CN112946274B - 颅内动脉瘤诊断血清标志物以及预测颅内动脉瘤破裂潜能血清标志物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及颅内动脉瘤诊断血清标志物以及预测颅内动脉瘤破裂潜能血清标志物。颅内动脉瘤诊断血清标志物选自以下蛋白因子中的一种或几种：PRTN3、CTSG、PDLIM1、MMP9、IGKV3‑20、MPO、PROC、LTF、FGA、FGB、PPBP或SERPINA1。预测颅内动脉瘤破裂潜能的血清标志物选自以下蛋白因子中的一种或几种：SAA1、LRG1、FGL1、PTGDS、COMP、IGKV4‑1、APOA4、FGA、FGB、FGG。与现有技术相比，本发明应用基于Orbitrap Exploris 480质谱仪的PRM质谱技术与生物信息学方法筛选出能够用于诊断颅内动脉瘤的血清标志物以及预测颅内动脉瘤破裂的血清标志物，为临床上颅内动脉瘤的诊治提供了新思路，具有较高的灵敏度、特异度和正确率。并且可以完善以及改良蛋白质质谱技术，降低检查费用，使之更适合于精准医学的临床应用。
Description
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，尤其是涉及颅内动脉瘤诊断血清标志物以及预测颅内动脉瘤破裂潜能血清标志物。
背景技术
颅内动脉瘤(Intracranial aneurysm，IA)是一种复杂的多因素脑血管疾病，一般人群中有2-3％发生颅内动脉瘤，每年约有1％的颅内动脉瘤破裂。颅内动脉瘤破裂是动脉瘤性蛛网膜下腔出血(aneurysmal subarachnoid hemorrhage，aSAH)最常见的病因，第一次出血病死率为35％，第二次出血病死率为60％～80％，大多数存活者存在明显的神经功能损伤。关于颅内动脉瘤的发病机制并不明确，其可能与高血压、吸烟、饮酒、脂质积累和血流动力学等因素相关。
目前，对颅内动脉瘤的诊断和筛选主要依赖脑血管造影(DSA)、磁共振血管造影(MRA)以及CT血管造影(CTA)。上述三种方法均存在费用昂贵和假阴性率高的缺点。同时作为诊断颅内动脉瘤金标准的DSA，由于其检查的有创性和形态学参数的宽泛性并不适合“精准医学”的要求。因此，临床上迫切发展一批颅内动脉瘤的血清诊断标志物，用于快速有效地分辨颅内动脉瘤患者，以改善当前颅内动脉瘤的诊治格局。
另一方面，大多数的无症状性颅内动脉瘤很少发生破裂，而预防性治疗(无论是介入治疗还是手术治疗)的相关医疗风险却高达6％，这个数值并不亚于颅内动脉瘤的自然破裂率。同时治疗这些无症状性颅内动脉瘤需要的医疗资源和费用都将成为社会和家庭的负担。针对无症状性颅内动脉瘤，如何预测其破裂可能性，提示医护人员是否需要干预以避免其破裂引起的严重后果，或者是否可以采取保守疗法，以避免过度医疗，成为临床上的一大难题。因此，临床上亟需一个客观全面地评价标准去评估颅内动脉瘤破裂的风险。
目前，临床上尚无可用于颅内动脉瘤早期诊断和破裂预测的生物标志物。故而，寻求可用于颅内动脉瘤的早期诊断和破裂预测评估的诊断标志物，不仅是医学实践中的重大难题，更是关系经济发展、国计民生的重要课题。
发明内容
