KR20210007180A - 당뇨병성 신증 진단용 조성물 - Google Patents

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KR20210007180A
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Abstract

본 발명은 소변 유래 소포 내에 포함되어 있는 마이크로 RNA 분석을 통하여 진행성 당뇨병성 신증을 예측 또는 진단하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 소변 유래 소포 내의 마이크로 RNA 분석을 수행하여 특정 마이크로 RNA의 발현 수준의 증감을 분석함으로써 진행성 당뇨병성 신증의 발병 위험도를 예측하거나 진단하는 방법에 관한 것이다.

Description

당뇨병성 신증 진단용 조성물{A composition for diagnosing diabetic nephropathy}
본 발명은 당뇨병성 신증 진단용 조성물, 상기 조성물을 이용한 당뇨병성 신증 진단에 관한 정보 제공 방법 등에 관한 것으로, 보다 자세하게는 소변 유래 소포 내의 마이크로 RNA를 이용한 당뇨병성 신증을 진단하는 방법 등에 관한 것이다.
당뇨병은 혈중 포도당 농도가 비정상적으로 상승된 상태로 장기간 지속되는 것을 특징으로 하는 일련의 대사이상을 지칭하는 질환으로, 생활의 서구화와 비만증의 증가로 인하여 2030 년 이후에는 국내 5백 20만 명 포함, 전 세계적으로는 5억 9천만 명까지 증가할 것으로 예측되고 있다. 대다수의 당뇨병 환자들은 혈당이 적절히 조절되지 않더라도 특별한 증상을 느끼지 못하는 경우가 많이 있으며, 당장 심각한 증상이 나타나지 않으므로 당뇨병에 의한 합병증의 심각성을 잘 인지하지 못할 때가 많다. 당뇨병에 의한 합병증으로는 신증(신장), 미세혈관 합병증, 대혈관 합병증 등이 있으며, 이 중 대혈관 합병증의 경우에는 약제와 의학의 발달로 증가 추세가 둔화된 반면, 당뇨병성 신증에 의한 말기신부전증(end state renal disease; ESRD)의 발생은 오히려 증가되는 추세를 보이고 있다.
당뇨병성 신증은 만성신장질환(chronic kidney disease; CKD)의 대표질환으로서 말기신부전증의 약 50 % 정도가 당뇨병성 신증에 의한 것임을 감안하면 매우 중대한 질환이다. 현재 국내에는 약 7만 여명의 말기신부전증 환자가 투석치료를 받고 있으며 이들이 차지하는 의료 비용은 신장 질환이 없는 환자와 비교하여 10배 이상을 차지하고 있으며, 말기신부전증 환자의 5 년 생존율은 40 % 미만으로서, 일반인의 사망률에 비하여 30 배 이상 높다. 따라서, 말기신부전증을 예방하기 위해서는, 진행성 당뇨병성 신증을 조기에 진단하는 것이 매우 중요하기 때문에 진단을 위한 다양한 방법의 개발이 활발히 이루어지고 있다.
이러한 당뇨병성 신증을 진단하거나 진행을 예측하는 방법으로는 신장 조직 검사, 사구체 여과율을 직접 측정하거나 추정 사구체 여과율을 계산하는 방법, 알부민뇨를 측정하는 방법 등이 있으나, 조직 검사는 현실적으로 모든 당뇨병성 신증 환자에 적용하는 것은 불가능하기 때문에 일반적으로 사용하기에는 어려움이 있으며, 추정 사구체 여과율은 몇 년에 걸쳐 종적 추정을 진행해야하기 때문에 진단까지 긴 시간이 소요된다는 한계점이 있다. 또한 알부민뇨는 변이가 있거나 알부민뇨 증상 없이 당뇨병성 신증으로 진행되는 경우가 많아, 진단 정확성이 떨어진다는 한계점이 있다.
따라서, 이러한 한계점을 극복하기 위하여, uric acid, TNFR1, TNFR2, FGF23 등과 같은 바이오 마커가 개발되었으나, 이러한 바이오 마커들도 알부민뇨나 추정 사구체 여과율로 보정하면, 신기능 감소 또는 말기신부전증 발생에 대한 예측도가 현저히 감소되기 때문에, 실질적으로 진행성 당뇨병성 신증을 진단하는 데는 적용되기 어려움이 있다.
