KR101117799B1

KR101117799B1 - 아토피성 피부질환 진단용 마커

Info

Publication number: KR101117799B1
Application number: KR1020090049992A
Authority: KR
Inventors: 양준모; 박용두
Original assignee: 사회복지법인 삼성생명공익재단
Priority date: 2009-06-05
Filing date: 2009-06-05
Publication date: 2012-03-07
Also published as: KR20100131214A

Abstract

아토피성 피부질환의 진단 및/또는 치료에 유용한 마커에 관한 것으로, 이를

이용하여 아토피성 피부질환의 진단하는 기술 및 상기 마커를 타겟으로 하여 아토피성 피부질환의 유발 인자, 또는 아토피성 피부질환의 예방, 경감 및/또는 치료 약물을 스크리닝하는 방법이 제공된다.

아토피, 진단, 마커

Description

아토피성 피부질환 진단용 마커{MARKER FOR THE DIAGNOSIS OF ATOIC DERMATITIS}

아토피성 피부질환의 진단 및/또는 치료에 유용한 마커에 관한 것으로, 이를 이용하여 아토피성 피부질환의 진단하는 기술 및 상기 마커를 타겟으로 하여 아토피성 피부질환의 유발 인자, 또는 아토피성 피부질환의 예방, 경감 및/또는 치료 약물을 스크리닝하는 방법이 제공된다.

아토피성 피부질환 (Atopic dermatitis, AD)은 유전적 요인이나 환경요인 등 다양한 요인에 의해 발병하여, 그 메커니즘은 명확하지 않다. 현재 아토피성 피부질환은 전적으로 육안적 소견으로 진단되고 있어, 임상의에 의한 주관이 개입되므로 객관성이 부족하다. 특히 아토피성 피부질환 중에서도 치료법을 결정하는 피진(皮疹)의 중증도를 판단하는 것은 어려운 과제로 되어 있다. 또한, 사회 일반적으로도 아토피성 피부질환 치료의 큰 기둥인 스테로이드 외용제의 기피 풍조가 강해지고 있기 때문에, 적절한 치료 기술의 개발이 요망되고 있다. 따라서, 병상의 악화, 개선의 지표 또한 치료효과의 표현으로서 아토피성 피부질환의 중증도를 분류할 수 있는 아토피성 피부질환 마커를 탐색한다는 것은 중요한 과제이다.

또한, 아토피성 피부질환의 발병률의 증가 추세와 직접적인 삶의 질에 대한 심각한 문제를 야기함으로 인하여 국가적 과제로 중요하게 지명되고 있을 정도로 사회적 관심이 모아지고 있는 상황이며, 종합적인 발병의 원인 규명과 환자 친화적인 치료의 개발이 필요한 시점이다.

이와 관련하여, 임상과 기초의학의 접목을 통한 시도가 이루어지고 있지만 보다 근본적인 환자 피부조직에서 일어나는 변화의 규명과 이를 기반으로 한 정확하고 효과적인 치료법이 필요한 상황이다.

현재 DNA칩, 프로테오믹스 기술 및 바이오인포메틱스 기술들이 질병의 발병 경로와 진행과정 그리고 치료를 위한 연구수단으로 이용되고 있지만, 아직 뚜렷한 성과는 얻어지지 못한 상황이다.

이에, 본 발명의 일례는 아토피성 피부질환 환자에서 발현이 증가 또는 감소되는 유전자 및 상기 유전자가 코딩하는 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 아토피성 피부질환 진단용 마커를 제공한다.

본 발명의 또 다른 예는 아토피성 피부질환 환자에서 발현이 증가 또는 감소되는 유전자 및 상기 유전자가 코딩하는 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 아토피성 피부질환 진단용 마커의 발현을 검출할 수 있는 아토피성 피부질환 진단용 바이오칩을 제공한다.

본 발명의 또 다른 예는 상기 아토피성 피부질환 진단용 마커의 발현 증가 또는 감소 여부를 측정하여 아토피성 피부질환 환자를 판단하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 예는 후보물질을 시료에 처리 후 상기 아토피성 피부질환 진단용 마커의 발현 정도를 측정하여 아토피성 피부질환 유발 인자를 탐색하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 예는 후보물질을 시료에 처리 후 상기 아토피성 피부질환 진단용 마커의 발현 정도를 측정하여 아토피성 피부질환 예방, 경감 및/또는 치료 물질을 탐색하는 방법을 제공한다.

본 발명은 아토피 피부질환의 효과적인 진단과 치료를 위한 목적 유전자로 활용될 수 있는, 환자 체내에서 비정상적인 발현을 보이는 특이적 유전자들의 발굴 을 목표로 한다. 외인성과 내인성으로 크게 분류하였을 때 외인성의 아토피 피부염 환자가 전체 환자의 70-80%를 점유하고 있고 내인성 환자는 20-30%를 차지하고 있다. 외인성과 내인성 환자군에서의 비정상적인 발현을 일으키는 유전자들을 발굴함을 통해 효과적인 진단과 치료 그리고 환자에 적합한 개인 맞춤의학을 이루고자 한다.

이를 위해 본 발명에서는 아토피성 피부질환에 관여하는 유전자들을 자유유동 전기영동법(FFE, free-flow electrophoresis), 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR) 등을 접목시켜 새롭게 발굴하였고, 이와 같이 발굴된 유전자들은 장래에 아토피성 피부질환의 치료의 목적으로 응용이 가능할 것으로 기대된다.

본 발명에서 자유유동 전기영동법(FFE, free-flow electrophoresis) 및 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR)을 통하여 아토피 피부염 환자에서 비정상적인 발현을 보이는 유전자들 또는 단백질들을 발굴하였다. 보다 구체적으로 아토피성 피부질환 환자로부터 얻어진 시료(예컨대, 피부 조직 또는 각질세포)에서의 비정상적 발현을 보이는 유전자 또는 단백질들을 발굴하였다.

상기 발굴된 유전자는 CYTB(NCBI GeneID: 6775065), NCL(NCBI GeneID: 4691), CHCHD3(NCBI GeneID: 54927), LIMS1(NCBI GeneID: 3987), NEF3(NCBI GeneID: 4741), ANXA2(NCBI GeneID: 302), CRKRS(NCBI GeneID: 51755), HCLS1(NCBI GeneID: 3059), HMGCS1(NCBI GeneID: 3157), PRKACA(NCBI GeneID: 5566), RCN1(NCBI GeneID: 5954), SMARCA5(NCBI GeneID: 8467), TPM1(NCBI GeneID: 7168), TRA1(NCBI GeneID: 7184), TUBA3(NCBI GeneID: 7846), TUBA6(NCBI GeneID: 84790), 및 HSPCA(NCBI GeneID: 3320)로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 상기 발굴된 단백질은 상기 유전자에 의하여 코딩되는 단백질들일 수 있다.

본 명세서에서 '아토피성 피부질환'은 협의로는 아토피성 피부염을 의미하며, 광의로는 아토피성 피부염을 포함하여 염증을 동반하지 않는 아토피성 피부질환도 포함하는 의미로 사용된다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 일례는 정상 시료와 비교하여 아토피성 피부질환 환자의 시료에서 발현 정도가 유의적으로 증가 또는 감소하는 유전자들을 발굴하여 이를 아토피성 피부질환의 진단용 마커로서 제공한다.

