CN108918868A - 一种检测骨关节炎的标记物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测骨关节炎的标记物，所述标志物为GALNT18、IGFLR1和MYDGF蛋白。进一步，本发明还提供了检测骨关节炎的标记物在制备诊断骨关节炎的试剂、试剂盒或芯片中的应用。本发明发现了3种在骨关节炎患者尿液中差异表达的蛋白，并研究其在骨关节炎早期检测中的应用前景；本发明提供的骨关节炎相关的尿液蛋白可作为骨关节炎的早期生物标志物，为进一步研究骨关节炎的遗传分子机制，为探索骨关节炎早期防治的药物靶点提供了新的方向。

Description

一种检测骨关节炎的标记物及其应用

技术领域

本发明涉及生物医学检测技术领域，具体涉及一种检测骨关节炎的标记物及其应用。

背景技术

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种多因素导致发病的，在中老年人群中十分常见的慢性退行性关节疾病，在全球分布广泛，女性多于男性，常见于膝关节、手指小关节、髋关节，也可见于肩关节、腕关节、踝关节等。骨关节炎是以关节软骨磨损、退变和关节周缘骨质增生为特征，急性期还常伴有滑膜炎。据调查，骨关节炎在60岁以上人群中患病率达50％以上，75岁以上人群患病率高达80％，该疾病的致残率可达53％。

膝关节骨关节炎造成膝关节疼痛、肿胀、僵硬、膝关节活动度受限和功能障碍等，严重影响患者的生活质量，最终也间接影响其预期寿命。目前，由于对OA的病因学尚缺乏根本性的认识，医学界对其根治仍然缺乏行之有效的药物手段，关节置换手术往往成为患者最终必须选择的治疗方式。为了走出OA治疗方面的困境，阐明OA的病因学机理并在其基础上探索治疗OA的有效方案，成为了医学界有待突破的研究方向。

蛋白质组的定义是指一个基因组、一个或多个细胞或某些组织所表达的所有蛋白质，无论是小到一个细胞还是大到一个生物体，都是从一个整体水平去研究参与生命活动的所有蛋白质。这些所有蛋白质并不是一个一成不变的集合，而是随时随地变化着的，因为随着生命活动的进行和稳态的调节总有不同的蛋白质在被表达或修饰。蛋白质是生命活动的承担者，也是大多数生物体结构的组成部分，蛋白质的形成要经过一系列的转录后修饰，因此，从基因组和转录组并不能直接推导出蛋白质组的情况。

蛋白质组学研究的标本可以是组织、细胞、血液、关节液、尿液等，早年对尿蛋白质组学的研究往往局限于泌尿系统疾病，后来逐渐扩展到全身性的以代谢紊乱为表现的疾病。由于尿液中很少有高丰度蛋白的影响，相比血液和关节液而言，尿蛋白质组学更有利于寻找疾病的生物标志物，同时可能在疾病机理上有所发现。

目前骨科关节领域用尿液为标本进行尿蛋白质组学的研究并不多，随着以iTRAQ技术等高通量蛋白质组学技术的出现和发展，这一领域的尿蛋白质组学研究呈现出逐渐增多的趋势。如前言所述，越来越多的证据表明骨关节炎的发生和发展与代谢因素有关，与此同时，很多学者多年来也在试图寻找骨关节炎的生物标志物未果，因此，很适合用尿蛋白质组学的方法来探索骨关节炎的生物标志物和研究其相关病理机制。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于寻找能够用于骨关节炎早期检测的生物标志物并提供其相关应用。

