KR20240054437A - 패혈증 진단 또는 예후 예측용 신규 바이오마커 및 이의 용도 - Google Patents

패혈증 진단 또는 예후 예측용 신규 바이오마커 및 이의 용도 Download PDF

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이진영
신범수
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Abstract

본 발명은 패혈증 진단 또는 예후 예측용 신규 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 패혈증을 진단하거나 패혈증 예후를 예측할 수 있는 신규 바이오마커를 발굴함으로써 패혈증 진단 또는 예후 예측용 조성물 및 키트를 제공할 수 있으며, 나아가 환자의 패혈증으로의 진행 여부 또는 패혈증의 치료 예후를 신속하고 정확하게 진단하여 환자 상태에 맞는 치료법을 제공할 수 있다.

Description

패혈증 진단 또는 예후 예측용 신규 바이오마커 및 이의 용도{Novel biomarkers for diagnosis or predicting prognosis of sepsis and uses thereof}
본 발명은 패혈증 진단 또는 예후 예측용 신규 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것이다.
패혈증(Sepsis)은 미생물 감염에 대한 숙주의 비정상적인 반응으로 발병하는 장기 기능 장애로, 사망에까지 이를 수 있는 급성 중증 질환이다. 패혈증 증상은 발병 부위에 따라 고열, 호흡 증가, 어지러움 등 다양하지만 점차 진행되면서 세동맥 혈관이 확장되고 혈압 상승제에 반응하지 않아 저혈압이 동반되면서 의식을 잃고 쓰러지게 된다. 패혈증의 치사율은 약 30% 정도이며 심각한 경우 약 50%까지 높아지고, 패혈성 쇼크(septic shock)가 오는 경우 80%의 치사율을 나타낸다. 패혈증 사망률은 2020년 기준 10만 명당 11.9명으로 전년도 대비 1% 증가하였으며, 진단, 모니터링 및 치료의 발전에도 불구하고 여전히 높은 수준이다. 특히 고령화 사회로 접어들면서 패혈증과 같은 고령 관련 질환의 사망률이 증가하는 추세이며, 이러한 패혈증은 원내 사망의 큰 부분을 차지한다.
하지만 패혈증에 대한 특이적인 진단법이 없다. 패혈증 진단은 환자의 체온, 맥박수, 호흡수, 혈압, 혈액 검사상의 백혈구 수치 등을 종합하여 판단해야 하며, 패혈증의 원인이 될 수 있는 감염증이 있는지를 확인하기 위해 혈액 배양 검사가 필수적이다. 혈액 배양 검사는 혈액 채취 후 일반적으로 3 ~ 5일 정도의 시간이 소요되기 때문에 신속한 항생제 투여가 필요한 패혈증 치료에서 적절한 치료 시기를 놓칠 우려가 있다.
최근에는 패혈증을 조기에 인식하고 환자를 보다 정확하게 분류하기 위해 표현형을 식별하고 분류를 개선하는데 도움이 되는 생물학적 마커, 즉 바이오마커(biomarker) 발굴에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 현재 혈중 젖당(lactate). C 반응성 단백(C-reactive protein, CRP), 프로칼시토닌(procalcitonin) 등의 분자를 통해 패혈증에 의한 장기 부전을 판정하고 환자의 임상 과정을 평가하고 있다. 그러나 이러한 바이오마커는 패혈증의 복잡한 조절 메커니즘을 설명하는데 있어 특이성과 민감도가 제한적이다.
따라서 종래 진단법을 보완하면서 신속하고 정확하게 패혈증을 진단하거나 예후를 예측할 수 있는 새로운 바이오마커 발굴 및 이를 이용한 진단법 개발이 여전히 요구되고 있다.
대한민국 등록특허공보 제10-1638778호 대한민국 등록특허공보 제10-1869509호
본 발명의 일 양상은 패혈증 진단 또는 예후 예측용 조성물 및 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 패혈증의 진단 또는 예후 예측을 위한 정보의 제공 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 양상은 hsa-let-7f-5p, miR-301a-3p 및 miR-331-3p로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 miRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 패혈증 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용된 "패혈증"은 상처나 염증 부위에 있던 세균이나 곰팡이, 바이러스 등이 혈액을 타고 퍼지면서 전신에 염증을 일으키는 병으로, 패혈증 증세가 나타났을 때 신속하고 적절한 치료가 이루어지지 않으면 독성물질이 온몸에 퍼져 짧은 시간 내에 사망에 이를 수 있다. 하지만 패혈증을 조기 진단하거나 치료법에 대한 예후를 예측하는데 활용 가능한, 우수한 특이성 및 민간도를 가지는 바이오마커가 없는 실정이다.
본 발명에서 사용된 "진단"은 아직 진단되지 않거나 진단을 받은 개체를 대상으로 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명에서의 진단은 바이오마커를 이용하여 패혈증으로의 진행 가능성을 확인하는 것일 수 있다.
본 발명에서 사용된 "예후"는 진단을 받은 개체를 대상으로 치료 전/후 개체의 재발, 전이, 약물 반응성, 내성 등과 같은 여부를 판단하는 것을 의미한다. 본 발명에서는 바이오마커를 이용하여 패혈증 환자의 향후 생존 예후가 좋을지 여부에 대해 예측하는 것일 수 있다.
