CN116223820A - 一种用于预测或诊断慢阻肺的生物标志物及其应用和筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于预测或诊断慢阻肺的生物标志物及其应用和筛选方法，所述生物标志物为胰岛素样生长因子IGFBP2。本发明通过LC‑MS/MS技术筛查慢阻肺患者血清中差异表达蛋白，并选择部分关键蛋白用酶联免疫吸附试验(ELISA)进行验证，通过上述方式寻找慢阻肺发生发展的关键蛋白IGFBP2作为COPD早期诊断的生物标志物。本发明中生物标志物IGFBP2在慢阻肺诊断中的应用，具有较高临床使用和推广价值，为临床治疗提供指导思路。

Description

一种用于预测或诊断慢阻肺的生物标志物及其应用和筛选 方法
技术领域
本发明涉及临床检验诊断技术领域，尤其涉及一种用于预测或诊断慢阻肺的生物标志物及其应用和筛选方法。
背景技术
慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD，慢阻肺)是一种受遗传和环境因素影响的异质性疾病。根据世界卫生组织报道到2030年COPD将在导致发病和死亡的慢性疾病中排名第三，每年将有450万人死于COPD及其相关疾病，并且到2060年时死亡人数会增至每年540万人。而在中国，在20岁及以上的普通人群中COPD的总体患病率为8.6％。COPD在世界范围内发病率、致残率和死亡率都很高，给社会带来了严重的负担。因此，加强COPD早期诊断和早期治疗的研究迫在眉睫。
目前，临床上对慢阻肺的诊断主要依赖肺功能检查结果，对急性加重期的判定依据临床症状的描述，过程操作复杂、检查费用较高且缺乏量化标准。慢性阻塞性肺疾病诊治指南(2021年修订版)中的诊断部分并未提供一种生物标志物来辅助量化诊断、严重程度评估及判断急性加重的病因和预后。COPD的治疗主要依靠内科治疗，常用于急性加重期治疗的三类药物是支气管扩张剂、抗生素和糖皮质激素。这些药物可以通过扩张支气管等来善症状、减轻恶化，但它们不针对具体发病机制。此外，没有研究表明这些药物能改善患者的肺功能、用药依从性和长期生活质量。且长期药物控制可导致耐药性和不良反应，如免疫抑制、骨质疏松、青光眼、白内障等。因此，需要寻找一种生物标志物来用于早期诊断慢阻肺。
发明内容
考虑目前慢阻肺的诊断操作复杂、检查费用较高且缺乏量化标准，缺乏一种生物标志物用于高效、便捷、精准、廉价的诊断慢性阻塞性肺疾病。为解决上述问题，本发提出一种用于预测或诊断慢阻肺的生物标志物。
本发明采用了如下技术方案：
本发明的第一个目的在于，提供一种用于预测或诊断慢阻肺的生物标志物，包含胰岛素样生长因子IGFBP2。
本发明的第二个目的在于，提供如上所述的生物标志物在制备用于预测或诊断慢阻肺风险的产品中的应用。
本发明的第三个目的在于，提供如上所述的生物标志物的筛选方法，包括：
步骤(a)、利用液相色谱串联质谱技术对慢阻肺患者和正常人的血清进行蛋白组学分析，筛查出正常人群与慢阻肺人群之间的差异表达蛋白；
步骤(b)、从正常人群与慢阻肺人群之间筛查出的数种差异表达蛋白中挑选关键蛋白IGFBP2作为诊断慢阻肺的生物标志物，并采用酶联免疫吸附实验进行验证。
具体方法如下：
1、收集实验所需的血清样本，用去高丰度试剂盒来提取蛋白质，使用了Bradford方法确定提取蛋白的浓度；
2、经过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定未降解蛋白总量，银染色检测聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白；
3、取定量的蛋白质用胰蛋白酶进行酶解，用液相色谱串联质谱分析对所得肽段进行检测，使用包含UniProt序列的人类蛋白质组学数据库进行鉴定，确定关键蛋白IGFBP2；
4、再次收集慢阻肺急性加重期患者和健康人的血清标本，用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测IGFBP2在血清样本中的浓度。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)是一种功能强大的蛋白质组学方法，一次可以识别多种差异表达蛋白(DEPs)的同时具有高分离性、高灵敏度和高特异性以及高通量分析性等优势。基于此背景，本发明通过LC-MS/MS技术筛查慢阻肺患者血清中差异表达蛋白，并选择部分关键蛋白用酶联免疫吸附试验(ELISA)进行验证，通过上述方式寻找慢阻肺发生发展的关键蛋白IGFBP2作为COPD早期诊断的生物标志物。
本发明中生物标志物IGFBP2在慢阻肺诊断中的应用，具有较高临床使用和推广价值，为临床治疗提供指导思路。
附图说明
图1为慢阻肺急性加重期患者与健康对照者间蛋白质火山图；
图2为慢阻肺急性加重期患者与健康对照者间蛋白质热图；
图3为慢阻肺急性加重期患者与健康对照者间血清IGFBP2浓度质谱结果；
图4为IGFBP2接受者操作特性曲线。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
1、材料
PierceTM Top 12Abundant Protein Depletion Spin Columns，购自Thermo公司；
移液器、离心机，购自Eppendorf公司；
垂直混合器，购自新芝生物科技公司；
酶标仪，购自BioTek公司；
DYY-6B型稳压稳流电泳仪，购自北京市六一仪器厂；
Gel Image System，购自天能公司；
振荡器，购自上海净信公司；
电泳仪，购自北京市六一仪器厂；
REVCO Value Plus，购自Thermo Scientific公司；
电泳槽，购自Life公司；
恒温水浴箱，购自太仓市华利达公司；
ELISA试剂盒，购自上海酶联生物公司。
2、方法
(1)血清样本的收集