本发明首先提供一种检测骨关节炎的标记物，所述标志物为GALNT18、IGFLR1和MYDGF蛋白。

优选的，所述GALNT18在骨关节炎样本中表达下调，所述IGFLR1和MYDG在骨关节炎样本中表达上调。

优选的，所述骨关节炎样本为尿液样本。

进一步地，本发明提供GALNT18、IGFLR1和MYDGF蛋白用于制备检测骨关节炎的试剂、试剂盒或芯片。

优选的，所述检测包括：

a)获得受试者和正常对照的尿液，

b)任选地，分离尿蛋白，

c)确定所述受试者和正常对照的尿液中权利要求1中所限定的蛋白的表达水平，

d)将所述受试者和正常对照的尿液中蛋白的表达水平进行比较，

e)根据步骤d)的比较结果，检测所述受试者是否患有骨关节炎疾病。

优选的，使用选自以下的方法进行步骤c)中的所述确定：质谱方法、ELISA方法、Western方法或其组合。

进一步，本发明还提供一种在骨关节炎患者尿液样本中筛选差异表达蛋白的方法，包括以下步骤：

⑴获得骨关节炎患者和正常对照的尿液；

⑵分离尿蛋白；

⑶分别对两组所述蛋白样本进行还原烷基化处理，得到两组蛋白样本溶液；

⑷分别向两组蛋白样本溶液中加入胰蛋白酶进行酶解处理；

⑸使用不同的标记试剂，分别对酶解处理后的两组样本进行iTRAQ标记处理，并将标记处理后的骨关节炎患者组与健康人的样本溶液混合；

⑹对混合后的样本进行液相色谱分离，再将液相色谱分离的肽段进行串联质谱分析；

⑻使用蛋白质鉴定软件对质谱分析结果进行蛋白质鉴定，根据蛋白质丰度水平，筛选分析得到骨关节炎患者与健康人样本中的差异表达蛋白；

⑼经过生物信息学分析鉴定差异性蛋白并阐述差异性蛋白的生物学功能；

⑽最终筛选到与骨关节炎相关的GALNT18、IGFLR1和MYDGF蛋白。

优选的，所述步骤⑼中生物信息学分析包括差异蛋白GO富集分析和KEGG信号通路富集分析。

国际标准化的基因功能分类体系Gene Ontology(GO)，包含三部分，分别描述相应基因的分子功能(molecμLar function，MF)、所处细胞器位置(cellμLar component，CC)及生物学过程(biological process，BP)。GO体系通过NCBI和Gene ontology数据库的信息，按照MF、CC和BP对蛋白进行分类和注释。通过对差异蛋白的GO条目富集度进行统计学分析，并计算出p值，进而整体把握差异蛋白的功能。

KEGG是有关蛋白质信号传导通路的主要公共数据库。通过对差异蛋白KEGG信号传导通路的富集度进行统计学分析，并计算出p值，进而整体把握差异蛋白参与的最主要生化代谢途径和信号转导途径。

更进一步地，本发明提供一种用于检测骨关节炎疾病的试剂盒，其包含检测GALNT18、IGFLR1和MYDGF蛋白表达量的试剂。

优选的，所述检测GALNT18、IGFLR1和MYDGF蛋白表达量的试剂包括GALNT18、IGFLR1和MYDGF蛋白的特异性抗体。

再进一步地，本发明提供一种芯片或陈列，所述的芯片或陈列上具有检测GALNT18、IGFLR1和MYDGF蛋白表达量的试剂。

优选的，所述的检测GALNT18、IGFLR1和MYDGF蛋白表达量的试剂为GALNT18、IGFLR1和MYDGF蛋白的特异性抗体。

有益效果

本发明发现了3种在骨关节炎患者尿液中差异表达的蛋白即GALNT18、IGFLR1和MYDGF蛋白，并研究其在骨关节炎早期检测中的应用前景；本发明提供的骨关节炎相关的尿液蛋白可作为骨关节炎的早期生物标志物，为进一步研究骨关节炎的病理机制，为探索骨关节炎早期防治的药物靶点提供了新的方向。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常为本领域常规方法。

本发明的发明人对4例骨关节炎样本及4例对照样本进行iTRAQ实验，结合生物信息学方法进行筛选，挑选出候选蛋白GALNT18、IGFLR1和MYDGF蛋白，现有研究中并没有GALNT18、IGFLR1和MYDGF蛋白共同作为标志物与骨关节炎相关的报道，进一步，发明人还采用westernblot检测上述蛋白在骨关节炎患者和正常人群的尿液样本中的表达，证实了所述GALNT18在骨关节炎尿液样本中表达下调，所述IGFLR1和MYDG在骨关节炎尿液样本中表达上调，其相关产品可用于诊断、治疗骨关节炎。