본 발명자들은 아토피성 피부질환 환자로부터 얻은 시료에서 CYTB(NCBI GeneID: 6775065), NCL(NCBI GeneID: 4691), CHCHD3(NCBI GeneID: 54927), LIMS1(NCBI GeneID: 3987), NEF3(NCBI GeneID: 4741), ANXA2(NCBI GeneID: 302), CRKRS(NCBI GeneID: 51755), HCLS1(NCBI GeneID: 3059), HMGCS1(NCBI GeneID: 3157), PRKACA(NCBI GeneID: 5566), RCN1(NCBI GeneID: 5954), SMARCA5(NCBI GeneID: 8467), TPM1(NCBI GeneID: 7168), TRA1(NCBI GeneID: 7184), TUBA3(NCBI GeneID: 7846), TUBA6(NCBI GeneID: 84790), 및 HSPCA(NCBI GeneID: 3320)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자의 발현이 유의적으로 증가 또는 감소하는 것으로 나타났다.(<실시예 1-2> 참조)

따라서, 본 발명의 일례에 따른 아토피성 피부질환 진단용 마커는

CYTB(NCBI GeneID: 6775065), NCL(NCBI GeneID: 4691), CHCHD3(NCBI GeneID: 54927), LIMS1(NCBI GeneID: 3987), NEF3(NCBI GeneID: 4741), ANXA2(NCBI GeneID: 302), CRKRS(NCBI GeneID: 51755), HCLS1(NCBI GeneID: 3059), HMGCS1(NCBI GeneID: 3157), PRKACA(NCBI GeneID: 5566), RCN1(NCBI GeneID: 5954), SMARCA5(NCBI GeneID: 8467), TPM1(NCBI GeneID: 7168), TRA1(NCBI GeneID: 7184), TUBA3(NCBI GeneID: 7846), TUBA6(NCBI GeneID: 84790), 및 HSPCA(NCBI GeneID: 3320) 및

상기 유전자에 의하여 코딩되는 단백질들

로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있다.

또 다른 예에서, 본 발명은 CYTB(NCBI GeneID: 6775065), NCL(NCBI GeneID: 4691), CHCHD3(NCBI GeneID: 54927), LIMS1(NCBI GeneID: 3987), NEF3(NCBI GeneID: 4741), ANXA2(NCBI GeneID: 302), CRKRS(NCBI GeneID: 51755), HCLS1(NCBI GeneID: 3059), HMGCS1(NCBI GeneID: 3157), PRKACA(NCBI GeneID: 5566), RCN1(NCBI GeneID: 5954), SMARCA5(NCBI GeneID: 8467), TPM1(NCBI GeneID: 7168), TRA1(NCBI GeneID: 7184), TUBA3(NCBI GeneID: 7846), TUBA6(NCBI GeneID: 84790), 및 HSPCA(NCBI GeneID: 3320)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자의 발현 정도를 측정할 수 있는 아토피성 피부질환 진단용 바이오칩, 또는 상기 칩과 유전자 발현 정도 측정 기기를 포함하는 아토피성 피부질환 진단용 키트를 제공한다.

상기 유전자의 발현 정도는 이들 유전자로부터 얻어지는 mRNA 양 또는 코딩 단백질 양에 의하여 측정 가능하다. 상기 mRNA 양 또는 단백질 양은 이 발명이 속하는 기술 분야에 알려진 모든 통상적 방법에 의하여 측정 가능하며, 예컨대, 상기 mRNA에 대한 cDNA, 및/또는 상기 mRNA 중 연속하는 5개 이상, 바람직하게 5 내지 500개, 보다 바람직하게 5 내지 100개, 더욱 바람직하게 10 내지 100개의 뉴클레오타이드 서열과 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 프로브, 또는 상기 단백질에 대한 항체를 이용하여 측정할 수 있다.

상기 바이오칩(Biochip)이란 유리, 실리콘, 또는 나일론 등의 재질로 된 작은 기판 위에 폴리뉴클레오타이드 (DNA, RNA 등), 단백질 등의 생물 분자들을 결합시켜 유전자 발현 양상, 유전자 결함, 단백질 분포, 반응 양상 등을 분석해낼 수 있는 생물학적 마이크로칩(Biological Microchip)을 의미한다.

mRNA의 발현량은 RT-PCR, 노던블롯(northern blot), 전기영동 등으로 측정 가능하며, 단백질 발현량은 효소 면역 측정법(ELISA), 형광면역 측정법(FIA), 방사선 면역 측정법(RIA), 발광 면역 측정법, 면역블롯(immunoblot)법, 웨스턴 블롯(western blot)법, 면역 염색법 등으로 측정 가능하나 이에 제한되는 것은 아니다.

또 다른 예에 있어서, 본 발명은 아토피성 피부질환 환자의 판단 방법을 제공한다. 아토피성 피부질환 환자인지 여부를 판단하는 방법은 다음과 같은 단계를 포함하는 것일 수 있다:

- 피검체로부터 얻은 시료에서의 CYTB(NCBI GeneID: 6775065), NCL(NCBI GeneID: 4691), CHCHD3(NCBI GeneID: 54927), LIMS1(NCBI GeneID: 3987), NEF3(NCBI GeneID: 4741), ANXA2(NCBI GeneID: 302), CRKRS(NCBI GeneID: 51755), HCLS1(NCBI GeneID: 3059), HMGCS1(NCBI GeneID: 3157), PRKACA(NCBI GeneID: 5566), RCN1(NCBI GeneID: 5954), SMARCA5(NCBI GeneID: 8467), TPM1(NCBI GeneID: 7168), TRA1(NCBI GeneID: 7184), TUBA3(NCBI GeneID: 7846), TUBA6(NCBI GeneID: 84790), 및 HSPCA(NCBI GeneID: 3320)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 발현 정도를 측정하는 단계;

- 상기 측정된 피검체로부터 얻은 시료, 예컨대, 혈청 또는 각질세포에서의 발현 정도를 정상 개체로부터 얻은 시료에서의 해당 유전자의 발현 정도와 비교하는 단계; 및

- 상기 비교 결과 피검체 발현 정도의 변화가 관찰되는 경우 상기 피검체를 아토피성 피부질환 환자로 판단하는 단계.

보다 바람직한 구체예에서, 상기 방법은 피검체에서의 CYTB(NCBI GeneID: 6775065), NCL(NCBI GeneID: 4691), CHCHD3(NCBI GeneID: 54927), LIMS1(NCBI GeneID: 3987), NEF3(NCBI GeneID: 4741), ANXA2(NCBI GeneID: 302), CRKRS(NCBI GeneID: 51755), HCLS1(NCBI GeneID: 3059), HMGCS1(NCBI GeneID: 3157), PRKACA(NCBI GeneID: 5566), RCN1(NCBI GeneID: 5954), SMARCA5(NCBI GeneID: 8467), TPM1(NCBI GeneID: 7168), TRA1(NCBI GeneID: 7184) 및 TUBA6(NCBI GeneID: 84790)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자의 발현이 정상 개체보다 감소하는 경우 상기 피검체를 아토피성 피부질환 환자로 판단할 수 있으며,

또한 피검체에서의 HSPCA(NCBI GeneID: 3320) 유전자의 발현이 정상 개체보 다 증가되는 경우 상기 피검체를 아토피성 피부질환 환자로 판단할 수 있으며,

또한 피검체에서의 TUBA3(NCBI GeneID: 7846) 유전자의 발현이 정상 개체보다 증가되는 경우 상기 피검체를 외인성 아토피성 피부질환 환자로 판단할 수 있으며,

또한 피검체에서의 TUBA3(NCBI GeneID: 7846) 유전자의 발현이 정상 개체보다 감소하는 경우 상기 피검체를 내인성 아토피성 피부질환 환자로 판단할 수 있다.

