병성 신증 환자의 혈액에는 적게 존재하거나 당뇨병 환자의 혈액에서 보다 당뇨병성 신증 환자의 혈액에서 더 많이 발현되는 바이오 마커 단백질과 이를 이용한 당뇨병성 신증의 조기진단 및 진행정도를 미리 예측 및 판단하는 진단키트에 관한 것이다.

당뇨병은 혈중 포도당 농도가 비정상적으로 상승된 상태로 장기간 지속되는 것을 특징으로 하는 일련의 대사이상을 지칭하는 것으로, 혈중 포도당 농도를 조절하는 가장 중요한 호르몬인 인슐린의 절대적 또는 상대적 생산 결핍의 결과이거나 인슐린이 작용하는 표적장기에서의 인슐린의 작용저하(인슐린 저항성)의 결과에 의한 것이다. 인슐린이라는 호르몬은 췌장의 베타세포에서 생성되어 탄수화물이 소화 흡수되어 만들어지는 포도당의 대사에 중추적인 역할을 수행하며, 고혈당이 되지 않도록 포도당 농도를 일정범위 내로 유지시켜 준다. 이러한 중요한 역할을 하는 인슐린을 분비하는 췌장의 베타세포가 파괴되어 인슐린이 부족하거나, 인슐린이 분비된다고 해도 효과적으로 기능을 수행할 수 없다면, 혈당은 지속적인 상승 상태를 보이고 체내의 포도당 대사를 포함한 신진대사 기능이 원활하게 이루어 질 수 없게 된다. 이러한 일련의 병적인 변화를 일컬어 당뇨병이라고 한다.

현재 당뇨병의 분류체계에는 여러 가지가 있고, 당뇨병에는 다양한 유형이 있지만, 주로 당뇨병의 발병 기전에 중점을 두고 제 1형 당뇨병 및 제2형 당뇨병으로 분류된다. 제 1형 당뇨병이란 과거의 인슐린 의존형 당뇨병에 해당하는 것으로 췌장의 베타세포가 파괴되면서 발생한 인슐린의 절대적인 결핍으로 말미암아 당뇨병이 생기는 것이고, 제2형 당뇨병이란 과거의 인슐린 비의존형 당뇨병에 해당하는 것으로 인슐린 저항성, 다시 말해서 인슐린이 분비되나 그 작용에 저항이 많아서 당뇨병이 생긴 것을 말한다.

대다수의 당뇨병 환자들은 혈당이 적절히 조절되지 않더라도 특별한 증상을 느끼지 못하는 경우가 많이 있으며, 당장 심각한 증상이 나타나지 않으므로 당뇨병에 의한 합병증의 심각성을 잘 인지하지 못할 때가 많다. 당뇨병에 의한 합병증은 크게 미세혈관 합병증, 대혈관 합병증 및 기타 합병증으로 나누어 볼 수가 있으며 이중 신증(신장)은 미세혈관 합병증으로 대표적인 당뇨병성 합병증으로 들 수 있 다.

당뇨병이 지속되면 전신의 혈관들이 손상을 입으며 이 과정에서 신장의 혈관들도 침범을 받게된다. 손상된 혈관은 신장의 주기능인 혈액여과에 나쁜 영향을 미쳐서, 체내에 과다한 수분 및 독성 물질을 축적시키게 된다. 뿐만 아니라 소변을 통해 단백질 등 영양분의 소실을 일으키기도 한다. 이러한 신장기능의 장애를 “당뇨병성 신증" 이라고 하고 결국 고혈당에 의해 신장기능의 장애가 발생게 되며, 고혈압도 신증의 발생에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

당뇨병성 신증의 병인은 아직 정확하게 밝혀지지는 않았으나, 신장 내의 혈역학적인 변화(intrarenal hemodynamic alterations), 사구체 단백의 포도당화(glycosylation of glomerular proteins), sorbitol의 축적 등 복합적 요인들이 당뇨병성 신증의 병인과 관련이 있는 것으로 여겨진다. 구심성 세동맥 저항(afferent arteriolar resistance)으로 인한 신장내의 혈역학적인 변화 그로 인한 혈압과 과여과는 당뇨병성 신증의 시작 및 진행에 중요한 역할을 하게 된다. 선택적인 구심성 혈관확장은 고혈당, 인슐린 부족, 지나친 단백섭취, 체액팽창, 내인성 혈관확장인자(예: angiotensin Ⅱ, endothelin)의 상승작용, 사구체 비후, 그리고 그 외에 다른 밝혀지지 않은 요인들로 인해 야기될 수 있다. 또한 고혈당으로 인한 단백질의 포도당화가 일어날 수 있는데, 교원질(collagen), 사구체기저막(glomerular basement membrane) 등과 같은 단백질의 경우 AGEs(advanced glycosylated end-products)로 알려진 비가역적인 부가물을 형성한다. AGEs는 조직에 축적되어 단백질간의 교차결합 및 당뇨병성 합병증의 발병에 관여하는 것으로 알려져 있다. 그리고 포도당은 aldose 환원효소에 의해서 sorbitol로 전환되는데 고혈당이 지속되면 지나친 sorbitol의 축적이 야기될 수 있다. Sorbitol은 polyol dehydrogenase에 의해 과당(fructose)으로 산화되는데, 이 sorbitol과 과당의 세포내 축적으로 인해서 myoinositol의 고갈을 일으킨다. Aldose 환원효소에 의한 sorbitol의 축적 외에도 protein kinase C의 활성의 증가 등도 나타나는데, 이러한 polyol pathway 내의 생화학적 이상으로 인하여 당뇨병성 신증이 야기될 수 있다.

당뇨병성 신증에서는 신기능이상 뿐만 아니라 세포 외 기질(ECM: extracellular matrix)의 축적도 중요한 역할을 한다. 경화증전의(presclerotic) cytokine인 transforming growth factor(TGF)-β은 당(glucose), AGE, 혈관작용성 호르몬(예: angiotensin Ⅱ, endothelin) 등에 의해서 자극되는 것으로 나타났는데, 이 TGF-β가 당뇨병성 신증의 발달에 주축적인 역할을 한다. TGF-β는 신증을 일으키는 대사성 인자와 혈역학적 인자 사이의 상호작용을 매개함으로써 당뇨병성 신증에서 ECM의 축적을 야기시키는 것으로 나타났다. TGF-β 외에도 다른 cytokine(예: vascular endothelial growth factor)들이 신증을 일으키는 역할에 대한 연구가 진행중이다. 제1형 당뇨병 환자의 경우 약 40%가 말기신질환(ESRD : end-stage renal disease)으로 진행되는 심각한 신증증세를 나타낸다. 당뇨병성 신증으로 진단된 당시에 신장이 비대하거나, 사구체여과율(GFR)이 상승되어 있는 경우가 있으며, 과여과(hyperfiltration)가 나타나는 경우 예후가 나쁘나 인슐린으로 치료하면 GFR과 신장의 크기는 정상화된다.