本发明的目的在于提供颅内动脉瘤诊断血清标志物以及预测颅内动脉瘤破裂潜能血清标志物。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明第一方面提供一组颅内动脉瘤诊断血清标志物，所述的血清标志物为蛋白因子，选自以下蛋白因子中的一种或几种：PRTN3(髓母细胞素)、CTSG(组织蛋白酶G)、PDLIM1(PDZ和LIM域蛋白1)、MMP9(基质金属蛋白酶9)、IGKV3-20(免疫球蛋白kappa可变域3-20)、MPO(髓过氧化物酶)、PROC(维生素K依赖蛋白C)、LTF(乳铁蛋白)、FGA(纤维蛋白原α链)、FGB(纤维蛋白原β链)、PPBP(血小板碱性蛋白)或SERPINA1(α1-抗胰蛋白酶)。
所述颅内动脉瘤诊断血清标志物可单独使用或组合后用于区分颅内动脉瘤患者和正常人[NC vs.(UR&R)]。
本发明第二方面，提供颅内动脉瘤诊断血清标志物在制备用于诊断颅内动脉瘤的工具中的应用，所述颅内动脉瘤诊断血清标志物选自以下蛋白因子中的一种或几种：PRTN3(髓母细胞素)、CTSG(组织蛋白酶G)、PDLIM1(PDZ和LIM域蛋白1)、MMP9(基质金属蛋白酶9)、IGKV3-20(免疫球蛋白kappa可变域3-20)、MPO(髓过氧化物酶)、PROC(维生素K依赖蛋白C)、LTF(乳铁蛋白)、FGA(纤维蛋白原α链)、FGB(纤维蛋白原β链)、PPBP(血小板碱性蛋白)或SERPINA1(α1-抗胰蛋白酶)。
在本方面的一个实施方式中，所述诊断颅内动脉瘤的工具选自质谱检测工具、试剂盒、芯片、试纸或其他高通量测序平台。
可以进行的检测方式包括但不限于质谱检测、试剂盒检测、芯片检测、试纸检测或其他高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的蛋白表达谱的构建将成为十分快捷且高效的工作。通过比对疾病患者与正常人的蛋白表达谱，很容易分析出哪些蛋白因子可能揭示疾病异常。因此，在高通量测序中获知所述颅内动脉瘤诊断血清标志物的异常与颅内动脉瘤相关也属于所述颅内动脉瘤诊断血清标志物的用途，同样在本发明保护的范围之内。
其中，PROC(维生素K依赖蛋白C)、IGKV3-20(免疫球蛋白kappa可变域3-20)、FGA(纤维蛋白原α链)、FGB(纤维蛋白原β链)为在颅内动脉瘤组中显著上调的蛋白因子。
其中，PRTN3(髓母细胞素)、CTSG(组织蛋白酶G)、MMP9(基质金属蛋白酶9)、MPO(髓过氧化物酶)、PDLIM1(PDZ和LIM域蛋白1)、PPBP(血小板碱性蛋白)、SERPINA1(α1-抗胰蛋白酶)、LTF(乳铁蛋白)为在颅内动脉瘤组中显著下调的蛋白因子。
本发明第三方面，提供预测颅内动脉瘤破裂潜能的血清标志物，所述的血清标志物为蛋白因子，选自以下蛋白因子中的一种或几种：SAA1(血清淀粉样蛋白A-1蛋白)、LRG1(富含亮氨酸的α-2-糖蛋白)、FGL1(纤维蛋白原样蛋白1)、PTGDS(前列腺素-H2 D-异构酶)、COMP(软骨寡聚基质蛋白)、IGKV4-1(免疫球蛋白kappa可变域4-1)、APOA4(载脂蛋白A-IV)、FGA(纤维蛋白原α链)、FGB(纤维蛋白原β链)、FGG(纤维蛋白原γ链)。
预测颅内动脉瘤破裂潜能的血清标志物可单独使用或组合后用于区分破裂动脉瘤患者和未破裂动脉瘤患者(UR vs.R)。
本发明第四方面，提供预测颅内动脉瘤破裂潜能的血清标志物在制备用于预测颅内动脉瘤是否破裂的工具中的应用，所述预测颅内动脉瘤破裂潜能的血清标志物选自以下蛋白因子中的一种或几种：SAA1(血清淀粉样蛋白A-1蛋白)、LRG1(富含亮氨酸的α-2-糖蛋白)、FGL1(纤维蛋白原样蛋白1)、PTGDS(前列腺素-H2 D-异构酶)、COMP(软骨寡聚基质蛋白)、IGKV4-1(免疫球蛋白kappa可变域4-1)、APOA4(载脂蛋白A-IV)、FGA(纤维蛋白原α链)、FGB(纤维蛋白原β链)、FGG(纤维蛋白原γ链)。
