CN108957013B

CN108957013B - 与骨关节炎相关的iglon5和serpinb13蛋白及其应用

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Publication number: CN108957013B
Application number: CN201811120793.5A
Authority: CN
Inventors: 范彧; 杨波; 王海; 林进; 吴志宏; 张保中; 常晓
Original assignee: Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
Current assignee: Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
Priority date: 2018-09-26
Filing date: 2018-09-26
Publication date: 2021-05-11
Anticipated expiration: 2038-09-26
Also published as: CN108957013A

Abstract

本发明提供了一种蛋白检测试剂，所述试剂包括检测骨关节炎样本中IGLON5和SERPINB13表达水平的试剂。本发明还提供了所述蛋白检测试剂在制备检测、辅助诊断骨关节炎试剂或试剂盒中的应用。进一步，本发明还提供一种用于检测骨关节炎疾病的ELISA试剂盒，所述试剂盒检测样本为尿液标本，获取无创、可大规模重复取样、保存方便的优势。本发明提供的骨关节炎相关的尿液蛋白可作为骨关节炎的早期生物标志物，为进一步研究骨关节炎的病理机制，为探索骨关节炎早期防治的药物靶点提供了新的方向。

Description

与骨关节炎相关的IGLON5和SERPINB13蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及生物医学检测技术领域，具体涉及与骨关节炎相关的IGLON5和SERPINB13蛋白及其应用。

背景技术

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种多因素导致发病的，在中老年人群中十分常见的慢性退行性关节疾病，在全球分布广泛，女性多于男性，常见于膝关节、手指小关节、髋关节，也可见于肩关节、腕关节、踝关节等。骨关节炎是以关节软骨磨损、退变和关节周缘骨质增生为特征，急性期还常伴有滑膜炎。据调查，骨关节炎在60岁以上人群中患病率达50％以上，75岁以上人群患病率高达80％，该疾病的致残率可达53％。

膝关节骨关节炎造成膝关节疼痛、肿胀、僵硬、膝关节活动度受限和功能障碍等，严重影响患者的生活质量，最终也间接影响其预期寿命。目前，由于对OA的病因学尚缺乏根本性的认识，医学界对其根治仍然缺乏行之有效的药物手段，关节置换手术往往成为患者最终必须选择的治疗方式。为了走出OA治疗方面的困境，阐明OA的病因学机理并在其基础上探索治疗OA的有效方案，成为了医学界有待突破的研究方向。

蛋白质组的定义是指一个基因组、一个或多个细胞或某些组织所表达的所有蛋白质，无论是小到一个细胞还是大到一个生物体，都是从一个整体水平去研究参与生命活动的所有蛋白质。这些所有蛋白质并不是一个一成不变的集合，而是随时随地变化着的，因为随着生命活动的进行和稳态的调节总有不同的蛋白质在被表达或修饰。蛋白质是生命活动的承担者，也是大多数生物体结构的组成部分，蛋白质的形成要经过一系列的转录后修饰，因此，从基因组和转录组并不能直接推导出蛋白质组的情况。

蛋白质组学研究的标本可以是组织、细胞、血液、关节液、尿液等，早年对尿蛋白质组学的研究往往局限于泌尿系统疾病，后来逐渐扩展到全身性的以代谢紊乱为表现的疾病。由于尿液中很少有高丰度蛋白的影响，相比血液和关节液而言，尿蛋白质组学更有利于寻找疾病的生物标志物，同时可能在疾病机理上有所发现。

目前骨科关节领域用尿液为标本进行尿蛋白质组学的研究并不多，随着以iTRAQ技术等高通量蛋白质组学技术的出现和发展，这一领域的尿蛋白质组学研究呈现出逐渐增多的趋势。如前言所述，越来越多的证据表明骨关节炎的发生和发展与代谢因素有关，与此同时，很多学者多年来也在试图寻找骨关节炎的生物标志物未果，因此，很适合用尿蛋白质组学的方法来探索骨关节炎的生物标志物和研究其相关病理机制。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种用于骨关节炎疾病早期检测的尿蛋白组学生物标志物IGLON5和SERPINB13，并提供其在制备检测骨关节炎试剂或试剂盒中应用。