당뇨병성 신증 발병 후 5∼10년 내에 미세알부민뇨(microalbuminuria)가 나 타난다. 미세알부민뇨는 뇨 중에 1일 30∼300 ㎎의 알부민이 배출되는 상태로써 제1형 당뇨병 환자의 신증의 민감한 지표가 된다. 뇨 중의 알부민양은 시간이 지남에 따라 증가하게 되고, 몇 년 후에는 뇨 중에 1일 300 ㎎ 이상의 알부민이 배출되는 명백한 알부민뇨(overt albuminuria)가 나타나게 된다. 미세알부민뇨 시기 동안에 혈압이 상승되고, 때로는 고혈압으로 진행되게 된다. 명백한 알부민뇨가 나타나는 동안 GFR은 대략 1 ㎖/min/month의 속도로 점점 감소하며, 일단 명백한 알부민뇨가 나타나면 당뇨병성 신증은 비가역적이 되며, 약 50%의 환자가 7년 내에 투석을 필요로 하게 되는 말기신부전증이 나타나게 된다. 제2형 당뇨병 환자의 경우 신증은 서서히 발현되고, 임상 경과는 제1형 당뇨병 환자와 비슷하게 진행된다. 제1형 당뇨병에서는 약 50%의 환자에서, 제2형 당뇨병에서는 약 30%의 환자에서 당뇨병성 신증에 의한 신기능의 소실을 가져올 수 있다. 그러나 전체 당뇨병 환자로 볼 때 제2형이 제1형 당뇨병 환자보다 훨씬 많기 때문에 신증의 발생빈도는 제2형 당뇨병에서 더 높다고 볼 수 있다.

당뇨에 의한 신장 합병증의 진행정도를 판단하는 바이오마커들은 한정적이다. 정기적이고 반복적으로 임상적인 증상, 환자의 병력을 통하여 당뇨병성 신증의 진단이 이루어진다. 오랜 기간의 당뇨병력을 가진 환자가 신증범위의 단백뇨(nephrotic-range proteinuria), 망막병증(retinopathy)이 있으면서 신질환의 명확한 다른 원인이 없으면 당뇨병성 신증으로 진단된다. 또한 소변내의 미세 알부민을 검사하여 미세 알부민뇨를 보이는 환자를 조기에 진단한 뒤 집중적인 혈당 치료 및 고혈압에 대한 철저한 치료 등 적절한 처치를 통해 당뇨병성 신증의 진행에 의 한 말기신부전으로의 진행을 완화시키는 것이 중요하다. 현재 당뇨병성 신증의 진행정도를 판단하는 바이오마커로서는 대표적인 것이 단백뇨 및 크레아틴이 있다. 그러나 단백뇨는 당뇨병성 신증 이외의 고혈압 및 심혈관 질환 발생을 의미하는 지표이기도하는 등 다른 질병 표지자와의 연관성이 높아 직접적인 당뇨병성 신증의 진행정도를 판정하기가 어려운 상태이다. 따라서, 임상적으로 특이성과 민감도가 높은 신규진단 마커와 아울러 이를 검출할 수 있는 단일클론항체를 개발할 경우, 당뇨병성 신증의 조기진단 및 진행정도를 미리 예측 할 수 있는 형태의 키트 개발을 도모할 수 있다.

이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 2차원 전기영동기술을 이용하여 당뇨병 개체의 혈액에서 보다 당뇨병성 신증초기 및 말기 개체의 혈액에서 감소 및 증가하는 바이오 마커 단백질들을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 당뇨병에서 당뇨병성 신증의 조기진단 및 진행정도를 효과적으로 진단할 수 있는 새로운 바이오 마커 단백질 또는 그 면역원성 단편을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 바이오 마커 단백질에 대한 항체 및 이를 이용한 진단키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 바이오 마커 단백질을 포함하는 당뇨병성 신증의 치료 및 예방용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 당뇨병성 개체의 혈액에서 보다 당뇨병성 신증 환자의 혈액에서 감소하는 하기 군에서 선택된 단백질을 유효성분으로 포함하는 당뇨병성 신증 진단용 바이오 마커를 제공한다:

서열번호 1의 아미노산 서열을 가지고 22-24 kD의 분자량 및 5.0-6.0의 pI를 갖는 C형 렉틴 도메인 패밀리3 맴버B(c-type lectin domain family 3, member B);

서열번호 2의 아미노산 서열을 가지고 8-10 kD (약 9 kD)의 분자량 및 4.2-5.2의 pI를 갖는 아포리포단백질 CIII(apolipoprotein CIII);

서열번호 3의 아미노산 서열을 가지고 22-24 KD의 분자량 및 4.9-5.9의 pI를 갖는 레티놀 결합 단백질(retinol binding protein 4);

서열번호 4의 아미노산 서열을 가지고 28-30 KD의 분자량 및 4.9-5.9의 pI를 갖는 프로아포-A-I 단백질(proapo-A-I protein);

서열번호 5의 아미노산 서열을 가지고 32-34 KD의 분자량 및 5.7-6.7의 pI를 갖는 피콜린 3 전구체(ficolin 3 precursor);

서열번호 6의 아미노산 서열을 가지고 54-56 KD의 분자량 및 5.0-6.0의 pI를 갖는 비타민 D 결합 단백질 전구체(vitamin D binging protein precursor);

서열번호 7의 아미노산 서열을 가지고 39-41 KD의 분자량 및 3.4-4.4의 pI를 갖는 히스티딘-리치 당단백질(histidine-rich glycoprotein);

서열번호 8의 아미노산 서열을 가지고 38-40 KD의 분자량 및 7.3-8.3의 pI를 갖는 보체인자 H-관련 1(complement factor H-related 1);