在本方面的一个实施方式中，所述预测颅内动脉瘤是否破裂的工具选自质谱检测工具、试剂盒、芯片、试纸或其他高通量测序平台。
可以进行的检测方式包括但不限于质谱检测、试剂盒检测、芯片检测、试纸检测或其他高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的蛋白表达谱的构建将成为十分快捷且高效的工作。通过比对疾病患者与正常人的蛋白表达谱，很容易分析出哪些蛋白因子可能揭示疾病异常。因此，在高通量测序中获知所述预测颅内动脉瘤破裂潜能的血清标志物的异常与颅内动脉瘤破裂潜能相关也属于所述颅内动脉瘤破裂潜能的血清标志物的用途，同样在本发明保护的范围之内。
其中，SAA1(血清淀粉样蛋白A-1蛋白)、LRG1(富含亮氨酸的α-2-糖蛋白)、FGL1(纤维蛋白原样蛋白1)、FGA(纤维蛋白原α链)、FGB(纤维蛋白原β链)、FGG(纤维蛋白原γ链)为在颅内动脉瘤破裂组中显著上调的蛋白因子。
其中，APOA4(载脂蛋白A-IV)、IGKV4-1(免疫球蛋白kappa可变域4-1)、COMP(软骨寡聚基质蛋白)、PTGDS(前列腺素-H2 D-异构酶)为在颅内动脉瘤破裂组中显著下调的蛋白因子。
本发明还提供使用颅内动脉瘤诊断血清标志物或预测颅内动脉瘤破裂潜能的血清标志物进行质谱检测应用，以判断所述的检测目标人员是否患有颅内动脉瘤或颅内动脉瘤是否破裂的方法，为：(1)收集待测患者的血清样本；(2)制备血清样本；(3)质谱数据的测定；(4)数据收集和生物信息学分析；
所述步骤(1)：采集全血至真空采血管，温柔地上下颠倒混匀，持续5-6次；4℃放置30-45min；4℃，1000g离心10min(离心后上层血清、中间凝胶、下层血细胞)；将血清转移至1.5ml离心管中，立即添加蛋白酶抑制剂Cocktail，混匀，于低温高速离心机进行2次离心，4℃，3000g离心10min；样品立即分装至/>0.6ml离心管，每管200μl，-80℃保存样品；
所述步骤(2)：每个血清样本在4℃，14000g离心30min，去除血清中的脂质分子，使用市售的BCA定量试剂盒(Thermo Fisher Scientific,USA)测定212例血清样品的蛋白浓度。按定量结果取每例血清样品各100μg蛋白，用100mM四乙基溴化铵(TEAB)稀释至1μg/μL。蛋白酶解：向100ug蛋白中加入终浓度为15mM二硫苏糖醇(DTT)，在37℃条件下进行还原反应1h。而后向上述混合物中加入终浓度为30mM碘乙酰胺(IAA)进行烷基化反应，室温避光30min。还原和烷基化的蛋白混合物用100mM TEAB洗涤三次，4℃，12000g离心20分钟。然后用100mM TEAB稀释样品至1μg/μL，以质量比1:100(酶:蛋白)加入Lys-C，37℃酶解2h，以质量比1:50(酶:蛋白)加入胰蛋白酶(Trypsin)，37℃过夜酶解。次日，向酶解后的肽段溶液中加入三氟乙酸(TFA，终浓度为0.5％)以终止酶解，然后在旋转真空浓缩器(Christ，德国)上干燥。肽段定量：使用市售的肽段定量试剂盒(Thermo Fisher Scientific,USA)测定酶解后的肽段浓度，根据结果将肽段稀释成1μg/μL，以进行下一步的质谱检测。
所述步骤(3)是利用Orbitrap Exploris 480质谱仪检测步骤(2)中的血清样本，采用PRM模式进行采集。一级扫描范围为350-1600m/z；目标蛋白的目的肽段的质荷比和保留时间信息导入指定列表，时间容差设置3min。
