CN114184794B - 尿液蛋白质在进展期白癜风激素疗效评估中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了耐扭蛋白A相互作用蛋白‑1和/或蛋白二硫化物异构酶A4在制备白癜风激素治疗疗效评估产品中的用途。所述两种蛋白对于预测进展期白癜风激素治疗疗效具有较好的临床应用前景，从而实现患者的个性化治疗。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及尿液中进展期白癜风蛋白标志物在激素治疗疗效评估中的用途。
背景技术
白癜风是一种常见的获得性色素脱失性疾病，临床上以境界清楚的皮肤色素脱失斑为主要表现。根据白癜风病情发展情况，分为进展期和稳定期，患者常出现不可预测的稳定期和进展期的反复交替。由于其具有影响美观、病程较长、治疗抵抗的特点，严重影响了患者的身心健康和生活质量。目前系统性应用糖皮质激素广泛应用于抑制白癜风的快速进展并刺激皮肤复色。临床上，常根据进展期白癜风患者的治疗反应，决定糖皮质激素的应用疗程。长期使用糖皮质激素将影响内源性激素正常功能，并导致严重的副作用；而糖皮质激素用量不足，将会贻误病情，造成白斑进一步进展。目前，评估白癜风激素疗效以临床表现为主，缺乏能客观、准确评估白癜风激素治疗疗效的生物标志物。此标志物能够用来辅助判断激素使用疗程，制定个性化治疗方案，及时停药减少副作用，或及时调整药物干预方案避免贻误病情，具有重要的临床价值。
基于质谱技术的蛋白质组分析是大规模筛选各种体液中疾病相关蛋白质生物标记物的有力生物学方法。尿液是鉴定潜在生物标志物的理想标本，具有取材方便、简单、无创、快速、能够连续监测等优势。尿蛋白质组学已被广泛用于肿瘤、自身免疫性病等疾病的生物标记物的筛选。既往研究中，尿蛋白质组学的方法也被用于预测药物治疗的疗效。目前尚无利用尿蛋白组学生物标志物评估活动性白癜风激素治疗疗效的研究报道。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的目的是在于提供与进展期白癜风激素治疗疗效评估相关的生物标志物，利用定量蛋白质组学技术手段，通过检测差异蛋白表达水平，可以判断患者经过激素治疗后疾病是否得到控制，从而为个体化治疗提供一种新的手段。
为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
第一方面，本发明提供了耐扭蛋白A相互作用蛋白-1和/或蛋白二硫化物异构酶A4在制备白癜风激素治疗疗效评估产品中的用途。
优选地，所述白癜风包括进展期白癜风。
在具体的实施方案中，相较于激素治疗前，所述耐扭蛋白A相互作用蛋白-1和/或蛋白二硫化物异构酶A4含量升高，指示所述受试者激素治疗疗效好。
优选地，所述蛋白含量的检测方法包括质谱技术和酶联免疫吸附试验法。
优选地，所述蛋白含量包括蛋白质相对含量。
优选地，其中所述质谱技术是在数据非依赖检测模式或基于靶向质谱模式下使用的。
优选地，所述检测耐扭蛋白A相互作用蛋白-1和/或蛋白二硫化物异构酶A4的含量的样本为受试者的尿液样本。
优选地，所述受试者是人。
第二方面，本发明提供了一种用于进展期白癜风激素治疗后疗效评估的试剂盒，包括检测耐扭蛋白A相互作用蛋白-1和/或蛋白二硫化物异构酶A4含量的试剂。
优选地，所述试剂包括质谱鉴定试剂。
在具体的实施方案中，所述质谱鉴定试剂在数据非依赖采集方法中或基于靶向质谱模式下使用的。数据非依赖检测方法是将质谱整个全扫描范围分为若干个窗口，高速、循环地对每个窗口中的所有离子进行选择、碎裂、检测，从而无遗漏、无差异地获得样本中所有离子的全部碎片信息。数据非依赖检测就像地毯式轰炸，无遗漏地打击全部目标。靶向质谱采集是利用目的蛋白的特征性肽段进行定量分析。
优选地，所述试剂包括耐扭蛋白A相互作用蛋白-1和/或蛋白二硫化物异构酶A4的特异性抗体。