여기서 "바이오마커"란 일반적으로 생물학적 시료에서 검출 가능한 물질로서 생체 변화를 알아낼 수 있는 폴리펩티드, 단백질, 핵산, 유전자, 지질, 당지질, 당단백질, 당 등과 같은 유기 생체 분자들을 모두 포함한다.
본 발명에서 사용된 "miRNA"는 마이크로 RNA(micro RNA)라고도 하며, 표적 RNA의 분해를 촉진시키거나 또는 그들의 번역을 억제시킴으로써 유전자 발현을 전사 후에 조절하는 21 내지 23개의 비암호화(non-coding) RNA를 의미한다. 일반적으로 miRNA는 pre-miRNA라 불리는 헤어핀(hairpin) 구조를 가지는 약 70-80 nt (nucleotide) 길이의 전구체로 전사된 후 RNAse III 효소인 Dicer에 의해 잘려 성숙된 형태로 생성된다. 30% 이상의 인간 miRNA는 클러스터로 존재하며, 하나의 전구체로 전사된 후 절단과정을 거쳐 최종 성숙 miRNA(mature miRNA)가 형성된다.
이러한 miRNA는 차세대 염기서열분석(next-generation sequencing, NGS)을 통해 확인된 패혈증 환자에서 특이적인 발현 수준 변화를 보이는 특정 miRNA로 구성되며, 패혈증 진단 또는 예후 예측을 위한 바이오마커로 제시될 수 있다.
상기 NGS는 수십만 개의 반응을 동시에 수행하는 다중화(multiplexing) 능력이 있으며, 적은 양의 샘플로도 시퀀싱이 가능하다. NGS는 상용화된 기술에 따라 구체적인 적용 기법이 다소 다르지만, 일반적으로 클론증폭(clonal amplification), 대량병렬 시퀀싱 및 Sanger 방법과 작용기전이 다른 새로운 염기서열결정법을 사용한다. 상용화 기술로는 2007년에 Roche가 출시한 454 GS 개량형 FLX model sequencer, 2006년에 Illumina가 출시한 Genome Analyzer HiSeq, 2007년에 Applied Biosystems가 출시한 SOLiD 등이 있다. 이러한 세 가지의 플랫폼은 공통적으로 복잡한 라이브러리 구축과 클로닝 과정을 버리고 클론증폭기술을 채택하였고, 한꺼번에 대량으로 처리할 수 있는 대량병렬방식(massively parallel sequencing) 기술을 택하였으며, 순환 시퀀싱(cyclic sequencing)을 통한 합성신호읽기(sequencing by synthesis)로 염기서열을 결정하여 번잡한 전기영동과정을 배제하였다. 또한 shotgun 방식을 사용하여 읽혀진 짧은 리드(read)를 컴퓨터로 배열하여 중복된 부분을 찾아 전체를 완성하는 알고리즘을 사용한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 miRNA는 엑소좀에서 분리된 것일 수 있다.
여기서 "엑소좀(exosome)"은 세포가 외부로 방출하는 지질 이중막으로 구성된 작은 소포체인 EVs(extracellular vesicles)의 일종으로, 다양한 세포들로부터 분비되며 대략 30 ~ 200 nm의 직경을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 엑소좀은 모체가 되는 세포 내부의 단백질, 지질, 핵산 (예컨대, DNA, mRNA, miRNA) 등을 유사하게 포함하고 있어, 질병 진단, 생물정보학, 약물 전달 시스템 등 다양한 분야에서 응용되고 있다.
상기 엑소좀은 전혈, 혈장, 혈청, 림프액, 타액, 소변, 조직 등의 시료로부터 얻을 수 있으며, 시료의 종류에 따라 통상적인 엑소좀 분리 방법을 제한 없이 적용 또는 변형하여 분리될 수 있다.
이와 같은 본 발명의 엑소좀 유래 miRNA, 즉 hsa-let-7f-5p, miR-301a-3p 및 miR-331-3p는 바이오마커로서 단독으로 사용되거나, 또는 2개 이상의 복수로 사용될 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 바이오마커가 2개 이상의 복수인 경우 miR-331-3p 및 miR-301a-3p, miR-331-3p 및 has-let-7f-5p, miR-301a-3p 및 has-let-7f-5p, 또는 miR-331-3p, miR-301a-3p 및 has-let-7f-5p일 수 있다.
이러한 miRNA 3개의 발현 수준을 측정하기 위해서는 각 miRNA에 특이적으로 결합하는 제제가 요구된다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 제제는 프라이머 쌍, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.
본 발명에서 사용된 "특이적으로 결합하는"이란 결합에 의해 표적 물질의 존재 여부를 검출할 수 있을 정도로 다른 물질에 비해 표적 물질에 대한 결합력이 뛰어남을 의미한다.
본 발명에서 사용된 "프라이머(primer)"는 짧은 자유 3 말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로, 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드(single strand oligonucleotide)를 의미한다. 상기 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응 (즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 7개 내지 50개의 뉴클레오티드 서열을 가진 센스(sense) 및 안티센스(antisense) 핵산으로 구성되며, DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 수준에서 15 ~ 30개의 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.
