KR101240208B1 - 제1형 당뇨병성 신증 진단용 단백질성 마커 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 제1형 당뇨병성 신증 진단용 단백질성 마커, 상기 단백질성 마커의 변화를 검출하는 물질을 포함하는 제1형 당뇨병성 신증 진단용 조성물, 상기 제1형 당뇨병성 신증 진단용 조성물을 포함하는 제1형 당뇨병성 신증 진단용 키트, 상기 제1형 당뇨병성 신증 진단용 단백질성 마커를 검출하는 방법, 상기 단백질성 마커를 활용한 제1형 당뇨병성 신증 치료제의 스크리닝 방법, 및 상기 단백질성 마커를 활용한 명백한 단백뇨 단계의 제1형 당뇨병성 신증 진단용 단백질성 마커에 관한 것이다.

Description

제1형 당뇨병성 신증 진단용 단백질성 마커 {Proteinic markers for diagnosing type I diabetic nephropathy}
본 발명은 제1형 당뇨병성 신증 진단용 단백질성 마커에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 정상 개체의 사구체에서 보다 제1형 당뇨병성 신증 개체의 사구체에서 더 많이 혹은 더 적게 발현되는 제1형 당뇨병성 신증 진단용 단백질성 마커, 및 이를 포함하는 제1형 당뇨병성 신증 진단용 조성물에 관한 것이다.
당뇨병은 혈중 포도당 농도가 비정상적으로 상승된 상태로 장기간 지속되는 것을 특징으로 하는 일련의 대사이상을 지칭하는 것으로, 혈중 포도당 농도를 조절하는 가장 중요한 호르몬인 인슐린의 절대적 또는 상대적 생산 결핍의 결과이거나 인슐린이 작용하는 표적장기에서의 인슐린의 작용저하(인슐린 저항성)의 결과에 의한 것이다. 인슐린이라는 호르몬은 췌장의 베타세포에서 생성되어 탄수화물이 소화 흡수되어 만들어지는 포도당의 대사에 중추적인 역할을 수행하며, 고혈당이 되지 않도록 포도당 농도를 일정범위 내로 유지시켜 준다. 이러한 중요한 역할을 하는 인슐린을 분비하는 췌장의 베타세포가 파괴되어 인슐린이 부족하거나, 인슐린이 분비된다고 해도 효과적으로 기능을 수행할 수 없다면, 혈당은 지속적인 상승 상태를 보이고 체내의 포도당 대사를 포함한 신진대사 기능이 원활하게 이루어질 수 없게 된다. 이러한 일련의 병적인 변화를 일컬어 당뇨병이라고 한다.
현재 당뇨병의 분류체계에는 여러 가지가 있고, 당뇨병에는 다양한 유형이 있지만, 주로 당뇨병의 발병 기전에 중점을 두고 제1형 당뇨병 및 제2형 당뇨병으로 분류된다. 제1형 당뇨병이란 과거의 인슐린 의존형 당뇨병에 해당하는 것으로 췌장의 베타세포가 파괴되면서 발생한 인슐린의 절대적인 결핍으로 말미암아 당뇨병이 생기는 것이고, 제2형 당뇨병이란 과거의 인슐린 비의존형 당뇨병에 해당하는 것으로 인슐린 저항성, 다시 말해서 인슐린이 분비되나 그 작용에 저항이 많아서 당뇨병이 생긴 것을 말한다.
대다수의 당뇨병 환자들은 혈당이 적절히 조절되지 않더라도 특별한 증상을 느끼지 못하는 경우가 많이 있으며, 당장 심각한 증상이 나타나지 않으므로 당뇨병에 의한 합병증의 심각성을 잘 인지하지 못할 때가 많다. 당뇨병에 의한 합병증은 크게 미세혈관 합병증, 대혈관 합병증 및 기타 합병증으로 나누어 볼 수가 있으며 이중 신증(신장)은 미세혈관 합병증으로 대표적인 당뇨병성 합병증으로 들 수 있다.
당뇨병이 지속되면 전신의 혈관들이 손상을 입으며 이 과정에서 신장의 혈관들도 침범을 받게 된다. 손상된 혈관은 신장의 주기능인 혈액여과에 나쁜 영향을 미쳐서, 체내에 과다한 수분 및 독성 물질을 축적시키게 된다. 뿐만 아니라 소변을 통해 단백질 등 영양분의 소실을 일으키기도 한다. 이러한 신장 기능의 장애를 “당뇨병성 신증”이라고 하고 결국 고혈당에 의해 신장 기능의 장애가 발생하게 되며, 고혈압도 신증의 발생에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
당뇨병성 신증의 병인은 아직 정확하게 밝혀지지는 않았으나, 신장 내의 혈역학적인 변화(intrarenal hemodynamic alterations), 사구체 단백의 포도당화(glycosylation of glomerular proteins), 솔비톨(sorbitol)의 축적 등 복합적 요인들이 당뇨병성 신증의 병인과 관련이 있는 것으로 여겨진다. 구심성 세동맥 저항(afferent arteriolar resistance)으로 인한 신장내의 혈역학적인 변화, 그로 인한 혈압과 과여과는 당뇨병성 신증의 시작 및 진행에 중요한 역할을 하게 된다. 선택적인 구심성 혈관확장은 고혈당, 인슐린 부족, 지나친 단백섭취, 체액팽창, 내인성 혈관확장인자(예: angiotensin Ⅱ, endothelin)의 상승작용, 사구체 비후, 그리고 그 외에 다른 밝혀지지 않은 요인들로 인해 야기될 수 있다. 또한 고혈당으로 인한 단백질의 포도당화가 일어날 수 있는데, 교원질(collagen), 사구체기저막(glomerular basement membrane) 등과 같은 단백질의 경우 AGEs(advanced glycosylated end-products)로 알려진 비가역적인 부가물을 형성한다. AGEs는 조직에 축적되어 단백질간의 교차결합 및 당뇨병성 합병증의 발병에 관여하는 것으로 알려져 있다. 그리고 포도당은 알도오스(aldose) 환원효소에 의해서 솔비톨로 전환되는데 고혈당이 지속되면 지나친 솔비톨의 축적이 야기될 수 있다. 솔비톨은 polyol dehydrogenase에 의해 과당(fructose)으로 산화되는데, 이 솔비톨과 과당의 세포내 축적으로 인해서 미오이노시톨(myoinositol)의 고갈을 일으킨다. 알도오스 환원효소에 의한 솔비톨의 축적 외에도 단백질 키나아제 C(protein kinase C)의 활성의 증가 등도 나타나는데, 이러한 polyol pathway 내의 생화학적 이상으로 인하여 당뇨병성 신증이 야기될 수 있다.
당뇨병성 신증에서는 신기능이상 뿐만 아니라 세포외기질(ECM: extracellular matrix)의 축적도 중요한 역할을 한다. 경화증전의(presclerotic) 사이토카인인 TGF-β(transforming growth factor-β)는 당(glucose), AGE, 혈관작용성 호르몬(예: angiotensin Ⅱ, endothelin) 등에 의해서 자극되는 것으로 나타났는데, 이 TGF-β가 당뇨병성 신증의 발달에 주축적인 역할을 한다. TGF-β는 신증을 일으키는 대사성 인자와 혈역학적 인자 사이의 상호작용을 매개함으로써 당뇨병성 신증에서 ECM의 축적을 야기시키는 것으로 나타났다. TGF-β 외에도 다른 사이토카인(예: vascular endothelial growth factor)들이 신증을 일으키는 역할에 대한 연구가 진행 중이다. 제1형 당뇨병 환자의 경우 약 40%가 말기신질환(ESRD: end-stage renal disease)으로 진행되는 심각한 신증증세를 나타낸다. 당뇨병성 신증으로 진단된 당시에 신장이 비대하거나, 사구체여과율(GFR)이 상승되어 있는 경우가 있으며, 과여과(hyperfiltration)가 나타나는 경우 예후가 나쁘나 인슐린으로 치료하면 GFR과 신장의 크기는 정상화된다.
당뇨병성 신증 발병 후 5∼10년 내에 미세알부민뇨(microalbuminuria)가 나타난다. 미세알부민뇨는 뇨 중에 1일 30∼300 ㎎의 알부민이 배출되는 상태로서 제1형 당뇨병 환자의 신증의 민감한 지표가 된다. 뇨 중의 알부민양은 시간이 지남에 따라 증가하게 되고, 몇 년 후에는 뇨 중에 1일 300 ㎎ 이상의 알부민이 배출되는 명백한 알부민뇨(overt albuminuria)가 나타나게 된다. 미세알부민뇨 시기 동안에 혈압이 상승되고, 때로는 고혈압으로 진행되게 된다. 명백한 알부민뇨가 나타나는 동안 GFR은 대략 1 ml/min/month의 속도로 점점 감소하며, 일단 명백한 알부민뇨가 나타나면 당뇨병성 신증은 비가역적이 되며, 약 50%의 환자가 7년 내에 투석을 필요로 하게 되는 말기신부전증이 나타나게 된다. 제2형 당뇨병 환자의 경우 신증은 서서히 발현되고, 임상 경과는 제1형 당뇨병 환자와 비슷하게 진행된다. 제1형 당뇨병에서는 약 50%의 환자에서, 제2형 당뇨병에서는 약 30%의 환자에서 당뇨병성 신증에 의한 신기능의 소실을 가져올 수 있다.