本发明的GALNT18、IGFLR1和MYDGF蛋白是在本发明之前的已知蛋白，其基本信息如下：

GALNT18NCBI Reference Sequence:NP_001350393.1，NP_940918.2；

IGFLR1NCBI Reference Sequence:NP_001332932.1，NP_001332933.1，NP_001332934.1，NP_001332935.1，NP_078936.1；

MYDGF NCBI Reference Sequence:NP_061980.1；

本发明应用iTRAQ联合质谱的方法鉴定到骨关节炎患者尿液中的蛋白标志物。同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)技术由AB SCIEX公司研发的一种体外同种同位素标记的相对与绝对定量技术。该技术利用多种同位素试剂标记蛋白多肽N末端或赖氨酸侧链基团，经高精度质谱仪串联分析，可同时比较多达8种样品之间的蛋白表达量，是近年来定量蛋白质组学常用的高通量筛选技术。iTRAQ定量蛋白质组学是蛋白酶切后形成多肽，用iTRAQ同位素试剂标记多肽N末端或赖氨酸侧链基团。标记后的肽段经过液相分离，进行一级质谱和二级质谱分析，在二级质谱前，被标记的不同样本中的同一肽段表现为相同的质荷比和其他理化性质。而在二级质谱中，信号离子表现为不同质荷比(114～121)的峰，根据波峰的高度及面积，可以鉴定出蛋白质和分析出同一蛋白质不同处理的定量信息。

iTRAQ试剂包括三部分：报告部分、肽反应部分、平衡部分。(1)报告部分有八种：113-121(无120)，因此iTRAQ试剂可同时标记8组样品。(2)肽反应部分：能与肽段N端及赖氨酸侧链氨基发生共价连接而标记上肽段。(3)平衡部分：保证被标记的同一肽段的质荷比相同。与传统的双向电泳定量分析相比，iTRAQ具有以下技术服务优势：(1)灵敏度高，检测限低，可检测出低丰度蛋白；(2)分离能力强，分析范围广，iTRAQ可以对任何类型的蛋白质进行分离鉴定，包括高分子量蛋白质、酸性蛋白和碱性蛋白，膜蛋白和不溶性蛋白；(3)高通量：同时对8个样本进行分析，提高了实验通量，可同时对多个时间点或不同处理的蛋白质进行分析；(4)结果可靠：定性与定量分析结果更加可靠；(5)自动化程度高：液相与质谱连用，自动化操作，分析速度快，分离效果好。

本文使用的术语“表达水平”指通过本领域技术人员已知和本文所述的方法测定的给定核酸或蛋白质的可测量。

本文使用的“对照”指未显示任何OA症状并且未诊断为骨关节炎或OA的个体或个体组。优选地，所述对照个体未使用影响OA的药物，并且未诊断为患有任何其他疾病。更优选地，对照个体具有与测试样本相比相似的性别、年龄和体重指标(BMI)。

GALNT18(Polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase 18，多肽N-乙酰半乳糖胺基转移酶18)

该蛋白由GALNT18基因编码，参与蛋白质代谢和粘蛋白O型聚糖生物合成过程；催化O链寡糖生物合成中的初始反应，将N-乙酰基-D-半乳糖胺残基转移到蛋白质受体上的丝氨酸或苏氨酸残基。研究发现，O-糖基化改变是肿瘤细胞的共性改变；GALNT18在肺癌细胞中的表达量很高；GALNT18蛋白在肺扁平上皮癌细胞QG56细胞中定位于高尔基体。

IGFLR1(IGF-like family receptor 1，胰岛素样家族受体1)由人染色体19的基因编码。IGF-样家族蛋白质作为细胞膜受体，以更高的亲和力结合IGFL1和IGFL3，并且还可以结合IGFL2。与IGFLR1相关的疾病包括皮肤病。

MYDGF(Myeloid-derived growth factor，髓源生长因子)由MYDGF(髓源生长因子)基因编码的蛋白。骨髓来源的单核细胞产生的旁分泌作用蛋白(mydgf)，其促进心肌细胞存活和心肌保护和/或心肌梗死(MI)后的修复的适应性血管生成。通过MAPK1/3，STAT3和CCND1介导的信号通路刺激内皮细胞增殖。抑制PI3K/AKT依赖性信号通路中的心肌细胞凋亡(相似性)。参与内皮细胞增殖和血管生成。