본 발명에서 사용된 "프로브(probe)"는 자연의 또는 변형된 모노머(monomer) 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하고, 표적 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다.
이러한 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드는 필요한 경우 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 상기 검출 가능한 표지는 검출 가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로서, 형광물질, 예를 들면, Cy3, Cy5 등과 같은 물질을 포함하는 검출 가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질일 수 있다. 상기 검출 가능한 표지는 핵산의 혼성화 결과를 확인할 수 있다.
이와 같은 패혈증 진단 또는 예후 예측용 조성물은 상기 바이오마커, 즉 miRNA의 발현 수준을 측정하여 패혈증 여부 또는 치료를 제공받은 패혈증 환자의 생존율을 효과적으로 판단할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 양상은 상기 조성물을 포함하는 패혈증 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공한다.
본 발명에서 사용된 "패혈증 진단 또는 예후 예측용 키트"는 검사 대상자, 보다 구체적으로 패혈증을 진단받지 않은 개체 또는 패혈증 환자로부터 채취한 생물학적 시료를 통해 진단하거나 예후를 예측할 수 있는 물질을 의미하며, 이를 통해 검사 대상자의 패혈증 여부 또는 치료 예후를 신속, 정확하고 간편하게 진단할 수 있다. 본 발명에서는 hsa-let-7f-5p, miR-301a-3p 및 miR-331-3p로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 miRNA를 검출하는 제제를 단독으로 포함하거나, 또는 이들 모두 포함할 수 있다.
상기 키트는 통상적인 RNA 발현 분석에 기반한 진단 키트를 제한 없이 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 키트는 PCR(polymerase chain reaction) 키트, RT-PCR(reverse transcription PCR) 키트 및 마이크로어레이(microarray) 키트로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.
예를 들면, 상기 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로 PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소, DNA 중합 효소 보조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있으며, 본 발명의 키트는 DNA 또는 RNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 진단용 키트일 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 a) 피험자로부터 분리된 생물학적 시료에서 hsa-let-7f-5p, miR-301a-3p 및 miR-331-3p로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 miRNA 발현 수준을 측정하는 단계; 및 b) 상기 측정된 miRNA 발현 수준을 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 패혈증의 진단 또는 예후 예측을 위한 정보의 제공 방법을 제공한다.
상기 a) 및 b) 단계에 대해 다음에서 자세히 살펴보며, 전술한 내용과 공통된 내용은 과도한 복잡성을 회피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
상기 a) 단계는 패혈증의 진단 또는 예후 예측에 대한 검사가 필요한 개체 또는 대상자로부터 생물학적 시료를 채취하여 3개의 miRNA 발현 수준을 측정하는 과정이다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 a) 단계의 피험자는 패혈증 의심 증상이 있는 개체 또는 패혈증 환자인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 a) 단계의 생물학적 시료는 전혈, 혈장, 혈청, 림프액, 타액, 소변 및 조직으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.
최소한의 침습으로 패혈증에 의한 분자 발현 수준을 정확하게 측정하기 위해서는 전혈 또는 혈장을 이용하는 것이 바람직하다.
본 발명에서의 miRNA 발현 수준은 통상적인 RNA 발현 분석 방법에 기반하여 제한 없이 측정될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 a) 단계의 유전자 발현 수준은 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 경쟁적 RT-PCR, 실시간 PCR, 실시간 RT-PCR, 핵산분해효소 보호 분석(nuclease protection assay), in situ 교잡, DNA 마이크로어레이 및 노던 블롯으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 방법으로 측정되는 것일 수 있다.
상기 b) 단계는 생물학적 시료에서 측정된 3개의 miRNA 발현 수준에 근거하여 피험자의 패혈증으로의 진행 여부 또는 패혈증 치료에 대한 예후를 예측하는 과정이다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 b) 단계는 대조군과 비교하여 피험자에서 hsa-let-7f-5p, miR-301a-3p 및 miR-331-3p로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 miRNA 발현 수준이 낮은 경우 패혈증으로 진단하거나 패혈증 예후가 나쁜 것으로 판별하는 것일 수 있다.
본 발명에서는 패혈증을 진단하거나 패혈증 예후를 예측할 수 있는 신규 바이오마커를 발굴함으로써 패혈증 진단 또는 예후 예측용 조성물 및 키트를 제공할 수 있으며, 나아가 환자의 패혈증으로의 진행 여부 또는 패혈증의 치료 예후를 신속하고 정확하게 진단하여 환자 상태에 맞는 치료법을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 패혈증 환자의 (A) miRNA 발현 패턴 및 (B) 마이크로어레이를 이용한 혈장 엑소좀 miRNA 내 배수 변화(FC)를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 패혈증 환자와 건강한 대조군에서 차등적으로 발현된 miRNA 4개에 대한 정량적 RT-PCR 검증을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 패혈증 환자의 하향조절된 엑소좀 miRNA 4개에 대한 유의한 농축 KEGG 경로 분석을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 병합된 단백질-단백질 상호작용(PPI) 네트워크를 나타낸 것으로, 점 및 선은 각각 유전자 및 상호작용을 표시한 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 패혈증 환자의 원내 사망률에 대한 hsa-let-7f-5p, miR-301a-3p 및 miR-331-3p 예측 값의 ROC 곡선을 나타낸 것이다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
1. 재료 및 방법
1-1. 모집단
패혈증의 진단 및 예후 예측을 위한 새로운 바이오마커를 발굴하기 위해 한국 삼성서울병원에 등록된 중증 성인 환자(critically ill adult patient)의 데이터를 이용하였다. 간략히 설명하면, 중환자실에 입원한 중증 성인 환자 (≥ 19세)로부터 기준 인구통계자료(demographics)와 임상 세부정보를 수집하였고, 이 중 2015년 10월부터 2020년 1월까지의 패혈증 환자 총 135명을 대상으로 하였다. 패혈증의 진단은 패혈증 및 패혈성 쇼크에 대한 제3차 국제 컨센서스 정의 (Pepsis-3)를 기준으로 하였으며, 새로운 정의가 발표되기 전에 등록한 환자는 재분류되었다.