그리고 소변내의 미세 알부민을 검사하여 미세 알부민뇨를 보이는 환자를 진단한 뒤 집중적인 혈당 치료 및 고혈압에 대한 철저한 치료 등의 수단 등을 통해 당뇨병성 신증의 진행에 의한 말기신부전으로의 진행을 완화시키는 것이 현재의 방법이다. 따라서 당뇨병성 신증에 의해 가장 먼저 손상되어지는 부분인 사구체의 손상을 줄일 수 있는 방법을 이용할 경우 진행 속도의 완화가 아닌 치료를 할 수 있을 것이다.
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 2차원 전기영동기술을 이용하여 정상 쥐의 사구체에서 보다 당뇨병성 신증에서 미세알부민뇨 단계와 명백한 알부민뇨 단계의 사구체에서 감소 및 증가하는 바이오 마커 단백질들을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 정상 개체의 사구체와 제1형 당뇨병성 신증 개체의 사구체에서 얻은 단백질 사이의 발현 차이를 확인할 수 있는 단백질 연구를 통해 제1형 당뇨병성 신증의 진단 및 치료에 적용하기 위한, 제1형 당뇨병성 신증 진단용 단백질성 마커를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 단백질성 마커의 변화를 검출하는 물질을 포함하는 제1형 당뇨병성 신증 진단용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 제1형 당뇨병성 신증 진단용 조성물을 포함하는 제1형 당뇨병성 신증 진단용 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 제1형 당뇨병성 신증 진단용 단백질성 마커를 검출하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 단백질성 마커를 활용한 제1형 당뇨병성 신증 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은, 명백한 단백뇨 단계의 제1형 당뇨병성 신증 진단용 단백질성 마커를 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 하기 폴리펩티드로 이루어진 군에서 선택되는 하나 또는 둘 이상의 조합인 것을 특징으로 하는 제1형 당뇨병성 신증 진단용 단백질성 마커를 제공한다:
서열번호 1의 아미노산 서열을 가지고 24-26 kD의 분자량을 갖는 Glutathione peroxidase 3;
서열번호 2의 아미노산 서열을 가지고 13-15 kD 분자량을 갖는 Histone H2A;
서열번호 3의 아미노산 서열을 가지고 30-32 kD의 분자량을 갖는 Glycoprotein m6a;
서열번호 4의 아미노산 서열을 가지고 14-16 kD의 분자량을 갖는 eukaryotic translation initiation factor 4, gamma 1 isoform a;
서열번호 5의 아미노산 서열을 가지고 41-43 KD의 분자량을 갖는 alpha skeletal muscle;
서열번호 6의 아미노산 서열을 가지고 21-23 kD의 분자량을 갖는 Peroxiredoxin-2;
서열번호 7의 아미노산 서열을 가지고 35-37 kD의 분자량을 갖는 Annexin A3; 및
서열번호 8의 아미노산 서열을 가지고 28-30 kD의 분자량을 갖는 Neuroendocrine secretory protein 55.
본 발명자들은 정상 개체의 사구체와 제1형 당뇨병성 신증 개체의 사구체에서 얻은 단백질들의 프로테옴을 분석하여 정상 개체에 비하여 제1형 당뇨병성 신증 개체에서 특징적으로 발현이 증가 또는 감소하는 단백질들을 검출하여 제1형 당뇨병성 신증의 진단 또는 치료에 사용될 수 있는 단백질성 마커들을 발굴하였다.
본 발명에 사용된 용어, ‘프로테옴(proteome)’이란 유전체로부터 만들어질 수 있는 모든 단백질의 총체를 의미하는데, 이는 한 세포 또는 조직에서 특이적인 생리 상태나 병리 상태에 따라 프로테옴의 양상이 항상 변화하게 되는 동적인 개념이다. 프로테오믹스(proteomics)는 이러한 프로테옴을 연구하는 방법과 기술을 포괄적으로 지칭하는 것으로, 단백질의 성질을 유전자의 발현, 번역 후 변형(post-translational modification), 다른 단백질과의 결합에 초점을 두어 연구함으로써 세포내 변형 과정과 네트워크 형성을 질병의 진행 과정과 연계시켜서 총체적으로 이해하고자 하는 연구 분야를 뜻한다. 이와 같이 프로테옴은 한 세포 또는 조직에서의 생리 상태나 병리 상태를 대변하므로, 질병의 진단에 직접 쓰일 수 있는 진단의 마커를 찾는 방법으로는 가장 적합한 것이다. 또한, 제1형 당뇨병성 신증과 같은 경우 특정 유전자의 발현이 질병의 진행 정도에 관여하여 제1형 당뇨병성 신증을 촉진하는 것으로 확인된다면, 그 단백질의 존재를 확인 및 동정하여 당뇨병성 신증 저해제 개발의 표적 단백질로 삼을 수도 있다. 게노믹스(Genomics)의 뛰어난 민감도와 유전자의 쉬운 증폭 등의 장점으로 이를 이용한 진단 및 치료제 개발 역시 많이 진행되고 있으나, DNA나 mRNA 단계에서의 변화가 실제로 세포 내에서 활성을 갖는 단백질의 변화로 곧바로 연결되지는 않을 수 있다는 점에서 이론상의 문제점이 남아있으며, 나아가 현실적으로는 유전물질이 없는 체액의 경우 프로테오믹스가 유일한 연구방법이다. 현재 비-침습적 접근(non-invasive approach)으로 진단에 쓰이고 있는 것은 혈장, 혈청, 뇨, 뇌척수액, 양수, 분비액 등의 체액인데, 많은 연구자들이 진단 마커로 질병 특이적인 단백질을 발굴하기 위해 프로테오믹스 방법을 도입하고 있다.
본 명세서에서 “제1형 당뇨병성 신증 진단용 단백질성 마커”는 정상 개체의 사구체 조직과 제1형 당뇨병성 신증 개체의 사구체 조직을 구분해내는 기준이 되는 물질 중에서 이 물질이 특히 단백질을 주요 구성물질로 하고 있는 것을 지칭한다. 본 발명에서 이 단백질성 마커는 제1형 당뇨병성 신증 개체의 조직에서의 존재량이 정상 개체의 조직에서의 존재량과 비교할 때 특징적으로 많거나 적다.
본 발명은 제1형 당뇨병성 신증 개체의 조직의 프로테옴을 정상 개체의 조직의 프로테옴과 분석한 것이기 때문에, 이렇게 확인된 단백질성 마커는 제1형 당뇨병성 신증에 대하여 특이적이라고 할 수 있으며, 따라서 제1형 당뇨병성 신증을 진단하는데 유용하게 사용될 수 있다. 나아가, 이렇게 확인된 단백질성 마커가 제1형 당뇨병성 신증에서 변화 양상이 두드러지는 것이라는 점을 감안한다면, 이 단백질성 마커의 생리학적 기능은 제1형 당뇨병성 신증의 발병에 직접적으로 관계된 것일 가능성이 있으며, 따라서 이 단백질성 마커는 제1형 당뇨병성 신증 발병의 메커니즘을 연구하거나 제1형 당뇨병성 신증 치료의 개발을 위한 표적 단백질로서도 유용하게 사용될 수 있다.
특히 본 발명의 제1형 당뇨병성 신증 진단용 단백질성 마커는 실제의 제1형 당뇨병성 신증 개체의 사구체 조직에서 프로테옴 수준에서 발굴해낸 것이기 때문에, 종래 DNA 또는 mRNA 수준에서 발견되는 제1형 당뇨병성 신증의 특이적 마커들에 비하여 더욱 임상적으로 활용 가치가 높은 마커들이며, 제1형 당뇨병성 신증에만 한정되어 있다는 점에서 제1형 당뇨병성 신증의 치료제의 표적으로서도 매우 유용한 것이다.
본 발명에서, 상기 단백질성 마커는 상기 분자량을 가지는 한 상기 서열번호를 가지는 전장 단백질의 일부일 수 있으며, 이 경우 도 3a 내지 도 3h의 MS/MS 결과에서 빨간색으로 표시된 트립신 분해된 펩티드 서열들을 가진다. 상기 트립신 분해된 펩티드란 프로테옴 분석의 방법으로서 MALDI-TOF 또는 MS/MS 분석을 위해 트립신(trypsin)으로 분해된 단백질의 펩티드를 의미한다. 또한 상기 분자량은 2차원 전기영동(two-dimensional electrophoresis) 상에서 확인된 값으로서 일반적으로 허용되는 실험상의 오차범위를 포함한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 단백질성 마커의 존재 여부와, 그 양, 패턴 또는 양자 모두를 검출하는 물질을 포함하는 제1형 당뇨병성 신증 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 제1형 당뇨병성 신증 진단용 조성물에서, 상기 단백질성 마커의 존재 여부와 그 양 또는 패턴의 특이적인 검출은 생물학적 시료 내에 본 발명의 제1형 당뇨병성 신증 진단용 단백질성 마커가 존재하는지 여부 및 그 양과 패턴을 확인하는 과정을 의미하며, 예를 들어, 상기 단백질성 마커에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 그 존재 여부와 그 양 또는 패턴을 확인하는 과정이 활용될 수 있다. 본 명세서에서 “생물학적 시료”란 제1형 당뇨병성 신증 진단용 단백질성 마커의 존재 여부와 그 양 또는 패턴이나, 이 단백질성 마커에 관한 유전자의 발현 여부와 그 발현량 또는 발현 패턴을 검출할 수 있는 세포나 조직 등을 의미한다. 또한, 본 명세서에서 “항체”란 항원의 항원결정기(epitope)에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질을 의미하며, 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함하는 개념이다.