또 다른 예에서, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 아토피성 피부질환 유발인자 탐색 방법을 제공한다:

- 후보물질을 생검 시료와 접촉시키는 단계;

- 상기 후보물질 접촉된 시료에서의 CYTB(NCBI GeneID: 6775065), NCL(NCBI GeneID: 4691), CHCHD3(NCBI GeneID: 54927), LIMS1(NCBI GeneID: 3987), NEF3(NCBI GeneID: 4741), ANXA2(NCBI GeneID: 302), CRKRS(NCBI GeneID: 51755), HCLS1(NCBI GeneID: 3059), HMGCS1(NCBI GeneID: 3157), PRKACA(NCBI GeneID: 5566), RCN1(NCBI GeneID: 5954), SMARCA5(NCBI GeneID: 8467), TPM1(NCBI GeneID: 7168), TRA1(NCBI GeneID: 7184), TUBA3(NCBI GeneID: 7846), TUBA6(NCBI GeneID: 84790), 및 HSPCA(NCBI GeneID: 3320)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 발현 정도를 측정하는 단계;

- 상기 후보물질 접촉된 시료에서 측정된 발현 정도를 후보물질 접촉되지 않은 시료에서의 해당 유전자의 발현 정도와 비교하는 단계; 및

- 상기 비교 결과 후보물질 접촉된 시료에서 상기 유전자의 발현 정도에 변화가 관찰되는 경우, 상기 후보물질을 아토피성 피부질환 유발인자로 판단하는 단계

예컨대, 상기 방법은 후보물질 접촉된 시료에서의 CYTB(NCBI GeneID: 6775065), NCL(NCBI GeneID: 4691), CHCHD3(NCBI GeneID: 54927), LIMS1(NCBI GeneID: 3987), NEF3(NCBI GeneID: 4741), ANXA2(NCBI GeneID: 302), CRKRS(NCBI GeneID: 51755), HCLS1(NCBI GeneID: 3059), HMGCS1(NCBI GeneID: 3157), PRKACA(NCBI GeneID: 5566), RCN1(NCBI GeneID: 5954), SMARCA5(NCBI GeneID: 8467), TPM1(NCBI GeneID: 7168), TRA1(NCBI GeneID: 7184) 및 TUBA6(NCBI GeneID: 84790) 유전자 발현이 후보물질 접촉되지 않은 시료보다 감소되는 경우, 또는 HSPCA(NCBI GeneID: 3320) 유전자의 발현이 후보물질 접촉되지 않은 시료보다 증가되는 경우 상기 후보물질을 아토피성 피부질환 유발인자로 판단하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다

또는 상기 방법은 후보물질 접촉된 시료에서의 TUBA3(NCBI GeneID: 7846)의 발현이 후보물질 접촉되지 않은 시료보다 증가되는 경우 상기 후보물질을 외인성 아토피성 피부질환 유발인자로 판단하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다. 또한 상기 방법은 후보물질 접촉된 시료에서의 TUBA3(NCBI GeneID: 7846)의 발현이 후보물질 접촉되지 않은 시료보다 감소되는 경우 상기 후보물질을 내인성 아토피성 피부질환 유발인자로 판단하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

또 다른 예에 있어서, 본 발명은 다음과 같은 단계를 포함하는 아토피성 피 부질환의 예방, 경감 및/또는 치료 물질의 탐색 방법을 제공한다:

- 후보물질을 아토피성 피부질환 환자로부터 얻은 시료와 접촉시키는 단계;

- 상기 후보물질 접촉된 아토피성 피부질환 환자의 시료에서 측정된 발현 정도를 후보물질 접촉되지 않은 아토피성 피부질환 환자의 시료에서의 해당 유전자의 발현 정도와 비교하는 단계; 및

- 상기 비교 결과 후보물질 접촉된 아토피성 피부질환 환자의 시료에서의 상기 유전자의 발현 정도의 변화가 관찰되는 경우, 상기 후보물질을 아토피성 피부질환의 예방, 경감 또는 치료 물질로 판단하는 단계.

예컨대, 상기 방법은 후보물질 접촉된 시료에서의 CYTB(NCBI GeneID: 6775065), NCL(NCBI GeneID: 4691), CHCHD3(NCBI GeneID: 54927), LIMS1(NCBI GeneID: 3987), NEF3(NCBI GeneID: 4741), ANXA2(NCBI GeneID: 302), CRKRS(NCBI GeneID: 51755), HCLS1(NCBI GeneID: 3059), HMGCS1(NCBI GeneID: 3157), PRKACA(NCBI GeneID: 5566), RCN1(NCBI GeneID: 5954), SMARCA5(NCBI GeneID: 8467), TPM1(NCBI GeneID: 7168), TRA1(NCBI GeneID: 7184) 및 TUBA6(NCBI GeneID: 84790) 유전자 발현이 후보물질 접촉되지 않은 시료보다 증가되는 경우, 또는 HSPCA(NCBI GeneID: 3320) 유전자의 발현이 후보물질 접촉되지 않은 시료보다 감소되는 경우 상기 후보물질을 아토피성 피부질환의 예방, 경감 또는 치료 물질로 판단하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다

또는 상기 방법은 후보물질 접촉된 시료에서의 TUBA3(NCBI GeneID: 7846)의 발현이 후보물질 접촉되지 않은 시료보다 감소되는 경우 상기 후보물질을 외인성 아토피성 피부질환의 예방, 경감 또는 치료 물질로 판단하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다. 또한 상기 방법은 후보물질 접촉된 시료에서의 TUBA3(NCBI GeneID: 7846)의 발현이 후보물질 접촉되지 않은 시료보다 증가되는 경우 상기 후보물질을 내인성 아토피성 피부질환의 예방, 경감 또는 치료 물질로 판단하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

본 명세서에서 피검체, 아토피성 피부질환 환자 및 정상 개체는 모든 동물, 바람직하게는 포유류, 더욱 바람직하게는 인간일 수 있으며, 이로부터 얻은 시료 또는 생검 시료는 모든 조직, 체액, 또는 세포일 수 있으며, 바람직하게는 피부조직 또는 각질세포일 수 있다. 또한, 정상 개체는 아토피성 피부질환의 증상 및 징후가 없으며, 개인적 및 가족적으로 아토피성 질환의 병력이 없는 개체를 의미한다. 아토피성 피부질환은 아토피성 피부염을 포함하여 가려움증과 피부건조증 및/또는 홍반을 동반하는 피부에 나타나는 모든 아토피성 질환을 의미하는 것이다.

본 발명에 의해서 외인성과 내인성 아토피 피부염에 관여하는 원인 유전자들의 규명 및 치료를 위한 목적 유전자들의 선정이 가능하게 되어, 추후 여러 치료제들의 개발의 가능성뿐만 아니라 종래 개발된 치료제들의 효과 판단에 활용이 기대되며, 환자 개별적인 미세한 차이점들의 파악을 가능케 하여 맞춤의학을 위한 근거 유전자에 대한 기초를 제공할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 참조예 >

아토피성 피부염 샘플 준비

공지된 방법에 따라 남성 아토피성 피부질환 환자(10명의 비아토피성 정상 피험자(정상 대조군), 10명의 외인성 아토피성 피부질환 환자 및 10명의 내인성 아토피성 피부질환 환자)로부터 채취한 조직 생검(punch biopsies)에서 아토피성 피부염 섬유아세포(fibroblast)를 수득하였다(Park YD et.al; Towards a proteomic analysis of atopic dermatitis: a two-dimensional-polyacrylamide gel electrophoresis/mass spectrometric analysis of cultured patient-derived fibroblasts. Proteomics; 4:3446-3455; 2004 및 Park YD et. Al; Towards profiling the gene expression of fibroblasts from atopic dermatitis patients: human 8K complementary DNA microarray. Clin Exp Allergy; 36:649-657; 2006). 상기 수득한 섬유아세포를 공지된 방법에 따라 1차 배양하였으며(Park YD et.al; Towards a proteomic analysis of atopic dermatitis: a two-dimensional-polyacrylamide gel electrophoresis/mass spectrometric analysis of cultured patient-derived fibroblasts. Proteomics; 4:3446-3455; 2004 및 Park YD et. Al; Towards profiling the gene expression of fibroblasts from atopic dermatitis patients: human 8K complementary DNA microarray. Clin Exp Allergy; 36:649-657; 2006), 본 실험은 삼성생명과학연구소 의학윤리위원회(Samsung Biomedical Research Institute Medical Ethics Committee)의 승인을 받아 수행되었다.