또한 11명의 건강한 대조군 (19세 이상)으로부터 서면 동의를 받아 혈액 검체 (각각 5 mL)를 기증받았다.
추가적으로 패혈증이 있는 중증 환자 (n = 35)와 건강한 대조군 (n = 5)의 독립 데이터는 외부 검증 코호트(external validation cohort)로 사용되었다.
1-2. 데이터 수집
등록 시 환자 인구통계자료, 중환자실 입원 이유, 질병 중증 점수 및 실험실 데이터 (PaO2/FiO2, 젖산, CRP, 프로칼시토닌, IL-6, 혈소판 수, 알부민, 총 빌리루빈 및 크레아틴 수준)로 구성된 임상 데이터를 얻었다.
질병의 중증도는 APACHE II(Acute Physiology and Chronic Health Evaluation II), SAPS 3(Simplified Acute Physiology Score 3) 및 SOFA(Sequential Organ Failure Assessment) 점수를 이용하여 평가되었다. 임상 데이터 외에도, 등록 후 48시간 이내에 각 환자로부터 19 mL의 전혈을 채취하였다.
1-3. 엑소좀 miRNA 분석
1-3-1. 혈장 준비
각 환자로부터 혈액 (최소 15 mL)을 수집하였다. 말초혈액을 EDTA 튜브에 넣고 4℃에서 10분간 480 g로 원심분리하여 혈장을 얻었고, 추가 분석이 이루어질 때까지 -80℃에서 냉동 보관하였다. 엑소좀 분리 및 RNA 정제에 앞서, 혈장은 0.8 μm 주사기 필터를 사용하여 사전 필터링한 후 남은 세포 찌꺼기를 제거하기 위해 추가 원심분리를 하였다.
1-3-2. 엑소좀 분리
엑소좀은 SBI ExoQuick 및 QIAGEN exoRNeasy를 사용하여 혈장에서 분리되었다. 시료에 최적화된 방법으로 엑소좀을 분리하기 위해 제조사의 프로토콜을 수정하여 시료의 불필요한 낭비를 피하고 잔류 불순물을 제거하였다. ExoQuick 시약 (SBI)은 혈장으로부터 엑소좀을 침전시키는데 사용되었고, ExoRNeasy mini kit (Qiagen)는 엑소좀으로부터 RNA를 직접 정제하는데 사용되었다. 엑소좀을 분리하기 위해 여과된 혈장 250 μL를 ExoQuick (System Biosciences) 63 μL에 넣고 4℃에서 30분간 배양하였다. ExoQuick™/혈장 혼합물을 1500 g에서 30분 동안 원심분리한 후, 상층액을 제거하고 1500 g에서 EV 펠릿을 5분 동안 원심분리하여 잔류 ExoQuick 용액을 제거하였다. EV 펠릿은 PBS 200 μL로 재현탁하였으며, 침전된 엑소좀은 즉시 사용하였다.
1-3-3. 총 RNA 분리 및 품질 분석
총 RNA는 제조사 지침에 따라 exoRNeasy Midi Kit (Qiagen)를 사용하여 혈장 분리 엑소좀에서 추출되었다. 간략히 설명하면, 여과된 시료는 Buffer XBP 및 XWP를 이용하여 세척 및 원심분리되었다. 분리된 엑소좀은 700 μl의 QIAzol 시약 (QIAGEN, Cat. 79306)에 용출되었고, 추출 전에 RNA Spike-In Control (QIAGEN Cat. 339390)로 스파이크를 확인하였다. 이어서 상 분리를 위해 용해물에 90 μL의 클로로포름을 첨가하였다. RNA를 포함하는 상부 수상(aqueous phase)을 새로운 수집 튜브로 이동시켰다. 수상 400 μl은 100% 에탄올 800 μl과 혼합하였으며, 그 혼합물을 2 ml 수집 튜브의 RNeasy MinElute 스핀 컬럼(spin column)으로 옮겼다. 원심분리 후, RNA를 컬럼 막에 결합시키고 Buffer RWT 및 RPE로 세척한 후 DNase/RNase-Free water를 첨가하여 10,000 g에서 1 ~ 2분 동안 원심분리하여 엑소좀 총 RNA를 수집하였다.