따라서, 진단 정확성이 증가된 진행성 당뇨병성 신증을 진단할 수 있는 신규 바이오 마커가 개발된다면, 말기신부전증으로 진행되는 것을 조기에 예방 또는 치료함으로써, 이로 인한 사망률 및 의료 비용을 현저히 낮출 수 있을 것으로 기대된다.
국내등록특허 10-1240208
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 소변으로부터 분리된 소포 내에 포함되어 있는 마이크로 RNA 중 hsa-let-7a-5p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-1246, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-187-3p, 및 hsa-miR-1290으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 마이크로 RNA 또는 이의 단편의 발현 수준의 변화를 측정하는 단계를 포함하는 진행성 당뇨병성 신증의 진단 방법, 상기 마이크로 RNA 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 유효성분으로 포함하는 진행성 당뇨병성 신증 진단용 조성물, 및 진단용 키트 등을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 (a) 생물학적 시료로부터 분리된 소포(extracellular vesicles)로부터 마이크로 RNA를 추출하는 단계; (b) 상기 추출된 마이크로 RNA 내에서 hsa-let-7a-5p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-1246, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-187-3p, 및 hsa-miR-1290으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 마이크로 RNA 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 발현 수준이 대조군과 비교하여 증가 또는 감소되었을 때 진행성 당뇨병성 신증으로 분류하는 단계를 포함하는 진행성 당뇨병성 신증의 예측 또는 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 생물학적 시료는 바람직하게는 소변 또는 혈액일 수 있으며, 상기 혈액은 혈장이나 혈청일 수 있으나, 마이크로 RNA가 포함된 소포를 가지고 있는 시료라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구체예에 있어서, 상기 대조군은 정상인 또는 진행성 당뇨병성 신증을 가지고 있지 않은 당뇨병 환자인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 발현 수준을 측정하는 단계는 바람직하게는 역전사효소 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소연쇄반응(competitive RT-PCR), 실시간 정량 역전사효소 중합효소연쇄반응(real-time quantitative RT-PCR; qRT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting), 유전자 칩, 차세대염기서열분석(next generation sequencing) 등일 수 있으며, 가장 바람직하게는 차세대염기서열분석(next generation sequencing) 방법이나, 마이크로 RNA의 발현 수준을 측정하는 방법이라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 (c) 단계는 바람직하게는 hsa-let-7a-5p, hsa-miR-146a-5p, 및 hsa-miR-1246으로 이루어진 군으로부터 선택된 두 개 이상의 마이크로 RNA 또는 이의 단편의 발현 수준이 대조군과 비교하여 증가 또는 감소되었을 때 진행성 당뇨병성 신증으로 분류할 수 있으며, 또는 hsa-miR-142-5p, hsa-miR-187-3p, 및 hsa-miR-1290으로 이루어진 군으로부터 선택된 두 개 이상의 마이크로 RNA 또는 이의 단편의 발현 수준이 대조군과 비교하여 증가 또는 감소되었을 때 진행성 당뇨병성 신증으로 분류할 수 있으며, 또는 hsa-miR-142-5p, hsa-miR-187-3p, 및 hsa-miR-1246으로 이루어진 군으로부터 선택된 두 개 이상의 마이크로 RNA 또는 이의 단편의 발현 수준이 대조군과 비교하여 증가 또는 감소되었을 때 진행성 당뇨병성 신증으로 분류할 수 있으나, hsa-let-7a-5p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-1246, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-187-3p, 및 hsa-miR-1290의 조합이라면 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 hsa-let-7a-5p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-1246, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-187-3p, 및 hsa-miR-1290으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 마이크로 RNA 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 유효성분으로 포함하는 소포를 이용한 진행성 당뇨병성 신증 예측 또는 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 hsa-let-7a-5p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-1246, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-187-3p, 및 hsa-miR-1290으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 마이크로 RNA 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 유효성분으로 포함하는 소포를 이용한 진행성 당뇨병성 신증 예측 또는 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 소포는 소변 또는 혈액으로부터 분리된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구체예에 있어서, 상기 키트는 소포로부터 마이크로 RNA를 분리하는 물질을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 진행성 당뇨병성 신증 진단을 위한 정보 제공 방법은 소변으로부터 분리된 소포 내의 마이크로 RNA를 이용하기 때문에 모든 환자에 적용이 용이할 뿐만 아니라, 비침습적 방법으로 높은 정확성을 가지고 진행성 당뇨병성 신증을 조기에 진단할 수 있다. 