서열번호 9의 아미노산 서열을 가지고 38-40 KD의 분자량 및 6.2-7.2의 pI를 갖는 햅토글로빈-관련 단백질 전구체(haptoglobin-related protein precursor);

서열번호 10의 아미노산 서열을 가지고 51-53 KD의 분자량 및 6.1-7.1의 pI를 갖는 헤모펙신 전구체(hemopexin precursor);

서열번호 11의 아미노산 서열을 가지고 22-24 KD의 분자량 및 4.7-5.7의 pI를 갖는 보체인자 I 경사슬(complement factor I light chain);

서열번호 12의 아미노산 서열을 가지고 43-45 KD의 분자량 및 5.7-6.7의 pI를 갖는 성호르몬-결합 글로불린(sex hormone-binding globulin);

서열번호 13의 아미노산 서열을 가지고 35-37 KD의 분자량 및 5.2-6.2의 pI를 갖는 아포리포단백질 E(apolipoprotein E); 또는

서열번호 14의 아미노산 서열을 가지고 25-27 KD의 분자량 및 7.7-8.7의 pI를 갖는 플라즈마 글루타티온 퍼옥시다제 전구체(plasma glutathione peroxidase precursor).

또한, 본 발명은 당뇨병 개체의 혈액에서 보다 당뇨병성 신증 환자의 혈액에서 더 많이 발현되는 하기 군에서 선택된 단백질을 유효성분으로 포함하는 당뇨병성 신증 진단용 바이오 마커를 제공한다:

서열번호 15의 아미노산 서열을 가지고 45-47 kD의 분자량 및 5.34-6.34의 pI를 갖는 색소 상피-유래 인자(pigment epithelium-derived factor);

서열번호 16의 아미노산 서열을 가지고 47-49 kD의 분자량 및 5.28-6.28의 pI를 갖는 보체성분 C4B3(complement component C4B3);

서열번호 17의 아미노산 서열을 가지고 50-52 kD의 분자량 및 5.34-6.34의 pI를 갖는 복합체-형성 당단백질 HC(complex-forming glycoprotein HC);

서열번호 18의 아미노산 서열을 가지고 26-28 kD의 분자량 및 4.92-5.92의 pI를 갖는 아디포넥틴 전구체(adiponectin precursor);

서열번호 19의 아미노산 서열을 가지고 12-14 kD의 분자량 및 5.27-6.27의 pI를 갖는 베타 2-마이크로글로불린(beta 2-microglobulin); 또는

서열번호 20의 아미노산 서열을 가지고 18-20 kD의 분자량 및 6.15-7.15의 pI를 갖는 보체성분 C4A(complement component C4A).

본 발명에서, 개체(subject)란 당뇨병성 신증 환자이며, 면역원성 단편이란 본 발명의 바이오 마커 단백질에 대한 항체에 의해 인식될 수 있는 하나 이상의 에피토프(epitope)를 가지고 있는 바이오 마커 단백질의 단편을 의미한다.

본 발명에서, 바이오 마커 단백질은 상기 분자량 및 pI를 가지는 한 상기 서열번호를 가지는 전장 단백질의 일부일 수 있으며, 이 경우 도 3의 MS/MS 결과에서 빨간색으로 표시된 트립신 분해된 펩타이드의 서열을 가진다. 상기 트립신 분해된 펩타이드란 MALDI-TOF 또는 MS/MS 분석을 위해 트립신(trysin)으로 분해된 단백질의 펩타이드를 의미한다. 또한, 상기 분자량과 pI는 2차원 전기영동(Two-dimensional electrophoresis)상에서 확인된 값으로서 일반적으로 허용되는 실험상의 오차범위를 포함한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 본 발명의 바이오 마커 단백질 또는 그 면역원성 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하는 당뇨병성 신증 진단제를 제공한다.

본 발명의 항체는 폴리클로날 항체일 수도 있으나, 모노클로날 항체인 것이 바람직하다. 폴리클로날 항체는 당업자에 알려진 종래방법에 따라 면역원인 바이오 마커 단백질 또는 그 단편을 외부 숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 외부 숙주는 마우스, 래트, 양, 토끼와 같은 포유동물을 포함한다. 면역원은 근내, 복강내 또는 피하 주사방법으로 주사되며, 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 보조제(adjuvant)와 함께 투여된다. 외부숙주로부터 정기적으로 혈액을 채취하여 향상된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수거하거나 이로부터 항체를 분리정제한다.

모노클로날 항체는 당업자에 알려진 융합에 의한 불멸화된 세포주 생성기술(Koeher and Milstein (1975) Nature, 256:495))에 의해 제조될 수 있다. 그 제조방법을 간단히 설명하면 다음과 같다. 먼저 순수한 단백질을 20 ㎍을 얻어서 Balb/C 쥐에 면역화를 시키거나 펩타이드를 합성하여 소혈청 알부민과 결합시켜 쥐에 면역화 시킨다. 그 후에 쥐에서 분리된 항원-생산 임파구를 인간 또는 마우스의 미엘로마와 융합하여 불멸화된 하이브리도마를 생성하며, 엘라이져(ELISA)방법을 사용하여 원하는 모노클노날 항체를 생성하는 하이브리도마 세포만을 선택하여 증식한 후 배양물로부터 모노클로날 항체를 분리 정제한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 개체의 체액에서 본 발명의 바이오 마커 단백질 또는 그 면역원성 단편의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, 개체의 당뇨병성 신증 진행 정도에 대한 진단 방법을 제공한다.

본 발명의 진단 방법에서, 인간 혈액인 것을 특징으로 하며, 상기 검출 단계는 개체의 간의 혈액 용액으로부터 이차원(2-D) 전기영동으로 바이오마커 단백질 또는 그 면역원성 단편의 존재를 직접 검출하거나, 혈액을 본 발명의 항체와 접촉시켜 항원항체반응을 통해 바이오 마커 단백질 또는 그 면역원성 단편의 존재를 간접적으로 확인하는 것을 포함한다. 항원항체반응으로서 현재 널리 알려진 immunoassay 법은 효소면역측정법 (ELISA, Coated tube), 항체결합 magnetic particle을 tube에 결합시킨 다음 antigen-tracer와 난분해성 오염물질을 서로 경쟁적으로 반응시켜 효소반응을 유발시켜 정량 하는 magnetic particle법, 항체결합 latex particle을 이용한 latex particle법 등이 있다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 본 발명의 바이오 마커 단백질 또는 그 면역원성 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하는 당뇨병성 신증의 진단 키트를 제공한다.