RNA의 양 및 순도는 NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific)으로 측정하였으며, RNA는 OD260/280의 비율이 1.8 - 2.9였다. miRNA의 품질, 수율 및 분포는 2100 bioanalyzer를 사용하여 분석되었다.
1-3-4. 역전사 및 microRNA 발현 프로파일링
miRCURY LNA™ miRNA Focus PCR 패널 (QIAGEN, Cat no. 339325)은 패혈증 환자 및 건강한 대조군의 엑소좀 miRNA 프로파일링을 위해 사용되었다. miRNA를 포함하는 총 RNA (10 ng/μL 농도)는 제조사의 권고에 따라 단일 miRCURY LNA miRNA PCR 분석 (QIAGEN, Cat no. 339306)을 사용하여 1차 가닥 cDNA로 1차 역전사되었다. 그런 다음 웰(well)당 cDNA 1 μL을 SYBR Green qPCR Master Mix와 혼합하고 179개의 miRNA 서열 패널을 포함하는 두 개의 96웰 PCR 어레이 플레이트에 위치하였다. Applied Biosystems Step-One Plus Real-Time PCR 시스템을 사용한 실시간 PCR 분석을 위해 최종 볼륨 10 μL에서 1 μL를 사용하였다. 상대량은 ΔΔCT 방법으로 계산되었고, RNA 품질이 좋지 않은 시료는 통계 분석에서 제외되었다.
시퀀싱 데이터 분석은 GeneGlobe Data Analysis Center (Qiagen)를 사용하여 수행하였다. GeneGlobe는 배수 변화(fold-change, FC) (FC = 신독성(nephrotoxicity) 그룹의 miRNA 발현 / 비 신독성 그룹의 miRNA 발현), FR (FR = FC, if FC ≥ 1 또는 FR = FC ≥ 1, if FC < 1) 및 각 miRNA에 대한 Wald 검정에 기초한 p 값을 제공하였다. miRNA 분석은 최상의 기준 대조군(reference control)을 식별하기 위해 geNorm 방법을 사용하여 수행되었다. 데이터 정규화를 위해 miR-486-5p, miR-151a-5p 및 hsa-miR-532-3p 발현의 중앙값(median)이 사용되었다. 상대적인 유전자 발현은 비교 사이클 임계값(cycle threshold, 2-ΔΔCT) 방법을 사용하여 계산되었다.
1-3-5. 정량적 RT-PCR에 의한 차등 발현 miRNA의 검증
맞춤형 96웰 Pick-&Mix microRNA PCR 플레이트 (Qiagen)는 miRNA 후보를 검증하기 위해 사용되었다. qRT-PCR은 miRCURY LNA miRNA PCR Starter Kit (Qiagen, No. 339320)와 miRCURY LNA SYBR Green PCR Kit (Qiagen, No. 339347)를 사용하여 후보 엑소좀 miRNA의 발현 수준을 정량화하기 위해 수행되었다. 또한, Applied Biosystems QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR System을 사용하여 총 10 μL의 부피로 수행하였으며, qRT-PCR 조건은 95℃에서 2분간, 그런 다음 95℃에서 10초 및 56℃에서 1분으로 40 사이클(cycle) 진행하였으며, 이어서 용융곡선(melting curve) 분석을 실시하였다. Synthetic UniSp3는 플레이트 간 교정기(interpolate calibrator)이자 qRT-PCR 대조군으로 분석되었다. 증폭 곡선은 QuantStudio Software v1.3 (Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 평가되었다. cel-miR-39-3p 수준은 모든 시료에서 안정적이었다. 35 사이클 이상의 정량 사이클(quantification cycle, Cq)은 검출할 수 없는 것으로 간주되어 각 miRNA에 대해 관측되는 최소 수준에서 관측 중단되었다. 상대 정량은 2-ΔCq 방법 (ΔCq = CqmiRNA - Cqcel-miR-39-3p)을 사용하여 수행되었다. 발현 수준은 통계 목적으로 로그 변환되었다.
1-4. 생물정보학 분석
생물정보학 분석을 위해 FR > 2.5 또는 FR > -2.5의 차등 발현 miRNA를 선택하였다. 선택된 모든 miRNA는 주석(comment)으로 "A"를 표시하거나 표시하지 않았으며 p 값 < 0.05이었다. TargetScan을 포함한 12가지 알고리즘에 따라 예측된 miRNA 표적 유전자 목록을 제공하는 miRWalk 플랫폼은 차등적으로 발현되는 miRNA의 표적 유전자를 예측하기 위해 평가되었다. 그런 다음 STRING 데이터베이스 (http://strin g-db.org)를 사용하여 표적 유전자의 단백질-단백질 상호작용(protein-protein interaction, PPI) 네트워크를 구성하였다. PPI 네트워크는 Cytoscape v3.9.1에 의해 추가로 시각화되었다. 또한 기능 농축(function enrichment) 분석을 위해 유전자 온톨로지(Gene Ontology) 데이터베이스 (http://www.geneontology.org/)를 사용하였다. 군집(cluster) 내에서 통계적으로 가장 유의한 용어(term)는 군집을 대표하기 위해 선택되었다. p 값 < 0.05 및 농축 유전자 수(concentrated gene numbers) ≥ 1.5인 용어만이 유의한 것으로 간주되었다 (≥ 1개의 유전자 수가 존재함). DAVID 생물정보학 리소스(resource)는 KEGG 데이터베이스를 기반으로 잘못 발현된 교차 유전자의 기본 생물학적 과정 및 경로를 설명하기 위한 기능 농축 분석을 수행하는데 사용되었다.