实施例1样本的收集

病例-对照研究是本研究所采用的方法。实验组的研究对象为2015年度在北京协和医院骨科住院的患严重骨关节炎的但还未接受手术治疗的患者4例，对照组的研究对象为不患有骨关节炎的相对健康者4例，实验组符合中华医学会骨科学分会骨关节炎诊断标准。实验组的年龄为58.5±2.0岁(56-61岁)，对照组的年龄为57.6±2.1岁(55-61岁)。根据中华人民共和国国家卫生与计划生育委员会2013年制定的《成人体重判定》标准，两组均选取BMI在24-28之间的超重者。实验方案经北京协和医院伦理委员会同意，并取得每位受试者的书面知情同意。实验组和对照组基本资料见表1。

收集实验组和对照组的晨起第二次中段尿，首先用无菌广口容器盛装，后转移至离心管，4,000g离心10min(4℃)，上清液被等分进50mL无菌管，-80℃保存备用。

表1样本的基本资料

OA病例组的纳入标准：

有完整的临床资料和影像学资料(双膝正侧位加髌骨轴位X线片)，根据病史和诊断标准诊断为严重骨关节炎(K-L分级4级)的体重超重女性患者，并签署知情同意书。

OA病例组的排除标准：

膝外伤手术史、膝关节感染、成年前膝关节畸形、代谢性骨病、下肢不等长、膝关节肿瘤史，骨质疏松症，肝肾疾病、高脂血症、高血压、糖尿病、甲状腺功能亢进、甲状旁腺功能亢进病史，近期服用雌激素、孕激素治疗者，痛风、类风湿关节炎等其它关节疾病，接受过改变病情抗风湿药或免疫抑制治疗，近6个月内接受过关节内注射药物治疗。BMI小于24或大于28。

对照组的纳入标准：

对照组选取的是不患有骨关节炎的超重女性患者，对照组的性别、年龄和BMI与OA病例组相匹配，并签署知情同意书。

对照组的排除标准：

膝外伤手术史、膝关节感染、成年前膝关节畸形、代谢性骨病、下肢不等长、膝关节肿瘤史，骨质疏松症，肝肾疾病、高脂血症、高血压、糖尿病、甲状腺功能亢进、甲状旁腺功能亢进病史，近期服用雌激素、孕激素治疗者，痛风、类风湿关节炎等其它关节疾病，接受过改变病情抗风湿药或免疫抑制治疗，近6个月内接受过关节内注射药物治疗。BMI小于24或大于28。

实施例2iTRAQ实验筛选差异蛋白

一、所用仪器和试剂

涡旋振荡器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司，型号：QL-901)

离心机(Thermo，型号：PICO17)

超声波细胞破碎仪(南京先欧仪器制造有限公司，型号：XO)

酶标仪(Thermo，型号：MμLtiskanMK3)

恒温孵浴器(上海浦东荣丰科学仪器有限公司，型号：HH.S4)

真空冷冻干燥机(Thermo，型号：SPD2010-230)

RIGOL L-3000高效液相色谱系统(北京普源精电科技有限公司)，流动相A：98％ddH2O，2％乙腈(pH 10)；流动相B：98％乙腈，2％ddH₂O(pH 10)高效液相色谱仪：(ThermoScientic EASY-nLC 1000System(Nano HPLC))，流动相A：100％超纯水，0.1％甲酸；流动相B：100％乙腈，0.1％甲酸质谱系统(Thermo，型号：Q-Exactive)

尿素(Bio-Rad，货号：161-0731，美国)

硫尿(Sigma-Aldrich，货号：T7875，美国)

CHAPS(Bio-Rad，货号：161-0460，美国)

Protease Inhibitor Cocktail(Roche，货号：04693116001，美国)

蛋白定量染液(Thermo Scientific，货号：23238，美国)

牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)(Sigma-Aldrich，货号：A2058，美国)