본 발명의 진단키트는 당업자에 알려진 종래의 제조방법에 의해 제조되며, 전형적으로 동결건조형태의 항체와 버퍼, 안정화제, 불활성 단백질 등을 포함한다. 상기 항체는 방사종(radionuclides), 형광원(fluorescors), 효소(enzymes)등에 의해 표지화될 수 있다.

본 발명의 단일클론항체는 immunoassay 키트(ELISA, antibody coated tube test, lateral-flow test, potable biosensor)에 다양하게 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 보다 높은 특이도와 민감도를 나타내는 항체의 개발을 통한 다양한 당뇨병성 합병증 검출 스펙트럼을 갖는 단백질칩 개발에도 이용될 수 있다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 당뇨병성 개체의 혈액에서 보다 당뇨병성 신증 환자의 혈액에서 감소하는 하기 군에서 선택된 단백질을 유효성분으로 포함하는 당뇨병성 신증 치료 및 예방용 조성물을 제공한다:

본 발명의 바이오마커 단백질들은 당뇨병성 신증 환자의 혈액에서 부족한 성분들이므로 이를 환자의 혈액에 보충하여 주면 당뇨병성 신증의 치료 및 예방에 효과를 발휘할 수 있을 것이다.

본 발명의 약학적 조성물은 약제학적 분야에서 공지된 방법에 의해 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 등과 혼합하여 주사제 등의 제형으로 제조되어 정맥주사 등으로 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 환자의 연령, 성별, 상태, 질병의 증상에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 바람직하게는 성인기준으로 1일 0.01-1mg의 단백질을 투여할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1: 시료준비 (Sample preparation)

고려대학교 용산 병원에서 제2형 당뇨병 및 당뇨병성 신증 환자의 혈청 미세알부민뇨 수치를 기준으로 나누어서 실험을 하였다. 당뇨병 환자의 수는 30명이며 당뇨병성 신증 환자 중 미세알부민뇨를 가진 환자 및 만성신부전을 가진 환자의 수는 각각 30명이다.

병원에서 얻은 혈청은 알부민 및 6가지 풍부한 양으로 존재하는 단백질을 제거하는 컬럼 [Agilent Multiple Affinity Removal Column(Agilent Technologies, Wilmington, DE, USA)]을 사용한다. 각각의 시료는 완충액 A로 5배 희석하여 0.22 um의 spin 필터에 놓고 원심분리기(Union-55R centrifuge, 한일과학, Korea)로 4℃, 16,000 x g에서 1시간 동안 돌리면 컬럼 상층부에는 부산물들이 남고 하층부에는 부산물들이 제거된 용액만이 남게 된다. 하층부의 용액을 4.6 x 100 mm 면역친화성 컬럼에 주입하여 분당 0.5 ml의 유속으로 실시하여 흘러나온 flow-through 분획을 얻는다. 이때 적게 존재하는 단백질들은 약 3분 경에 흘러나오는 분획을 얻고, 약 13분 경에 6종의 거대 단백질들은 면역친화성 컬럼에 결합한다. 이와 같은 방법으로 모든 시료를 처리하여 각각의 시료를 분자량 3 kDa 이하를 제거하는 컬럼[Molecular cut-off column (Amicon, Millipore Corp., USA)]을 사용하여 HPLC 분획물에 존재하는 염과 지질을 제거한다. 이러한 농축된 시료에 5배의 차가운 아세톤을 넣고 -20℃에서 하루 보관한다. -20℃에서 침전된 단백질은 원심분리기(Union-55R centrifuge, 한일과학, Korea)로 4℃, 13,000 rpm에서 10분 동안 돌리면 여분의 지질이 제거되고 단백질만이 남게 된다. 이러한 침전물을 공기 중에서 말리고 시료 완충액을 넣어 단백질 정량을 하여 -70℃ 냉동고에 보관한다. 시료 완충액의 조성은 다음과 같다: 7 M urea, 2 M thiourea, 4% CHAPS, 40 mM Tris-Cl(pH 8.5), 65 mM DTT, 1 mM EDTA, 1% IPG buffer에 이르게 한다.

실시예 2: 이차원 전기영동(Two-Dimensional Electrophoresis)

가. 일차원 전기영동(Isoelectroforcusing, IEF):

시료 완충액으로 처리된 시료의 단백질 양을 60 ㎍으로 하여 일차원 전기영동을 실시한다. 시료의 총 부피가 450 ㎕가 되게 rehydration 완충액(8 M urea, 2% CHAPS, 13mM DTT, 1 % IPG buffer)을 섞어 일차원 전기영동을 할 수 있는 24 ㎝ strip holder에 넣은 뒤 pH 4-7 범위의 Drystrip(Amerahsm Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)을 strip holder에 장착한다. 20℃에서 5시간 가량 strip을 rehydration 완충액으로 불려준 뒤 다음과 같은 조건으로 일차원 전기영동을 수행한다: 200 V 30분, 500 V 1분, 8,000 V 45분, 8,000 V 72000 Vhrs, 11시간 30분. 총 146 kVhr. 일차원 전기영동은 IPGphore(Amerahsm Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)로 수행했다.

나. 이차원 전기영동(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis, SDS-PAGE):

일차원 전기영동이 끝난 strip을 이차원 전기영동을 하기 위해 일차원 전기영동이 끝난 strip을 cap tube에 넣고 일차 평형화 용액[6 M urea, 50 mM Tris-cl(pH 8.8), 30% glycerol, 2% SDS, 1% DTT] 10 ㎖에 15분간 반응시킨 후 버리고, 다시 이차 평형화 용액 [6 M urea, 50 mM Tris-cl(pH 8.8), 30% glycerol, 2% SDS, 1.5% IAA] 10 ㎖을 넣고 10분간 재 반응한다. 11~16%로 만들어진 Polyacylamide 젤(25×30 ㎝) 위에 반응이 끝난 strip을 장착하고 0.5% 아가로우즈로 sealing한다. 이차원 전기영동은 Ettan Dalt(Amerahsm Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)에 전기영동 완충액(24 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS)을 넣고 전기영동을 실시한다. 전기영동 조건은 다음과 같다: 70 V 1시간, 180 V 2시간, 360 V 2시간, 430 V 3시간 30분.