本发明首先提供一种蛋白检测试剂，所述试剂包括检测骨关节炎样本中IGLON5和SERPINB13表达水平的试剂。

优选的，所述蛋白检测试剂能够通过检测受试者样本中IGLON5和SERPINB13蛋白的表达水平来检测是否患有骨关节炎的风险。

优选的，所述骨关节炎样本为尿液样本。

进一步地，本发明提供了所述的蛋白检测试剂在制备检测、辅助诊断骨关节炎试剂或试剂盒中的应用。

优选的，所述IGLON5和SERPINB13蛋白在骨关节炎样本中表达下调。

优选的，所述检测包括：

a)获得受试者和正常对照的尿液，

b)任选地，分离尿蛋白，

c)确定所述受试者和正常对照的尿液中IGLON5和SERPINB13蛋白的表达水平，

d)将所述受试者和正常对照的尿液中蛋白的表达水平进行比较，

e)根据步骤d)的比较结果，检测所述受试者是否患有骨关节炎疾病。

优选的，使用选自以下的方法进行步骤c)中的所述确定：质谱方法、ELISA方法、Westernblot方法或其组合。

进一步地，本发明还提供了一种用于检测骨关节炎疾病的ELISA试剂盒，其包含IGLON5和SERPINB13蛋白的检测试剂。

优选的，所述IGLON5和SERPINB13蛋白的检测试剂包括IGLON5和SERPINB13蛋白的特异性抗体试剂。

优选的，所述IGLON5和SERPINB13蛋白的特异性抗体为单克隆抗体和/或多克隆抗体。

本发明检测骨关节炎疾病的ELISA试剂盒采用的包被抗体为抗IGLON5和SERPINB13单克隆抗体，包被抗体的作用是捕获待测样品(例如，尿液)中的IGLON5和SERPINB13，其捕获原理是通过抗原抗体的特异性结合。本发明对包被抗体的要求是能够捕获抗原分子IGLON5和SERPINB13上的抗原决定簇，从而使二者能够有效的特异性结合，因此，满足可与抗原分子特异性结合的抗体，包括鼠、兔、鸡、狗或猴等种属源性的抗IGLON5和SERPINB13单克隆抗体均可采用为包被抗体。

本发明检测骨关节炎疾病的ELISA试剂盒采用的检测抗体为抗IGLON5和SERPINB13多克隆抗体，检测抗体的作用是与包被抗体上的抗原分子IGLON5和SERPINB13相结合，从而检测待测样品中的IGLON5和SERPINB13。本发明对检测抗体的要求是能够检测与抗原分子IGLON5和SERPINB13上的抗原决定簇上相结合的，因此，满足可与抗原分子特异性结合的抗体，包括鼠、兔、鸡、狗、猴等种属源性的抗IGLON5和SERPINB13多克隆抗体均可采用为检测抗体。

优选的，所述抗体可以通过商购途径获得，也可以自行制备，所述制备方法是所属技术领域人员已知的。

需要特别说明的是，包被抗体和检测抗体虽然同为抗IGLON5或SERPINB13抗体，但是不能采用同一种属的抗IGLON5或SERPINB13抗体。原因在于：采用不同种属的抗IGLON5或SERPINB13抗体是为了使检测抗体能够结合到与包被抗体不同的抗原位点上，从而检测不同的抗原表位，以及当采用同一种属的抗体时，带有显色反应酶的抗体可同时与捕获及检测抗体相结合，致使显色反应不具有特异性，无法确定待测抗原的量。因此，在选择包被抗体和检测抗体时，需要选取来自于不同种属的抗IGLON5或SERPINB13抗体。

优选的，所述试剂盒还包括抗IGLON5和SERPINB13单克隆抗体包被的酶标板、标记抗IGLON5和SERPINB13多克隆抗体、蛋白标准品IGLON5和SERPINB13、TMB底物溶液、稀释液、洗涤缓冲液、终止溶液。

更进一步地，本发明提供所述试剂盒在制备检测或辅助诊断骨关节炎的试剂盒中的应用。

更进一步地，本发明还提供IGLON5和SERPINB13蛋白在制备治疗骨关节炎药物中的应用。

优选的，所述IGLON5和SERPINB13蛋白是通过构建外源过表达载体在制备治疗骨关节炎药物中的应用。

优选的，所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。

在本发明中，是本领域已知的各种载体，如市售的载体、包括质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。表达载体向宿主细胞中的导入可以使用电穿孔法、磷酸钙法、脂质体法、DEAE葡聚糖法、显微注射、病毒感染、脂质体转染、与细胞膜透过性肽的结合等周知的方法。

在本发明中，“宿主细胞”可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS或293细胞的动物细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