표적 유전자의 농축 경로를 기반으로, 그룹화된 miRNA의 생물학적 기능은 miRNA 표적을 예측하는 7개의 알고리즘 (DIANA, miRanda, miRBridge, PicTar, PITA, rna22 및 TargetScan)과 실험적으로 검증된 2개의 데이터베이스 (TarBase 및 miRecords)를 해석하는 miRsystem 데이터베이스에 의해 예측되었다. PPI 네트워크는 표적 유전자와 다른 유전자 간의 기능적 상호작용에 주석(annotate)을 달기 위해 STRING 데이터베이스를 사용하여 설정되었다. PPI 네트워크를 구축하기 위해 텍스트 마이닝(text mining), 실험, 데이터베이스 및 공동발현(co-expression)을 포함한 활성 상호작용 소스(source)와 "호모 사피엔스(Homo sapiens)"로 제한된 종(species), 그리고 상호작용 점수 > 0.7이 적용되었고, 이는 유전자 간의 물리적 및 기능적 상호작용을 보여주었다. PPI 네트워크 구축에 대해 총 점수가 0.9를 초과하는 유전자 쌍을 선택하였다. 이어서 Cytoscape 소프트웨어를 적용해 간접 PPI와 드라이버 유전자(driver gene)의 PPI를 병합하여 상호연결되고 교차된 기능 모듈을 발견하고 핵심 유전자를 표적으로 하였다. 결국, 엑소좀 miRNA의 차등 발현과 잘 알려진 패혈증 매커니즘 간의 상호관계를 분석하려고 하였다.
1-5. 통계 분석
임상 데이터는 범주형 변수의 경우 숫자 (백분율)로 표시되고 연속형 변수의 경우 중앙값과 사분위간 범위(interquartile range, IQR) (25번째 - 75번째 백분위수)로 표시되었다. 상대적인 miRNA 수준은 각 miRNA에 대해 2DCT (기준 miRNA의 2CT - 관심 miRNA의 CT)를 사용하여 구하였다. miRNA의 차등 발현의 p 값은 Poisson의 분포(distribution)에 기초하여 계산되었고 p 값의 임계값은 거짓 발견율(false discovery rate)에 의해 결정되었다. 수신자 조작 특성(Receiver operating characteristic, ROC) 곡선 분석을 수행하였고, 곡선하면적(areas under the curve, AUC)은 패혈증 환자의 원내 사망률을 예측하는 miRNA의 성능을 평가하는 것으로 보고되었다. 모든 검정은 양측검정(two-sided test)이었고, p 값 < 0.05의 경우 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
2. 결과
2-1. 모집단의 기준 특성
중환자실에 입원한 대상자 135명의 기준 특성은 하기 표 1에 나타내었다. 또한 외부 검증 코호트의 패혈증 환자 35명에 대한 기준 특성은 하기 표 2에 나타내었다.
환자 수 (%) 또는 중앙값 (IQR)
연령, 세 66 (58 - 74)
성별, 남성 91 (67.4)
BMI, kg/m2 22.9 (20.6 - 26.0)
동반질병
악성종양
당뇨병
만성폐쇄성폐질환
만성신장질환
뇌혈관질환
만성간질환
울혈성심부전
결합조직질환
51 (37.8)
41 (30.4)
16 (11.9)
10 (7.4)
8 (5.9)
8 (5.9)
7 (5.2)
2 (1.5)
중환자실 입원 시 임상 상태
기계적 인공호흡 필요
승압제 관리 필요
59 (43.7)
70 (51.9)
질병 중증도
SAPS3 점수
APACHE II 점수
SOFA 점수
55 (47 - 63)
24 (20 - 30)
9 (7 - 11)
실험실 결과
CRP, mg/dL
젖산, mmol/L
프로칼시토닌, ng/mL
IL-6, pg/mL
혈소판 수, 10³/μL
알부민, g/dL
총 빌리루빈, mg/dL
크레아틴, mg/dL
12.5 (5.9 - 24.8)
2.9 (2.0 - 4.4)
6.06 (0.85 - 25.18)
228 (65 - 807)
135 (59 - 214)
2.9 (2.6 - 3.2)
1.1 (0.7 - 2.5)
1.3 (0.8 - 1.9)
환자 수 (%) 또는 중앙값 (IQR)
연령, 세 64 (52 - 72)
성별, 남성 27 (77.1)
BMI, kg/m2 23.0 (20.6 - 26.1)
동반질병
악성종양
당뇨병
만성폐쇄성폐질환
만성신장질환
뇌혈관질환
만성간질환
울혈성심부전
결합조직질환
17 (48.6)
10 (28.6)
5 (14.3)
6 (17.1)
1 (2.9)
2 (5.7)
2 (5.7)
2 (5.7)
중환자실 입원 시 임상 상태
기계적 인공호흡 필요
승압제 관리 필요
18 (51.4)
18 (51.4)
질병 중증도
SAPS3 점수
APACHE II 점수
SOFA 점수
52 (45 - 63)
22 (20 - 38)
8 (7 - 11)
실험실 결과
CRP, mg/dL
젖산, mmol/L
프로칼시토닌, ng/mL
IL-6, pg/mL
혈소판 수, 10³/μL
알부민, g/dL
총 빌리루빈, mg/dL
크레아틴, mg/dL
13.2 (6.5 - 25.1)
2.4 (1.8 - 4.0)