본 발명에서, 상기 다클론 항체는 당업자에 알려진 종래방법에 따라 항원인 단백질성 마커 또는 그 항원결정기를 갖는 단편을 외부 숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 외부 숙주는 마우스, 래트, 양, 토끼와 같은 포유동물을 포함한다. 면역원은 근내, 복강내 또는 피하 주사방법으로 주사되며, 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 보조제(adjuvant)와 함께 투여된다. 외부숙주로부터 정기적으로 혈액을 채취하여 향상된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수거하거나 이로부터 항체를 분리·정제한다.
또한 상기 단일클론 항체는 당업자에 알려진 융합에 의한 불멸화된 세포주 생성기술(Koeher and Milstein (1975) Nature, 256:495)에 의해 제조될 수 있다. 그 제조방법을 간단히 설명하면 다음과 같다. 먼저 순수한 단백질을 20 μg을 얻어서 Balb/C 쥐에 면역화를 시키거나 펩티드를 합성하여 소혈청 알부민과 결합시켜 쥐에 면역화 시킨다. 그 후에 쥐에서 분리된 항원-생산 임파구를 인간 또는 마우스의 미엘로마와 융합하여 불멸화된 하이브리도마를 생성하며, ELISA 방법을 사용하여 원하는 단일클론 항체를 생성하는 하이브리도마 세포만을 선택하여 증식한 후 배양물로부터 단일클론 항체를 분리·정제한다.
상기 항체를 이용하여 단백질의 존재 여부와 그 양 또는 패턴을 측정하는 방법으로는, 웨스턴 블롯, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선 면역분석(Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테를로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역 전기영동, 조직 면역 염색, 면역 침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
이 분석 방법들을 통하여, 정상 개체의 생물학적 시료에서의 항원-항체 복합체의 형성량과 제1형 당뇨병성 신증 개체의 생물학적 시료에서의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, 이로부터 본 발명의 제1형 당뇨병성 신증 진단용 단백질성 마커의 존재 여부와 그 양 또는 패턴을 판단할 수 있으며, 궁극적으로 제1형 당뇨병성 신증이 의심되는 환자의 발병 여부를 조기에 진단할 수 있게 된다.
여기서 “항원-항체 복합체”란 제1형 당뇨병성 신증 진단용 단백질성 마커와 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량이나 형성 패턴은 통상 2차 항체에 연계된 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기 및 패턴을 검출함으로써 측정이 가능하다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자, 레독스 분자, 방사선 동위원소 등을 예로 들 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제, 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다. 검출 라벨로서 형광물이 사용되는 경우 이용 가능한 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다. 검출 라벨로서 리간드가 사용되는 경우 이용 가능한 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다. 검출 라벨로서 발광물이 사용되는 경우 이용 가능한 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다. 검출 라벨로서 미소입자가 사용되는 경우 이용 가능한 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다. 검출 라벨로서 레독스 분자가 사용되는 경우 이용 가능한 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4W(CN)8, [Os(bpy)3]2+ , [RU(bpy)3]2+, [MO(CN)8]4- 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다. 검출 라벨로서 방사성 동위원소가 사용되는 경우 이용 가능한 방사성 동위원소에는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I 또는 186Re 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 제1형 당뇨병성 신증 진단용 조성물에서, 상기 “제1형 당뇨병성 신증 진단용 단백질성 마커의 존재 여부와 그 양 또는 패턴을 특이적으로 검출하는 물질”은 해당 단백질성 마커의 존재 여부와 그 양 또는 패턴을 검출하기 위한 분석 방법에서 해당 단백질성 마커에 대하여 특이적으로 사용될 수 있는 임의의 물질일 수 있으며, 반드시 항체로 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 제1형 당뇨병성 신증 진단용 조성물은 정상 개체의 생물학적 시료와 제1형 당뇨병성 신증이 의심되는 개체의 생물학적 시료에서 상기 단백질성 마커의 존재 여부와 그 양 또는 패턴의 차이를 검출하는 것에 기술적 특징이 있는 것이기 때문에, 이렇게 단백질성 마커의 존재 여부와 그 양 또는 패턴을 가능하게 하는 물질이라면 어떠한 것이라도 “제1형 당뇨병성 신증 진단용 단백질성 마커의 존재 여부와 그 양 또는 패턴을 특이적으로 검출하는 물질”로서 사용될 수 있고 발명이 목적하는 기술적 효과를 달성할 수 있으며, 당업자라면 당업계의 평균적인 지식 및 공지기술을 참고하여 구체적인 실시양상에 따라 적당한 물질을 특별한 어려움 없이 선택하여 사용할 수 있을 것이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 단백질성 마커를 코딩하는 유전자의 발현 여부와, 그 발현량, 발현 패턴 또는 양자 모두를 검출하는 물질을 포함하는 제1형 당뇨병성 신증 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 제1형 당뇨병성 신증 진단용 조성물에서, 상기 단백질성 마커의 존재 여부와 그 양 또는 패턴은, 상기 단백질 자체를 검출하는 방법을 사용하는 것 외에도, 조직 내에서 해당 단백질성 마커를 코딩하는 유전자의 발현 여부와 그 발현량 또는 발현 패턴을 검출함으로써 단백질성 마커의 존재 여부와 그 양 또는 패턴을 유추하는 방법을 사용할 수도 있다.
여기서 유전자의 발현 여부와 그 발현량 또는 발현 패턴의 검출은 통상적으로 해당 유전자의 전사로 인해 생성된 mRNA의 존재 여부와 그 양 또는 패턴을 확인하는 과정으로써 수행될 수 있다. 이러한 mRNA의 존재 여부와 그 양 또는 패턴을 확인하기 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay), 노던 블롯, DNA 칩 등이 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
이 분석 방법들을 통하여, 정상 개체의 생물학적 시료에서의 mRNA의 존재 여부와 그 양 또는 패턴을 제1형 당뇨병성 신증이 의심되는 개체의 생물학적 시료에서의 mRNA의 존재 여부와 그 양 또는 패턴과 비교할 수 있고, 이로부터 본 발명의 제1형 당뇨병성 신증 진단용 단백질성 마커를 코딩하는 유전자의 발현 여부와 그 발현량 또는 발현 패턴의 차이를 판단하며, 궁극적으로 제1형 당뇨병성 신증이 의심되는 환자의 조직에서 제1형 당뇨병성 신증의 발병 여부를 조기에 진단하는 것이 가능하게 된다.
본 발명의 제1형 당뇨병성 신증 진단용 조성물에서, 상기 mRNA의 존재 여부와 그 양 또는 패턴을 RT-PCR로 측정하기 위한 키트는 본 발명의 단백질성 마커에 관한 mRNA에 특이적인 프라이머를 포함한다. 본 명세서에서 “프라이머”는 템플레이트(template)와 상보적으로 결합할 수 있고 역전사효소 또는 DNA 중합효소가 템플레이트의 복제를 개시할 수 있도록 하는 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 특정 유전자의 핵산 서열에 상보적인 서열을 가지는 뉴클레오티드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp 의 길이가 사용될 수 있다. 그 외 RT-PCR 키트는 구체적인 실시 양상에 따라 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머라제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수 (DEPCwater), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시시킬 수 있다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 다른 염기 서열을 포함할 수도 있다. 프라이머는 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있으며, 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다.
본 발명의 제1형 당뇨병성 신증 진단용 조성물에서, 상기 “제1형 당뇨병성 신증 진단용 단백질성 마커를 코딩하는 유전자의 발현 여부와 그 발현량 또는 발현 패턴을 특이적으로 검출하는 물질”은 해당 단백질성 마커를 코딩하는 유전자의 발현 여부와 그 발현량 또는 발현 패턴의 분석 방법에 있어서 해당 단백질성 마커에 특이적으로 사용될 수 있는 임의의 물질일 수 있으며, 반드시 RT-PCR용 프라이머에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 제1형 당뇨병성 신증 진단용 조성물은 정상 개체의 생물학적 시료와 제1형 당뇨병성 신증이 의심되는 개체의 생물학적 시료에서 제1형 당뇨병성 신증 진단용 단백질성 마커를 코딩하는 유전자의 발현 여부와 그 발현량 또는 발현 패턴의 차이를 검출하는 것에 기술적 특징이 있는 것이기 때문에, 이러한 차이의 검출을 가능하게 하는 물질은 어떠한 것이라도 “제1형 당뇨병성 신증 진단용 단백질성 마커를 코딩하는 유전자의 발현 여부와 그 발현량 또는 발현 패턴을 특이적으로 검출하는 물질”로서 사용될 수 있고 발명이 목적하는 기술적 효과를 달성할 수 있으며, 당업자라면 당업계의 평균적인 지식을 참고하여 구체적인 실시양상에 따라 적당한 물질을 선택하여 사용할 수 있을 것이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 제1형 당뇨병성 신증 진단용 조성물을 포함하는 제1형 당뇨병성 신증 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 제1형 당뇨병성 신증 진단용 키트는, 상기 제1형 당뇨병성 신증 진단용 조성물에 포함되는 제1형 당뇨병성 진단용 단백질성 마커의 존재 여부와 그 양 또는 패턴을 특이적으로 검출하는 물질, 또는 제1형 당뇨병성 신증 진단용 단백질성 마커를 코딩하는 유전자의 발현 여부와 그 발현량 또는 발현 패턴을 특이적으로 검출하는 물질 외에 단백질 존재 여부와 그 양 또는 패턴의 분석 방법 또는 유전자 발현 여부와 그 발현량 또는 발현 패턴의 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 진단 키트가 단백질의 존재 여부와 그 양 또는 패턴을 검출하기 위한 진단 키트인 경우에는, 이 진단 키트는 예를 들어 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 성분을 포함하는 진단 키트일 수 있으며, 이러한 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 성분들, 예를 들어 표지된 2차 항체, 발색단 (chromopores), 효소 (예를 들어, 항체와 접합된 효소) 및 그의 기질, 및 정량 대조군 단백질에 특이적인 항체 등을 포함할 수 있다. 한편, 상기 진단 키트가 유전자의 발현 여부와 그 발현량 또는 발현 패턴을 검출하기 위한 진단 키트인 경우에는, 이 진단 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 성분을 포함하는 진단 키트일 수 있으며, 이러한 RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 외에도 구체적인 실시 양상에 따라 예를 들어 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머라제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPCwater), 멸균수, 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍 등을 포함할 수 있다. 또한, 구체적인 실시 양상에 따라서는, 상기 제1형 당뇨병성 신증 진단용 키트는 DNA 칩 또는 단백질 칩을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 제1형 당뇨병성 신증 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자로부터 본 발명의 제1형 당뇨병성 신증 진단용 단백질성 마커를 검출하는 방법을 제공한다.