진행성 당뇨병성 신증은 말기 신장 질환의 가장 중요한 위험인자이며 진행을 평가하여 조기부터 적극적이고 포괄적인 관리를 하는 것이 무엇보다도 중요한데, 본 발명의 비침습적 바이오 마커는 진행성 당뇨병성 신증을 조기에 정확히 예측 및 진단할 수 있기 때문에, 말기신부전증으로 진행될 수 있는 고위험군 환자를 조기에 예측할 수 있다. 또한, 이를 통하여 적극적이고 포괄적인 관리를 통하여 말기신부전증으로 진행되는 것을 조기에 예방 또는 치료함으로써, 이로 인한 합병증, 사망률 및 의료 비용을 현저히 낮출 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 다양한 소포 추출법에 따라 소변으로부터 추출된 소포를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 다양한 소포 추출법에 따라 추출된 소포가 exosomal marker를 가지고 있는지 웨스턴 블롯팅으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 소변으로부터 추출된 소포 내에 포함되어 있는 작은 크기의 RNA(A) 및 큰 크기의 RNA(B)의 크기를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 소변으로부터 추출된 소포 내에 포함되어 있는 마이크로 RNA의 프로파일을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 hsa-let-7a-5p, hsa-miR-146a-5p, 및 hsa-miR-1246 마이크로 RNA의 진단학적 유의성을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 hsa-let-7a-5p, hsa-miR-146a-5p, 및 hsa-miR-1246 마이크로 RNA 발현 수준의 증감에 따른 진단학적 유의성을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 hsa-let-7a-5p, hsa-miR-146a-5p, 및 hsa-miR-1246 마이크로 RNA의 ROC 커브를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 hsa-let-7a-5p, hsa-miR-146a-5p, 및 hsa-miR-1246 마이크로 RNA의 진행성 당뇨병성 신증 진단을 위한 결정 트리를 나타낸 도면이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 hsa-miR-142-5p, hsa-miR-187-3p, 및 hsa-miR-1290 마이크로 RNA의 진단학적 유의성을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 hsa-miR-142-5p, hsa-miR-187-3p, 및 hsa-miR-1290 마이크로 RNA 발현 수준의 증감에 따른 진단학적 유의성을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 hsa-miR-142-5p, hsa-miR-187-3p, 및 hsa-miR-1290 마이크로 RNA의 ROC 커브를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 hsa-miR-142-5p, hsa-miR-187-3p, 및 hsa-miR-1290 마이크로 RNA의 진행성 당뇨병성 신증 진단을 위한 결정 트리를 나타낸 도면이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 hsa-miR-142-5p, hsa-miR-187-3p, 및 hsa-miR-1246 마이크로 RNA의 진단학적 유의성을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 hsa-miR-142-5p, hsa-miR-187-3p, 및 hsa-miR-1246 마이크로 RNA 발현 수준의 증감에 따른 진단학적 유의성을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 hsa-miR-142-5p, hsa-miR-187-3p, 및 hsa-miR-1246 마이크로 RNA의 ROC 커브를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 hsa-miR-142-5p, hsa-miR-187-3p, 및 hsa-miR-1246 마이크로 RNA의 진행성 당뇨병성 신증 진단을 위한 결정 트리를 나타낸 도면이다.
본 발명은 당뇨병 환자의 소변 유래 소포 내에 포함되어 있는 마이크로 RNA 분석을 통하여 진행성 당뇨병성 진증을 조기에 진단하거나 예측하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명자들은 피검자의 소변 시료를 이용하여 소변 유래 소포로부터 마이크로 RNA를 추출하고, 이에 대하여 분석을 수행하여 진행성 당뇨병성 신증의 바이오 마커로 활용할 수 있는 소변 유래 소포 내의 마이크로 RNA를 발굴하고 qRT-PCR을 통하여 확인하였다.
이에, 본 발명자들은 (a) 생물학적 시료로부터 분리된 소포(extracellular vesicles)로부터 마이크로 RNA를 추출하는 단계; (b) 상기 추출된 마이크로 RNA 내에서 hsa-let-7a-5p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-1246, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-187-3p, 및 hsa-miR-1290으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 마이크로 RNA 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 발현 수준이 대조군과 비교하여 증가 또는 감소되었을 때 진행성 당뇨병성 신증으로 분류하는 단계를 포함하는 진행성 당뇨병성 신증 진단을 위한 정보 제공 방법, hsa-let-7a-5p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-1246, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-187-3p, 및 hsa-miR-1290으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 마이크로 RNA 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 유효성분으로 포함하는, 소포를 이용한 진행성 당뇨병성 신증 진단용 조성물, 상기 진단용 조성물을 포함하는 소포를 이용한 진행성 당뇨병성 신증 진단용 키트를 제공한다.