< 실시예 1>

본 발명의 아토피성 피부질환 진단 마커의 검출

<1-1> 자유유동 전기영동법( FFE , free - flow electrophoresis ) 분석

상기 <참조예>에서 수득한 정상 섬유아세포, 외인성 섬유아세포 및 내인성 섬유아세포를 10mM의 HEPES pH 7.9 버퍼 용액 (1.5mM MgCl₂, 10mM KCl, 및 protease inhibitors Complete, Mini (Roche사 #11836153001) 함유)에 초음파를 사용하여 용해시켰다. 상기 시료들을 10분 동안 냉각하면서 배양하고, 100,000g 속도로 4°C, 30분 동안 원심 분리하였다. 상기 원심 분리후, 상층액을 회수하고 단백질 농도를 3mg/mL로 적정한 다음, 80°C에 저장하였다. 상기 단백질 용액을 각각 96-웰 플레이트(SepPak C18 solid phase extraction plate, Waters #186002321)에 담고, 각 웰에 50㎕의 1 % TFA(trifluoroacetic acid)를 첨가하여 요소용액(urea solution)에 있는 펩티드를 안정화시키고 카바밀화(carbamylation)를 방지하였다. 상기 플레이트를 각각 진공 다기관(vacuum manifold, Waters #097945)상에서 1mL 아세토니트릴(acetonitrile)을 사용하여 2번, 0.1 % TFA 용액을 사용하여 2번 평형화(equilibration)시켰다. 상기 펩티드를 C18 물질에 결합시키고 1mL의 0.1 % TFA 사용하여 2번 수세하였다. 이후, 500㎕의 70% 아세토니트릴을 사용하여 상기 펩티드를 플레이트로부터 녹여 분리하였다. 250㎕의 각 펩티드 용액을 진공 원심분리기를 사용하여 건조상태로 증발시켰다. 상기 과정을 통해 확보된 펩티드를 이용하여 당업계에 공지된 방법에 따라 자유유동 전기영동을 수행하였다.

상기 자유유동 전기영동의 결과를 도 1에 기재하였으며, 구체적으로 정상군의 경우를 도 1a에, 외인성 아토피 피부질환(ADe, extrinsic type of atopic dermatitis)의 경우를 도 1b에, 내인성 아토피 피부질환(ADi, intrinsic type of atopic dermatitis)의 경우를 도 1c에 기재하였다. 상기 도 1에 기재된 바와 같이 정상 대조군과는 달리 아토피성 피부 질환을 가진 환자에서 93개의 단백질이 특이적인 발현 양상을 나타내는 것을 알 수 있었다.

상기 단백질을 종래 공지된 방법(Park YD et. al., Two-dimensional electrophoretic profiling of atopic dermatitis in primary cultured keratinocytes from patients. Proteomics, 6:1362-1370, 2006)에 따라 LC-MS/MS(액체크로마토그래피/질량분석기)를 수행하였다.

구체적으로, 여러 경우에 질량분석(MALDI-TOF) 결과를 추가적으로 확인하기 위해 LC-MS/MS를 사용한 단백질 동정 방법이 이용된다. 대상이 되는 단백질 스팟을 변형된 트립신(Promega, Madison, WI, 미국)으로 추출하였다. 상기 트립픽 펩티드(tryptic peptides)의 추출 및 분석을 위해 스펙트로미터(Finnigan LCQ Duo ion trap mass spectrometer)가 직접 연결된 역상 고성능 액체크로마토그래피(reversed phase capillary HPLC)를 사용하였다. 트랩핑 칼럼(0.075×20mm)과 용해 칼럼(0.075×130mm)을 모두 TFA C18 beads(5㎛; Vydac, Hesperia, CA, 미국)로 팩킹하였다. 상기 펩티드를 0.1%(v/v) 포름산에 함유된 5%(v/v) 아세토니트릴을 사용하여 트랩핑 칼럼에 농축시켰다. 0.1 % (v/v) 포름산에 함유된 아세토니트릴 농도 구배를 5에서 80%로 조절하면서 50분 동안 0.15㎕/분 속도로 흘려주어 펩티드를 분리하였다. 상기 스펙트로미터를 이용하여 상기 분리된 펩티드의 MS/MS 스펙트라 서열(spectra sequences)을 분석하였다.

상기 분석된 MS/MS 스펙트라 서열(spectra sequences)을 마스콧 소프트웨어(www.matrixscience.com)를 사용하는 MSDB, OWL 또는 NCBI 비중복 단백질 데이터베이스(non-redundant protein database)상에 존재하는 펩티드 서열과 비교함으로써 동정하고 그 결과를 하기 표 1에 기재하였다. 특히 하기 표 1의 score, seq coverage 수치는 상기 소프트웨어를 이용한 검색 결과 자동으로 산출되는 데이터이다.