DTT(Bio-Rad，货号：161-0611，美国)

碘乙酰胺(Bio-Rad，货号：163-2109，美国)

试剂盒中的Dissolution Buffer(AB Sciex，PN：4381664)

胰酶(Promega，货号：V5111，美国)

10K超滤管(milipore，PN：UFC5010BK)

8标试剂盒(AB Sciex，PN：4390812，PN：4381664)

Ziptip(Millipore，PN：ZTC18M096(2μg))

色谱柱：Durashell-C18，4.6mm×250mm，5μm，(Agela，货号：DC952505-0)

乙腈(Merck，货号：100030，德国)

氨水(Sigma-Aldrich，货号：17837，美国)

预柱(AcclaimPepMap100column，2cm x 100μm，C18，5μm)

色谱柱(EASY-Spray column，12cmx 75μm，C18，3μm)

进样瓶(Thermo，11190533)

瓶盖(Thermo，11150635)

喷针(Thermo，PN：ES542)

二、iTRAQ定量实验流程

1.样品蛋白提取

1)将样本按照1：10(W/V)加入lysis buffer(7M尿素，2M硫脲，0.1％CHAPS，片/50mL Protease Inhibitor Cocktail)，涡旋混匀。

2)超声60s(0.2s on、2s off)，振幅22％。

3)室温提取30分钟。

4)15,000g，4℃离心20min，小心取出上清，分装后冻存于-80℃。

2.蛋白定量(Bradford法)

1)采用Bradford法[Marion M.Bradford.AnalyticalBiochemistry,1976,72:248-254]测定样本提取的蛋白浓度。先将样本用lysis buffer(7M尿素、2M硫脲、0.1％CHAPS)进行一定倍数稀释使其终浓度落在标曲范围内，稀释好的样本和标准品(将BSA用lysis buffer溶解成系列浓度的标准蛋白)各取10μL分别和300μL蛋白定量染料避光反应20min，用酶标仪同时测定标准品和样本在595nm下的吸光值，根据标准品每管吸光值和浓度的关系绘制标准曲线(曲线公式：y＝1.4337×x2+0.0406×x+0.03728，R²＝0.98906)。

2)根据曲线公式计算各样品蛋白浓度。

3.蛋白酶解(FilterAided Sample Preparation，FASP)

1)蛋白定量后取200μg蛋白溶液置于离心管中；

2)加入终浓度25mM DTT，60度反应1小时；

3)加入终浓度50mM碘乙酰胺，室温10分钟；

4)将还原烷基化后的蛋白溶液加入10K的超滤管中，12,000转离心20分钟，弃掉收集管底部溶液；

5)加入iTRAQ试剂盒中的Dissolution Buffer 100μL，12,000转离心20分钟，弃掉收集管底部溶液，重复3次；

6)更换新的收集管，在超滤管中加入胰蛋白酶，总量4μg(与蛋白质量比1:50)，体积50μL，37℃反应过夜；

7)次日，12,000转离心20分钟，酶解消化后的肽段溶液离心于收集管底部；

8)在超滤管中加入50μL DissolutionBuffer，12,000转再次离心20分钟，与上步合并，收集管底部共得到100μL酶解后的样品。

4.iTRAQ标记

1)从冰箱中取出iTRAQ试剂，平衡到室温，将试剂离心至管底。

2)向每管试剂中加入150μL异丙醇，涡旋振荡，离心至管底。

3)取50μL样品(100μg酶解产物)转移到新的离心管中。

4)将iTRAQ试剂填加到样品中，涡旋振荡，离心至管底，室温反应2小时。

5)加入100μL水终止反应。

6)为了检测标记效率及定量准确性，从4组样品中各取出1μL混合，用Ziptip脱盐后进行MALDI-TOF-TOF(AB SCIEX 4800Plus)鉴定，确认标记反应良好；