본 명세서에 있어서 "생물학적 시료(biological sample)"란, 비침습적으로 획득될 수 있는 시료로서, 소포를 포함하고 있는 모든 시료를 의미하며, 바람직하게는 혈액, 혈장, 혈청, 골수, 조직, 세포, 타액, 객담, 머리카락, 소변, 대변 등일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 혈액, 또는 소변이나, 마이크로 RNA를 포함하고 있는 소포를 가지고 있는 시료라면 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 있어서, "소포(extracellular vesicle)"란 다양한 세포로부터 분비되는 나노 크기의 막으로 된 구조물을 의미하며, 본 발명에서는 세포로부터 자연적으로 분비되거나, 인공적으로 생산된, 소변 또는 혈액 내에 포함되어 있는 막으로 된 모든 구조물을 총칭한다. 이러한 소포는 세포밖 소포체, 세포외 소포체, 세포외 소포, 엑소좀, 나노소포, 나노베지클, 미세소포체, 미세소포 등과 혼용되어 사용될 수 있다. 상기 소포는 대략 30 내지 200 nm의 직경을 가지고 있으며, 소포 내에는 세포로부터 유래된 다양한 종류의 단백질, DNA, mRNA, 마이크로 RNA 등이 포함되어 있다. 상기 소포는 소변 또는 혈액으로부터 원심분리, 초고속원심분리, 고압처리, 압출, 초음파분해, 세포 용해, 균질화, 냉동-해동, 전기천공, 기계적 분해, 화학물질 처리, 필터에 의한 여과, 겔 여과 크로마토그래피, 프리-플로우 전기영동, 및 모세관 전기영동으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 방법을 사용하여 분리할 수 있다. 또한, 불순물의 제거를 위한 세척, 수득된 소포의 농축 등의 과정을 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에 있어서, "마이크로 RNA(micro RNA; miRNA)"는 약 10 내지 30 개의 뉴클레오티드로 구성되는 작은 비암호(non-coding) RNA 분자를 총칭한다. 이러한 마이크로 RNA는 식물, 동물, 바이러스 등에서 내인적으로 관찰되 전사(transcription) 후 유전자 발현, RNA 억제(silencing)에 관여하여 단백질의 생산을 조절하는 것으로 알려져 있다.
본 명세서에 있어서 "정보 제공 방법(method for providing information)”이란, 당뇨병 환자에서 진행성 당뇨병성 신증이 발병할 가능성이 있는지, 또는 진행성 당뇨병성 신증이 발병할 가능성이 상대적으로 높은지, 또는 진행성 당뇨병성 신증이 이미 발병하였는지에 대한 정보를 제공하는 방법으로서, 상기 방법을 통하여 진행성 당뇨병성 신증이 발병으로 이한 말기신부전증 유발 위험성, 즉, 고위험군에 대해서도 예측할 수 있으며, 이를 말기신부전증의 예방 및 치료에 관한 정보를 제공하는 방법으로서도 사용할 수도 있다.