所述步骤(4)是一种生物信息学分析检测方法，其特征是：将原始数据导入Skyline-Daily软件种进行提峰与手动校正，然后导出肽比率结果；以Mann-Whitney秩检验比较颅内动脉瘤(未破裂动脉瘤、破裂动脉瘤)和正常人之间的血清蛋白组数据，以及未破裂动脉瘤和动脉瘤之间的血清蛋白组数据，筛选出高置信度的蛋白因子(肽段因子)；数据集分为75％的训练集以及25％的预测集，对训练集进行基于bootstrap的逻辑回归法建立判别模型，后采用接收者操作特征曲线(ROC曲线)进行模型评估。
与现有技术相比，本发明应用基于Orbitrap Exploris 480质谱仪的PRM质谱技术与生物信息学方法筛选出能够用于诊断颅内动脉瘤的血清标志物以及预测颅内动脉瘤破裂的血清标志物，为临床上颅内动脉瘤的诊治提供了新思路，具有较高的灵敏度、特异度和正确率。并且可以完善以及改良蛋白质质谱技术，降低检查费用，使之更适合于精准医学的临床应用。
附图说明
图1基于PRM技术得到的在颅内动脉瘤组(UR&R)中显著上调的5个肽段因子。***p<0.001。
图2基于PRM技术得到的在颅内动脉瘤组(UR&R)中显著下调的11个肽段因子。***p<0.001。
图3基于PRM技术得到的在破裂颅内动脉瘤组(R)中显著上调的7个肽段因子。***p<0.001。
图4基于PRM技术得到的在破裂颅内动脉瘤组(R)中显著下调的4个肽段因子。***p<0.001。
图5区分破裂动脉瘤/未破裂动脉瘤和健康人组的最佳因子组合(16个肽段因子)ROC联合曲线；
图6区分破裂动脉瘤组和未破裂动脉瘤组的最佳因子组合(11个肽段因子)ROC联合曲线。
具体实施方式
本发明首先提供一组颅内动脉瘤诊断血清标志物，所述的血清标志物为蛋白因子，选自以下蛋白因子中的一种或几种：PRTN3(髓母细胞素)、CTSG(组织蛋白酶G)、PDLIM1(PDZ和LIM域蛋白1)、MMP9(基质金属蛋白酶9)、IGKV3-20(免疫球蛋白kappa可变域3-20)、MPO(髓过氧化物酶)、PROC(维生素K依赖蛋白C)、LTF(乳铁蛋白)、FGA(纤维蛋白原α链)、FGB(纤维蛋白原β链)、PPBP(血小板碱性蛋白)或SERPINA1(α1-抗胰蛋白酶)。
所述颅内动脉瘤诊断血清标志物可单独使用或组合后用于区分颅内动脉瘤患者和正常人[NC vs.(UR&R)]。
本发明还提供预测颅内动脉瘤破裂潜能的血清标志物，所述的血清标志物为蛋白因子，选自以下蛋白因子中的一种或几种：SAA1(血清淀粉样蛋白A-1蛋白)、LRG1(富含亮氨酸的α-2-糖蛋白)、FGL1(纤维蛋白原样蛋白1)、PTGDS(前列腺素-H2 D-异构酶)、COMP(软骨寡聚基质蛋白)、IGKV4-1(免疫球蛋白kappa可变域4-1)、APOA4(载脂蛋白A-IV)、FGA(纤维蛋白原α链)、FGB(纤维蛋白原β链)、FGG(纤维蛋白原γ链)。
预测颅内动脉瘤破裂潜能的血清标志物可单独使用或组合后用于区分破裂动脉瘤患者和未破裂动脉瘤患者(UR vs.R)。
为实现本发明的目的，本发明采用的方法包括颅内动脉瘤模型血清蛋白质质谱、质谱仪以及生物信息学分析，通过以下步骤实现：1、收集血清样品；2、制备血清样品；3、质谱数据的测定；4、数据收集和生物信息学分析。
具体实验步骤如下：
1、收集血清样本：
(1)采集全血至真空采血管，上下颠倒混匀，持续5-6次；
(2)4℃放置30-45min；
(3)4℃，1000g离心10min(离心后上层血清、中间凝胶、下层血细胞)；