在安徽医科大学第二附属医院呼吸与重症医学科收治的患者中采集11份血清样本用于实验。8份血清样本来自COPD患者，其中5例是急性加重期患者，3例是稳定期患者，其余3份样本来自健康人作为对照组。采集血液样本约10ml，室温避光条件下放置1h，后于设置为4℃3000转的离心机中离心15分钟。用移液枪吸入上清转移到新管中，-80℃保存，待实验使用。
(2)蛋白质提取和质量控制
采用PierceTM Top 12Abundant Protein Depletion Spin Columns去高丰度试剂盒来提取蛋白质。使用了Bradford方法确定提取蛋白的浓度。所有血清样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定未降解蛋白总量，银染色检测聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白。
(3)胰蛋白酶对蛋白质的酶解
将60μg定量蛋白与5μL二硫苏糖醇溶液(1M)混合在离心管中。37℃下保存1h后，在黑暗中向离心管中加入20μL碘乙酰胺溶液，室温下再静置1小时。离心所有样品后丢弃上清液。将颗粒与100μL尿酸缓冲液(8M尿素，100mM Tris-HCl；pH值8.0)。离心三次，每次除去上清液，所得沉淀与NH4HCO3(50mM,100μL)混合。再将混合物离心三次，每次都丢弃上清液。将胰蛋白酶按蛋白与胰蛋白酶50:1的比例加入超滤管。样品在37℃下酶解12-16小时。
(4)液相色谱串联质谱分析
每份血清样品采用纳升流速HPLC液相系统进行分离混合物中的多肽。流动相A相设置为2％乙腈、0.1％甲酸、98％水。流动相B相设置为80％乙腈、0.08％甲酸、20％水。采用以下B相梯度参数:0～50min，提高至26％；50-70min，增至38％；70-71min，增加到100％；71～78min，保持在100％。每份样品经毛细管高效液相色谱分离后用Q Exactive HF质谱仪(Thermo Scientific)对所得肽段进行进行质谱分析。
(5)序列数据库搜索与分析
肽鉴定通过使用包含UniProt序列的人类蛋白质组学数据库进行。
(6)酶联免疫吸附试验(ELISA)
本研究收集了80例慢阻肺急性加重期患者和80例健康人的血清标本，试剂盒设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl。每孔加入酶标试剂100μl，空白孔除外。用封板膜封板后置37℃温育60分钟。揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。每孔加终止液50μl来终止反应。以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。根据吸光度计算出浓度。
3、结果
1)液相色谱串联质谱分析确定组间差异蛋白
慢阻肺急性加重人群与正常人群之间鉴定出45个差异表达蛋白，13个上调，32个下调。其中在慢阻肺急性加重人群与正常人群之间上调的13个蛋白质中包括IGFBP2。慢阻肺稳定期患者组和健康对照组共检测到79个差异表达蛋白，其中18个上调，61个下调。
慢性阻塞性肺病急性加重组与健康对照组的火山图见图1。火山图显示了所有蛋白表达变化的分布，红点表示蛋白表达上调，绿点表示蛋白表达下调，黑点表示蛋白表达无显著差异。对这些差异蛋白进行聚类分析，热图能够显示慢性阻塞性肺病急性加重组的蛋白表达模式。
慢性阻塞性肺病急性加重组与健康对照组的热图见图2，结果发现COPD急性加重组的蛋白表达模式聚类在一起，且蛋白表达模式与健康对照组有显著差异。
2)酶联免疫吸附试验结果
通过ELISA实验测得IGFBP2在正常人群血清中浓度的平均值±标准偏差为644.50±342.01ng/ml，在慢阻肺急性加重人群血清中的浓度为947.91±318.80ng/ml，p<0.001，表明两组间血清的IGFBP2浓度存在差异且符合质谱结果(图3)。进一步利用实验数据绘制接受者操作特性曲线(ROC曲线)，得到受试者工作特征下面积(AUROC)为0.705(95％ CI:0.623,0.787)，表明IGFBP2对慢阻肺急性加重期的诊断具有较高的准确性(图4)。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种用于预测或诊断慢阻肺的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物为胰岛素样生长因子IGFBP2。
2.如权利要求1所述的生物标志物在制备用于预测或诊断慢阻肺风险的产品中的应用。
3.如权利要求1所述的生物标志物的筛选方法，其特征在于，包括：
步骤(a)、利用液相色谱串联质谱技术对慢阻肺患者和正常人的血清进行蛋白组学分析，筛查出正常人群与慢阻肺人群之间的差异表达蛋白；
步骤(b)、从正常人群与慢阻肺人群之间筛查出的数种差异表达蛋白中挑选关键蛋白IGFBP2作为诊断慢阻肺的生物标志物，并采用酶联免疫吸附实验进行验证。
4.如权利要求3所述的生物标志物的筛选方法，其特征在于，具体方法如下：
1、收集实验所需的血清样本，用去高丰度试剂盒来提取蛋白质，使用了Bradford方法确定提取蛋白的浓度；
2、经过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定未降解蛋白总量，银染色检测聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白；
3、取定量的蛋白质用胰蛋白酶进行酶解，用液相色谱串联质谱分析对所得肽段进行检测，使用包含UniProt序列的人类蛋白质组学数据库进行鉴定，确定关键蛋白IGFBP2；
4、再次收集慢阻肺急性加重期患者和健康人的血清标本，用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测IGFBP2在血清样本中的浓度。
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