다. 염색(Staining):

이차원 전기영동이 끝난 뒤 젤을 가시화 시키기 위해 silver 염색을 한다. Silver 염색과정은 다음과 같다. 50% methanol, 12% acetic acid로 이루어진 용액에 3시간 가량 반응시켜 고정화 (Fixation)하고, 50% ethanol로 20분간 3회 세척(Washing)하고, 0.2% Sodium thiosulfate 용액으로 1분간 반응시켜 민감화(Sensitizing)하고, D.W.로 세척(Washing)하고, 0.1% Silver nitrate, 0.075% formaldehyde(37%) 용액으로 20분간 반응시켜 반응화 (Improving)하고, D.W.로 다시 세척(Washing)하고, 미리 차게 만든 6% Sodium carbonate, 0.075% formaldehyde(37%) 용액으로 약 7분간 반응시켜 가시화(Developing)하고, 50% methanol, 12% acetic acid 용액으로 처리하여 반응을 정지시킨다.

라. 이미지 분석(Image Analysis):

실험한 젤들을 분석하기 위해 먼저 ImageScanner(Amersham Pharmacia Bio-tech, Uppsala, Sweden)로 스캔한다. 단백질 발현이 차이나는 점들을 분석하기 위해 이차원 전기영동 분석 전용 프로그램인 ImageMaster(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)로 분석을 수행한다.

실시예 3: 질량분석 (ESI-Q-TOF/MS/MS Analysis)

이미지 분석프로그램으로 찾아낸 점들을 동정하기 위해 이차원 전기영동이 끝난 젤로부터 점(spot)들을 오려낸다. 먼저 silver를 없애기 위해 30 mM Potassium Ferricyanide와 100 mM Sodium Thiosulfate 용액이 1:1로 섞인 탈염색 용액 100 ㎕을 젤 조각에 5분간 처리한다. 이후에 400 ㎕의 물로 3번 세척한다.

다시 200 mM ammonium bicarbonate로 반응한 뒤 물로 세척한다. Acetonitrile을 넣어 젤이 하얗게 변할 때까지 탈수시킨다. 이 젤을 진공 원심분리기(Speed vacuum centrifuge)에 넣어서 젤로부터 용액을 완전히 없앤다. 건조된 젤 조각은 0.2 ㎍의 trypsin (promega)이 들어있는 50 mM의 ammonium bicarbonate 20 ㎕로 얼음(ice)상에서 45분간 함수시킨다. 반응용액을 제거 후 50 mM의 ammonium bicarbonate 30 ㎕를 넣은 후 37℃로 밤새 반응시킨다. 그 펩타이드 용액은 C18 nano column(home made)를 이용하여 염분을 제거한다.

Custom-made chromatographic columns은 질량분석 이전에 펩타이드 염분제거 와 농축용으로 사용된다. Poros reverse R2 material(20-30 um bead size, PerSeptive Biosystems)의 100-300 nL로 구성된 column은 단단히 조여진 GELoader tip(Eppendorp, hamburg, Germany)에 팩킹되어 있다. 10 mL syringe는 공기압으로 column을 통해 물질을 통과 시킨다. 펩타이드 용액 30 ㎕는 5% formic acid 용액 내에서 희석되어 column안으로 이동된다. 그리고 30 ㎕는 5% formic acid 용액으로 세척된다. MS/MS분석을 위해 펩타이드는 borosilicate nanoelectrospray needle(Micromass, Manchester, UK)에 50% methnol/49% H₂0/1% formic acid와 섞여 용출된다.

MS/MS는 Q-TOF2 mass spectrometer(Micromass, Mancheser, UK)상에서 nano-ESI로 수행되어진다. 그 소스(source)온도는 80℃이다. 1 kV의 전압는 안정된 flow rate(10-30 nL/min)를 생성하기위해 0-5 psi의 nitrogen back-pressure와 혼합되어진 이온 소스(ion source)에서 borosilicate nanoelectrospray needles(EconoTip^TM,New Objective, USA)에 적용되어진다. 그 원뿔(cone) 전류는 40 V이다. Quardrupole analyser는 hexapole collision cell에서 분절화를 하기위해 전구 이온(precursor ion)을 선택하는데 사용된다. 충돌가스(collision gas)는 6-7 x 10^-5 mbar의 아르곤(Ar)이며 출동 에너지(collision energy)는 20-30 V이다. 생성 이온은 반사기(reflector)와 작은 통로판 검사기(micro channel plate detector) 그리고 time-to-digital 변환기에 맞추어지는 TOF 분석기를 이용하여 분석된다. 그 자료는 Mass Lynx Widows NT PC system을 이용하여 진행된다.

단백질을 동정하기 위해 모든 MS/MS 스펙트럼은 MASCOT search program(www.matrixscience.com)을 이용하여 NCBInr 데이터베이스에서 단백질 서열을 조사하였다.

실시예 4: Western blotting

가. SDS-PAGE 전기영동: 당뇨병 및 당뇨병성 신증 환자의 혈청 단백질 15 ㎍을 10% SDS-PAGE 전기영동을 실시한다. 혈청 시료 5 ～ 8 ㎕(단백질 15 ㎍)에 SDS-PAGE loading 완충액 (60 mM Tris-Cl, 2% SDS, 25% Glycerol, 14.4 mM 2-Mercaptoethnol, 0.1% Bromophenol Blue, pH 6.8) 3 ㎕를 섞어 mini gel (6×8 ㎝)에서 분자량별(separating gel상에서 120 V로 내린다.)로 분리한다. 이때 사용한 running 완충액의 조성은 0.025 M Tris-Cl, 0.192 M Glycine, 1% SDS(pH 8.3)이다.

나. Blotting: SDS-PAGE가 끝난 뒤 gel의 단백질을 Semi-dry 형태의 transfer kit(Bio-rad)을 이용하여 NitroCellulose 막으로 transfer시킨다. 50 mA에서 1 시간 30 분 동안 실시한다.