再进一步，本发明还提供一种在骨关节炎患者尿液样本中筛选差异表达蛋白的方法，包括以下步骤：

⑴获得骨关节炎患者和对照组的尿液；

⑵分离尿蛋白；

⑶分别对两组所述蛋白样本进行还原烷基化处理，得到两组蛋白样本溶液；

⑷分别向两组蛋白样本溶液中加入胰蛋白酶进行酶解处理；

⑸使用不同的标记试剂，分别对酶解处理后的两组样本进行iTRAQ标记处理，并将标记处理后的骨关节炎患者组与对照组的样本溶液混合；

⑹对混合后的样本进行液相色谱分离，再将液相色谱分离的肽段进行串联质谱分析；

⑻使用蛋白质鉴定软件对质谱分析结果进行蛋白质鉴定，根据蛋白质丰度水平，筛选分析得到骨关节炎患者与对照组的样本中的差异表达蛋白；

⑼经过生物信息学分析鉴定差异性蛋白并阐述差异性蛋白的生物学功能；

⑽最终筛选到与骨关节炎相关的IGLON5和SERPINB13蛋白。

优选的，所述步骤⑼中生物信息学分析包括差异蛋白GO富集分析和KEGG信号通路富集分析。

有益效果

本发明通过实验研究证实与对照组相比，IGLON5和SERPINB13蛋白在骨关节炎患者尿液中表达下调，并研究其作为分子靶点在骨关节炎早期检测、辅助诊断的试剂或试剂盒或治疗药品中的应用前景；进一步，本发明提供一种用于检测骨关节炎疾病的ELISA试剂盒，所述试剂盒检测样本为尿液标本，获取无创、可大规模重复取样、保存方便的优势。本发明提供的与骨关节炎相关的尿液蛋白可作为骨关节炎的早期生物标志物，为进一步研究骨关节炎的病理机制，为探索骨关节炎早期防治的药物靶点提供了新的方向。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常为本领域常规方法。

本发明的发明人对4例骨关节炎样本及4例对照样本进行iTRAQ实验，结合生物信息学方法进行筛选，挑选出候选蛋白IGLON5和SERPINB13蛋白，现有研究中并没有IGLON5和SERPINB13蛋白共同作为标志物与骨关节炎相关的报道，进一步，发明人还采用westernblot验证上述蛋白在骨关节炎患者和对照组的尿液样本中的表达，证实了所述IGLON5和SERPINB13在骨关节炎尿液样本中表达下调，其相关产品可用于诊断、治疗骨关节炎。

本发明的IGLON5和SERPINB13蛋白是在本发明之前的已知蛋白，其基本信息如下：

IGLON5 NCBI Reference Sequence:NP_001094842.1；

SERPINB13 NCBI Reference Sequence：NP_036529.1，NP_001294852.1，NP_001335196.1，NP_001335197.1，NP_001335198.1，NP_001335199.1；

本发明所述IGLON5(IgLON family member 5，IgLON家族成员5)，与其疾病包括睡眠障碍和goutieres Aicardi综合征1、显性和隐性。

本发明所述SERPINB13(serpin family B member 13，丝氨酸蛋白酶抑制剂13)，其属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族成员，在角质形成细胞的增殖或分化中起重要作用；与其相关的疾病包括鳞状细胞癌，头颈部。具有丝氨酸型内肽酶抑制剂活性和半胱氨酸型内肽酶抑制剂活性。

本发明应用iTRAQ联合质谱的方法鉴定到骨关节炎患者尿液中的蛋白标志物。同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)技术由AB SCIEX公司研发的一种体外同种同位素标记的相对与绝对定量技术。该技术利用多种同位素试剂标记蛋白多肽N末端或赖氨酸侧链基团，经高精度质谱仪串联分析，可同时比较多达8种样品之间的蛋白表达量，是近年来定量蛋白质组学常用的高通量筛选技术。iTRAQ定量蛋白质组学是蛋白酶切后形成多肽，用iTRAQ同位素试剂标记多肽N末端或赖氨酸侧链基团。标记后的肽段经过液相分离，进行一级质谱和二级质谱分析，在二级质谱前，被标记的不同样本中的同一肽段表现为相同的质荷比和其他理化性质。而在二级质谱中，信号离子表现为不同质荷比(114～121)的峰，根据波峰的高度及面积，可以鉴定出蛋白质和分析出同一蛋白质不同处理的定量信息。

iTRAQ试剂包括三部分：报告部分、肽反应部分、平衡部分。(1)报告部分有八种：113-121(无120)，因此iTRAQ试剂可同时标记8组样品。(2)肽反应部分：能与肽段N端及赖氨酸侧链氨基发生共价连接而标记上肽段。(3)平衡部分：保证被标记的同一肽段的质荷比相同。与传统的双向电泳定量分析相比，iTRAQ具有以下技术服务优势：(1)灵敏度高，检测限低，可检测出低丰度蛋白；(2)分离能力强，分析范围广，iTRAQ可以对任何类型的蛋白质进行分离鉴定，包括高分子量蛋白质、酸性蛋白和碱性蛋白，膜蛋白和不溶性蛋白；(3)高通量：同时对8个样本进行分析，提高了实验通量，可同时对多个时间点或不同处理的蛋白质进行分析；(4)结果可靠：定性与定量分析结果更加可靠；(5)自动化程度高：液相与质谱连用，自动化操作，分析速度快，分离效果好。