본 명세서에 있어서 “마이크로 RNA의 발현 수준을 측정하는 방법”은 진행성 당뇨병성 신증을 예측 또는 진단하기 위하여 소변 유래 소포 내에 포함되어 있는 hsa-let-7a-5p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-1246, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-187-3p, 및/또는 hsa-miR-1290 마이크로 RNA의 양을 측정함으로써 확인할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 정량 RT-PCR(Real-time qRT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(northern blotting), DNA 마이크로어레이 칩, Luminex를 이용한 Target-Specific PCR sequence detection with MagPlex®™Microsphere 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에 있어서, "키트(kit)"란 소변 유래 소포 내에 포함되어 있는 hsa-let-7a-5p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-1246, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-187-3p, 및/또는 hsa-miR-1290 마이크로 RNA의 양을 측정하여 진행성 당뇨병성 신증의 발병 여부를 예측할 수 있는 검진용 기기를 의미하며, 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 상기 마이크로 NA 양을 측정할 수 있는 형태라면 제한이 없다. 바람직하게는 상기 마이크로 RNA에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브(probe) 또는 프라이머(primer) 세트를 포함할 수 있으며, 상기 "프로브 또는 프라이머"는 상기 마이크로 RNA 또는 이의 단편에 상보적인 서열을 가지는 올리고뉴클레오타이드(oliogonucleotide)를 의미하나, 상기 마이크로 RNA 또는 이의 단편의 양을 측정할 수 있는 물질이라면 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 있어서, “단편(fragment)”이란 마이크로 RNA의 서열과 비교하여 일부가 결실되거나, 또는 일부가 추가되거나, 또는 마이크로 RNA 서열과 상응하는 위치와 동일한 서열의 분절을 포함하는 것일 수 있으며, 본 발명의 마이크로 RNA 발현 수준을 측정할 수 있는 서열이라면 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1: 소변으로부터 소포 추출
소변으로부터 추출된 소포를 진단에 사용 가능한지 확인하기 위하여, 제2형 당뇨병 환자의 소변으로부터 다양한 방법을 이용하여 소포(extracellular vesicle)를 추출하였다.
1.1. 초원심분리법(ultracentrifugation)
일차적으로 소변 내에 포함되어 있는 파편(debris)들을 제거하기 위하여, 100 mL의 소변을 50 mL의 튜브에 나누어 담고, 2,000 g, 4 ℃의 조건으로 20 분 동안 원심분리하고, 상층액을 수거하여 새로운 50 mL의 튜브에 옮겨 담았다. 이후 큰 막 소포(large membrane vesicle)를 제거하기 위하여, 13,500 g, 4 ℃의 조건으로 20 분 동안 원심분리하고, 상층액을 다시 새로운 튜브로 옮겨 담았다. 그리고 200,000 g, 4 ℃의 조건으로 60 분 동안 초고속 원심분리를 실시하고 상층액을 제거하여, 소포 펠릿(pellet)을 획득하였다. 획득된 소포 펠릿은 400 μL의 인산염완충용액(phosphate buffered saline; PBS)을 이용하여 재부유시킨 후에 사용하기 전까지 -80 ℃에서 보관하였다.
1.2. 침전법(Precipitation)
일차적으로 소변 내에 포함되어 있는 파편(debris)들을 제거하기 위하여, 100 mL의 소변을 50 mL의 튜브에 나누어 담고, 2,000 g, 4 ℃의 조건으로 20 분 동안 원심분리하고, 상층액을 수거하여 새로운 50 mL의 튜브에 옮겨 담았다. 이후 큰 막 소포(large membrane vesicle)를 제거하기 위하여, 13,500 g, 4 ℃의 조건으로 20 분 동안 원심분리하고, 획득된 상층액은 0.22 μm 필터를 이용하여 여과하였다. 그리고 amicon tube(100 K)를 이용하여 5 mL로 농축시켰다. 농축된 5 mL의 소변 시료에 1 mL의 ExoQuick-TC 용액을 첨가하고 혼합한 후에, 4 ℃에서 16 시간 동안 반응시켜 소포 펠릿을 획득하였다. 획득된 소포 펠릿은 400 μL의 인산염완충용액(phosphate buffered saline; PBS)을 이용하여 재부유시킨 후에 사용하기 전까지 -80 ℃에서 보관하였다.
1.3. 크로마토그래피법(Chromatography)
일차적으로 소변 내에 포함되어 있는 파편(debris)들을 제거하기 위하여, 100 mL의 소변을 50 mL의 튜브에 나누어 담고, 2,000 g, 4 ℃의 조건으로 20 분 동안 원심분리하고, 상층액을 수거하여 새로운 50 mL의 튜브에 옮겨 담았다. 이후 큰 막 소포(large membrane vesicle)를 제거하기 위하여, 13,500 g, 4 ℃의 조건으로 20 분 동안 원심분리하고, 획득된 상층액은 0.22 μm 필터를 이용하여 여과하였다. 그리고 amicon tube(100 K)를 이용하여 500 μL로 농축시켰다. 그리고 qEV 컬럼에 10 mL의 인산염완충용액을 주입한 뒤에, 500 μL로 농축시킨 시료를 주입하였다. 그리고 인산염완충용액을 1 mL씩 연속적으로 주입하며, 컬럼을 통과하여 나온 용액을 회수하였다. 회수 방법은 fraction 1에서 5까지는 2.5 mL씩 회수하였고, 이후 fraction 15까지는 500 μ씩 회수하였다. 그리고 소포가 포함되어 있는 fraction 7 내지 11은 사용하기 전까지 -80 ℃에서 보관하였다.