아토피성 피부 질환을 가진 환자에서 특이적인 발현 양상을 나타내는 단백질

Protein	Accession No.	Peptides Matched	Score	Seq. coverage (%)	pI value	Band No†
H⁺-transporting two-sector ATPase (EC 3.6.3.14) alpha chain precursor	PWHUA	ILGADTSVDLEETGR TGAIVDVPVGEELLGR	73	5	9.16	1
Stathmin (Leukemia-associated phosphoprotein p18)	A40936	ASGQAFELILSPR	50	8	5.76	1
Calreticulin* (Calcium binding protein)	A37047 gi\|913148	EQFLDGDGWTSR EQFLDGDGWTSR	49 56	2 38	4.29 6.86	1 10
Translation initiation factor eIF-4C	gi\|1082871	ELVFKEDGQEYAQVIK	66	11	5.07	2
cAMP - dependent protein kinase catalytic subunit alpha isoform 1 ( PRKACA )	gi\|4506055	RFGNLKNGVNDIK	44 34 31 37	3 3 3 3	8.84 8.84 8.84 8.84	2 5 27 29
Annexin A2 isoform 1 ( ANXA2 )	gi\|50845388	QDIAFAYQR	36	2	8.53	2
3- hydroxy -3- methylglutaryl - Coenzyme A synthase 1 ( HMG CS1 )	gi\|555833	SLAR LVSSTSDLPKR	31	4	8.05	2
CTP:phosphocholine cytidylyltransferase b	gi\|21361202	EFIGNFLELFGPDGAWK SPSR	37	5	5.99	2
Hematopoietic cell - specific Lyn substrate 1 ( HCLS1 )	gi\|30582487	KTTPIEAASSGARGLK	35	3	4.74	3
Histone H4	HSHU4	GKGGK ISGLIYEETR	67	14	11.36	4
Histone H2A.1	HSHUA1	AGLQFPVGR	46	6	10.90	4
Histone H2B (Testis-specific histone H2B)	H2BT_HUMAN	LLLPGELAK AMSIMNSFVTDIFER AMSIMNSFVTDIFER	45	19	10.32	4
HUMCYTOK NID	AAA35748	LALDIDIATYR LALDIDIATYR	50	2	5.30	4
Calmodulin-salmon	gi\|71664	ADQLTEEQIAEFK DTDSEEEIREAFR	48	17	4.09	4
CDC2 - related protein kinase *7 ( CRKRS** )	gi\|7706549	SGHK AQGTR QLMEGLEYCHKK	49 48	1 1 1 1	9.48 9.48 9.48 9.48	5 13 20 25
LMOD2 protein*	gi\|38541921	QPNSILKEIK	44 54 87 49 46	4 4 4 4 4	9.39 9.39 9.39 9.39 9.39	6 8 10 12 17
Histone H2A.2	gi\|31979	LLLPGELAK AMGIMNSFVNDIFER	112	19	10.21	7
Coiled-coil domain containing 2	gi\|13376669	MEEVMNGYNMLK MMQDDLNFK	27	4	5.17	7
Apolipoprotein E	gi\|178849	EGAERGLSAIR	34	3	5.65	8
Alpha-fetoprotein precursor	gi\|4501989	QEFLINLVK	34	1	5.48	8
TGF-betaIIR alpha	gi\|1827475	DLNSSNILVK	33	1	5.54	8
Histone H2B	gi\|28173554 gi\|1568557	ESYSIYVYK AMGIMNSFVNDIFER LLLPGELAK	152 135	26 36	10.31 10.31	9 13
Histone H3	gi\|386772	EIAQDFKTDLR	54	8	10.99	9
ENX-1	gi\|1279913	NVSCKNCSIQRGSK	41	2	5.74	9
ARR3	gi\|48145815	TSSNGKLSIYLVKR	40	3	5.53	9
Arrestin-C	gi\|2134787	TSSNGKLSIYLGKR	38	3	5.81	9
Leucine-zipper protein FKSG13*	gi\|11034809	SDQVNGVLVLSLLDK QAEMEGAVQSIQGELSK KLEVNEAELLR HTLEKRMNK	204 230	13 11	5.67 5.67	10 17
Desmin*	gi\|1408188	TNEKVELQELNDR VELQELNDR IESLNEEIAFLK EYQDLLNVK	201 136	7	5.21	10 12
Neurofilament 3 (150 kDa *medium) ( NEF3** )	gi\|4885513	KVQSLQDEVAFLR EYQDLLNVK	95 94 79	2 2 2	4.90 4.90 4.90	10 12 17
EMILIN1 protein	gi\|14043093	MADLGATKDR	46	2	4.77	10
Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K	gi\|55958544	TDYNASVSVPDSSGPER GSYGDLGGPIITTQVTIPK DLAGSIIGKGGQRIK	97	11	5.46	10
cAMP responsive element binding protein 3-like 3*	gi\|14211949	QNLSLLEQLK	44 38	2 2	4.99 4.99	10 12
Clathrin, light polypeptide isoform b	gi\|6005995	QSEQVEKNKINNR	41	5	4.57	10
ATP synthase, H⁺ transporting, mitochondrial F1 complex, alpha subunit, isoform 1, cardiac muscle*	gi\|15030240	ILGADTSVDLEETGR ILGADTSVDLEETGR TGAIVDVPVGEELLGR	85 115 98	2 5 2	9.07 9.07 9.07	10 12 29
Reductase,dihydrofolate	gi\|223661	GRINLVLSRELK INLVLSRELK	48	6	8.56	10
Histone H2A.5	gi\|70686	AGLQFPVGR VTIAQGGVLPNIQAVLLPK	47	21	11.05	11
Epithelial sodium channel beta subunit	gi\|563833	LVALAK	29	4	4.49	11
Neurofilament, light polypeptide 68kDa	gi\|5453762	FASFIER EYQDLLNVK	69	2	4.66	12
Chain B, Crystal Structure Of The N-Terminal Coiled Coil Domain From Apc	gi\|10120598	EVLKQLQGSI QELEDNSNHLTK	53 28	40 18	4.91 4.91	12 25
H2B histone family, member F	gi\|10800140	LLLPGELAK ESYSIYVYK MPEPSKSAPAPKK AMGIMNSFVNDIFER	144	36	10.31	13
H2B histone family, member C	gi\|4504259	LLLPGELAK ESYSVYVYK MPELAKSAPAPKK AMGIMNSFVNDIFER	138	36	10.31	13
Histone H4	gi\|223582	TLYGFGG VFLENVIR DDIQGITKPAIR	99	26	11.20	13
Nucleolin ( Protein C23 ) ( NCL )	gi\|128841	ALELTGLK TGISDVFAK GIAYIEFK GFGFVDFNSEEDAK FGYVDFESAEDLEK	219	7	4.59	14
hnRNP U protein	gi\|32358	NFILDQTNVSAAAQR SSGPTSLFAVTVAPPGAR	152	4	5.60	14
Eukaryotic translation initiation factor 3, subunit 9 eta, 116kDa	gi\|51094702	GTQGVVTNFEIFR	52	1	4.89	14
Heat shock protein gp96 precursor	gi\|15010550	LIINSLYK FAFQAEVNR SILFVPTSAPR ELISNASDALDK EFEPLLNWMK GVVDSDDLPLNVSR EEASDYLELDTIK NLLHVTDTGVGMTR DDEVDVDGTVEEDLGK	512	13	4.73	15
Heat shock 90 kDa protein 1, alpha isoform 1 ( HSPCA )	gi\|72219	APFDLFENR ADLINNLGTIAK EDQTEYLEER TLTIVDTGIGMTK EGLELPEDEEEK GVVDSEDLPLNISR SLTNDWEDHLAVK YESLTDPSKLDSGK YYTSASGDEMVSLK NPDDITNEEYGEFYK	698			16
Heat shock 90 kDa protein 1 beta (tumor rejection antigen -1) ( TRA1 )	gi\|34304590	IDIIPNPQER ADLINNLGTIAK ELISNASDALDK EDQTEYLEER TLTLVDTGIGMTK EGLELPEDEEEK GVVDSEDLPLNISR SLTNDWEDHLAVK YESLTDPSKLDSGK NPDDITQEEYGEFYK	683	18	4.97	16
Tumor necrosis factor type 1 receptor associated protein (TRAP-1)	gi\|1082886	GVVDSEDIPLNLSR	80	2	8.43	16
Tubulin alpha 6 ( TUBA 6)	gi\|14389309	AVFVDLEPTVIDEVR VGINYQPPTVVPGGDLAK	64	7	4.96	16
Epican	gi\|31191	ESSETPDQFMTADETR	58	2	5.11	16
Protein disulfide isomerase-related protein 5	gi\|1710248	TGEAIVDAALSALR LAAVDATVNQVLASR GSTAPVGGGAFPTIVER GSTAPVGGGAFPTIVER	291	10	4.95	18
Alpha - tubulin ( TUBA3 )	gi\|37492	AVFVDLEPTVIDEVR NLDIERPTYTNLNR VGINYQPPTVVPGGDLAK	122	10	5.02	18
Gamma enolase	gi\|930101	GNPTVEVDLYTAK	37	3	4.94	18
Glucocorticoid receptor AF-1 specific elongation factor	gi\|7108915	LPLQDVYK EHALLAYTLGVK YYVTIIDAPGHR	170	7	9.08	18
EEF1A1 protein	gi\|48735185	LPLQDVYK EHALLAYSQKR YYVTIIDAPGHR	143	7	9.12	18
Eukaryotic translation elongation factor 1 gamma	gi\|15530265	ALIAAQYSGAQVR	85	2	6.25	18
Heat shock protein Hsp47 precursor	gi\|105724	HLAGLGLTEAIDK	87			18
GTPase-activating protein rhoGAP	gi\|1082428	NPEQEPIPIVLR	65			18
Gamma-actin	gi\|178045	DLTDYLMK GYSFTTTAER QEYDESGPSIVHR SYELPDGQVITIGNER	273	25	5.65	19
Reticulocalbin 1 precursor ( RCN 1)	gi\|4506455	IDNDGDGFVTTEELK	69	4	4.86	19
Novel protein similar to heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C	gi\|3171899	VFIGNLNTLVVK	62	4	4.93	19
Annexin A2, isoform 2*	gi\|18645167	DALNIETAIK SLYYYIQQDTK SYSPYDMLESIR LSLEGDHSTPPSAYGSVK AEDGSVIDYELIDQDAR	280 214	20 13	7.57 7.57	20 30
Tropomyosin 1 alpha chain (Alpha-tropomyosin) ( TPM 1)	gi\|136092	IQLVEEELDR QLEDELVSLQK	112	7	4.69	20
Semenogelin II precursor	gi\|4506885	QHLGGSQQLLNYK	104	2	9.08	20
Seminal peptide 20	gi\|225667	LPSEFSQFPHGAGK	70	70	8.59	20
Seminal plasma peptide	gi\|261592	LPSEFSQFPHGQK	70	52	9.53	20
GOLGIN-160	G160_HUMAN	HFKAASLELSEVKK HFKAASLELSEVKK	42	2	5.74	21
Nonmuscle myosin heavy chain (NMHC)*	gi\|189036	IAQLEEQLDNETK IAEFTTNLTEEEEK	71	2 2 2	5.23 5.23 5.23	22 23 24
T cell receptor beta chain	gi\|29646939	CASSEELAGGSYNEQ	21	100	3.68	22
Beta-cop homolog	gi\|5257007	LLLVFWEIVPK	44	1	5.64	23
Phospholipid scramblase 4	gi\|9966819	AVYSIQNEKK	28	3	5.53	23
HEJ1	gi\|14719299	EQYSAVIIAK	34 53	15 15	9.00 9.00	26 34
2-phosphopyruvate-hydratase alpha-enolase*	gi\|693933	GNPTVEVDLFTSK YISPDQLADLYK	59 117	5 5	7.01 7.01	27 29
ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F1 complex, alpha subunit isoform b	gi\|50345982	VVDALGNAIDGK HALIIYDDLSK TSIAIDTIINQK EAYPGDVFYLHSR ILGADTSVDLEETGR	364	12	8.24	27
Cytochrome b ( CYTB )	gi\|29690503	MTPMRKTNPLMK	31	3	7.84	27
Cytidylate kinase	gi\|15928999	IVPVEITISLLK	23	5	8.45	28
Annexin A2, isoform 2	gi\|18645167	DALNIETAIK GVDEVTIVNILTNR SYSPYDMLESIR SLYYYIQQDTK	214	13	7.57	30
LIM homeobox transcription factor 1, alpha isoform 6A	gi\|28893581	QLQKGDEFVLK	25	2	7.03	30
Coiled - coil - helix - coiled - coil - helix domain containing 3 ( CHCHD3 )	gi\|51094828	RVAEELALEQAK	23	5	8.48	31
Ankyrin repeat-containing protein ASB-2	gi\|5566244	DGDEEALKTMIK	32	2	7.23	32
Brain-derived neurotrophic precursor (BDNF)	BDNF_HUMAN	TAVDMSGGTVTVLEK	19	6	9.01	33
Olfactory receptor-like protein HGMP07E (OR17-4)	OLFE_HUMAN	NKDMHGALGR	16	3	8.99	33
BAI1-associated protein 2-like 2	gi\|15990471	AAELEEKRR RSLPR	45	2	9.66	36
Immunoglobulin heavy chain VHDJ region	gi\|21670231	GLEWIGEISQR	36	8	9.34	36
LIM and senescent cell antigen-like domains 1 ( LIMS1 )	gi\|13529137	VIEGGVVSALNK	29	3	8.50	36
CD5 antigen (p56-62)	gi\|7656965	VLDAGDPTSR	28	2	8.66	36
Paraneoplastic neuronal antigen MA3	gi\|6179740	AVENNVVSRR	26	2	9.59	36
Protease serine 1	gi\|29649713	VLEGNEQFINAAK TLNNDIMLIKLSSR	37	32	10.28	37
SWI / SNF - related matrix-associated actin-dependent regulator of chromatin a5 ( SMARCA5 )	gi\|18606276	MVVLDKLLPKLK	23	1	8.27	37
TLL2 protein	gi\|33878312	FCGDKIPEPLVSTDSR	17	2	8.22	37
HSGAPDR NID: g31644	HSGAPDR	IISNASCTTNCLAPLAK GALQNIIPASTGAAK	46	9	8.26	38
(BDNF_HUMAN) Splice isoform Displayed	P23560-00-00-00	TAVDMSGGTVTVLEK	33	6	9.01	40