本文中使用的术语“样本”包括从任何来源获得的样本或培养物。样本可以获自血液(包括任何血液制品，如全血、血浆、血清或特定类型的血细胞)、尿液、唾液等。样本还包括组织样本。在一个实施方式中，样本来自尿液。

本文使用的术语“表达水平”指通过本领域技术人员已知方法测定的给定核酸或蛋白质的可测量。

本文使用的术语“对照”指未显示任何OA症状并且未诊断为骨关节炎或OA的个体或个体组。优选地，所述对照个体未使用影响OA的药物，并且未诊断为患有任何其他疾病。更优选地，对照个体具有与测试样本相比相似的性别、年龄和体重指标(BMI)。

本发明使用的术语“酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay简称ELISA)”指是利用抗体分子能与抗原分子特异性结合的特点，将游离的杂蛋白和结合于固相载体的目的蛋白分离，并利用特殊的标记物对其定性或定量分析的一种检测方法。ELISA过程包括：抗原吸附在固相载体上，这个过程称为包被，加待测抗体，再加相应酶标记抗体，生成抗原—待测抗体—酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体的量。待测抗体的量与有色产物成正比。同理也可包被抗体，测定抗原含量。ELISA最常用的四种方法：直接法测定抗原；间接法测定抗体；双抗体夹心法测定抗原；竞争法测定抗原。

实施例1样本的收集

病例-对照研究是本研究所采用的方法。实验组的研究对象为2015年度在北京协和医院骨科住院的患严重骨关节炎的但还未接受手术治疗的患者4例，对照组的研究对象为不患有骨关节炎的相对健康者4例，实验组符合中华医学会骨科学分会骨关节炎诊断标准。实验组的年龄为58.5±2.0岁(56-61岁)，对照组的年龄为57.6±2.1岁(55-61岁)。根据中华人民共和国国家卫生与计划生育委员会2013年制定的《成人体重判定》标准，两组均选取BMI在24-28之间的超重者。实验方案经北京协和医院伦理委员会同意，并取得每位受试者的书面知情同意。实验组和对照组基本资料见表1。

收集实验组和对照组的晨起第二次中段尿，首先用无菌广口容器盛装，后转移至离心管，4,000g离心10min(4℃)，上清液被等分进50mL无菌管，-80℃保存备用。

表1样本的基本资料

OA病例组的纳入标准：

有完整的临床资料和影像学资料(双膝正侧位加髌骨轴位X线片)，根据病史和诊断标准诊断为严重骨关节炎(K-L分级4级)的体重超重女性患者，并签署知情同意书。

OA病例组的排除标准：

膝外伤手术史、膝关节感染、成年前膝关节畸形、代谢性骨病、下肢不等长、膝关节肿瘤史，骨质疏松症，肝肾疾病、高脂血症、高血压、糖尿病、甲状腺功能亢进、甲状旁腺功能亢进病史，近期服用雌激素、孕激素治疗者，痛风、类风湿关节炎等其它关节疾病，接受过改变病情抗风湿药或免疫抑制治疗，近6个月内接受过关节内注射药物治疗。BMI小于24或大于28。

对照组的纳入标准：

对照组选取的是不患有骨关节炎的超重女性患者，对照组的性别、年龄和BMI与OA病例组相匹配，并签署知情同意书。

对照组的排除标准：

实施例2 iTRAQ实验筛选差异蛋白

一、所用仪器和试剂

涡旋振荡器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司，型号：QL-901)

离心机(Thermo，型号：PICO17)

超声波细胞破碎仪(南京先欧仪器制造有限公司，型号：XO)

酶标仪(Thermo，型号：MμLtiskan MK3)

恒温孵浴器(上海浦东荣丰科学仪器有限公司，型号：HH.S4)

真空冷冻干燥机(Thermo，型号：SPD2010-230)

RIGOL L-3000高效液相色谱系统(北京普源精电科技有限公司)，流动相A：98％ddH₂O，2％乙腈(pH 10)；流动相B：98％乙腈，2％ddH₂O(pH 10)高效液相色谱仪：(ThermoScientic EASY-nLC 1000 System(Nano HPLC))，流动相A：100％超纯水，0.1％甲酸；流动相B：100％乙腈，0.1％甲酸

质谱系统(Thermo，型号：Q-Exactive)

尿素(Bio-Rad，货号：161-0731，美国)

硫尿(Sigma-Aldrich，货号：T7875，美国)

CHAPS(Bio-Rad，货号：161-0460，美国)

Protease Inhibitor Cocktail(Roche，货号：04693116001，美国)