1.4. 한외여과법(Ultrafiltration)
일차적으로 소변 내에 포함되어 있는 파편(debris)들을 제거하기 위하여, 100 mL의 소변을 50 mL의 튜브에 나누어 담고, 2,000 g, 4 ℃의 조건으로 20 분 동안 원심분리하고, 상층액을 수거하여 새로운 50 mL의 튜브에 옮겨 담았다. 이후 큰 막 소포(large membrane vesicle)를 제거하기 위하여, 13,500 g, 4 ℃의 조건으로 20 분 동안 원심분리하고, 획득된 상층액은 0.22 μm 필터를 이용하여 여과하였다. 그리고 amicon tube(100 K)를 이용하여 400 μL로 농축시킨 후, 사용하기 전까지 -80 ℃에서 보관하였다.
실시예 2: 소변으로부터 추출된 소포의 확인
실시예 1과 동일한 방법으로 추출된 소포를 Malvern NanoSight NS300 장비를 이용하여 확인하였다. 그 결과는 도 1에 나타내었다. 또한, 추출된 소포를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 실시하였다. 그 결과는 도 2에 나타내었다.
도 1에 나타난 바와 같이, 각 추출법들 모두에서 100 내지 300 nm의 직경을 가진 소포가 추출되었다는 것을 확인하였다.
또한 도 2에 나타난 바와 같이, 소변으로부터 추출된 소포가 모두 exosomal marker인 CD-9, TSG101, 및 베타-액틴을 포함하고 있는 것을 확인하였다.
상기 결과들을 통하여, 소변으로부터 정상적으로 소포가 분리되었다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 소변으로부터 추출된 소포 내에 포함된 RNA 확인
소변으로부터 추출된 소포 내에 마이크로 RNA(micro RNA; miRNA)가 포함되어 있는지 확인하기 위하여, miRNeasy Serum/Plasma Kit(Qiagen)를 이용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 추출한 소포로부터 RNA를 추출하였다. 그리고 추출된 RNA는 Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies)를 이용하여 크기를 확인하였다. 200 nt 이하의 작은 크기의 RNA는 Agilent Small RNA Kit를 이용하여 그 크기를 측정하였으며, 그 결과는 도 3A에 나타내었다. 또한, 약 4,200 nt 정도의 큰 크기의 RNA는 Agilent RNA 6000 Pico Kit로 측정하였으며, 그 결과는 도 3B에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 500 nt 이상의 RNA는 포함되지 않은 반면, 200 nt 이하의 small RNA가 소포에 포함되어 있는 것을 확인하였다.
실시예 4: 소변으로부터 추출된 소포 내에 포함된 마이크로 RNA 프로파일 확인
4.1. 진행성 당뇨병성 신증 환자의 소변으로부터 추출된 소포 내의 마이크로 RNA 프로파일 확인
제2형 당뇨병 환자 중에서 진행성 당뇨병성 신증이 있다고 판단되는 환자의 소변으로부터 추출된 소포 내의 마이크로 RNA의 프로파일을 확인하기 위하여, 차세대염기서열분석(next generation sequencing; NGS)을 실시하였다. 그 결과는 도 4에 나타내었다.
도 4A에 나타난 바와 같이, 초원심분리법(UC)으로 추출한 소포에서는 314 종류의 마이크로 RNA가 검출되었으며, 크로마토그래피법(qEV)으로 추출한 소포에서는 174 종류의 마이크로 RNA가 검출되었다. 또한, 침전법(Exoquick)으로 추출한 소포에서는 91 종류의 마이크로 RNA가 검출되었으며, 한외여과법(Amicon)으로 추출한 소포에서는 130 종류의 마이크로 RNA가 검출되었다.
또한 도 4B에 나타난 바와 같이, 모든 추출법에서 동일하게 검출된 마이크로 RNA는 57 종류였다.