상기 제1형 당뇨병성 신증 진단용 단백질성 마커를 검출하는 방법은, 상기 본 발명의 제1형 당뇨병성 신증 진단용 조성물을 제1형 당뇨병성 신증이 의심되는 환자에게서 채취한 생물학적 시료에 처리하고, 그 처리 결과로부터 본 발명의 제1형 당뇨병성 신증 진단용 단백질성 마커의 존재 여부와 그 양 또는 패턴의 차이를 검출함으로써 수행될 수 있다. 또한, 상기 본 발명의 제1형 당뇨병성 신증 진단용 조성물을 제1형 당뇨병성 신증이 의심되는 환자에게서 채취한 생물학적 시료에 처리하고, 그 처리 결과로부터 본 발명의 제1형 당뇨병성 신증 진단용 단백질성 마커를 코딩하는 유전자의 발현 여부와 그 발현량 또는 발현 패턴의 차이를 검출함으로써 수행될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 단백질성 마커를 발현하는 세포 및 동물에 시험 화합물을 처리하는 단계, 및 시험 화합물이 상기 단백질성 마커의 생리학적 활성을 촉진 또는 억제하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 제1형 당뇨병성 신증 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 제1형 당뇨병성 신증 진단용 단백질성 마커는 제1형 당뇨병성 신증 개체의 조직에서 변화 양상이 두드러지는 것이기 때문에 제1형 당뇨병성 신증의 발병에 직접 관여하는 단백질일 가능성이 있으며, 따라서 제1형 당뇨병성 신증 발병의 메커니즘을 연구하거나 제1형 당뇨병성 신증의 치료제의 개발을 위한 표적 단백질로서도 유용하게 사용될 수 있는 것이다. 즉, 본 발명의 제1형 당뇨병성 신증 진단용 단백질성 마커는 제1형 당뇨병성 신증의 치료제 개발의 중요한 전제를 해결한 것이므로, 따라서 이 단백질성 마커를 이용하여 제1형 당뇨병성 신증의 치료제를 스크리닝하는 방법도 본 발명의 범주에 속한다.
이런 치료제를 스크리닝하는 방법으로는, 본 발명의 제1형 당뇨병성 신증 진단용 단백질성 마커를 어피니티 칼럼에 고정시키고 이를 시료와 접촉시켜 정제하는 방법 [Pandya et al, Virus Res 87: 135-143, 2002], 투-하이브리드 방법을 이용하는 방법 [Fields, S and Song, O., Nature 340: 245 -246, 1989], 웨스턴 블랏["Molecular Cloning - A Laboratory Manual" Cold Spring Habor Laboratory, NY, Maniatis, T. at al.(1982) section 18.30-18.74], 하이스루풋스크리닝 방법 [Aviezer et al, J Biomol Screen 6: 171-7, 2001] 등 을 비롯한 다수의 공지의 방법을 사용할 수 있으며, 당업자라면 구체적인 실시 양상에 따라 적절한 방법을 선택할 수 있다. 스크리닝에 사용하기 위한 시험 화합물을 포함하는 시료로서는 조직 추출액, 유전자 라이브러리의 발현산물, 합성 화합물, 합성 펩티드, 천연 화합물 등이 있으나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기 폴리펩티드로 이루어진 군에서 선택되는 하나 또는 둘 이상의 조합인 것을 특징으로 하는 명백한 단백뇨 단계의 제1형 당뇨병성 신증 진단용 단백질성 마커를 제공한다:
서열번호 5의 아미노산 서열을 가지고 41-43 KD의 분자량을 갖는 alpha skeletal muscle;
서열번호 6의 아미노산 서열을 가지고 21-23 kD의 분자량을 갖는 Peroxiredoxin-2; 및
서열번호 8의 아미노산 서열을 가지고 28-30 kD의 분자량을 갖는 Neuroendocrine secretory protein 55.
당뇨병성 신증 발병 후 5∼10년 내에 미세 단백뇨(또는 미세알부민뇨)가 나타나고 그로부터 몇 년 후에는 명백한 단백뇨(또는 명백한 알부민뇨)가 나타나게 된다. 일단 명백한 알부민뇨가 나타나면 당뇨병성 신증은 비가역적이 되며, 약 50%의 환자가 7년 내에 투석을 필요로 하게 되는 말기신부전증이 나타나게 된다. 따라서 당뇨병성 신증이 발병한 환자로부터 병의 진행정도를 파악하여 미세 단백뇨 단계인지, 명백한 단백뇨 단계인지를 진단한다면 병의 진행정도에 따른 적절한 치료가 가능할 것이다.
본 발명에서, 상기 “미세단백뇨”는 뇨 중에 1일 30∼300 ㎎의 알부민이 배출되는 상태로서 제1형 당뇨병 환자의 신증의 민감한 지표가 된다. 또한 “명백한 알부민뇨(overt albuminuria)”는 뇨 중의 알부민양은 시간이 지남에 따라 증가하게 되어 뇨 중에 1일 300 ㎎ 이상의 알부민이 배출되는 상태를 말한다.
본 발명의 실시예 4에서는, 미세 단백뇨 단계의 당뇨병성 신증 개체와 명백한 단백뇨 단계의 당뇨병성 신증 개체에서 발현의 차이를 보이는 단백질들을 동정함으로써 이들 단백질이 명백한 단계의 제1형 당뇨병성 신증의 진단 마커로 사용될 수 있음을 입증하였다 (표 3).
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 제1형 당뇨병성 신증 진단용 단백질성 마커, 상기 단백질성 마커의 변화를 검출하는 물질을 포함하는 제1형 당뇨병성 신증 진단용 조성물, 상기 제1형 당뇨병성 신증 진단용 조성물을 포함하는 제1형 당뇨병성 신증 진단용 키트, 상기 제1형 당뇨병성 신증 진단용 단백질성 마커를 검출하는 방법, 상기 단백질성 마커를 활용한 제1형 당뇨병성 신증 치료제의 스크리닝 방법, 및 상기 단백질성 마커를 활용한 명백한 단백뇨 단계의 제1형 당뇨병성 신증 진단용 단백질성 마커가 제공된다.
도 1은 정상 그룹과 STZ를 이용하여 제1형 당뇨를 유발시킨 그룹에서 24주 동안 단백뇨(proteinuria)를 측정한 결과를 나타내는 이미지이고,
도 2a는 실험 6주 후 정상 쥐들의 사구체 단백질에서 감소 및 증가한 단백질을 나타내는 2-D 전기영동 이미지이고,
도 2b는 실험 6주 후 STZ 투여한 쥐들의 사구체 단백질에서 감소 및 증가한 단백질을 나타내는 2-D 전기영동 이미지이고,
도 2c는 실험 24주 후 정상 쥐들의 사구체 단백질에서 감소 및 증가한 단백질을 나타내는 2-D 전기영동 이미지이고,
도 2d는 실험 24주 후 STZ 투여한 쥐들의 사구체 단백질에서 감소 및 증가한 단백질을 나타내는 2-D 전기영동 이미지이고,
도 3a 내지 도 3h는 정상 그룹과 제1형 당뇨를 유발시킨 그룹에서 다르게 발현되는 단백질들을 ESI-Q-TOF/MS/MS를 이용하여 동정한 결과이고,
도 4a는 Annexin A3, Glutathione peroxidase 3 단백질이 제1형 당뇨병성 신증에 걸린 쥐들의 사구체에서 발현량이 증가 또는 감소한 것을 보여주는 웨스턴 블롯 이미지이고,
도 4b는 Annexin A3, Glutathione peroxidase 3 단백질이 제1형 당뇨병성 신증에 걸린 쥐들의 사구체에서 발현량이 증가 또는 감소한 것을 통계 프로그램을 이용하여 보여주는 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1. 시료준비 (Sample preparation)
오리엔트 바이오에서 래트(wistar rat)를 구입하여 STZ(Streptozotocin)를 이용하여 제1형 당뇨를 유발시킨 후, 매주 체중과 혈당을 확인하고 3주마다 단백뇨를 측정하여 당뇨병성 신증에 걸린 것을 확인하였다 (도 1). 이 때 STZ 투여 후 6주와 24주 후에 쥐들을 부검하여 마그네틱 비드를 이용하여 사구체를 분리하였다. 이때 각 그룹의 개체의 수는 15마리이다. 분리한 사구체를 용해버퍼(lysis buffer)에 넣고 차가운 상태를 유지하며 초음파(sonicator)를 이용하여 세포를 부숴주었다, 덩어리가 없도록 부숴준 사구체가 포함된 용해버퍼의 5배 용량의 TCA(trichloroacetic acid)/아세톤 용액을 넣고 180분간 4℃에서 흔들어주며 보관하였다. 4℃에서 침전된 단백질은 원심분리기(Union-55R centrifuge, 한일과학, Korea)로 4℃, 13,000 rpm에서 10분 동안 돌려 여분의 지질을 제거하고 단백질만이 남게 하였다. 이러한 침전물을 공기 중에서 말리고 시료 완충액을 넣어 단백질 정량을 하여 -70℃ 냉동고에 보관하였다. 시료 완충액의 조성은 다음과 같다: 7 M urea, 2 M thiourea, 65 mM DTT in 20 mM Tris-Cl(pH 8.8)에 이르게 한다.