2.92 (0.75 - 15.83)
사용 불가
130 (76 - 177)
2.9 (2.5 - 3.2)
0.9 (0.6 - 1.7)
1.2 (0.9 - 2.0)
2-2. 엑소좀 miRNA 프로파일링
혈장 유래 엑소좀의 miRNA 함량을 분석하기 위해 패혈증 환자에서 miRNA 프로파일링 분석을 수행하고 건강한 개인의 결과와 비교하였다. 그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 패혈증 환자에서는 대조군과 비교하여 179개의 miRNA가 차등 발현되었으며, 이 중 8개의 상향조절된 miRNA (miR-223-3p, miR-122-5p, miR-30e-3p, miR-99a-5p, miR-155-5p, miR-125b-5p, miR-378a-3p 및 miR-150-5p)와 17개의 하향조절된 miRNA (miR-335-5p, hsa-let-7f-5p, miR-301a-3p, miR-331-3p, miR-495-3p, miR-374b-5p, miR-409-3p, miR-18a-5p, miR-133b, miR-28-5p, miR-148b-3p, miR-376c-3p, miR-133a-3p, miR-584-5p, miR-766-3p, miR-22-5p 및 miR-376c-3p)가 발견되었다.
2-3. 차등 발현 miRNA의 검증
차등 발현된 25개의 miRNA를 식별한 다음 정량적 PCR 검증을 위해 하향조절된 상위 4개의 엑소좀 hsa-let-7f-5p, miR-335-5p, miR-331-3p 및 miR-301a-3p를 선택하였으며, 이는 마이크로어레이에 의한 선별 결과에 따라 이루어졌다. 그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 패혈증 환자에서 miR-335-5p, miR-301a-3p, hsa-let-7f-5p 및 miR-331-3p의 수준은 건강한 대조군과 비교하여 유의미하게 감소하였다 (p < 0.0001).
외부 검증 코호트에서는 상위 4개의 하향조절 엑소좀 miRNA의 차이 분석을 위해 패혈증 환자 35명과 건강한 대조군 5명을 검사하였고, 그 결과 hsa-let-7f-5p, miR-335-5p, miR-331-3p 및 miR-301a-3p가 건강한 대조군과 비교하여 패혈증 환자에서 하향조절되었다 (p < 0.0001).
2-4. 생물정보학 분석
2-4-1. 그룹화된 miRNA에 대한 KEGG 경로 분석
KEGG 경로 분석 결과에서는 도 3에 나타낸 바와 같이, 4개의 miRNA의 표적 유전자가 주로 MAPK, PI3K-Akt, mTOR, Ras, Wnt, FoxO, 인슐린(insulin), TGF-β, 수명 조절(longevity regulating) 및 AGE-RAGE 신호전달 경로에 집중되어 있었다.
또한 하기 표 3에 나타낸 바와 같이, hsa-let-7f-5p, miR-331, miR-301a 및 miR-335-5p에 대한 가장 공통적인 농축 KEGG 경로는 PI3K-Akt 및 MAPK 신호전달 경로인 것으로 나왔다.
miRNAs 농축된 KEGG 경로 유전자 수
1. has-let-7f-5p
hsa04151 PI3K-Akt signaling pathway 39
hsa04010 MAPK signaling pathway 39
hsa04150 mTOR signaling pathway 27
2. miR-331-3p
hsa04010 MAPK signaling pathway 25
hsa04151 PI3K-Akt signaling pathway 14
hsa04014 Ras signaling pathway 11
3. miR-301a-3p
hsa04010 MAPK signaling pathway 32
hsa04014 Ras signaling pathway 25
hsa04068 FoxO signaling pathway 24
4. miR-335-5p
hsa04010 MAPK signaling pathway 33
hsa04151 cAMP signaling pathway 10
hsa04068 FoxO signaling pathway 9
2-4-2. 그룹화된 miRNA의 잠재적 표적 유전자에 대한 GO 농축 분석
4개의 miRNA의 잠재적 표적 유전자는 miRsystem 데이터베이스에 의해 예측되었고, 예측된 4개의 차등 발현 miRNA의 총 1,817개의 표적 유전자는 GO 기능 농축을 위해 사용되었다. 생물학적 과정(biological process)의 분석은 선택된 miRNA가 주로 세포 과정, 생물학적 조절 및 대사 과정에 관여한다는 것을 나타냈다. 분자 기능에 대해서는 결합, 단백질 결합 및 이온 결합을 포함하였다. 마지막으로, 세포적 기반(cellular component)에서는 선택된 miRNA가 세포 해부학적 실체(cellular anatomical entity), 세포내(intracellular) 및 세포소기관(organelle)과 관련 있는 것으로 드러났다.