(4)将血清转移至1.5ml离心管中，立即添加蛋白酶抑制剂Cocktail，混匀，于低温高速离心机进行2次离心，4℃，3000g离心10min；
(5)样品立即分装至0.6ml离心管，每管200μl，-80℃保存样品。
2、血清样本前处理：
(1)每个血清样本在4℃，14000g离心30min，去除血清中的脂质分子；
(2)使用市售的BCA定量试剂盒(Thermo Fisher Scientific,USA)测定212例血清样品的蛋白浓度。
(3)取第(2)中所述的每例样品各100μg蛋白，用100mM四乙基溴化铵(TEAB)稀释至1μg/μL。
(4)蛋白酶解：向100ug蛋白中加入终浓度为15mM二硫苏糖醇(DTT)，在37℃条件下进行还原反应1h。而后向上述混合物中加入终浓度为30mM碘乙酰胺(IAA)进行烷基化反应，室温避光30min。还原和烷基化的蛋白混合物用100mM TEAB洗涤三次，4℃，12000g离心20分钟。然后用100mM TEAB稀释样品至1μg/μL，以质量比1:100(酶:蛋白)加入Lys-C，37℃酶解2h，以质量比1:50(酶:蛋白)加入胰蛋白酶(Trypsin)，37℃过夜酶解。次日，向酶解后的肽段溶液中加入三氟乙酸(TFA，终浓度为0.5％)以终止酶解，然后在旋转真空浓缩器(Christ，德国)上干燥。
(5)肽段定量：使用市售的肽段定量试剂盒(Thermo Fisher Scientific,USA)测定酶解后的肽段浓度，根据结果将肽段稀释成1μg/μL，以进行下一步的质谱检测。
3、质谱检测：
仪器型号：Orbitrap Exploris 480质谱仪(Thermo Fisher Scientific,USA)
色谱柱型号：50cm C18色谱分离柱(2μm,75μm,x 500mm，Thermo FisherScientific,USA)
流速：200nL
梯度：A相：0.1％FA水溶液；B相：80％ACN。分离梯度0-50％的B相，分离总时间：65min。
Orbitrap Exploris 480质谱参数：采用PRM模式进行采集。一级扫描范围(m/z)：350-1600；将目的肽段的质荷比和保留时间信息(见下表1)导入指定列表(InclusionList)中，时间容差3min。
表1 20个蛋白对应25个肽段的质荷比、电荷以及保留时间信息
4、数据收集与生物信息学分析：
通过Skyline-daily软件进行数据收集与分析：
(1)将目标蛋白质的Fasta文件导入skyline中；
(2)肽段设置：背景库为Uniprot库，导入搜库结果文件作为谱图库，肽段长度为8-25AA；
(3)子离子(Transition)提取设置：母离子电荷：2；根据谱图库选择最强的子离子进行提取；采集模式为Targeted；
二十个候选蛋白因子所挑选的25个肽段的母子离子信息如下表2所示：
表2二十个候选蛋白因子所挑选的25个肽段因子的母子离子信息
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(4)手工检查每个子离子的提取时间一级ID时间，比对保留时间、峰面积等；
(5)导出肽比率结果进行后续统计分析。
通过SPSS Statistics 20软件进行统计分析：
以Mann-Whitney秩检验比较颅内动脉瘤(未破裂动脉瘤、破裂动脉瘤)和正常人之间[NC vs.(UR&R)]的血清蛋白组数据，以及未破裂动脉瘤和动脉瘤之间(UR vs.R)的血清蛋白组数据，选择两组间差别最显著的蛋白因子(肽段因子)进行后续机器学习建模分析。