* 다수 검출된 단백질

† Band No: 도1의 밴드 번호와 일치

<1-2> 실시간 중합효소 연쇄반응( real - time PCR )

상기 <실시예 1-1>에서 아토피성 피부 질환을 가진 환자에서 특이적인 발현 양상을 나타내는 단백질의 발현 양상을 실시간 중합효소 연쇄반응을 통하여 확인하였다. 보다 구체적으로 종래 공지된 방법(Park YD et. al., Towards profiling the gene expression of fibroblasts from atopic dermatitis patients: human 8K complementary DNA microarray. Clin Exp Allergy, 36:649-657, 2006)에 따라 하기 표 2에 나타낸 프라이머를 사용하여 ABI PRISM^？ 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems, CA, USA)을 통해 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하였다.

실시간 중합효소 연쇄반응에 사용된 프라이머

Name	Description		Sequence	Expected size (bp)
CYTB	Cytochrome b	Forward	5'-CAGGCTTCCACGGACTTCAC-3'(서열번호 1)	180
		Reverse	5'-ACCCTCATCAATAGATGGAGACA-3'(서열번호 2)
NCL	Nucleolin (Protein C23)	Forward	5'-GAAGCACCTGGAAAACGAAAGA-3'(서열번호 3)	98
		Reverse	5'-AAAGCCGTAGTCGGTTCTGTG-3'(서열번호 4)
CHCHD3	Coiled-coil-helix-coiled-coil-helix domain containing 3	Forward	5'-GAGGCGGACGAGAATGAGAAC-3'(서열번호 5)	117
		Reverse	5'-ACCAGAATACCGCTGAGACTTC-3'(서열번호 6)
LIMS1	LIM and senescent cell antigen-like domains 1	Forward	5'-ATCATTGGCCGAGTTATCAAAGC-3'(서열번호 7)	119
		Reverse	5'-AGGTGTCTCCCAGCATTCTTG-3'(서열번호 8)
NEF3	Neurofilament 3 (150kDa medium)	Forward	5'-GATCCAGGCATCGCACATCA-3'(서열번호 9)	118
		Reverse	5'-CTGGTGCATATTCTGGTCTGAG-3'(서열번호 10)
ANXA2	Annexin A2 isoform 1	Forward	5'-TCTACTGTTCACGAAATCCTGTG-3'(서열번호 11)	133
		Reverse	5'-TGGCTGTTTCAATGTTCAAAGC-3'(서열번호 12)
CRKRS	CDC2-related protein kinase 7	Forward	5'-GTCACCGCTTGGTATCGAAG-3'(서열번호 13)	149
		Reverse	5'-GGAGAAGGTGTCGGAATCAGA-3'(서열번호 14)
HCLS1	Hematopoietic cell-specific Lyn substrate 1	Forward	5'-AGTGGGCCATGATGTGTCTG-3'(서열번호 15)	104
		Reverse	5'-CTCCCCATCGTTGCTCCTTTT-3'(서열번호 16)
HMGCS1	3-hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzyme A synthase 1	Forward	5'-GTGCCCGAAGGAGGAAACAG-3'(서열번호 17)	82
		Reverse	5'-TGATCCAGGCATGGTGAAAGA-3'(서열번호 18)
PRKACA	cAMP-dependent protein kinase catalytic subunit alpha isoform 1	Forward	5'-CACAACTGACTGGATTGCCAT-3'(서열번호 19)	122
		Reverse	5'-TGGAGACCCGGATTTCTTCTTC-3'(서열번호 20)
RCN1	Reticulocalbin 1 precursor	Forward	5'-TGGATCAAACGGGTGCAGAAA-3'(서열번호 21)	128
		Reverse	5'-AGGTAGTAACCATAGGTGGCTTG-3'(서열번호 22)
SMARCA5	SWI/SNF-related matrix-associated actin-dependent regulator of chromatin a5	Forward	5'-TGCAAACTGACCGGGCAAATA-3'(서열번호 23)	167
		Reverse	5'-GCCAACGGATAGTAAGTTCTG C-3'(서열번호 24)
TPM1	Tropomyosin 1 alpha chain	Forward	5'-CCACGCTCTCAACGATATGA-3'(서열번호 25)	90
		Reverse	5'-CAGAGAGGTGGGACATCCAG-3'(서열번호 26)
TRA1	Tumor rejection antigen (gp96) 1	Forward	5'-TCTATGTGCGCCGTGTATTCA-3'(서열번호 27)	113
		Reverse	5'-GCGGGAAACATTCAAGGGGA-3'(서열번호 28)
TUBA3	Tubulin alpha 3	Forward	5'-CTTCGTCTCCGCCATCAG-3'(서열번호 29)	95
		Reverse	5'-TTGCCAATCTGGACACCA-3'(서열번호 30)
TUBA6	Tubulin alpha 6	Forward	5'-TGCTCATGGAACGTCTCTCAG-3'(서열번호 31)	243
		Reverse	5'-GGCTAATAAGGCGGTTAAGGTT-3'(서열번호 32)
HSPCA	Heat shock 90kDa protein 1, alpha isoform 1	Forward	5'-TGGATATCCCATTACTCTTTTTGTG-3'(서열번호 33)	96
		Reverse	5'-TCTTTTTCTTCTTCTTTGTCTTCCTT-3'(서열번호 34)