第三方面，本发明提供了一种用于进展期白癜风激素治疗后疗效评估的系统，包括检测耐扭蛋白A相互作用蛋白-1和/或蛋白二硫化物异构酶A4含量的试剂。
第四方面，本发明提供了一种预测进展期白癜风激素治疗后疗效的方法，包括步骤：
1)获得受试者的尿液样本，
2)从尿液样本中提取蛋白质，
3)确定受试者尿液样本中选自以下的蛋白质的含量水平：耐扭蛋白A相互作用蛋白-1，蛋白二硫化物异构酶A4。
优选地，所述蛋白含量的检测方法为质谱方法。
当采用质谱方法确定蛋白质水平时，在获得尿液样本的步骤之后，还可以包括蛋白质提取，酶切。在具体的实施方案中，用3倍体积乙醇提取尿液样本中的蛋白沉淀，用胰蛋白酶消化尿液样本中的蛋白。
在具体的实施方案中，所述质谱方法是数据非依赖采集方法。具体地，数据非依赖检测方法将质谱整个全扫描范围分为若干个窗口，高速、循环地对每个窗口中的所有离子进行选择、碎裂、检测，从而无遗漏、无差异地获得样本中所有离子的全部碎片信息。
本发明的优点和有益效果：
在本发明中，收集了非节段型进展期白癜风患者经激素治疗前后的尿液，采用液相色谱-高分辨质谱方法。通过PCA、OPLS-DA监督聚类分析，差异倍数分析和T检验分析，筛选出潜在的生物标志物，并通过酶联免疫吸附试验法进一步验证差异蛋白对疾病抵抗组和有效组之间治疗疗效预测有很好的区分，具有良好的临床应用前景。
本发明首次发现了能够评估进展期白癜风激素治疗疗效的蛋白标志物，通过检测蛋白标志物的含量，可以判断受试者经过激素治疗后疾病是否得到控制，制定个性化治疗方案，提高治疗疗效、减少不良反应、避免延误病情。
附图说明
图1：进展期白癜风治疗后抵抗组和有效组尿液蛋白组学PCA分类图；
图2：进展期白癜风治疗后抵抗组和有效组尿液蛋白组学OPLS-DA分类图；
图3：人耐扭蛋白A相互作用蛋白-1(TOR1AIP1)和人蛋白二硫化物异构酶A4(PDIA4)及其二者组合后的ROC曲线；
图4：尿液样本中人耐扭蛋白A相互作用蛋白-1含量差异表达图；
图5：尿液样本中人蛋白二硫化物异构酶A4含量差异表达图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
下述实施例所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所有的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
本文中，所述蛋白二硫化物异构酶A4(P13667)和耐扭蛋白A相互作用蛋白-1(Q5JTV8)，记载在www.uniprot.org数据库中。
本文中，“激素治疗”包括使用任何可以治疗进展期白癜风的激素类药物进行干预，其包括(但不限于)糖皮质激素类药物如予泼尼松龙、氢化可的松、可的松、泼尼松、甲泼尼松、曲安西龙、帕拉米松；治疗的方法可以根据本领域技术人员熟知方法，根据具体的药物、患者的状况和被治疗的疾病的病程和状况等而定。
在一具体实施方式中，本发明的治疗方法：泼尼松龙0.5mg/kg/d口服一周，而后在5周内逐渐减停进行疗效评估。
本文中，“激素有效”定义为既往存在的所有病变完全停止发展，无新的病变出现，伴或不伴白斑的复色。“激素抵抗”定义为既往存在的白斑继续进展或出现新的白斑。
实施例1
本发明用液相色谱-高分辨质谱(LC-MS/MS)通过数据非依赖性采集方法(Dataindependent acquisition,DIA)检测尿液中相关蛋白质。
一、材料与试剂
1)仪器：Easy-nLC 1000(Thermo Fisher Scientific公司)；Orbitrap FusionLumos质谱仪质谱仪(Thermofisher Scientific公司)。