机器学习建模分析：
将以上筛选出的肽段进行模型训练，基于bootstrap 10000次的重抽样方法。在所有样本(212例)中取75％的样本作为训练集样本，剩余25％为预测集样本。采用逻辑回归的方法进行模型建立，然后是用接收者操作特征曲线(receiver operating characteristiccurve,ROC)进行模型评估。
基于PRM方法在212例血清中靶向验证20种蛋白因子的表达水平
20种蛋白因子对应的25条肽段因子中，5个肽段因子在颅内动脉瘤组(UR&R)中显著上调(表3、图1)，而11个肽段因子在该组中显著下调(表4、图2)。此外，相较于未破裂动脉瘤组，3个肽段因子在破裂动脉瘤组中显著上调(表5、图3)；与之对应的有8个肽段因子在破裂动脉瘤组中显著下调(表6、图4)。
所述的在颅内动脉瘤组中显著上调的5个肽段因子包括：
表3五个在颅内动脉瘤组中显著上调的肽段因子
所述的在颅内动脉瘤组中显著下调的11个肽段因子包括：
表4十一个在颅内动脉瘤组中显著下调的肽段因子
所述的在破裂动脉瘤组中显著上调的7个肽段因子包括：
表5七个在破裂动脉瘤组中显著上调的肽段因子
所述的在破裂动脉瘤组中显著下调的4个肽段因子包括：
表6四个在破裂动脉瘤组中显著下调的肽段因子
2、Mann-Whitney秩检验结果
在组别1[NC vs.(UR&R)]中，有12种蛋白因子对应16条肽段的p-value小于0.001，表示极显著性差异；在组别2(UR vs.R)中，有10种蛋白因子对应11条肽段的p-value小于0.001，表示极显著性差异；
表7两个组别的Mann-Whitney秩检验结果
3、基于机器学习方法建立颅内动脉瘤诊断及预测模型
使用上述12种蛋白的16条肽段作为区分颅内动脉瘤患者和正常人[NC vs.(UR&R)]的血清诊断标志物在训练集上进行基于bootstrap的逻辑回归模型建立；使用上述10种蛋白的11条肽段作为预测颅内动脉瘤破裂的血清标志物(UR vs.R)在训练集上进行基于bootstrap的逻辑回归模型建立；
使用预测集(25％的分组样本)进行模型评估，AUC、敏感度、特异度和精准度结果如下表所示：
表8两个组别的AUC、敏感度、特异度和精确度
本发明应用基于Orbitrap Exploris 480质谱仪的PRM质谱技术与生物信息学方法筛选出能够用于诊断颅内动脉瘤的血清标志物以及预测颅内动脉瘤破裂的血清标志物，为临床上颅内动脉瘤的诊治提供了新思路，具有较高的灵敏度、特异度和正确率。并且可以完善以及改良蛋白质质谱技术，降低检查费用，使之更适合于精准医学的临床应用。
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
212例破裂颅内动脉瘤/未破裂颅内动脉瘤血清和正常人血清收集与制备
根据性别和年龄随机分组，收集100例健康人(NC)做对照，57例未破裂颅内动脉瘤患者(UR)，55例破裂颅内动脉瘤患者(R)。
主要仪器和试剂：采血管、离心管、BCA定量试剂盒(Thermo Fisher Scientific,USA)、肽段定量试剂盒(Thermo Fisher Scientific,USA)、四乙基溴化铵、DTT、IAA、胰蛋白酶等。
实验步骤：
1、收集血清样本：
(1)采集全血至真空采血管，温柔地上下颠倒混匀，持续5-6次；
(2)4℃放置30-45min；
(3)4℃，1000g离心10min(离心后上层血清、中间凝胶、下层血细胞)；