실시예 2. 이차원 전기영동(Two-Dimensional Electrophoresis)
2-1. 일차원 전기영동(Isoelectroforcusing, IEF):
시료 완충액으로 처리된 시료의 단백질 양을 80 μg으로 하여 일차원 전기영동을 실시하였다. 시료의 총 부피가 450 μl가 되게 rehydration 완충액(8 M urea, 2% CHAPS, 13 mM DTT, 1 % IPG buffer)을 섞어 일차원 전기영동을 할 수 있는 24㎝ 스트립 홀더(strip holder)에 넣은 뒤 pH 3-10 범위의 Drystrip(Amerahsm Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)을 스트립 홀더에 장착하였다. 20℃에서 5시간가량 스트립(strip)을 rehydration 완충액으로 불려준 뒤 다음과 같은 조건으로 일차원 전기영동을 수행하였다: 200 V 30분, 500 V 1분, 8,000 V 45분, 8,000 V 72000 Vhrs, 11시간 30분. 총 146 kVhr. 일차원 전기영동은 IPGphore(Amerahsm Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)로 수행하였다.
2-2. 이차원 전기영동(SDS-PAGE)
이차원 전기영동을 하기 위해, 일차원 전기영동이 끝난 스트립을 캡튜브(cap tube)에 넣고 일차 평형화 용액[6 M urea, 50 mM Tris-cl(pH 8.8), 30% glycerol, 2% SDS, 1% DTT] 10 ml에 15분간 반응시킨 후 버리고, 다시 이차 평형화 용액 [6 M urea, 50 mM Tris-cl(pH 8.8), 30% glycerol, 2% SDS, 1.5% IAA] 10 ml을 넣고 15분간 재반응시켰다. 12%로 만들어진 폴리아크릴아마이드 젤(Polyacylamide gel, 25×30 ㎝) 위에 반응이 끝난 스트립을 장착하고 0.5% 아가로즈로 실링(sealing)하였다. 이차원 전기영동은 Ettan Dalt(Amerahsm Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)에 전기영동 완충액(24 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS)을 넣고 전기영동을 실시하였다. 전기영동 조건은 다음과 같다: 55 V 1시간, 160 V 1시간, 330 V 4시간.
2-3. 염색(Staining)
이차원 전기영동이 끝난 뒤 젤을 가시화시키기 위해 은(silver) 염색을 하였다. 은 염색과정은 다음과 같다. 50% 메탄올, 12% 아세트산으로 이루어진 용액에 3시간가량 반응시켜 고정화(Fixation)하고, 50% 에탄올로 20분간 3회 세척하고, 0.2% 티오황산나트륨(Sodium thiosulfate) 용액으로 1분간 반응시켜 민감화(Sensitizing)하고, 증류수(distilled water, DW)로 세척하고, 0.1% 질산은(Silver nitrate), 0.075% 포름알데히드(formaldehyde, 37%) 용액으로 20분간 반응시켜 반응화(Improving)하고, 증류수로 다시 세척하고, 미리 차게 만든 6% 탄산나트륨(Sodium carbonate), 0.075% 포름알데히드(37%) 용액으로 약 7분간 반응시켜 가시화(Developing)하고, 50% 메탄올, 12% 아세트산 용액으로 처리하여 반응을 정지시켰다.
2-4. 이미지 분석(Image Analysis)
실험한 젤들을 분석하기 위해 먼저 ImageScanner(Amersham Pharmacia Bio-tech, Uppsala, Sweden)로 스캔하였다. 단백질 발현이 차이나는 점들을 분석하기 위해 이차원 전기영동 분석 전용 프로그램인 ImageMaster(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)로 분석을 수행하였다.
도 2a는 실험 6주 후 정상 쥐들의 사구체 단백질에서 감소 및 증가한 단백질을 나타내는 2-D 전기영동 이미지이고, 도 2b는 실험 6주 후 STZ 투여한 쥐들의 사구체 단백질에서 감소 및 증가한 단백질을 나타내는 2-D 전기영동 이미지이고, 도 2c는 실험 24주 후 정상 쥐들의 사구체 단백질에서 감소 및 증가한 단백질을 나타내는 2-D 전기영동 이미지이고, 도 2d는 실험 24주 후 STZ 투여한 쥐들의 사구체 단백질에서 감소 및 증가한 단백질을 나타내는 2-D 전기영동 이미지이다. 이들 결과에서 발현의 차이가 있는 점(spot)들을 이하에서 분석하였다.
실시예 3. 질량분석 (ESI-Q-TOF/MS/MS Analysis)
이미지 분석프로그램으로 찾아낸 점들을 동정하기 위해 이차원 전기영동이 끝난 젤로부터 점(spot)들을 오려냈다. 먼저 은을 없애기 위해 30 mM 페리시안화칼륨(Potassium Ferricyanide)과 100 mM 티오황산나트륨(Sodium Thiosulfate) 용액이 1:1로 섞인 탈염색 용액 100 μl을 젤 조각에 5분간 처리하였다. 이후에 400 μl의 물로 3번 세척하였다.
다시 200 mM 탄화수소암모늄(ammonium bicarbonate)으로 반응한 뒤 물로 세척하였다. 아세토나이트릴(Acetonitrile)을 넣어 젤이 하얗게 변할 때까지 탈수시켰다. 이 젤을 진공 원심분리기(Speed vacuum centrifuge)에 넣어서 젤로부터 용액을 완전히 없앴다. 건조된 젤 조각은 0.2 μg의 트립신(promega)이 들어있는 50 mM의 탄화수소암모늄 20 μl로 얼음(ice)상에서 45분간 함수시켰다. 반응용액을 제거 후 50 mM의 탄화수소암모늄 30 μl을 넣은 후 37℃로 밤새 반응시켰다. 그 펩티드 용액은 C18 나노 칼럼(nano column, home made)를 이용하여 염분을 제거하였다.
크로마토그래피 칼럼(Custom-made chromatographic columns)은 질량분석 이전에 펩티드 염분제거와 농축용으로 사용되었다. Poros reverse R2 material(20-30 um bead size, PerSeptive Biosystems)의 100-300 nL로 구성된 칼럼은 단단히 조여진 GELoader tip(Eppendorp, hamburg, Germany)에 팩킹하였다. 10 mL 실린지(syringe)는 공기압으로 칼럼을 통해 물질을 통과시켰다. 펩티드 용액 30 μl은 5% 포름산(formic acid) 용액 내에서 희석되어 칼럼 안으로 이동되었다. 그리고 30 μl은 5% 포름산 용액으로 세척되었다. MS/MS분석을 위해 펩티드는 borosilicate nanoelectrospray needle(Micromass, Manchester, UK)에 50% methnol/49% H20/1% formic acid와 섞여 용출시켰다.
MS/MS는 Q-TOF2 mass spectrometer(Micromass, Mancheser, UK)상에서 nano-ESI로 수행하였다. 그 소스(source) 온도는 80℃이다. 1 kV의 전압은 안정된 flow rate(10-30 nL/min)를 생성하기 위해 0-5 psi의 nitrogen back-pressure와 혼합되어진 이온 소스(ion source)에서 borosilicate nanoelectrospray needles(EconoTipTM, New Objective, USA)에 적용하였다. 그 원뿔(cone) 전류는 40 V이다. Quardrupole analyser는 hexapole collision cell에서 분절화를 하기 위해 전구 이온(precursor ion)을 선택하는데 사용되었다. 충돌가스(collision gas)는 6-7 x 10-5 mbar의 아르곤(Ar)이며 출동 에너지(collision energy)는 20-30 V이다. 생성 이온은 반사기(reflector)와 작은 통로판 검사기(micro channel plate detector) 그리고 time-to-digital 변환기에 맞추어지는 TOF 분석기를 이용하여 분석된다. 그 자료는 Mass Lynx Widows NT PC system을 이용하여 진행되었다.