4.2. 진행성 당뇨병성 신증을 예측할 수 있는 마이크로 RNA 확인
진행성 당뇨병성 신증을 예측할 수 있는 마이크로 RNA를 확인하기 위하여, 실험군으로는 제2형 당뇨병 환자 중에서 진행성 당뇨병성 신증이 있다고 판단되는 환자 60 명의 소변으로부터 추출된 소포 내의 마이크로 RNA를 이용하였다. 그리고 대조군으로는 제2형 당뇨병 환자 중에서 비진행성 당뇨병성 신증이 있거나, 신증이 없다고 판단되는 환자 58 명의 소변으로부터 추출된 소포 내의 마이크로 RNA를 이용하였다. 각각의 마이크로 RNA를 차세대염기서열분석법으로 확인하여, 대조군과 실험군에서 유의성있는 차이를 보이는 마이크로 RNA를 확인하였다.
그 결과, hsa-let-7a-5p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-1246, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-187-3p, 및 hsa-miR-1290의 마이크로 RNA의 프로파일에서 유의성있는 차이를 나타내는 것을 확인하였다. 각각의 마이크로 RNA 서열은 표 1에 나타내었다.
miRNA Sequence 서열번호
hsa-let-7a-5p ugagguaguagguuguauaguu 1
hsa-miR-146a-5p ugagaacugaauuccauggguu 2
hsa-miR-1246 aauggauuuuuggagcagg 3
hsa-miR-142-5p cauaaaguagaaagcacuacu 4
hsa-miR-187-3p ucgugucuuguguugcagccgg 5
hsa-miR-1290 uggauuuuuggaucaggga 6
4.3. 진행성 당뇨병성 신증을 예측할 수 있는 마이크로 RNA 검증
실시예 4.2에서 확인된 6 개의 마이크로 RNA의 조합을 이용하여 진행성 당뇨병성 신증의 진단 예측 정확성을 높일 수 있는지 확인하기 위하여, 각각의 마이크로 RNA의 발현 정도 및 이의 조합을 이용한 진단 예측 정확성은 차세대염기서열분석법을 이용하여 확인하였다.
hsa-let-7a-5p, hsa-miR-146a-5p, 및 hsa-miR-1246의 조합에 대한 진단 예측 정확성 결과는 도 5 내지 7에 나타내었다. 예측 모델을 위한 결정 트리(decision tree)는 도 8에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, hsa-let-7a-5p, hsa-miR-146a-5p, 및 hsa-miR-1246는 진행성 당뇨병성 신증의 진단 예측에 있어서 유의성있는 결과를 나타낸다는 것을 확인하였다. 그리고 도 6에 나타난 바와 같이, has-miR-146a-5p 및 has-miR-1246은 진행성 당뇨병성 신증 환자에서 유의성있게 증가되며, has-let-7a-5p는 감소되는 것을 확인하였다. 또한, 도 7에 나타난 바와 같이, ROC 커브를 통하여, 평균 77 %의 진단 정확성을 나타내는 것을 확인하였다.
hsa-miR-142-5p, hsa-miR-187-3p, 및 hsa-miR-1290의 조합에 대한 진단 예측 정확성 결과는 도 9 내지 11에 나타내었다. 예측 모델을 위한 결정 트리(decision tree)는 도 12에 나타내었다.
도 9에 나타난 바와 같이, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-187-3p, 및 hsa-miR-1290는 진행성 당뇨병성 신증의 진단 예측에 있어서 유의성있는 결과를 나타낸다는 것을 확인하였다. 그리고 도 10에 나타난 바와 같이, hsa-miR-142-5p 및 hsa-miR-1290은 진행성 당뇨병성 신증 환자에서 유의성있게 증가되며, hsa-miR-187-3p는 감소되는 것을 확인하였다. 또한, 도 11에 나타난 바와 같이, ROC 커브를 통하여, 평균 85 %의 진단 정확성을 나타내는 것을 확인하였다.
hsa-miR-142-5p, hsa-miR-187-3p, 및 hsa-miR-1246의 조합에 대한 진단 예측 정확성 결과는 도 13 내지 15에 나타내었다. 예측 모델을 위한 결정 트리(decision tree)는 도 16에 나타내었다.
도 13에 나타난 바와 같이, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-187-3p, 및 hsa-miR-1246은 진행성 당뇨병성 신증의 진단 예측에 있어서 유의성있는 결과를 나타낸다는 것을 확인하였다. 그리고 도 14에 나타난 바와 같이, hsa-miR-142-5p 및 hsa-miR-1246은 진행성 당뇨병성 신증 환자에서 유의성있게 증가되며, hsa-miR-187-3p는 감소되는 것을 확인하였다. 또한, 도 15에 나타난 바와 같이, ROC 커브를 통하여, 평균 86 %의 진단 정확성을 나타내는 것을 확인하였다.