(4)将血清转移至1.5ml离心管中，立即添加蛋白酶抑制剂Cocktail，混匀，于低温高速离心机进行2次离心，4℃，3000g离心10min；
(5)样品立即分装至0.6ml离心管，每管200μl，-80℃保存样品。
2、血清样本前处理：
(1)每个血清样本在4℃，14000g离心30min，去除血清中的脂质分子；
(2)使用市售的BCA定量试剂盒测定212例血清样品的蛋白浓度。
(3)取第(2)中所述的每例样品各100μg蛋白，用100mM四乙基溴化铵(TEAB)稀释至1μg/μL。
(4)蛋白酶解：向100ug蛋白中加入终浓度为15mM二硫苏糖醇(DTT)，在37℃条件下进行还原反应1h。而后向上述混合物中加入终浓度为30mM碘乙酰胺(IAA)进行烷基化反应，室温避光30min。还原和烷基化的蛋白混合物用100mM TEAB洗涤三次，4℃，12000g离心20分钟。然后用100mM TEAB稀释样品至1μg/μL，以质量比1:100(酶:蛋白)加入Lys-C，37℃酶解2h，以质量比1:50(酶:蛋白)加入胰蛋白酶(Trypsin)，37℃过夜酶解。次日，向酶解后的肽段溶液中加入三氟乙酸(TFA，终浓度为0.5％)以终止酶解，然后在旋转真空浓缩器(Christ，德国)上干燥。
(5)肽段定量：使用市售的肽段定量试剂盒(Thermo Fisher Scientific,USA)测定酶解后的肽段浓度，根据结果将肽段稀释成1μg/μL，以进行下一步的质谱检测。
实施例2
破裂颅内动脉瘤/未破裂颅内动脉瘤血清标志物的靶向蛋白质组学验证
使用PRM质谱技术靶向测定212例血清样本中20种候选蛋白因子(25种肽段因子)的表达水平。
主要仪器：Orbitrap Exploris 480Mass Spectrometer(Thermo FisherScientific,USA)
实验步骤：色谱柱型号：50cm C18色谱分离柱(2μm,75μm,x 500mm，Thermo FisherScientific,USA)；流速：200nL；梯度：A相：0.1％FA水溶液；B相:80％ACN。分离梯度0-50％的B相，分离总时间：65min；Orbitrap Exploris 480质谱参数：采用PRM模式进行采集。一级扫描范围(m/z)：350-1600；将目的肽段的质荷比和保留时间信息(表1)导入指定列表。
实施例3
PRM数据收集与生物信息学分析
原始数据导入Skyline-Daily软件进行数据收集：(1)将目标蛋白质的Fasta文件导入skyline中；(2)肽段设置：背景库为Uniprot库，导入搜库结果文件作为谱图库，肽段长度为8-25AA；(3)子离子(Transition)提取设置：母离子电荷：2；根据谱图库选择最强的子离子进行提取；采集模式为Targeted；二十个候选蛋白因子所挑选的25个肽段的母子离子信息如表2所示。(4)手工检查每个子离子的提取时间一级ID时间，比对保留时间、峰面积等；(5)导出肽比率结果进行后续统计分析。
导出的数据用SPSS Statistics 20软件进行统计分析：以Mann-Whitney秩检验比较颅内动脉瘤(未破裂动脉瘤、破裂动脉瘤)和正常人之间[NC vs.(UR&R)]的血清蛋白组数据，以及未破裂动脉瘤和动脉瘤之间(UR vs.R)的血清蛋白组数据，选择两组间差别最显著的蛋白因子进行后续机器学习建模分析。