단백질을 동정하기 위해 모든 MS/MS 스펙트럼은 MASCOT search program(www.matrixscience.com)을 이용하여 NCBInr 데이터베이스에서 단백질 서열을 조사하였다.
상기와 같이 정상, 미세 단백뇨 단계, 및 명백한 단백뇨 단계의 당뇨병성 신증에 걸린 쥐의 사구체에서 다르게 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 ESI-Q-TOF/MS/MS를 이용하여 확인하였으며, 그 결과는 도 3a 내지 도 3h에 나타내었다.
실시예 4. 웨스턴 블롯팅(Western blotting)
4-1. SDS-PAGE 전기영동
정상 및 당뇨병성 신증 쥐들의 사구체 단백질 10 μg를 12% SDS-PAGE 전기영동을 실시하였다. 혈청 시료 15~20 μl (단백질 10 μg)에 SDS-PAGE loading 완충액 (60 mM Tris-Cl, 2% SDS, 25% Glycerol, 14.4 mM 2-Mercaptoethnol, 0.1% Bromophenol Blue, pH 6.8) 4 μl을 섞어 mini gel (6×8 ㎝)에서 분자량별(separating gel상에서 100 V로 로딩)로 분리하였다. 이때 사용한 running 완충액의 조성은 0.025 M Tris-Cl, 0.192 M Glycine, 1% SDS(pH 8.3)이다.
4-2. 블롯팅(Blotting)
SDS-PAGE가 끝난 뒤 젤의 단백질을 Semi-dry 형태의 transfer kit(Bio-rad)을 이용하여 Polyvinylidene Fluoride (PVDF) 막으로 옮겼다. 젤 한 장 당 50 mA에서 1시간 30분 동안 실시하였다.
4-3. 항체반응
Glutathione peroxidase 3 (Gpx3)과 Annexin A3, Peroxyredoxin 2 (Prdx2) 를 대상으로 하여 실시하였다. 막(membrane)을 5% w/v nonfat dry milk로 실온에서 1시간 동안 블로킹(blocking)시켰다. 일차 항체로는 Gpx3, Annexin A3, Prdx2를 사용하고 이들은 polyclonal antibody이다. 이 항체들을 4℃에서 24시간동안 반응시켰다. 일차항체의 희석농도는 각각 1/3,000, 1/100, 1/4,000으로 하였다. TBS/T(0.1%, Tris-buffered saline-tween 20)로 세척한 후에 이차 항체로 실온에서 1시간 반응시켰다. 이차항체는 anti-rabbit을 사용하고, 희석농도는 anti-rabbit은 1/3,000이였다. 이차항체 반응 후에 TBS/T로 세척하고 난 뒤, ECL (Pierce Biotechnology, Inc., USA.)로 가시화 시켰다.
상기와 같이 이차원 전기영동실험을 수행한 결과, 다음과 같이 정상 쥐의 사구체에서 보다 당뇨병성 신증에 걸린 쥐들의 사구체에서 새롭게 발현되거나 발현양이 감소 및 증가하는 단백질들이 동정되었다.
1) 미세 단백뇨 단계의 당뇨병성 신증에 걸린 쥐들의 사구체에서 발현되는 단백질
미세 단백뇨 단계인 쥐들의 사구체를 대상으로 전기영동을 수행한 결과, 4개의 발현이 감소한 단백질(# 1010, # 1437, # 1582, # 2194)과 1개의 증가하는 단백질(# 2087)을 찾을 수 있었다 (도 2a, 2b). 발현이 감소한 단백질은 정상 쥐들의 사구체 단백질보다 약 50% 이상 감소하였으며, 증가한 단백질은 약 100% 이상 증가하였다. ESI-Q-TOF를 수행한 결과 미세단백뇨를 가진 당뇨병성 신증에 걸린 쥐의 사구체에서 발현이 감소 및 증가한 단백질을 하기 표 1과 같이 동정하였다.
Figure 112010037019690-pat00001
2) 명백한 단백뇨 단계의 당뇨병성 신증에 걸린 쥐들의 사구체에서 발현되는 단백질
명백한 단백뇨 단계인 쥐들의 사구체를 대상으로 전기영동을 수행한 결과, 6개의 발현이 감소한 단백질(# 1010, #1360, # 1437, # 1582, #2160, # 2194)과 2개의 증가하는 단백질(#1907, # 2087)을 찾을 수 있었다 (도 2c, 2d). 발현이 감소한 단백질은 정상 쥐들의 사구체 단백질보다 약 50% 이상 감소하였으며, 증가한 단백질은 약 100% 이상 증가하였다. ESI-Q-TOF를 수행 한 결과 명백한 단백뇨를 가진 당뇨병성 신증에 걸린 쥐의 사구체에서 발현이 감소 및 증가한 단백질을 하기 표 2와 같이 동정하였다.
Figure 112010037019690-pat00002
3) 미세한 단백뇨 단계와 명백한 단백뇨 단계의 당뇨병성 신증에 걸린 쥐들의 사구체에서 발현되는 단백질
명백한 단백뇨 단계의 쥐의 사구체를 대상으로 전기영동을 수행한 결과, 2개의 발현이 감소한 단백질(#1360, # 2160)과 1개의 증가하는 단백질(#1907)을 찾을 수 있었다 (도 2b 2d). 발현이 감소한 단백질은 미세 단백뇨단계의 쥐의 사구체 단백질보다 약 50% 이상 감소하였으며, 증가한 단백질은 약 100% 이상 증가하였다. ESI-Q-TOF를 수행 한 결과 명백한 단백뇨를 가진 당뇨병성 신증에 걸린 쥐의 사구체에서 발현이 감소 및 증가한 단백질을 하기 표 3과 같이 동정하였다.
Figure 112010037019690-pat00003
4) 단백질의 아미노산 서열의 결정
상기와 같이 당뇨병성 신증에 걸린 쥐의 사구체에서 다르게 발현되는 단백질들을 ESI-Q-TOF/MS/MS를 이용하여 동정하여 도 3a 내지 도 3h의 결과를 얻었다. 도면에서 빨간색은 매치된 트립신 분해 펩타이드의 서열을 나타낸다. 이들 단백질의 아미노산 서열은 NCBInr 데이타베이스(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 서치하여 Glutathione peroxidase 3 (서열번호 1), Histone H2A (서열번호 2), Glycoprotein m6a (서열번호 3), eukaryotic translation initiation factor 4, gamma 1 isoform a (서열번호 4), alpha skeletal muscle (서열번호 5), Peroxiredoxin-2 (서열번호 6), Annexin A3 (서열번호 7), Neuroendocrine secretory protein 55 (서열번호 8)을 가짐을 확인하였다.
5) 웨스턴 블로팅(Western blotting) 시험결과
상기 발현이 변화된 단백질들 중 당뇨병성 신증에 걸린 쥐의 사구체에서 동정된 단백질인 Glutathione peroxidase 3, 및 Annexin A3을 웨스턴 블롯 실험 결과를 도 4a에 나타내고, 그 상대적인 강도를 도 4b에 나타내었다. 결과에서 보는 바와 같이, 신증의 진행정도에 따라 Glutathione peroxidase 3의 양은 유의적으로 감소하는 것으로 나타났고 Annexin A3의 양은 유의적으로 증가하는 것으로 나타났다. 이것으로 보아 Glutathione peroxidase 3, 및 Annexin A3은 당뇨병성 신증의 치료제로서의 사용과 당뇨병성 신증의 연구에 매우 유용할 것으로 생각된다.