상기 결과들을 통하여, 본 발명의 차세대염기서열분석법을 이용한 진단 방법은 소변, 혈청 등의 용이하게 획득이 가능한 생물학적 시료로부터 분리된 소포에 포함되어 있는 hsa-let-7a-5p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-1246, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-187-3p, 및 hsa-miR-1290 마이크로 RNA를 이용함으로써, 모든 환자에게 적용이 용이할 뿐만 아니라, 높은 진단 정확성을 가지고 있기 때문에 진행성 당뇨병성 신증의 예측 또는 진단에 효과적으로 사용하여, 말기신부전증으로 진행될 수 있는 고위험군 환자를 조기에 예측하여 적극적이고 포괄적인 관리를 통하여 말기신부전증으로 진행되는 것을 조기에 예방 또는 치료함으로써, 이로 인한 합병증, 사망률 및 의료 비용을 현저히 낮출 수 있을 것으로 기대된다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
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Claims (12)

  1. (a) 생물학적 시료로부터 분리된 소포(extracellular vesicles)로부터 마이크로 RNA를 추출하는 단계;
    (b) 상기 추출된 마이크로 RNA 내에서 hsa-let-7a-5p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-1246, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-187-3p, 및 hsa-miR-1290으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 마이크로 RNA 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 발현 수준이 대조군과 비교하여 증가 또는 감소되었을 때 진행성 당뇨병성 신증으로 분류하는 단계를 포함하는, 진행성 당뇨병성 신증의 예측 또는 진단을 위한 정보 제공 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 소변 또는 혈액인 것을 특징으로 하는, 정보 제공 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 대조군은 정상인 또는 진행성 당뇨병성 신증을 가지고 있지 않은 당뇨병 환자인 것을 특징으로 하는, 정보 제공 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 발현 수준을 측정하는 단계는 차세대염기서열분석(next generation sequencing), 역전사효소 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소연쇄반응(competitive RT-PCR), 실시간 정량 역전사효소 중합효소연쇄반응(real-time quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting), 및 유전자 칩으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 방법으로 측정하는 것을 특징으로 하는, 정보 제공 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 (c) 단계는 hsa-let-7a-5p, hsa-miR-146a-5p, 및 hsa-miR-1246으로 이루어진 군으로부터 선택된 두 개 이상의 마이크로 RNA의 발현 수준이 대조군과 비교하여 증가 또는 감소되었을 때 진행성 당뇨병성 신증으로 분류하는 것을 특징으로 하는, 정보 제공 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 (c) 단계는 hsa-miR-142-5p, hsa-miR-187-3p, 및 hsa-miR-1290으로 이루어진 군으로부터 선택된 두 개 이상의 마이크로 RNA의 발현 수준이 대조군과 비교하여 증가 또는 감소되었을 때 진행성 당뇨병성 신증으로 분류하는 것을 특징으로 하는, 정보 제공 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 (c) 단계는 hsa-miR-142-5p, hsa-miR-187-3p, 및 hsa-miR-1246으로 이루어진 군으로부터 선택된 두 개 이상의 마이크로 RNA의 발현 수준이 대조군과 비교하여 증가 또는 감소되었을 때 진행성 당뇨병성 신증으로 분류하는 것을 특징으로 하는, 정보 제공 방법.
  8. hsa-let-7a-5p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-1246, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-187-3p, 및 hsa-miR-1290으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 마이크로 RNA 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 유효성분으로 포함하는, 소포를 이용한 진행성 당뇨병성 신증 예측 또는 진단용 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 소포는 소변 또는 혈액으로부터 분리된 것을 특징으로 하는, 예측 또는 진단용 조성물.
  10. hsa-let-7a-5p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-1246, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-187-3p, 및 hsa-miR-1290으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 마이크로 RNA 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 유효성분으로 포함하는, 소포를 이용한 진행성 당뇨병성 신증 예측 또는 진단용 키트.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 소포는 소변 또는 혈액으로부터 분리된 것을 특징으로 하는, 예측 또는 진단용 키트.
  12. 제 10 항에 있어서,
    상기 키트는 소포로부터 마이크로 RNA를 분리하는 물질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 예측 또는 진단용 키트.
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