다. 항체반응: Plasma glutathione peroxidase(eGPx)을 대상으로 하여 실시한다. Membrane을 5% w/v nonfat dry milk로 실온에서 1시간 동안 blocking시킨다. 일차 항체로는 plasma glutathione peroxidase을 사용하고 plasma glutathione peroxidase은 monoclonal antibody이다. Plasma glutathione peroxidase의 antibody를 4℃에서 24시간동안 반응시킨다. 일차항체의 희석농도는 1/500으로 한다. TBS/T(0.1%, Tris-buffered saline-tween 20)로 washing한 후에 이차 항체로 실온에서 1시간 반응시킨다. 이차항체는 anti-mouse를 사용하고, 희석농도는 anti-mouse는 1/10,000이였다. 이차항체 반응 후에 TBS/T로 세척하고 난 뒤, ECL (Pierce Biotechnology, Inc., USA.)로 가시화 시킨다.

실시예 5: ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay:ELISA) 시험법

당뇨병 환자 100명 및 당뇨병성 신증 환자 96명의 혈청샘플 및 eGPx 표준물질 100 μl를 각 well에 넣는다. 이때 기준물질의 단백질 농도는 300, 150, 75, 37.5, 18.75, 9.4, 4.7 ng/ml로 하여 연속 희석한다. 뚜껑을 덮고 실온에서 2시간 동안 반응하여 polyclonal 항체가 붙어있는 plate에 항원을 붙인다. 2시간 후 plate를 비운 뒤 세정완충용액으로 다섯번 세척하고, 희석된 이차 항체 anti-eGPx 용액 100 μl을 각 well에 넣는다. 뚜껑을 잘 덮어 실온에서 1시간 동안 반응시킨다. 1시간 후 plate를 비운 뒤 세정완충용액으로 다섯번 세척하고, Streptavidin-PAL 용액 100 μl을 각 well에 넣는다. 뚜껑을 잘 덮어 실온에서 1시간 동안 반응시킨다. 10분 동안 섞은 뒤 plate를 비우고 세정완충용액으로 다섯번 세척한다. 기질반응용액 pNPP 100 μl을 각 well에 넣은 다음 뚜껑을 잘 덮어 37℃에서 표준물질농도가 300 ng/ml인 흡광도가 1.5-2.0 units에 이를 정도(약 20분)로 반응시켜 색깔 변화를 유도하고, 여기에 50 μl의 반응 정지용액을 각각의 well에 넣고 ELISA reader를 이용하여 405nm에서 광흡수도를 측정한다. 표준물질의 농도로 구해진 표준곡선을 이용하여 각 혈청샘플에 존재하는 eGPx의 양을 구한다.

상기와 같이 이차원 전기영동실험을 수행한 결과, 다음과 같이 당뇨병 환자에서 보다 당뇨병성 신증 환장에서의 혈청에서 새롭게 발현되거나 발현양이 감소 및 증가하는 단백질들이 동정되었다.

1. 미세단백뇨를 가진 당뇨병성 신증 환자의 혈청에서 발현되는 단백질

미세단백뇨를 가진 당뇨병성 신증 환자군을 대상으로 전기영동을 수행한 결과 13개의 발현이 감소한 단백질(# 29, # 66, # 69, # 72, # 225, # 228, # 229, # 230, # 232, # 247, # 310, # 360, # 390)과 4개의 증가하는 단백질(# 6, # 9, # 21, #151)을 찾을 수 있었다(도 1a). 발현이 감소한 단백질은 당뇨병 환자군의 단백질보다 약 50% 이상 감소하였으며, 증가한 단백질은 약 100% 이상 증가하였다. ESI-Q-TOF를 수행 한 결과 당뇨병에서 미세단백뇨를 가진 당뇨병성 신증으로 진행시 발현이 감소 및 증가한 단백질을 아래 표 1와 같이 동정하였다.

스팟	분자량(kDa)/pI	단백질명	Vol.증감
# 29	22.9/5.5	c-type lectin domain family 3, member B	-73%
# 66	23.3/5.8	Retinol binding protein 4	-23%
# 69	28.9/5.5	Proapo-A-I protein	-62%
# 72	28.9/5.5	Proapo-A-I protein	-74%
# 225	33.4/6.2	Ficolin 3 precursor	-62%
# 228	38.8/7.8	Complement factor H-related 1	-63%
# 229	33.4/6.2	Ficolin 3 precursor	-75%
# 230	33.4/6.2	Ficolin 3 precursor	-79%
# 232	39.5/6.4	Haptoglobin-related protein precursor	-54%
# 247	52.3/6.6	Hemopexin precursor	-50%
# 310	22.8/5.2	Complement factor 1 light chain	-64%
# 360	36.3/5.7	Apolipoprotein E	-34%
# 390	25.8/8.2	Plasma glutathione peroxidase precursor (eGPx)	-45%
# 6	46.5/5.8	Pigment epithelium-derived factor	+142%
# 9	46.5/5.8	Pigment epithelium-derived factor	+103%
# 21	47.9/5.8	Complement component C4B3	+131%
# 151	26.5/5.4	Adiponectin precursor	+128%

2. 만성신부전을 가진 당뇨병성 신증 환자의 혈청에서 발현되는 단백질

만성신부전을 가진 당뇨병성 신증 환자군을 대상으로 전기영동을 수행한 결과 16개의 발현이 감소한 단백질(# 27, # 28, #29, # 38, # 66, # 112, # 139, # 196, # 225, # 247, # 299, # 310, # 334, # 360, # 390)과 3개의 증가하는 단백질(# 151, # 303, # 347)을 찾을 수 있었다(도 1b). 발현이 감소한 단백질은 당뇨병 환자군의 단백질보다 약 50% 이상 감소하였으며, 증가한 단백질은 약 100% 이상 증가하였다. 특히 만성 신부전을 가진 당뇨병 환자에서 2개의 단백질(# 151, # 304)은 1000% 이상 증가하였다. ESI-Q-TOF/MS/MS를 수행 한 결과 당뇨병에서 만성신부전을 가진 당뇨병성 신증으로 진행시 감소 및 증가한 단백질을 아래 표 2와 같이 동정하였다.