<110> Korea University Industrial and Academic Collaboration Foundation <120> Proteinic markers for diagnosing type I diabetic nephropathy <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 228 <212> PRT <213> Wistar Rat <400> 1 Met Ala Arg Ile Leu Arg Ala Ser Cys Leu Leu Ser Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Gly Phe Val Pro Pro Gly Arg Gly Gln Glu Lys Ser Lys Thr Asp Cys 20 25 30 His Gly Gly Met Ser Gly Thr Ile Tyr Glu Tyr Gly Ala Leu Thr Ile 35 40 45 Asp Gly Glu Glu Tyr Ile Pro Phe Lys Gln Tyr Ala Gly Lys Tyr Ile 50 55 60 Leu Phe Val Asn Val Ala Ser Tyr Cys Gly Leu Thr Asp Gln Tyr Leu 65 70 75 80 Gly Gln Glu Leu Asn Ala Leu Gln Glu Glu Leu Gly Pro Phe Gly Leu 85 90 95 Val Ile Leu Gly Phe Pro Cys Asn Gln Phe Gly Lys Gln Glu Pro Gly 100 105 110 Glu Asn Ser Glu Ile Leu Pro Ser Leu Lys Tyr Val Arg Pro Gly Gly 115 120 125 Gly Phe Val Pro Asn Phe Gln Leu Phe Glu Lys Gly Asp Val Asn Gly 130 135 140 Glu Lys Glu Gln Lys Phe Tyr Thr Phe Leu Lys Asn Ser Cys Pro Pro 145 150 155 160 Thr Ala Glu Leu Leu Gly Ser Pro Gly Arg Leu Phe Trp Glu Pro Met 165 170 175 Lys Ile His Asp Ile Arg Trp Asn Phe Glu Lys Phe Leu Val Gly Pro 180 185 190 Asp Gly Ile Pro Ile Met Arg Trp Tyr His Arg Thr Thr Val Ser Asn 195 200 205 Val Lys Met Asp Ile Leu Ser Tyr Met Arg Arg Gln Ala Ala Leu Gly 210 215 220 Ala Arg Gly Lys 225 <210> 2 <211> 130 <212> PRT <213> Wistar Rat <400> 2 Met Ser Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Ala Arg Ala Lys Ala Lys 1 5 10 15 Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His 20 25 30 Arg Leu Leu Tyr Lys Gly Asn Tyr Ser Glu Arg Val Gly Ala Ser Ala 35 40 45 Pro Val Tyr Leu Ala Ala Val Leu Glu Tyr Leu Thr Ala Glu Ile Leu 50 55 60 Glu Leu Ala Gly Asn Ala Ala Arg Asp Asn Lys Lys Thr Arg Ile Ile 65 70 75 80 Pro Arg His Leu Gln Leu Ala Ile Arg Asn Asp Glu Glu Leu Asn Lys 85 90 95 Leu Leu Gly Arg Val Thr Ile Ala Gln Gly Gly Val Leu Pro Asn Ile 100 105 110 Gln Ala Val Leu Leu Pro Lys Lys Thr Glu Ser His His Lys Ser Lys 115 120 125 Gly Lys 130 <210> 3 <211> 278 <212> PRT <213> Wistar Rat <400> 3 Met Glu Glu Asn Met Glu Glu Gly Gln Thr Gln Lys Gly Cys Phe Glu 1 5 10 15 Cys Cys Ile Lys Cys Leu Gly Gly Ile Pro Tyr Ala Ser Leu Ile Ala 20 25 30 Thr Ile Leu Leu Tyr Ala Gly Val Ala Leu Phe Cys Gly Cys Gly His 35 40 45 Glu Ala Leu Ser Gly Thr Val Asn Ile Leu Gln Thr Tyr Phe Glu Met 50 55 60 Ala Arg Thr Ala Gly Asp Thr Leu Asp Val Phe Thr Met Ile Asp Ile 65 70 75 80 Phe Lys Tyr Val Ile Tyr Gly Ile Ala Ala Ala Phe Phe Val Tyr Gly 85 90 95 Ile Leu Leu Met Val Glu Gly Phe Phe Thr Thr Gly Ala Ile Lys Asp 100 105 110 Leu Tyr Gly Asp Phe Lys Ile Thr Thr Cys Gly Arg Cys Val Ser Ala 115 120 125 Trp Phe Ile Met Leu Thr Tyr Leu Phe Met Leu Ala Trp Leu Gly Val 130 135 140 Thr Ala Phe Thr Ser Leu Pro Val Tyr Met Tyr Phe Asn Val Trp Thr 145 150 155 160 Ile Cys Arg Asn Thr Thr Leu Val Glu Gly Ala Asn Leu Cys Leu Asp 165 170 175 Leu Arg Gln Phe Gly Ile Val Thr Ile Gly Glu Glu Lys Lys Ile Cys 180 185 190 Thr Val Ser Glu Asn Phe Leu Arg Met Cys Glu Ser Thr Glu Leu Asn 195 200 205 Met Thr Phe His Leu Phe Ile Val Ala Leu Ala Gly Ala Gly Ala Ala 210 215 220 Val Ile Ala Met Val His Tyr Leu Met Val Leu Ser Ala Asn Trp Ala 225 230 235 240 Tyr Val Lys Asp Ala Cys Arg Met Gln Lys Tyr Glu Asp Ile Lys Ser 245 250 255 Lys Glu Glu Gln Glu Leu His Asp Ile His Ser Thr Arg Ser Lys Glu 260 265 270 Arg Leu Asn Ala Tyr Thr 275 <210> 4 <211> 130 <212> PRT <213> Wistar Rat <400> 4 Met Glu Ile Asp Ile Pro His Val Trp Leu Tyr Leu Ala Glu Leu Ile 1 5 10 15 Thr Pro Ile Leu Gln Glu Asp Gly Val Thr Met Gly Glu Leu Phe Arg 20 25 30 Glu Ile Ser Lys Pro Leu Arg Pro Met Gly Lys Ala Thr Ser Phe Leu 35 40 45 Leu Glu Ile Leu Gly Leu Leu Tyr Lys Asn Met Gly Pro Lys Lys Val 50 55 60 Gly Met Leu Trp Gln Glu Ala Gly Leu Ser Trp Arg Glu Phe Leu Gly 65 70 75 80 Gln Asp Ile Gly Ser Phe Val Val Glu Lys Lys Val Asn Tyr Thr Leu 85 90 95 Gly Glu Glu Ser Glu Ala Pro Gly Gln Arg Thr Leu Ala Cys Glu Glu 100 105 110 Leu Arg Arg Gln Leu Glu Lys Leu Leu Lys Asp Gly Asp Ser Asn Gln 115 120 125 Cys Ala 130 <210> 5 <211> 377 <212> PRT <213> Wistar Rat <400> 5 Met Cys Asp Glu Asp Glu Thr Thr Ala Leu Val Cys Asp Asn Gly Ser 1 5 10 15 Gly Leu Val Lys Ala Gly Phe Ala Gly Asp Asp Ala Pro Arg Ala Val 20 25 30 Phe Pro Ser Ile Val Gly Arg Pro Arg His Gln Gly Val Met Val Gly 35 40 45 Met Gly Gln Lys Asp Ser Tyr Val Gly Asp Glu Ala Gln Ser Lys Arg 50 55 60 Gly Ile Leu Thr Leu Lys Tyr Pro Ile Glu His Gly Ile Ile Thr Asn 65 70 75 80 Trp Asp Asp Met Glu Lys Ile Trp His His Thr Phe Tyr Asn Glu Leu 85 90 95 Arg Val Ala Pro Glu Glu His Pro Thr Leu Leu Thr Glu Ala Pro Leu 100 105 110 Asn Pro Lys Ala Asn Arg Glu Lys Met Thr Gln Ile Met Phe Glu Thr 115 120 125 Phe Asn Val Pro Ala Met Tyr Val Ala Ile Gln Ala Val Leu Ser Leu 130 135 140 Tyr Ala Ser Gly Arg Thr Thr Gly Ile Val Leu Asp Ser Gly Asp Gly 145 150 155 160 Val Thr His Asn Val Pro Ile Tyr Glu Gly Tyr Ala Leu Pro His Ala 165 170 175 Ile Met Arg Leu Asp Leu Ala Gly Arg Asp Leu Thr Asp Tyr Leu Met 180 185 190 Lys Ile Leu Thr Glu Arg Gly Tyr Ser Phe Val Thr Thr Ala Glu Arg 195 200 205 Glu Ile Val Arg Asp Ile Lys Glu Lys Leu Cys Tyr Val Ala Leu Asp 210 215 220 Phe Glu Asn Glu Met Ala Thr Ala Ala Ser Ser Ser Ser Leu Glu Lys 225 230 235 240 Ser Tyr Glu Leu Pro Asp Gly Gln Val Ile Thr Ile Gly Asn Glu Arg 245 250 255 Phe Arg Cys Pro Glu Thr Leu Phe Gln Pro Ser Phe Ile Gly Met Glu 260 265 270 Ser Ala Gly Ile His Glu Thr Thr Tyr Asn Ser Ile Met Lys Cys Asp 275 280 285 Ile Asp Ile Arg Lys Asp Leu Tyr Ala Asn Asn Val Met Ser Gly Gly 290 295 300 Thr Thr Met Tyr Pro Gly Ile Ala Asp Arg Met Gln Lys Glu Ile Thr 305 310 315 320 Ala Leu Ala Pro Ser Thr Met Lys Ile Lys Ile Ile Ala Pro Pro Glu 325 330 335 Arg Lys Tyr Ser Val Trp Ile Gly Gly Ser Ile Leu Ala Ser Leu Ser 340 345 350 Thr Phe Gln Gln Met Trp Ile Thr Lys Gln Glu Tyr Asp Glu Ala Gly 355 360 365 Pro Ser Ile Val His Arg Lys Cys Phe 370 375 <210> 6 <211> 198 <212> PRT <213> Wistar Rat <400> 