2)主要试剂：乙腈(Thermofisher Scientific公司)；富集柱(75μm×2cm,C18,5μm,Thermo Scientific公司),C18反相色谱柱(75um×50cm,C18，Kyoto Monotech公司)。
3)样本：纳入58例非节段型进展期白癜风患者，泼尼松龙0.5mg/kg/d口服一周，而后在5周内逐渐减停后立即复诊。通过患者两次就诊间电子照片、Wood灯荧光显像和临床检查结果对比来评估患者的治疗反应。共42例激素治疗有效，16例激素治疗抵抗。留取上述样本激素治疗前及治疗后的尿液，将两组分为性别、年龄匹配的实验组及验证组进行实验，来自北京协和医院。
二、试验方法
1.1人尿液样品的收集
收集空腹晨尿，尿液样本5000g/min离心30min，去掉尿沉渣。
1.2尿液蛋白质提取
取离心后的尿液上清，上清液加入3倍体积的乙醇，经4℃沉淀2小时，10000g/min离心30min得到尿蛋白沉淀。沉淀加入裂解液溶解(7M尿素，2M硫脲，0.1M二硫苏糖醇和5mM三氨基甲烷(Tris))，37℃静置1小时，加入1mol/L的碘乙酰胺至终浓度0.05mol/L，室温避光45min。样本转移到10KD超滤膜上用缓冲液(7M尿素和50mM Tris)清洗两次之后，用25mM碳酸氢铵溶液再清洗两次。处理后的样品在25mM碳酸氢铵溶液中用胰蛋白酶消化。消化后的肽段从10KD的过滤器中洗脱，在C18柱上脱盐纯化。
1.3液相分析
样本及混合的质控样本肽段首先用高效液相色谱柱(4.6mm×250mm，3μm)进行预分离，多肽的洗脱液梯度为5％～35％B液(90％乙腈)，流速为1mL/min，洗脱时间为30min。每分钟收集一个组分，抽干后溶解于0.1％甲酸水溶液，按照6～7,8～9,10～11,12～13,14～16,17～19,20～22和23～26将收集的组分合并为8个组分。
1.4质谱分析
上述样品的各个组分均采用相同的LC-MS/MS参数进行分析。多肽样品先后经过富集柱和C18反向分析柱，多肽的洗脱液梯度为5％～30％B液(0.1％甲酸，99.9％乙腈)，流速为300nL/min，洗脱时间为40min。洗脱的肽段用Thermofisher Orbitrap fusion Thribridlumos质谱仪分析鉴定，分析模式采用数据非依赖采集模式。
1.5质谱数据分析
质谱数据应用Spectronaut(Biognosys公司，版本14.3)软件进行数据库检索，数据库为SwissProt人类蛋白质组学数据库(www.uniprot.org,20121条序列)。搜索参数为:胰蛋白酶酶切，误切位点为2个，母离子和子离子的质量精确度分别为10ppm和0.02Da，固定修饰为半胱氨酸的脲基甲基化，可变修饰为甲硫氨酸氧化(+43.00Kn)。
三、结果
非监督PCA得分图(图1)显示激素治疗有效组和激素治疗抵抗组呈现出一定的区分度。进一步采用监督OPLS-DA构建模型(图2),两组区分度更加明显。将p<0.05确定为差异蛋白，共筛选出差异蛋白341个。经验证组进行验证后筛选出54个差异蛋白。结果显示治疗前抵抗组及有效组间人耐扭蛋白A相互作用蛋白-1(FC＝0.35787)，人蛋白二硫化物异构酶A4(FC＝0.26298)具有统计学差异。
采用ROC曲线评估差异蛋白对激素治疗疗效的预测效果，结果显示人耐扭蛋白A相互作用蛋白-1，人蛋白二硫化物异构酶A4具有较好的预测价值，AUC值分别为0.7738和0.9524，预测效果良好，进一步使用随机森林模型评估人耐扭蛋白A相互作用蛋白-1和人蛋白二硫化物异构酶A4联合预测能力，AUC值为0.899(图3)。
实施例2
发明人用ELISA试剂盒检测治疗前后激素治疗有效组及抵抗组尿液中相关蛋白质。
一、材料与试剂
1)仪器：MOLECULAR DEVICES CMax Plus酶标仪，洗板仪(Thermo Labsystems公司)，微量高速离心机(国产，型号：TG16W)，隔水式恒温培养箱(国产，型号：GNP-9080)。