机器学习建模分析：将以上筛选出的肽段进行模型训练，基于bootstrap 10000次的重抽样方法。在所有样本(212例)中取75％的样本作为训练集样本，剩余25％为预测集样本。采用逻辑回归的方法进行模型建立，然后是用接收者操作特征曲线(receiveroperating characteristic curve,ROC)进行模型评估。
3个实施例的结果都参见图1、图2、图3、图4、图5、图6。图1-4显示，20种蛋白因子对应的25条肽段因子中，5个肽段因子在颅内动脉瘤组(UR&R)中显著上调，而11个肽段因子在该组中显著下调。此外，相较于未破裂动脉瘤组，3个肽段因子在破裂动脉瘤组中显著上调；与之对应的有8个肽段因子在破裂动脉瘤组中显著下调。
图5为使用12种蛋白的16条肽段作为区分颅内动脉瘤患者和正常人[NC vs.(UR&R)]的血清诊断标志物在训练集上进行基于bootstrap的逻辑回归模型建立，然后使用预测集(25％的分组样本)进行模型评估得到的ROC曲线。其AUC为0.951，敏感性87.5％，特异性95.2％，准确率90.6％。
图6为使用上述10种蛋白的11条肽段作为预测颅内动脉瘤破裂的血清标志物(URvs.R)在训练集上进行基于bootstrap的逻辑回归模型建立，然后使用预测集(25％的分组样本)进行模型评估得到的ROC曲线。其AUC为0.948，敏感性91.7％，特异性93.8％，准确率92.9％。
总结以上各步实验的结果，得出了以下结论：12种蛋白因子对应的16条肽段因子可以作为区分颅内动脉瘤患者和正常人[NC vs.(UR&R)]的血清诊断标志物，10种蛋白因子对应的11条肽段因子可以作为预测颅内动脉瘤破裂(UR vs.R)的血清预测标志物；具有较高的灵敏度、特异度和正确率。这就为进一步的临床研究提供了重要依据，为颅内动脉瘤的诊治方案提供了新思路。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.颅内动脉瘤诊断血清标志物组合在制备用于诊断颅内动脉瘤的工具中的应用，其特征在于，所述颅内动脉瘤诊断血清标志物组合为以下蛋白因子的组合：PRTN3、CTSG、PDLIM1、MMP9、IGKV3-20、MPO、PROC、LTF、FGA、FGB、PPBP或SERPINA1；
PROC、IGKV3-20、FGA、FGB为在颅内动脉瘤组中显著上调的蛋白因子；
PRTN3、CTSG、MMP9、MPO、PDLIM1、PPBP、SERPINA1、LTF为在颅内动脉瘤组中显著下调的蛋白因子。
2.根据权利要求1所述颅内动脉瘤诊断血清标志物在制备用于诊断颅内动脉瘤的工具中的应用，其特征在于，所述诊断颅内动脉瘤的工具选自质谱检测工具、试剂盒、芯片、试纸或其他高通量测序平台。
3.预测颅内动脉瘤破裂潜能的血清标志物组合在制备用于预测颅内动脉瘤是否破裂的工具中的应用，其特征在于，所述预测颅内动脉瘤破裂潜能的血清标志物组合选自以下蛋白因子的组合：SAA1、LRG1、FGL1、PTGDS、COMP、IGKV4-1、APOA4、FGA、FGB、FGG；
SAA1、LRG1、FGL1、FGA、FGB、FGG为在颅内动脉瘤破裂组中显著上调的蛋白因子；
APOA4、IGKV4-1、COMP、PTGDS为在颅内动脉瘤破裂组中显著下调的蛋白因子。
4.根据权利要求技术3所述预测颅内动脉瘤破裂潜能的血清标志物在制备用于预测颅内动脉瘤是否破裂的工具中的应用，其特征在于，所述预测颅内动脉瘤是否破裂的工具选自质谱检测工具、试剂盒、芯片、试纸或其他高通量测序平台。
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