스팟	분자량(kDa)/pI	단백질명	Vol.증감
# 27	22.9/5.2	c-type lectin domain family 3, member B	-60%
# 28	22.9/5.2	c-type lectin domain family 3, member B	-75%
# 29	22.9/5.2	c-type lectin domain family 3, member B	-77%
# 38	8.8/4.7	Apolipoprotein CIII	-52%
# 66	23.2/5.5	Retinol binding protein 4	-45%
# 112	54.5/5.4	Vitamin D binging protein precursor	-88%
# 139	33.4/6.2	Ficolin 3 precursor	-52%
# 196	40.2/3.9	Histidine-rich glycoprotein	-54%
# 225	33.4/6.2	Ficolin 3 precursor	-80%
# 247	52.3/6.6	Hemopexin precursor	-74%
# 299	33.4/6.2	Ficolin 3 precursor	-83%
# 310	22.8/5.2	Complement factor I light chain	-64%
# 334	43.9/6.2	Sex hormone-binding globulin	-71%
# 360	36.3/5.7	Apolipoprotein E	-63%
# 390	25.8/8.2	Plasma glutathione peroxidase precursor (eGPx)	-70%
# 134	50.6/5.8	Complex-forming glycoprotein HC	+428%
# 151	26.5/5.4	Adiponectin precursor	+1281%
# 303	12.9/5.8	Beta 2-microglobulin	+1092%
# 347	19.4/6.7	Complement component C4A	+297%

3. 단백질의 아미노산 서열의 결정

상기와 같이 당뇨병에서 미세단백뇨 및 만성신부전을 가진 당뇨병성 신증으로 진행시 다르게 발현되는 단백질들을 ESI-Q-TOF/MS/MS를 이용하여 동정하여 도 3a 내지 도 3k의 결과를 얻었다. 도면에서 빨간색은 매치된 트립신 분해 펩타이드의 서열을 나타낸다. 이들 단백질의 아미노산 서열은 NCBInr 데이타베이스(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 서치하여 c-type lectin domain family 3, member B (서열번호 1), Apolipoprotein CIII (서열번호 2), Retinol binding protein 4 (서열번호 3), Proapo-A-I protein (서열번호 4), Ficolin 3 precursor (서열번호 5), Vitamin D binging protein precursor (서열번호 6), Histidine-rich glycoprotein (서열번호 7), Complement factor H-related 1 (서열번호 8), Haptoglobin-related protein precursor (서열번호 9), Hemopexin precursor (서열번호 10), Complement factor I light chain (서열번호 11), Sex hormone-binding globulin (서열번호 12), Apolipoprotein E (서열번호 13), Plasma glutathione peroxidase precursor (서열번호 14), Pigment epithelium-derived factor (서열번호 15), Complement component C4B3 (서열번호 16), Complex-forming glycoprotein HC (서열번호 17), Adiponectin precursor (서열번호 18), Beta 2-microglobulin (서열번호 19), 및 Complement component C4A (서열번호 20)을 가짐을 확인하였다.

4. Western blotting 과 ELISA 시험결과

상기 발현이 변화된 단백질들 중 당뇨병성 신증 환자의 혈액에서 동정된 단백질인 plasma glutathione peroxidase를 western blot을 한 실험 결과를 도 4a에 나타내고, 그 상대적인 강도를 도 4b에 나타내었다. 결과에서 보는 바와같이 신증의 진행정도에 따라 plasma glutathione peroxidase의 양 유의적으로 감소하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 2차 전기영동의 결과와 같은 결과를 나타내었다. 도 5는 환자의 수를 늘여 당뇨병 환자 100명 및 미세단백뇨 환자 96명의 혈액으로 plasma glutathione peroxidase를 ELISA를 한 실험 결과이며, 2차 전기영동의 결과 및 western blot을 한 결과와 마찬가지로 신증의 진행정도에 따라 유의적인 감소를 나타내었다. 이것으로 보아 plasma glutathione peroxidase는 신증의 조기진단에 매우 유용할 것으로 생각되며, 또한 당뇨병성 신증 치료 및 예방용 조성물로서의 가능성을 나타내었다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 결과로 얻어진 당뇨병에서 당뇨병성 신증의 조기진단 및 진행에 의해 발현이 감소한 단백질 14 (중복되는 단백질은 제외)개와 양이 증가하는 단백질 6(중복되는 단백질은 제외)개는 당뇨병성 신증의 조기진단 및 질병의 정도를 판단할 수 있는 바이오마커로 사용될 수 있다. 본 발명의 바이오 마커 단백질은 당뇨병성 신증환자의 혈액에서 측정할 수 있으며, 당뇨병에서 당뇨병성 신증으로의 조기진단 및 진행 정도를 미리 예견하고 파악할 수 있다. 또한, 본 발명의 바이오마커 단백질을 기초로 제조된 단일클론항체는 당뇨병성 신증의 조기진단 및 진행 정도를 진단할 수 있는 immunoassay 키트 (ELISA, antibody coated tube test, lateral-flow test, potable biosensor)에 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 보다 높은 특이도와 민감도를 나타내는 항체의 개발을 통한 다양한 당뇨병성 합병증 중 당뇨병성 신증 조기진단 및 진행정도의 검출 스펙트럼을 갖는 단백질 칩 개발에 이용될 수도 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

당뇨병성 개체의 혈액에서 보다 당뇨병성 신증 환자의 혈액에서 감소하는 하기 군에서 선택된 단백질을 유효성분으로 포함하는 당뇨병성 신증 진단용 바이오 마커 조성물:

서열번호 1의 아미노산 서열을 가지고 22-24 kD의 분자량 및 5.0-6.0의 pI를 갖는 C형 렉틴 도메인 패밀리3 맴버B(c-type lectin domain family 3, member B);

서열번호 2의 아미노산 서열을 가지고 8-10 kD의 분자량 및 4.2-5.2의 pI를 갖는 아포리포단백질 CIII(apolipoprotein CIII);

서열번호 3의 아미노산 서열을 가지고 22-24 KD의 분자량 및 4.9-5.9의 pI를 갖는 레티놀 결합 단백질(retinol binding protein 4);

서열번호 4의 아미노산 서열을 가지고 28-30 KD의 분자량 및 4.9-5.9의 pI를 갖는 프로아포-A-I 단백질(proapo-A-I protein);

서열번호 5의 아미노산 서열을 가지고 32-34 KD의 분자량 및 5.7-6.7의 pI를 갖는 피콜린 3 전구체(ficolin 3 precursor);

서열번호 6의 아미노산 서열을 가지고 54-56 KD의 분자량 및 5.0-6.0의 pI를 갖는 비타민 D 결합 단백질 전구체(vitamin D binging protein precursor);