蛋白定量染液(Thermo Scientific，货号：23238，美国)

牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)(Sigma-Aldrich，货号：A2058，美国)

DTT(Bio-Rad，货号：161-0611，美国)

碘乙酰胺(Bio-Rad，货号：163-2109，美国)

试剂盒中的Dissolution Buffer(AB Sciex，PN：4381664)

胰酶(Promega，货号：V5111，美国)

10K超滤管(milipore，PN：UFC5010BK)

8标

试剂盒(AB Sciex，PN：4390812，PN：4381664)

Ziptip(Millipore，PN：ZTC18M096(2μg))

色谱柱：Durashell-C18，4.6mm×250mm，5μm，

(Agela，货号：DC952505-0)

乙腈(Merck，货号：100030，德国)

氨水(Sigma-Aldrich，货号：17837，美国)

预柱(Acclaim PepMap100 column，2cm x 100μm，C18，5μm)

色谱柱(EASY-Spray column，12cm x 75μm，C18，3μm)

进样瓶(Thermo，11190533)

瓶盖(Thermo，11150635)

喷针(Thermo，PN：ES542)

二、iTRAQ定量实验流程

1.样本蛋白提取

1)将样本按照1：10(W/V)加入lysis buffer(7M尿素，2M硫脲，0.1％CHAPS，片/50mL Protease Inhibitor Cocktail)，涡旋混匀。

2)超声60s(0.2s on、2s off)，振幅22％。

3)室温提取30分钟。

4)15,000g，4℃离心20min，小心取出上清，分装后冻存于-80℃。

2.蛋白定量(Bradford法)

1)采用Bradford法[Marion M.Bradford.Analytical Biochemistry,1976,72:248-254]测定样本提取的蛋白浓度。先将样本用lysis buffer(7M尿素、2M硫脲、0.1％CHAPS)进行一定倍数稀释使其终浓度落在标曲范围内，稀释好的样本和标准品(将BSA用lysis buffer溶解成系列浓度的标准蛋白)各取10μL分别和300μL蛋白定量染料避光反应20min，用酶标仪同时测定标准品和样本在595nm下的吸光值，根据标准品每管吸光值和浓度的关系绘制标准曲线(曲线公式：y＝1.4337×x2+0.0406×x+0.03728，R²＝0.98906)。

2)根据曲线公式计算各样本蛋白浓度。

3.蛋白酶解(Filter Aided Sample Preparation，FASP)

1)蛋白定量后取200μg蛋白溶液置于离心管中；

2)加入终浓度25mM DTT，60度反应1小时；

3)加入终浓度50mM碘乙酰胺，室温10分钟；

4)将还原烷基化后的蛋白溶液加入10K的超滤管中，12,000转离心20分钟，弃掉收集管底部溶液；

5)加入iTRAQ试剂盒中的Dissolution Buffer 100μL，12,000转离心20分钟，弃掉收集管底部溶液，重复3次；

6)更换新的收集管，在超滤管中加入胰蛋白酶，总量4μg(与蛋白质量比1:50)，体积50μL，37℃反应过夜；

7)次日，12,000转离心20分钟，酶解消化后的肽段溶液离心于收集管底部；

8)在超滤管中加入50μL Dissolution Buffer，12,000转再次离心20分钟，与上步合并，收集管底部共得到100μL酶解后的样本。

4.iTRAQ标记

1)从冰箱中取出iTRAQ试剂，平衡到室温，将

试剂离心至管底。

2)向每管

试剂中加入150μL异丙醇，涡旋振荡，离心至管底。

3)取50μL样本(100μg酶解产物)转移到新的离心管中。

4)将iTRAQ试剂填加到样本中，涡旋振荡，离心至管底，室温反应2小时。

5)加入100μL水终止反应。

6)为了检测标记效率及定量准确性，从4组样本中各取出1μL混合，用Ziptip脱盐后进行MALDI-TOF-TOF(AB SCIEX 4800 Plus)鉴定，确认标记反应良好。