2)主要试剂：人视黄醇结合蛋白-1ELISA检测试剂盒(泉州市九邦生物科技有限公司)，人耐扭蛋白A相互作用蛋白-1ELISA检测试剂盒(泉州市九邦生物科技有限公司)。
3)样本：22例非节段型进展期白癜风患者激素治疗前、后的尿液(12例激素治疗有效，10例激素治疗抵抗)，治疗方案同实例1,来自北京协和医院。
二、试验方法
1.1人尿液样品的收集
收集空腹晨尿，尿液样本3000g/min离心20min，取上清液，去掉尿沉渣，装入1.5mL离心管。
1.2试剂准备
1)提前将ELISA检测试剂盒自冰箱取出，室温放置30分钟；
2)使用超纯水将25x清洗缓冲液稀释；
3)使用校准稀释液将标准品按照说明书要求倍比稀释，并将校准稀释液作为空白对照。
1.3实验步骤
1)设置标准品孔，标准品孔各加入不同浓度的标准品50μl。
2)分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中加样品50μl。将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。每孔加入酶标试剂100μl。用封板膜封板后置37℃温育60分钟。
3)每孔注入洗液350μL，浸泡1min，在洗板仪进行洗板，重复5次。
4)每孔先加入显色剂A 50μl，再加入显色剂B 50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。
5)每孔加终止液50μl，终止反应，轻拍微孔板侧面混匀，待溶液由蓝色均变为黄色后，尽快使用酶标仪检测450nm处吸光度。
6)以标准物的浓度为纵坐标，吸光度为横坐标，计算出标准曲线的直线回归方程或多项式二次回归方程，将样品的吸光度代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
三、结果
ELISA结果显示，人耐扭蛋白A相互作用蛋白-1在治疗后抵抗组和有效组间均有统计学差异，和质谱的数据一致。在治疗有效组中，与治疗前相比，人耐扭蛋白A相互作用蛋白-1经过治疗后水平升高；在治疗抵抗组中，与治疗前相比，人耐扭蛋白A相互作用蛋白-1治疗后水平降低，与治疗有效组趋势相反(图4)。
人蛋白二硫化物异构酶A4在治疗后抵抗组和有效组间有统计学差异，和质谱的数据一致。在治疗有效组中，与治疗前相比，人蛋白二硫化物异构酶A4经过治疗后水平升高；在治疗抵抗组中，与治疗前相比，治疗后水平进一步降低，与治疗有效组趋势相反(图5)。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (6)
1.耐扭蛋白A相互作用蛋白-1和/或蛋白二硫化物异构酶A4在制备白癜风激素治疗疗效评估产品中的用途；
所述白癜风包括进展期白癜风。
2.根据权利要求1所述的用途，与激素治疗前相比，所述耐扭蛋白A相互作用蛋白-1和/或蛋白二硫化物异构酶A4含量升高，指示激素治疗疗效好。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述蛋白含量的检测方法包括质谱技术和酶联免疫吸附试验法。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，其中所述质谱技术是指靶向和非靶向的采集模式下使用的。
5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述检测耐扭蛋白A相互作用蛋白-1和/或蛋白二硫化物异构酶A4的含量的样本为受试者的尿液样本。
6.一种用于进展期白癜风激素治疗后疗效评估的系统，其特征在于，包括检测耐扭蛋白A相互作用蛋白-1和/或蛋白二硫化物异构酶A4含量的试剂。
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