2-4-3. PPI 네트워크
공통적인 KEGG 경로의 핵심 유전자 및 유전자 간의 상호작용을 식별하기 위해 그룹화된 miRNA의 405개의 표적 유전자를 STRING 데이터베이스에 매핑하였다. PPI 네트워크는 중요한 감수성 유전자(susceptibility gene)를 기반으로 구성되었으며, 결합 점수 및 등급(degree)이라는 두 개의 위상 매개변수(topological parameters)를 기반으로 평가되었다. 등급 ≥ 7 및 합산 점수 ≥ 0.9가 컷오프(cut-off) 기준이었다. PPI 네트워크는 1,224개의 노드(node)와 2,429개의 에지(edge)로 구성되었다. 농축 경로 분석 결과에서는 유전자가 암의 경로인 PI3K-Akt 및 MAPK 신호전달 경로와 관련이 있는 것으로 나타났다.
2-4-4. 예상 유전자에서의 클러스터 분석
STRING의 K-평균 군집화(K-means clustering) 방법을 사용하여 예측된 405개의 유전자에 대해 군집 분석을 수행하여 잠재적으로 질병이나 상태와 관련된 상관 유전자들의 그룹을 발견하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 상위 2개의 유의미한 농축 KEGG 경로와 PPI 네트워크의 결과를 통합하였다.
2-5. 원내 사망률을 예측하는 3개의 miRNA에 대한 ROC 분석 및 AUC
상위 4개의 하향조절 엑소좀 miRNA 중 종래 패혈증과 관련성이 알려진 바가 없는 hsa-let-7f-5p, miR-301a-3p 및 miR-331-3p를 선택하여 miRNA의 ROC 분석을 실시하였다. 그 결과, 도 5 및 하기 표 4에 나타낸 바와 같이, 원내 사망률에 대한 hsa-let-7f-5p, miR-301a-3p 및 miR-331-3p의 AUC는 각각 0.913, 0.092 및 0.931이었으며, 이들 조합의 AUC은 단일 miRNA와 동일하거나 보다 증가된 것으로 나타났다 (p < 0.001).
외부 검증 코호트에서는 원내 사망률에 대한 hsa-let-7f-5p, miR-301a-3p 및 miR-331-3p의 AUC는 각각 0.920, 0.914 및 0.907이었다.
AUC (95% CI) P 값
miR-331-3p 0.931 (0.886 - 0.977) < 0.001
miR-301a-3p 0.929 (0.881 - 0.977) < 0.001
has-let-7f-5p 0.913 (0.860 - 0.965) < 0.001
miR-331-3p + miR-301a-3p 0.936 (0.893 - 0.979) < 0.001
miR-331-3p + has-let-7f-5p 0.931 (0.885 - 0.976) < 0.001
miR-301a-3p + has-let-7f-5p 0.936 (0.893 - 0.979) < 0.001
miR-331-3p + miR-301a-3p + has-let-7f-5p 0.937 (0.894 - 0.981) < 0.001
이러한 결과는 하기 표 5의 hsa-let-7f-5p, miR-301a-3p 및 miR-331-3p를 바이오마커로 활용하여 패혈증으로의 진행이 예측되는 환자를 보다 정확하게 선별할 수 있으며, 그 예후 또한 정확하게 예측 가능하다는 것을 시사한다.
miRNA 염기서열 (5'-3') 서열번호
hsa-let-7f-5p ugagguaguagauuguauaguu 1
miR-301a-3p cagugcaauaguauugucaaagc 2
miR-331-3p gccccugggccuauccuagaa 3
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (8)

  1. hsa-let-7f-5p, miR-301a-3p 및 miR-331-3p로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 miRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 패혈증 진단 또는 예후 예측용 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 miRNA는 엑소좀에서 분리된 것인 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 제제는 프라이머 쌍, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인 조성물.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 패혈증 진단 또는 예후 예측용 키트.
  5. a) 피험자로부터 분리된 생물학적 시료에서 hsa-let-7f-5p, miR-301a-3p 및 miR-331-3p로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 miRNA 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    b) 상기 측정된 miRNA 발현 수준을 대조군과 비교하는 단계
    를 포함하는 패혈증의 진단 또는 예후 예측을 위한 정보의 제공 방법.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 a) 단계의 생물학적 시료는 전혈, 혈장, 혈청, 림프액, 타액, 소변 및 조직으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인 방법.
  7. 청구항 5에 있어서,
    상기 a) 단계의 miRNA 발현 수준은 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 경쟁적 RT-PCR, 실시간 PCR, 실시간 RT-PCR, 핵산분해효소 보호 분석(nuclease protection assay), in situ 교잡, DNA 마이크로어레이 및 노던 블롯으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 방법으로 측정되는 것인 방법.
  8. 청구항 5에 있어서,
    상기 b) 단계는 대조군과 비교하여 피험자에서 hsa-let-7f-5p, miR-301a-3p 및 miR-331-3p로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 miRNA 발현 수준이 낮은 경우 패혈증으로 진단하거나 패혈증 예후가 나쁜 것으로 판별하는 것인 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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