7)混合标记后的样品，涡旋振荡，离心至管底。

8)真空冷冻离心干燥。

9)抽干后的样品冷冻保存待用。

5.酶解肽段离线预分离及LC-MS/MS质谱分析

5.1高pH条件下的反相色谱分离

1)混合标记后的样品用100μL流动相A溶解，14000g离心20min，取上清待用。

2)使用400μg酶解好的BSA进行分离(柱温45℃，检测波长214nm)，检测系统情况。

3)取100μL准备好的样本上样、分离，流速0.7mL/min。

5.2纳升级反相色谱-Q Exactive进行蛋白质分析

1.实验步骤

1)将高pH反相分离得到的组份用20μL 2％甲醇，0.1％甲酸复溶。

2)12,000rpm离心10分钟，吸取上清上样。

3)上样体积10μL，采取夹心法上样。

4)Loading Pump流速350nl/min，15分钟。

5)分离流速300nl/min，分离梯度如下表2：

表2纳升级反相色谱分离梯度

2.质谱参数设置

a)离子源参数：

Spray voltage：2.3kv；

Capillary Temperature：320℃；

Ion Source：EASY-Spray source；

DP：100；

b)FμLl MS：

Resolution：70000FWHM；

FμLl Scan AGC target：3e6；

FμLl Scan Max.IT：20ms；

Scan range：300-1800m/z；

c)dd-MS2：

Resolution：17500FWHM；

AGC target：1e5；

Maximum IT：120ms；

Intensity threshold：8.30E+03；

Fragmentation Methods：HCD；

NCE：32％；

Top N：20；

6.质谱数据分析

6.1数据库

数据库的选择是以所需物种、数据库注释完备性及序列可靠性为参考依据的。在本次实验中选择的数据库来自UniProt(http://www.uniprot.org/)，数据库本版为：UniProt.Rat.201509.fasta。

6.2检索软件

iTRAQ的质谱分析是由Thermo Q-Exactive型质谱完成，产生的质谱原始文件*.RAW采用Mascot 2.5.1软件搜库处理，采用scaffold软件对搜库结果进行质控。

7.生物信息学分析

7.1差异蛋白定量信息统计

对要比较的两组样本使用Perseus 1.3.0.4.(www.maxquant.org)软件进行统计分析，筛选P value≤0.05，并且两组样本中蛋白ratio≥1.25或ratio≤0.75的差异蛋白。

7.2差异蛋白质功能注释

使用UniProt(http://www.uniprot.org/)对全部蛋白质进行全面的生物学功能注释，获取与这些蛋白质所有相关的功能信息。包括Gene Ontology(GO)和通路等注释信息。

7.3差异蛋白功能富集分析

使用MetaCore软件对不同组别差异蛋白进行功能富集分析。使用MetaCore对各组差异表达蛋白质进行了基于Gene Ontology(GO)的生物学过程(biologicalprocess)，细胞组分(cellμLar component)和分子功能(molecμLar function)的富集分析。该分析是指利用功能注释工具高通量地对每个蛋白质进行注释，得到实验鉴定蛋白质在各类生物学过程或分子功能上的分布情况，并将该分布与总体蛋白质的相应分布进行比较，从而确认实验鉴定的蛋白质在哪几类生物学过程或分子功能上显著富集(即p值小于0.05)，从整体上把握鉴定的蛋白质与预期功能分布之间的吻合程度，还可以获得与某些特定功能相关的蛋白质分子。通过MetaCore分析，获得差异蛋白质的生物学过程、细胞组分、分子功能富集结果。

7.4差异蛋白质通路富集分析

使用MetaCore软件对差异表达蛋白质进行通路分析，获取与差异表达蛋白质所有相关的通路信息以及富集的通路。

8.结果

基于iTRAQ技术，本发明从实验组和对照组的尿液中共鉴定到了1413种蛋白质，其中两组间的差异蛋白总共有394个，170个蛋白质在OA实验组中上调，224个蛋白质在OA实验组中下调。根据GO分析可知：差异蛋白主要位于细胞外囊泡、细胞外分泌小体、细胞外基质部分以及细胞膜；差异蛋白与肽酶和肽链内切酶等的调节和抑制作用有关，还与细胞粘附分子和蛋白受体的结合等分子功能相关；差异蛋白主要参与细胞粘附、损伤修复的调节、应激反应等生物过程。