상기 실시간 중합효소 연쇄 반응한 결과를 하기 표 3 및 도 2에 기재하였다. 하기 표 3 및 도 2에 기재한 바와 같이, 정상 대조군과는 달리 아토피성 피부 질환을 가진 환자에서 특이적인 발현 양상을 나타내는 유전자를 검출할 수 있었다. 보다 구체적으로 하기 표 3에 기재한 바와 같이, CYTB(NCBI GeneID: 6775065), NCL(NCBI GeneID: 4691), CHCHD3(NCBI GeneID: 54927), LIMS1(NCBI GeneID: 3987), NEF3(NCBI GeneID: 4741), ANXA2(NCBI GeneID: 302), CRKRS(NCBI GeneID: 51755), HCLS1(NCBI GeneID: 3059), HMGCS1(NCBI GeneID: 3157), PRKACA(NCBI GeneID: 5566), RCN1(NCBI GeneID: 5954), SMARCA5(NCBI GeneID: 8467), TPM1(NCBI GeneID: 7168), TRA1(NCBI GeneID: 7184), TUBA3(NCBI GeneID: 7846), TUBA6(NCBI GeneID: 84790)의 유전자의 발현이 감소하는 경우 아토피성 피부 질환 환자로 판단할 수 있으며, 또한 HSPCA(NCBI GeneID: 3320) 유전자의 발현이 증가하는 경우 아토피성 피부 질환 환자로 판단할 수 있다. 한편 TUBA3(NCBI GeneID: 7846) 유전자의 발현이 증가하는 경우 외인성 아토피성 피부 질환 환자로 판단할 수 있으며 TUBA3(NCBI GeneID: 7846) 유전자의 발현이 감소하는 경우 내인성 아토피성 피부 질환 환자로 판단할 수 있다.

아토피성 피부 질환을 가진 환자에서 특이적인 발현 양상을 나타내는 유전자

Name	AD type
Name	ADe (%)*	ADi (%)*
CYTB	57 ±6.2	47 ±3.2
NCL	42 ±1.7	35 ±1.0
CHCHD3	26 ±3.8	23 ±2.1
LIMS1	46 ±0.6	42 ±4.9
NEF3	61 ±5.1	42 ±3.4
ANXA2	60 ±4.5	44 ±2.7
CRKRS	62 ±5.2	52 ±1.7
HCLS1	77 ±4.0	77 ±5.1
HMGCS1	82 ±11.1	43 ±2.7
PRKACA	87 ±3.4	50 ±4.9
RCN1	58 ±2.1	41 ±1.5
SMARCA5	62 ±2.3	24 ±0.9
TPM1	75 ±4.7	36 ±3.5
TRA1	76 ±4.2	41 ±1.3
TUBA3	126 ±8.3	87 ±4.3
TUBA6	79 ±5.4	55 ±1.8
HSPCA	118 ±9.0	102 ±6.2

* 상기 %는 정상군(100%)에 대한 비교 %를 의미하며, 각 데이터는 정상군(10명), 외인성 아토피성 피부질환 환자(10명) 및 내인성 아토피성 피부질환 환자(10명)에 대한 평균* 상기 %는 정상군(100%)에 대한 비교 %를 의미하며, 각 데이터는 정상군(10명), 외인성 아토피성 피부질환 환자(10명) 및 내인성 아토피성 피부질환 환자(10명)에 대한 평균±표준편차를 의미한다.

도 1은 자유유동 전기영동의 결과를 나타낸 것으로, 도 1a는 정상군의 경우를 도 1b는 외인성 아토피 피부질환(ADe, extrinsic type of atopic dermatitis)의 경우를, 도 1c는 내인성 아토피 피부질환(ADi, intrinsic type of atopic dermatitis)의 경우를 나타낸 것이다.

도 2는 실시간 중합효소 연쇄반응을 통해 선별한 외인성 또는 내인성 아토피 피부염 환자에서의 유전자 발현의 정도를 검증한 결과를 보여주는 것이다.

<110> SAMSUNG LIFE PUBLIC WELFARE FOUNDATION SAMSUNG MEDICAL CENTER <120> MARKER FOR THE DIAGNOSIS OF ATOIC DERMATITIS <130> DPP20090577KR <160> 34 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYTB_Forward primer <400> 1 caggcttcca cggacttcac 20 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYTB_Reverse primer <400> 2 accctcatca atagatggag aca 23 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCL_Forward primer <400> 3 gaagcacctg gaaaacgaaa ga 22 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCL_Reverse primer <400> 4 aaagccgtag tcggttctgt g 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHCHD3_Forward primer <400> 5 gaggcggacg agaatgagaa c 21 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHCHD3_Reverse primer <400> 6 accagaatac cgctgagact tc 22 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LIMS1_Forward primer <400> 7 atcattggcc gagttatcaa agc 23 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LIMS1_Reverse primer <400> 8 aggtgtctcc cagcattctt g 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NEF3_Forward primer <400> 9 gatccaggca tcgcacatca 20 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NEF3_Reverse primer <400> 10 ctggtgcata ttctggtctg ag 22 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ANXA2_Forward primer <400> 11 tctactgttc acgaaatcct gtg 23 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ANXA2_Reverse primer <400> 12 tggctgtttc aatgttcaaa gc 22 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRKRS_Forward primer <400> 13 gtcaccgctt ggtatcgaag 20 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRKRS_Reverse primer <400> 14 ggagaaggtg tcggaatcag a 21 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCLS1_Forward primer <400> 15 agtgggccat gatgtgtctg 20 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCLS1_Reverse primer <400> 16 ctccccatcg ttgctccttt t 21 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMGCS1_Forward primer <400> 17 gtgcccgaag gaggaaacag 20 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMGCS1_Reverse primer <400> 18 tgatccaggc atggtgaaag a 21 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRKACA_Forward primer <400> 19 cacaactgac tggattgcca t 21 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRKACA_Reverse primer <400> 20 tggagacccg gatttcttct tc 22 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RCN1_Forward primer <400> 21 tggatcaaac gggtgcagaa a 21 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RCN1_Reverse primer <400> 22 aggtagtaac cataggtggc ttg 23 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SMARCA5_Forward primer <400> 23 tgcaaactga ccgggcaaat a 21 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SMARCA5_Reverse primer <400> 24 gccaacggat agtaagttct gc 22 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TPM1_Forward primer <400> 25 ccacgctctc aacgatatga 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TPM1_Reverse primer <400> 26 cagagaggtg ggacatccag 20 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRA1_Forward primer <400> 27 tctatgtgcg ccgtgtattc a 21 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRA1_Reverse primer <400> 28 gcgggaaaca ttcaagggga 20 <210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TUBA3_Forward primer <400> 29 cttcgtctcc gccatcag 18 <210> 30 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TUBA3_Reverse primer <400> 30 ttgccaatct ggacacca 18 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TUBA6_Forward primer <400> 31 tgctcatgga acgtctctca g 21 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TUBA6_Reverse primer <400> 32 ggctaataag gcggttaagg tt 22 <210> 33 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSPCA_Forward primer <400> 33 tggatatccc attactcttt ttgtg 25 <210> 34 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSPCA_Reverse primer <400> 34 tctttttctt cttctttgtc ttcctt 26