7)混合标记后的样本，涡旋振荡，离心至管底。

8)真空冷冻离心干燥。

9)抽干后的样本冷冻保存待用。

5.酶解肽段离线预分离及LC-MS/MS质谱分析

5.1高pH条件下的反相色谱分离

1)混合标记后的样本用100μL流动相A溶解，14000g离心20min，取上清待用。

2)使用400μg酶解好的BSA进行分离(柱温45℃，检测波长214nm)，检测系统情况。

3)取100μL准备好的样本上样、分离，流速0.7mL/min。

5.2纳升级反相色谱-Q Exactive进行蛋白质分析

1.实验步骤

1)将高pH反相分离得到的组份用20μL 2％甲醇，0.1％甲酸复溶。

2)12,000rpm离心10分钟，吸取上清上样。

3)上样体积10μL，采取夹心法上样。

4)Loading Pump流速350nl/min，15分钟。

5)分离流速300nl/min，分离梯度如下表2：

表2纳升级反相色谱分离梯度

2.质谱参数设置

a)离子源参数：

Spray voltage：2.3kv；

Capillary Temperature：320℃；

Ion Source：EASY-Spray source；

DP：100；

b)FμLl MS：

Resolution：70000FWHM；

FμLl Scan AGC target：3e6；

FμLl Scan Max.IT：20ms；

Scan range：300-1800m/z；

c)dd-MS2：

Resolution：17500FWHM；

AGC target：1e5；

Maximum IT：120ms；

Intensity threshold：8.30E+03；

Fragmentation Methods：HCD；

NCE：32％；

Top N：20；

6.质谱数据分析

6.1数据库

数据库的选择是以所需物种、数据库注释完备性及序列可靠性为参考依据的。在本次实验中选择的数据库来自UniProt(http://www.uniprot.org/)，数据库本版为：UniProt.Rat.201509.fasta。

6.2检索软件

iTRAQ的质谱分析是由Thermo Q-Exactive型质谱完成，产生的质谱原始文件*.RAW采用Mascot 2.5.1软件搜库处理，采用scaffold软件对搜库结果进行质控。

7.生物信息学分析

7.1差异蛋白定量信息统计

对要比较的两组样本使用Perseus 1.3.0.4.(www.maxquant.org)软件进行统计分析，筛选P value≤0.05，并且两组样本中蛋白ratio≥1.25或ratio≤0.75的差异蛋白。

7.2差异蛋白质功能注释

使用UniProt(http://www.uniprot.org/)对全部蛋白质进行全面的生物学功能注释，获取与这些蛋白质所有相关的功能信息。包括Gene Ontology(GO)和通路等注释信息。

7.3差异蛋白功能富集分析

使用MetaCore软件对不同组别差异蛋白进行功能富集分析。使用MetaCore对各组差异表达蛋白质进行了基于Gene Ontology(GO)的生物学过程(biological process)，细胞组分(cellμLar component)和分子功能(molecμLar function)的富集分析。该分析是指利用功能注释工具高通量地对每个蛋白质进行注释，得到实验鉴定蛋白质在各类生物学过程或分子功能上的分布情况，并将该分布与总体蛋白质的相应分布进行比较，从而确认实验鉴定的蛋白质在哪几类生物学过程或分子功能上显著富集(即p值小于0.05)，从整体上把握鉴定的蛋白质与预期功能分布之间的吻合程度，还可以获得与某些特定功能相关的蛋白质分子。通过MetaCore分析，获得差异蛋白质的生物学过程、细胞组分、分子功能富集结果。

7.4差异蛋白质通路富集分析

使用MetaCore软件对差异表达蛋白质进行通路分析，获取与差异表达蛋白质所有相关的通路信息以及富集的通路。

8.结果

基于iTRAQ技术，本发明从实验组和对照组的尿液中共鉴定到了1413种蛋白质，其中两组间的差异蛋白总共有394个，170个蛋白质在OA实验组中上调，224个蛋白质在OA实验组中下调。根据GO分析可知：差异蛋白主要位于细胞外囊泡、细胞外分泌小体、细胞外基质部分以及细胞膜；差异蛋白与肽酶和肽链内切酶等的调节和抑制作用有关，还与细胞粘附分子和蛋白受体的结合等分子功能相关；差异蛋白主要参与细胞粘附、损伤修复的调节、应激反应等生物过程。

发明人通过Gene Onlogy和信号通路分析，以及结合文献发明人筛选了在骨关节炎患者的尿液中表达下调的差异蛋白IGLON5和SERPINB13。IGLON5和SERPINB13蛋白可以作为骨关节炎的尿液生物标志物，对于疾病的诊断、治疗和预后提供理论依据。

实施例3 western blot检测IGLON5和SERPINB13蛋白在骨关节炎患者中的表达情况

进一步验证上述4例骨关节炎患者及4例对照者尿液样本IGLON5和SERPINB13蛋白表达情况。使用贝博生物液体样品蛋白提取试剂盒，具体步骤参照说明书；采用康为世纪微量BCA蛋白定量试剂盒(货号：CW2011)，具体步骤见其说明书。然后，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)以及蛋白质印迹，具体步骤如下：

所述SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：

1、蛋白质样品变性:

a)根据BCA蛋白质浓度测定结果，每个凝胶加样孔中加入相同质量的总蛋白提取物。按照每1微升蛋白样品加入0.25微升蛋白上样缓冲液的比例，混合蛋白样品和蛋白上样缓冲液(5x)。

b)100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。

c)冷却到室温后，直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。

2、胶板制备:

采用Bio-Rad公司的微型垂直板电泳装置制备0.75mm厚的凝胶，照说明书安装好玻璃板后，先在小烧杯中配制5mL 10％的分离胶，配方如下：

表3分离胶配方

组分	用量
		30％丙烯酰胺溶液	1.7mL
Tris-HCL(1.5M，pH8.8)	1.3mL
		10％SDS	0.05mL
10％AP	0.05mL
		TEMED	0.002mL
灭菌ddH<sub>2</sub>O	补充至5mL

混匀后立即灌胶，然后加1mL蒸馏水覆盖，室温下放置约30min待胶聚合后，用蒸馏水洗2-3次，再用滤纸吸干。然后制备2mL 5％的浓缩胶，配方如下：

表4浓缩胶配方

组分	用量
		30％丙烯酰胺溶液	0.33mL
Tris-HCL(1.0M，pH6.8)	0.25mL
		10％SDS	0.02mL
10％AP	0.02mL
		TEMED	0.002mL
灭菌ddH<sub>2</sub>O	补充至2mL

混匀后立即灌胶，插入样品梳，避免产生气泡，待胶凝固后，取出样品梳，后用蒸馏水和1x蛋白电泳缓冲液先后冲洗样品孔。

3、上样及电泳

将凝胶板装在电泳装置上，内槽中加满1x蛋白电泳缓冲液，外槽中1x蛋白电泳缓冲液应超过铂丝，按顺序上样。在末端泳道中加入蛋白质质量标准蛋白梯度。电泳时蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

所述蛋白质印迹：

1、预先用转印缓冲液浸泡NC膜、滤纸、海棉垫。SDS-PAGE结束后取出凝胶，去除浓缩胶，在Tris/甘氨酸缓冲液中漂洗数秒，然后置于转印缓冲液中浸泡15-30min。打开电转印夹，每侧垫上一块专用的用转印缓冲液浸泡透的海棉垫，再各放一块转印液浸透的滤纸，滤纸与海棉垫大小相同或与NC膜，凝胶大小相同均可，将凝胶平放在阴极侧滤纸上，最后将NC膜平放在凝胶上，去除气泡，夹好电转印夹。在电泳槽加满电转印液，插入电转印夹，将电泳槽放入冰箱内(电转印液之前要放入冰箱内预冷)，连接好电极，接通电流，转印夹的NC膜应对电泳槽的正极。

2、封闭：用1xTBS漂洗一次。加入含5％的无脂奶粉TBS封闭缓冲液，置于振荡培养箱中进行封闭；

3、一抗杂交：弃封闭液，加入用一抗(IGLON5 antibody(武汉博欧特生物科技有限公司)；SERPINB13 antibody(GeneTex))稀释液稀释的一抗杂交溶液，置于4℃杂交过夜，第二天在振荡培养箱中进行杂交；

4、回收一抗杂交液，用TBST洗膜3次；

5、弃TBST，加入用封闭缓冲液稀释的二抗(Goat Anti-Rabbit IgG,HRPConjugated，CW0103)杂交溶液，置于振荡培养箱中进行杂交；

6、弃二抗溶液，用TBST洗膜3次；

7、ECL化学发光及图像采集和分析：按照高灵敏度化学发光检测试剂盒(康为世纪货号CW0049B)，具体步骤参照说明书。

8、以β-Actin作为内参进行数据标准化，以正常人作为参照样本，观察骨关节炎尿液样本中IGLON5和SERPINB13蛋白的相对表达水平。

结果显示，与对照组相比，骨关节炎患者尿液中IGLON5和SERPINB13蛋白在骨关节炎组中的表达下调。与蛋白组学实验结果具有一致性。提示IGLON5和SERPINB13可能是与骨关节炎发生相关的关键因子。

实施例4骨关节炎相关IGLON5和SERPINB13蛋白检测试剂盒组装

本发明的发明人以上述结果为依据，可应用IGLON5和SERPINB13蛋白或其抗体建立通过检测IGLON5和SERPINB13蛋白表达水平来诊断骨关节炎患者尿液样本的ELISA试剂盒。它包括：固相载体、标记物和可与所述标记物发生显色反应的底物；标记物为酶标记IGLON5和SERPINB13蛋白或酶标记IGLON5和SERPINB13蛋白抗体、生物素标记SERPINB13和IGLON5蛋白或者生物素标记IGLON5和SERPINB13蛋白抗体。