6 Met Ala Ser Gly Asn Ala His Ile Gly Lys Pro Ala Pro Asp Phe Thr 1 5 10 15 Gly Thr Ala Val Val Asp Gly Ala Phe Lys Glu Ile Lys Leu Ser Asp 20 25 30 Tyr Arg Gly Lys Tyr Val Val Leu Phe Phe Tyr Pro Leu Asp Phe Thr 35 40 45 Phe Val Cys Pro Thr Glu Ile Ile Ala Phe Ser Asp His Ala Glu Asp 50 55 60 Phe Arg Lys Leu Gly Cys Glu Val Leu Gly Val Ser Val Asp Ser Gln 65 70 75 80 Phe Thr His Leu Ala Trp Ile Asn Thr Pro Arg Lys Glu Gly Gly Leu 85 90 95 Gly Pro Leu Asn Ile Pro Leu Leu Ala Asp Val Thr Lys Ser Leu Ser 100 105 110 Gln Asn Tyr Gly Val Leu Lys Asn Asp Glu Gly Ile Ala Tyr Arg Gly 115 120 125 Leu Phe Ile Ile Asp Ala Lys Gly Val Leu Arg Gln Ile Thr Val Asn 130 135 140 Asp Leu Pro Val Gly Arg Ser Val Asp Glu Ala Leu Arg Leu Val Gln 145 150 155 160 Ala Phe Gln Tyr Thr Asp Glu His Gly Glu Val Cys Pro Ala Gly Trp 165 170 175 Lys Pro Gly Ser Asp Thr Ile Lys Pro Asn Val Asp Asp Ser Lys Glu 180 185 190 Tyr Phe Ser Lys His Asn 195 <210> 7 <211> 324 <212> PRT <213> Wistar Rat <400> 7 Met Ala Ala Ser Leu Trp Val Gly Pro Arg Gly Thr Ile Asn Asn Tyr 1 5 10 15 Pro Gly Phe Asn Pro Ser Val Asp Ala Glu Ala Ile Arg Lys Ala Ile 20 25 30 Lys Gly Ile Gly Thr Asp Glu Lys Thr Leu Ile Asn Ile Leu Thr Glu 35 40 45 Arg Ser Asn Ala Gln Arg Gln Leu Ile Val Lys Gln Tyr Gln Glu Ala 50 55 60 Tyr Glu Gln Ala Leu Lys Ala Asp Leu Lys Gly Asp Leu Ser Gly His 65 70 75 80 Phe Glu His Val Met Val Ala Leu Ile Thr Ala Pro Ala Val Phe Asp 85 90 95 Ala Lys Gln Leu Lys Lys Ser Met Arg Gly Met Gly Thr Asp Glu Asp 100 105 110 Thr Leu Ile Glu Ile Leu Thr Thr Arg Thr Ser Arg Gln Met Lys Glu 115 120 125 Ile Ser Gln Ala Tyr Tyr Thr Ala Tyr Lys Lys Asn Leu Arg Asp Asp 130 135 140 Ile Ser Ser Glu Thr Ser Gly Asp Phe Arg Lys Ala Leu Leu Thr Leu 145 150 155 160 Ala Asp Gly Gly Arg Asp Glu Ser Leu Lys Val Asp Glu His Leu Ala 165 170 175 Lys Lys Asp Ala Gln Thr Leu Tyr Asp Ala Gly Glu Lys Lys Trp Gly 180 185 190 Thr Asp Glu Asp Lys Phe Thr Glu Ile Leu Cys Leu Arg Ser Phe Pro 195 200 205 Gln Leu Lys Leu Thr Phe Asp Glu Tyr Arg Asn Ile Ser Gln Lys Asp 210 215 220 Ile Glu Asp Ser Ile Lys Gly Glu Leu Ser Gly His Phe Glu Asp Leu 225 230 235 240 Leu Leu Ala Val Val Arg Cys Thr Arg Asn Thr Pro Ala Phe Leu Ala 245 250 255 Gly Arg Leu His Gln Ala Leu Lys Gly Ala Gly Thr Asp Glu Phe Thr 260 265 270 Leu Asn Arg Ile Met Val Ser Arg Ser Glu Ile Asp Leu Leu Asp Ile 275 280 285 Arg Arg Glu Phe Lys Lys His Tyr Gly Cys Ser Leu Tyr Ser Ala Ile 290 295 300 Gln Ser Asp Thr Ser Gly Asp Tyr Arg Thr Val Leu Leu Lys Ile Cys 305 310 315 320 Gly Gly Asp Asp <210> 8 <211> 256 <212> PRT <213> Wistar Rat <400> 8 Met Asp Arg Arg Ser Arg Ala His Gln Trp Arg Arg Ala Arg His Asn 1 5 10 15 Tyr Asn Asp Leu Cys Pro Pro Ile Gly Arg Arg Ala Ala Thr Ala Leu 20 25 30 Leu Trp Leu Ser Cys Ser Ile Ala Leu Leu Arg Ala Leu Ala Ser Ser 35 40 45 Asn Ala Arg Ala Gln Gln Arg Ala Ala Gln Arg Arg Ser Phe Leu Asn 50 55 60 Ala His His Arg Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gln Val Leu Pro 65 70 75 80 Glu Ser Ser Glu Ser Glu Ser Asp His Glu His Glu Glu Ala Glu Pro 85 90 95 Glu Leu Ala Arg Pro Glu Cys Leu Glu Tyr Asp Gln Asp Asp Tyr Glu 100 105 110 Thr Glu Thr Asp Ser Glu Thr Glu Pro Glu Ser Asp Ile Gln Ser Glu 115 120 125 Thr Glu Phe Glu Thr Glu Pro Glu Thr Glu Pro Glu Thr Ala Pro Thr 130 135 140 Thr Glu Pro Glu Thr Glu Pro Glu Asp Glu Arg Gly Pro Arg Gly Ala 145 150 155 160 Thr Phe Asn Gln Ser Leu Thr Gln Arg Leu His Ala Leu Lys Leu Gln 165 170 175 Ser Ala Asp Ala Ser Pro Arg Arg Ala Gln Pro Thr Thr Gln Glu Pro 180 185 190 Glu Ser Ala Ser Glu Gly Glu Glu Pro Gln Arg Glu Pro Leu Asp Glu 195 200 205 Asp Pro Arg Asp Pro Glu Glu Ser Glu Glu Arg Arg Glu Ala Asn Arg 210 215 220 Gln Pro Arg Arg Cys Lys Thr Arg Arg Pro Ala Arg Arg Arg Asp Gln 225 230 235 240 Ser Pro Glu Ser Pro Pro Arg Lys Gly Pro Ile Pro Ile Arg Arg His 245 250 255

Claims (9)

  1. 정상 개체에 비하여 제1형 당뇨병성 신증 개체의 사구체에서 발현의 차이를 나타내는, 하기 폴리펩티드로 이루어진 군에서 선택되는 하나 또는 둘 이상의 조합인 것을 특징으로 하는 제1형 당뇨병성 신증 진단용 단백질성 마커 조성물:
    서열번호 1의 아미노산 서열을 가지고 24-26 kD의 분자량을 갖는 Glutathione peroxidase 3;
    서열번호 2의 아미노산 서열을 가지고 13-15 kD 분자량을 갖는 Histone H2A;
    서열번호 3의 아미노산 서열을 가지고 30-32 kD의 분자량을 갖는 Glycoprotein m6a;
    서열번호 4의 아미노산 서열을 가지고 14-16 kD의 분자량을 갖는 eukaryotic translation initiation factor 4, gamma 1 isoform a;
    서열번호 5의 아미노산 서열을 가지고 41-43 KD의 분자량을 갖는 alpha skeletal muscle;
    서열번호 6의 아미노산 서열을 가지고 21-23 kD의 분자량을 갖는 Peroxiredoxin-2;
    서열번호 7의 아미노산 서열을 가지고 35-37 kD의 분자량을 갖는 Annexin A3; 및
    서열번호 8의 아미노산 서열을 가지고 28-30 kD의 분자량을 갖는 Neuroendocrine secretory protein 55;
  2. 제 1항의 단백질성 마커의 존재 여부와, 그 양, 패턴 또는 양자 모두를 검출하는 물질을 포함하는 제1형 당뇨병성 신증 진단용 조성물.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 단백질성 마커의 존재 여부와, 그 양, 패턴 또는 양자 모두를 검출하는 물질은 제1형 당뇨병성 신증 진단용 단백질성 마커를 특이적으로 인식하는 항체인 것을 특징으로 하는 제1형 당뇨병성 신증 진단용 조성물.
  4. 제 1항의 단백질성 마커를 코딩하는 유전자의 발현 여부와, 그 발현량, 발현 패턴 또는 양자 모두를 검출하는 물질을 포함하는 제1형 당뇨병성 신증 진단용 조성물.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 단백질성 마커를 코딩하는 유전자의 발현 여부와, 그 발현량, 발현 패턴 또는 양자 모두를 검출하는 물질은 제1형 당뇨병성 신증 진단용 단백질성 마커를 코딩하는 유전자의 mRNA를 검출하기 위한 RT-PCR용 프라이머인 것을 특징으로 하는 제1형 당뇨병성 신증 진단용 조성물.
  6. 제 2항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 제1형 당뇨병성 신증 진단용 조성물을 포함하는 제1형 당뇨병성 신증 진단용 키트.
  7. 제1형 당뇨병성 신증 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자로부터 제 1항의 단백질성 마커를 검출하는 방법.
  8. 제 1항의 단백질성 마커를 발현하는 세포 또는 동물에 시험 화합물을 처리하는 단계, 및 시험 화합물이 상기 단백질성 마커의 생리학적 활성을 촉진 또는 억제하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 제1형 당뇨병성 신증 치료제의 스크리닝 방법.
  9. 정상 개체에 비하여 제1형 당뇨병성 신증 개체의 사구체에서 발현의 차이를 나타내는, 하기 폴리펩티드로 이루어진 군에서 선택되는 하나 또는 둘 이상의 조합인 것을 특징으로 하는 명백한 단백뇨 단계의 제1형 당뇨병성 신증 진단용 단백질성 마커 조성물:
    서열번호 5의 아미노산 서열을 가지고 41-43 KD의 분자량을 갖는 alpha skeletal muscle;
    서열번호 6의 아미노산 서열을 가지고 21-23 kD의 분자량을 갖는 Peroxiredoxin-2; 및
    서열번호 8의 아미노산 서열을 가지고 28-30 kD의 분자량을 갖는 Neuroendocrine secretory protein 55.
KR1020100054338A 2010-06-09 2010-06-09 제1형 당뇨병성 신증 진단용 단백질성 마커 KR101240208B1 (ko)

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