Claims

HCLS1(NCBI GeneID: 3059) 유전자로부터 얻어지는 mRNA에 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 프로브; 및

상기 유전자에 의하여 코딩되는 단백질을 검출하기 위한 항체

로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는

아토피성 피부질환 진단용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 추가적으로,

CYTB(NCBI GeneID: 6775065), NCL(NCBI GeneID: 4691), CHCHD3(NCBI GeneID: 54927), LIMS1(NCBI GeneID: 3987), NEF3(NCBI GeneID: 4741), ANXA2(NCBI GeneID: 302), CRKRS(NCBI GeneID: 51755), HMGCS1(NCBI GeneID: 3157), PRKACA(NCBI GeneID: 5566), RCN1(NCBI GeneID: 5954), SMARCA5(NCBI GeneID: 8467), TPM1(NCBI GeneID: 7168), TRA1(NCBI GeneID: 7184), TUBA3(NCBI GeneID: 7846), TUBA6(NCBI GeneID: 84790) 및 HSPCA(NCBI GeneID: 3320) 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자로부터 얻어지는 mRNA에 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 프로브; 및

상기 1종 이상의 유전자에 의하여 코딩되는 단백질을 검출하기 위한 항체

로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는

아토피성 피부질환 진단용 조성물.
제1항 또는 제2항의 조성물을 포함하는 아토피성 피부질환 진단용 바이오칩.
아토피성 피부질환의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 피검체로부터 얻은 시료에서 아토피성 피부질환 마커 HCLS1(NCBI GeneID: 3059) 유전자의 발현 정도를 측정하여 이를 정상 개체에서의 해당 유전자의 발현 정도와 비교하는 단계를 포함하는, 아토피성 피부질환 마커를 검출하는 방법.
제4항에 있어서, 추가적으로,

피검체로부터 얻은 시료에서 CYTB(NCBI GeneID: 6775065), NCL(NCBI GeneID: 4691), CHCHD3(NCBI GeneID: 54927), LIMS1(NCBI GeneID: 3987), NEF3(NCBI GeneID: 4741), ANXA2(NCBI GeneID: 302), CRKRS(NCBI GeneID: 51755), HMGCS1(NCBI GeneID: 3157), PRKACA(NCBI GeneID: 5566), RCN1(NCBI GeneID: 5954), SMARCA5(NCBI GeneID: 8467), TPM1(NCBI GeneID: 7168), TRA1(NCBI GeneID: 7184), TUBA3(NCBI GeneID: 7846), TUBA6(NCBI GeneID: 84790) 및 HSPCA(NCBI GeneID: 3320)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아토피성 피부질환 마커 유전자의 발현 정도를 측정하여 이를 정상 개체에서의 해당 유전자의 발현 정도와 비교하는 단계를 포함하는,

아토피성 피부질환 마커를 검출하는 방법.
후보물질을 생검 시료와 접촉시키는 단계;

상기 후보물질이 접촉된 시료에서의 HCLS1(NCBI GeneID: 3059) 유전자의 발현 정도를 측정하는 단계;

상기 후보물질이 접촉된 시료에서 측정된 발현 정도를 후보물질이 접촉되지 않은 시료에서의 해당 유전자의 발현 정도와 비교하는 단계; 및

상기 비교 결과 후보물질이 접촉된 시료에서 상기 유전자의 발현이 후보물질 접촉되지 않은 시료보다 감소되는 경우, 상기 후보물질을 아토피성 피부질환 유발인자로 판단하는 단계

를 포함하는 아토피성 피부질환 유발인자 탐색 방법.
제6항에 있어서, 추가적으로,

후보물질을 생검 시료와 접촉시키는 단계;

상기 후보물질이 접촉된 시료에서의 CYTB(NCBI GeneID: 6775065), NCL(NCBI GeneID: 4691), CHCHD3(NCBI GeneID: 54927), LIMS1(NCBI GeneID: 3987), NEF3(NCBI GeneID: 4741), ANXA2(NCBI GeneID: 302), CRKRS(NCBI GeneID: 51755), HMGCS1(NCBI GeneID: 3157), PRKACA(NCBI GeneID: 5566), RCN1(NCBI GeneID: 5954), SMARCA5(NCBI GeneID: 8467), TPM1(NCBI GeneID: 7168), TRA1(NCBI GeneID: 7184), TUBA3(NCBI GeneID: 7846), TUBA6(NCBI GeneID: 84790) 및 HSPCA(NCBI GeneID: 3320)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자의 발현 정도를 측정하는 단계;

상기 후보물질이 접촉된 시료에서 측정된 발현 정도를 후보물질이 접촉되지 않은 시료에서의 해당 유전자의 발현 정도와 비교하는 단계; 및

상기 비교 결과 후보물질이 접촉된 시료에서 상기 유전자의 발현 정도에 변화가 관찰되는 경우, 상기 후보물질을 아토피성 피부질환 유발인자로 판단하는 단계

를 포함하는 아토피성 피부질환 유발인자 탐색 방법.
후보물질을 아토피성 피부질환 환자로부터 얻은 시료와 접촉시키는 단계;

상기 후보물질이 접촉된 시료에서의 HCLS1(NCBI GeneID: 3059) 유전자의 발현 정도를 측정하는 단계;

상기 후보물질이 접촉된 아토피성 피부질환 환자의 시료에서 측정된 발현 정도를 후보물질이 접촉되지 않은 아토피성 피부질환 환자의 시료에서의 해당 유전자의 발현 정도와 비교하는 단계; 및

상기 비교 결과 후보물질이 접촉된 시료에서 상기 유전자의 발현이 후보물질 접촉되지 않은 시료보다 증가되는 경우, 상기 후보물질을 아토피성 피부질환의 예방, 경감 또는 치료 물질로 판단하는 단계

를 포함하는 아토피성 피부질환의 예방, 경감 또는 치료 물질의 탐색 방법.
제8항에 있어서, 추가적으로,

후보물질을 아토피성 피부질환 환자로부터 얻은 시료와 접촉시키는 단계;

상기 후보물질이 접촉된 시료에서의 CYTB(NCBI GeneID: 6775065), NCL(NCBI GeneID: 4691), CHCHD3(NCBI GeneID: 54927), LIMS1(NCBI GeneID: 3987), NEF3(NCBI GeneID: 4741), ANXA2(NCBI GeneID: 302), CRKRS(NCBI GeneID: 51755), HMGCS1(NCBI GeneID: 3157), PRKACA(NCBI GeneID: 5566), RCN1(NCBI GeneID: 5954), SMARCA5(NCBI GeneID: 8467), TPM1(NCBI GeneID: 7168), TRA1(NCBI GeneID: 7184), TUBA3(NCBI GeneID: 7846), TUBA6(NCBI GeneID: 84790) 및 HSPCA(NCBI GeneID: 3320)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자의 발현 정도를 측정하는 단계;

상기 후보물질이 접촉된 아토피성 피부질환 환자의 시료에서 측정된 발현 정도를 후보물질이 접촉되지 않은 아토피성 피부질환 환자의 시료에서의 해당 유전자의 발현 정도와 비교하는 단계; 및

상기 비교 결과 후보물질이 접촉된 아토피성 피부질환 환자의 시료에서의 상기 유전자의 발현 정도의 변화가 관찰되는 경우, 상기 후보물질을 아토피성 피부질환의 예방, 경감 또는 치료 물질로 판단하는 단계

를 포함하는 아토피성 피부질환의 예방, 경감 또는 치료 물질의 탐색 방법.