发明人通过Gene Onlogy和信号通路分析，以及结合文献发明人筛选了1个在骨关节炎患者的尿液中表达下调的差异蛋白，即GALNT18(Polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase 18，多肽N-乙酰半乳糖胺基转移酶18)，和2个表达上调的差异蛋白即IGFLR1(IGF-like familyreceptor 1，胰岛素样家族受体1)和MYDGF(Myeloid-derived growth factor，髓源生长因子)。这些蛋白可以作为骨关节炎的尿液生物标志物，对于疾病的诊断、治疗和预后提供理论依据。

实施例3western blot检测GALNT18、IGFLR1和MYDGF蛋白在骨关节炎患者中的表达情况

一、蛋白提取

蛋白提取过程同时实例2中所述。

二、利用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行总蛋白定量

采用康为世纪微量BCA蛋白定量试剂盒(货号：CW2011)，具体步骤见其说明书。

三、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

1、蛋白质样品变性:

a)根据BCA蛋白质浓度测定结果，每个凝胶加样孔中加入相同质量的总蛋白提取物。按照每1微升蛋白样品加入0.25微升蛋白上样缓冲液的比例，混合蛋白样品和蛋白上样缓冲液(5x)。

b)100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。

c)冷却到室温后，直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。

2、胶板制备:

采用Bio-Rad公司的微型垂直板电泳装置制备0.75mm厚的凝胶，照说明书安装好玻璃板后，先在小烧杯中配制5mL 10％的分离胶，配方如下：

表3分离胶配方

组分	用量
		30％丙烯酰胺溶液	1.7mL
Tris-HCL(1.5M，pH8.8)	1.3mL
		10％SDS	0.05mL
10％AP	0.05mL
		TEMED	0.002mL
灭菌ddH2O	补充至5mL

混匀后立即灌胶，然后加1mL蒸馏水覆盖，室温下放置约30min待胶聚合后，用蒸馏水洗2-3次，再用滤纸吸干。然后制备2mL 5％的浓缩胶，配方如下：

表4浓缩胶配方

组分	用量
		30％丙烯酰胺溶液	0.33mL
Tris-HCL(1.0M，pH6.8)	0.25mL
		10％SDS	0.02mL
10％AP	0.02mL
		TEMED	0.002mL
灭菌ddH2O	补充至2mL

混匀后立即灌胶，插入样品梳，避免产生气泡，待胶凝固后，取出样品梳，后用蒸馏水和1x蛋白电泳缓冲液先后冲洗样品孔。

3、上样及电泳

将凝胶板装在电泳装置上，内槽中加满1x蛋白电泳缓冲液，外槽中1x蛋白电泳缓冲液应超过铂丝，按顺序上样。在末端泳道中加入蛋白质质量标准蛋白梯度。电泳时蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

四、蛋白质印迹

1、按照上述方法先进行SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白。

2、预先用转印缓冲液浸泡NC膜、滤纸、海棉垫。SDS-PAGE结束后取出凝胶，去除浓缩胶，在Tris/甘氨酸缓冲液中漂洗数秒，然后置于转印缓冲液中浸泡15-30min。打开电转印夹，每侧垫上一块专用的用转印缓冲液浸泡透的海棉垫，再各放一块转印液浸透的滤纸，滤纸与海棉垫大小相同或与NC膜，凝胶大小相同均可，将凝胶平放在阴极侧滤纸上，最后将NC膜平放在凝胶上，去除气泡，夹好电转印夹。在电泳槽加满电转印液，插入电转印夹，将电泳槽放入冰箱内(电转印液之前要放入冰箱内预冷)，连接好电极，接通电流，转印夹的NC膜应对电泳槽的正极。

3、封闭：用1xTBS漂洗一次。加入含5％的无脂奶粉TBS封闭缓冲液，置于振荡培养箱中进行封闭；

4、一抗杂交：弃封闭液，加入用一抗稀释液稀释的一抗杂交溶液，置于4℃杂交过夜，第二天在振荡培养箱中进行杂交；

5、回收一抗杂交液，用TBST洗膜3次；

6、弃TBST，加入用封闭缓冲液稀释的二抗(Goat Anti-Rabbit IgG,HRPConjugated，CW0103)杂交溶液，置于振荡培养箱中进行杂交；