서열번호 7의 아미노산 서열을 가지고 39-41 KD의 분자량 및 3.4-4.4의 pI를 갖는 히스티딘-리치 당단백질(histidine-rich glycoprotein);

서열번호 8의 아미노산 서열을 가지고 38-40 KD의 분자량 및 7.3-8.3의 pI를 갖는 보체인자 H-관련 1(complement factor H-related 1);

서열번호 9의 아미노산 서열을 가지고 38-40 KD의 분자량 및 6.2-7.2의 pI를 갖는 햅토글로빈-관련 단백질 전구체(haptoglobin-related protein precursor);

서열번호 10의 아미노산 서열을 가지고 51-53 KD의 분자량 및 6.1-7.1의 pI를 갖는 헤모펙신 전구체(hemopexin precursor);

서열번호 11의 아미노산 서열을 가지고 22-24 KD의 분자량 및 4.7-5.7의 pI를 갖는 보체인자 I 경사슬(complement factor I light chain);

서열번호 12의 아미노산 서열을 가지고 43-45 KD의 분자량 및 5.7-6.7의 pI를 갖는 성호르몬-결합 글로불린(sex hormone-binding globulin);

서열번호 13의 아미노산 서열을 가지고 35-37 KD의 분자량 및 5.2-6.2의 pI를 갖는 아포리포단백질 E(apolipoprotein E); 또는

서열번호 14의 아미노산 서열을 가지고 25-27 KD의 분자량 및 7.7-8.7의 pI를 갖는 플라즈마 글루타티온 퍼옥시다제 전구체(plasma glutathione peroxidase precursor).
당뇨병 개체의 혈액에서 보다 당뇨병성 신증 환자의 혈액에서 더 많이 발현되는 하기 군에서 선택된 단백질을 유효성분으로 포함하는 당뇨병성 신증 진단용 바이오 마커 조성물:

서열번호 15의 아미노산 서열을 가지고 45-47 kD의 분자량 및 5.34-6.34의 pI를 갖는 색소 상피-유래 인자(pigment epithelium-derived factor);

서열번호 16의 아미노산 서열을 가지고 47-49 kD의 분자량 및 5.28-6.28의 pI를 갖는 보체성분 C4B3(complement component C4B3);

서열번호 17의 아미노산 서열을 가지고 50-52 kD의 분자량 및 5.34-6.34의 pI를 갖는 복합체-형성 당단백질 HC(complex-forming glycoprotein HC);

서열번호 18의 아미노산 서열을 가지고 26-28 kD의 분자량 및 4.92-5.92의 pI를 갖는 아디포넥틴 전구체(adiponectin precursor);

서열번호 19의 아미노산 서열을 가지고 12-14 kD의 분자량 및 5.27-6.27의 pI를 갖는 베타 2-마이크로글로불린(beta 2-microglobulin); 또는

서열번호 20의 아미노산 서열을 가지고 18-20 kD의 분자량 및 6.15-7.15의 pI를 갖는 보체성분 C4A(complement component C4A).
제1항 또는 제2항의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하는 당뇨병성 신증 진단제.
제3항에 있어서, 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 당뇨병성 신증 진단제.
제1항 또는 제2항의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하는 당뇨병성 신증의 진단 키트.
당뇨병성 개체의 혈액에서 보다 당뇨병성 신증 환자의 혈액에서 감소하는 하기 군에서 선택된 단백질을 유효성분으로 포함하는 당뇨병성 신증 치료 및 예방용 조성물:

서열번호 1의 아미노산 서열을 가지고 22-24 kD의 분자량 및 5.0-6.0의 pI를 갖는 C형 렉틴 도메인 패밀리3 맴버B(c-type lectin domain family 3, member B);

서열번호 2의 아미노산 서열을 가지고 8-10 kD의 분자량 및 4.2-5.2의 pI를 갖는 아포리포단백질 CIII(apolipoprotein CIII);

서열번호 3의 아미노산 서열을 가지고 22-24 KD의 분자량 및 4.9-5.9의 pI를 갖는 레티놀 결합 단백질(retinol binding protein 4);

서열번호 4의 아미노산 서열을 가지고 28-30 KD의 분자량 및 4.9-5.9의 pI를 갖는 프로아포-A-I 단백질(proapo-A-I protein);

서열번호 5의 아미노산 서열을 가지고 32-34 KD의 분자량 및 5.7-6.7의 pI를 갖는 피콜린 3 전구체(ficolin 3 precursor);

서열번호 6의 아미노산 서열을 가지고 54-56 KD의 분자량 및 5.0-6.0의 pI를 갖는 비타민 D 결합 단백질 전구체(vitamin D binging protein precursor);

서열번호 7의 아미노산 서열을 가지고 39-41 KD의 분자량 및 3.4-4.4의 pI를 갖는 히스티딘-리치 당단백질(histidine-rich glycoprotein);

서열번호 8의 아미노산 서열을 가지고 38-40 KD의 분자량 및 7.3-8.3의 pI를 갖는 보체인자 H-관련 1(complement factor H-related 1);

서열번호 9의 아미노산 서열을 가지고 38-40 KD의 분자량 및 6.2-7.2의 pI를 갖는 햅토글로빈-관련 단백질 전구체(haptoglobin-related protein precursor);

서열번호 10의 아미노산 서열을 가지고 51-53 KD의 분자량 및 6.1-7.1의 pI를 갖는 헤모펙신 전구체(hemopexin precursor);

서열번호 11의 아미노산 서열을 가지고 22-24 KD의 분자량 및 4.7-5.7의 pI를 갖는 보체인자 I 경사슬(complement factor I light chain);

서열번호 12의 아미노산 서열을 가지고 43-45 KD의 분자량 및 5.7-6.7의 pI를 갖는 성호르몬-결합 글로불린(sex hormone-binding globulin);

서열번호 13의 아미노산 서열을 가지고 35-37 KD의 분자량 및 5.2-6.2의 pI를 갖는 아포리포단백질 E(apolipoprotein E); 또는

서열번호 14의 아미노산 서열을 가지고 25-27 KD의 분자량 및 7.7-8.7의 pI를 갖는 플라즈마 글루타티온 퍼옥시다제 전구체(plasma glutathione peroxidase precursor).