具体试剂盒可有下述试剂组成：

1)酶标板(固相载体)；

2)人IGLON5和SERPINB13标准蛋白；

3)标记物；

4)稀释液；

5)洗液；

6)显色试剂；

7)终止液。

本领域技术人员已知，以上组分仅是示意性的，所述酶标板可以是一抗包被过的(用于双夹心ELISA法、竞争法)或没有包被过的(用于直接ELISA法)；人IGLON5和SERPINB13标准蛋白可以是富集或表达、合成的全蛋白或包含抗原决定簇的肽段；标记物可以是辣根过氧化物酶标记或生物素标记；显色试剂可以是TMB、OPD或ABTS等。ELISA法可以是双夹心法、直接法或者竞争法。

以ELISA双夹心法为例组装检测骨关节炎的ELISA试剂盒：

1.ELISA实验中常规试剂：

包被缓冲液(pH9.6的碳酸盐缓冲液)：Na₂CO₃1.59g，NaHCO₃2.93g，加蒸馏水至1L。

洗涤缓冲液(pH7.4)：8.0gNaCl；0.2g KH₂PO₄；2.9gNa₂HPO₄·12H₂O；0.2g KCl；0.5mL 0.05％吐温-20，加ddH₂O至1L。

稀释液:牛血清白蛋白(BSA)0.1g加洗涤缓冲液至100mL；

本试剂盒使用的抗人IGLON5和SERPINB13蛋白鼠源单克隆抗体和抗IGLON5和SERPINB13蛋白兔源多克隆抗体均可商业购买例如上海乔羽生物科技有限公司。

蛋白标准品IGLON5和SERPINB13为人源重组蛋白均商业购买例如北京义翘神州科技有限公司。

2.酶标板的包被：

所述的抗IGLON5和SERPINB13蛋白鼠源单克隆抗体包被的酶标板通过如下方法制备：用pH9.6的碳酸盐包被缓冲液将纯化后抗IGLON5和SERPINB13单克隆抗体稀释成目的浓度0.63μg/mL；将稀释好的抗体溶液混匀后加入微孔中，100μL/孔，4℃过夜；洗板3次，200μL/孔；加入3％BSA封闭液，300μL/孔，4℃过夜；洗板3次，200μL/孔；-20℃保存。

3.酶标抗体的制备：

取抗IGLON5和SERPINB13蛋白兔源多克隆抗体，分别与HRP进行偶联，得到酶标记抗体。取一定量的酶标记抗体加入到稀释液中，充分混匀，使其终浓度为2μg/mL(可根据具体的条件而定)，2-8℃避光保存。

4.试剂盒的组装：

检测骨关节炎的ELISA试剂盒可以为表5中的组分：

表5 ELISA检测试剂盒

该试剂盒的使用方法如下：

(1)分别取IGLON5和SERPINB13标准蛋白浓度分别为900pg/mL，600pg/mL，300pg/mL，150pg/mL，75pg/mL溶液50μL加入包被抗体的酶标板绘制标准曲线；

(2)分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔，在酶标板上待测样品孔中先加样品稀释液40μL，然后再加待测样品10μL(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；

(3)用封板膜封板后置37℃温育30分钟；

(4)小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；

(5)每孔加入酶标试剂50μL；

(6)温育，洗涤，步骤同上；

(7)每孔先加入TMB底物溶液A 50μL，再加入TMB底物溶液B 50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟；

(8)每孔加终止液50μL，终止反应；

(9)以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)，计算各样本中蛋白含量。

本发明的ELISA试剂盒可在制备骨关节炎疾病检测试剂盒中的应用。

本发明试剂盒发挥尿液标本获取无创、可大规模重复取样、保存方便的优势，利用尿液标本检测IGLON5和SERPINB13蛋白及其多肽片段。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种蛋白检测试剂，其特征在于，所述试剂包括检测骨关节炎样本中IGLON5和SERPINB13表达水平的试剂。

2.根据权利要求1所述的蛋白检测试剂，其特征在于，所述骨关节炎样本为尿液样本。

3.权利要求2所述的蛋白检测试剂在制备检测、辅助诊断骨关节炎试剂或试剂盒中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述IGLON5和SERPINB13蛋白在骨关节炎尿液样本中表达下调。

5.一种用于检测骨关节炎疾病的ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括IGLON5和SERPINB13蛋白的特异性抗体试剂。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述IGLON5和SERPINB13蛋白的特异性抗体为单克隆抗体和/或多克隆抗体。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括抗IGLON5和SERPINB13单克隆抗体包被的酶标板、标记抗IGLON5和SERPINB13多克隆抗体、蛋白标准品IGLON5和SERPINB13、TMB底物溶液、稀释液、洗涤缓冲液、终止溶液。

8.根据权利要求5-7任一项所述试剂盒在制备检测或辅助诊断骨关节炎的试剂盒中的应用，所述试剂盒检测骨关节炎尿液样本中IGLON5和SERPINB13蛋白的表达情况。