7、弃二抗溶液，用TBST洗膜3次；

8、ECL化学发光及图像采集和分析：按照高灵敏度化学发光检测试剂盒(康为世纪货号CW0049B)，具体步骤参照说明书。

9、以β-Actin作为内参进行数据标准化，以正常人作为参照样本，观察骨关节炎尿液样本中GALNT18、IGFLR1和MYDGF蛋白的相对表达水平。

所述GALNT18、IGFLR1和MYDGF一抗如下：

GALNT18antibody((LS-C102332，LSBio)；

IGFLR1antibody(PAB20596，abnova)；

Anti-MYDGF Antibody(11353-1-AP，Proteintech)。

五、实验结果

结果显示，与正常对照组相比，骨关节炎患者尿液中GALNT18蛋白在骨关节炎组中的表达下调，IGFLR1和MYDGF蛋白在骨关节炎组中的表达上调。与蛋白组学实验结果具有一致性。提示GALNT18、IGFLR1和MYDGF可能是与骨关节炎发生相关的关键因子。

实施例4骨关节炎相关尿蛋白检测试剂盒制备

本发明的试剂盒为检测骨关节炎相关GALNT18、IGFLR1和MYDGF尿蛋白的试剂盒。

以β-Actin作为内参，以正常人作为参照样本，观察骨关节炎尿液样本中GALNT18、IGFLR1和MYDGF蛋白的相对表达水平。

本发明所述试剂盒包括提取尿液样本中的蛋白质的试剂，所述试剂包括lysisbuffer；

所述试剂盒可以包括蛋白浓度测定试剂，所述试剂源于BCA蛋白定量试剂盒，所述试剂盒可以在市面上购买。

所述试剂盒还包括分离胶配方体系的试剂以及浓缩胶配方体系的试剂，如实施例3中表3和表4所示；所述试剂盒还包括5x蛋白上样缓冲液、5x蛋白电泳缓冲液。

所述试剂盒还包括NC膜、10x转印缓冲液、10xTBS缓冲液、1xTBST缓冲液、脱脂奶粉、一抗、二抗、显影液、定影液、ECL化学发光试剂。

所述试剂盒放于4℃，避光保存。

上述试剂可以商业购买。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种检测骨关节炎的标记物，其特征在于，所述标志物为GALNT18、IGFLR1和MYDGF蛋白。

2.根据权利要求1所述的标志物，其特征在于，所述GALNT18在骨关节炎样本中表达下调，所述IGFLR1和MYDG在骨关节炎样本中表达上调。

3.根据权利要求2所述的标志物，其特征在于，所述骨关节炎样本为尿液样本。

4.GALNT18、IGFLR1和MYDGF蛋白的用途，其特征在于，用于制备检测骨关节炎的试剂、试剂盒或芯片。

5.根据权利要求4所述的用途，所述检测包括：

a)获得受试者和正常对照的尿液，

b)任选地，分离尿蛋白，

c)确定所述受试者和正常对照的尿液中权利要求1中所限定的蛋白的表达水平，

d)将所述受试者和正常对照的尿液中蛋白的表达水平进行比较，

e)根据步骤d)的比较结果，检测所述受试者是否患有骨关节炎疾病。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，使用选自以下的方法进行步骤c)中的所述确定：质谱方法、ELISA方法、Western方法或其组合。

7.一种用于检测骨关节炎疾病的试剂盒，其特征在于，其包含检测GALNT18、IGFLR1和MYDGF蛋白表达量的试剂。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述检测GALNT18、IGFLR1和MYDGF蛋白表达量的试剂包括GALNT18、IGFLR1和MYDGF蛋白的特异性抗体试剂。

9.一种芯片或陈列，其特征在于，所述的芯片或陈列上具有检测GALNT18、IGFLR1和MYDGF蛋白表达量的试剂。

10.根据权利要求9所述的芯片或阵列，其特征在于，所述的检测GALNT18、IGFLR1和MYDGF蛋白表达量的试剂为GALNT18、IGFLR1和MYDGF蛋白的特异性抗体。