CN105368975A - 颅内动脉瘤标志物odam及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及颅内动脉瘤标志物ODAM及其应用，更具体的涉及标志物ODAM基因及其表达产物在制备颅内动脉瘤诊疗制剂中的应用。发明人对颅内动脉瘤病例进行高通量测序，在差异表达明显的基因中挑选出低表达的候选基因ODAM，进一步的分子验证证实了ODAM在颅内动脉瘤组中低表达。本发明提供了新的颅内动脉瘤的监测治疗靶点，具有重要的临床应用价值。

Description

颅内动脉瘤标志物ODAM及其应用

技术领域

本发明涉及肿瘤标志物，具体涉及颅内动脉瘤标志物ODAM及其应用，更具体的涉及标志物ODAM基因及其表达产物在制备颅内动脉瘤诊疗制剂中的应用。

背景技术

颅内动脉瘤(intracranialaneurysm，IA)是指多种因素造成的颅内动脉壁结构破坏，进而导致的动脉壁异常膨出。颅内动脉瘤发病率较高，调查结果显示，以先天性动脉瘤占大部分人群，40-66岁最为常见，约有10％的病人入院前死亡，尸体解剖检出率约为1-5％，颅内动脉瘤破裂出血后30天的死亡率达45％，存活者中30％存在不同程度的残疾，此外仍约有500万以上的隐匿性颅内动脉瘤未被发现和诊断，因此该疾病极为凶险，严重威胁人类的生命健康。我国属颅内动脉瘤的高发地区，人群发病率达0.1-4％。

颅内动脉瘤的主要的治疗手段包括开颅手术夹闭、血管内介入治疗、动脉瘤包裹及载瘤血管的闭塞或结扎，传统的手术夹闭和血管内介入治疗是颅内动脉瘤的主要治疗方法。随着介入医学和材料学的发展，传统的手术逐渐转变为血管内介入治疗，并成为颅内动脉瘤的首选治疗手段。动脉瘤的血管介入治疗主要包括单纯弹簧圈栓塞、球囊辅助剂支架辅助的弹簧圈栓塞。随着材料学和治疗理念的更新，血管介入治疗从简单的弹簧圈栓塞转变为血流重建治疗。通过在载瘤动脉内放置一血流重建装置，为新生内膜生长提供支撑，随后通过新生内膜完全隔绝动脉瘤。虽然血流重建装置能够很好地治疗颅内动脉瘤，特别是巨大动脉瘤，但是目前仍面临一些问题，如动脉瘤的复发和再次破裂等。

尽管颅内动脉瘤的治疗有了长足的发展，但病人的预后仍然很差，其致死率高达30-40％。究其原因，除了疾病本身的临床症状凶险，治疗风险大以外，疾病致病机制的不确定是其主要原因。颅内动脉瘤的发病机制已经争论了许多年，但仍无定论，其可能与遗传、。由于疾病能使患者直接面对死亡的威胁，所以，弄清其病因和发展规律对于合理的选择治疗方式至关重要。

发明人对5例颅内动脉瘤病例组和3例对照组组织样本进行高通量测序，结合生物信息学方法进行基因筛选，在差异表达明显的基因中挑选出低表达的候选基因ODAM，进一步，发明人进行了分子验证，证实了ODAM在颅内动脉瘤组中低表达。本发明提供了新的颅内动脉瘤的监测治疗靶点，具有重要的临床应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种颅内动脉瘤诊断制剂，所述颅内动脉瘤诊断制剂检测ODAM基因和/或基因的表达产物。进一步的，所述的ODAM基因和/或基因的表达产物在颅内动脉瘤组织中低表达。

进一步，所述颅内动脉瘤诊断制剂采用荧光定量PCR试剂盒、基因芯片、免疫方法检测颅内动脉瘤组织中ODAM基因的表达。优选的，所述的荧光定量PCR试剂盒中含有一对特异性扩增ODAM基因的引物；所述的基因芯片中包括与ODAM基因的核酸序列杂交的探针。更优选的，荧光定量PCR试剂盒内含有特异性检测ODAM基因的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQIDNO.1，下游引物序列为SEQIDNO.2。

进一步，所述的颅内动脉瘤的诊断制剂采用免疫方法检测颅内动脉瘤组织中ODAM基因的表达产物。优选的，所述免疫方法为ELISA检测和/或胶体金检测。进一步，所述检测ODAM蛋白的ELISA法为使用ELISA检测试剂盒。所述试剂盒中的抗体可采用市售的ODAM单克隆抗体或多克隆抗体。进一步，所述的试剂盒包括：包被ODAM抗体的固相载体，酶标抗体，酶的底物，蛋白标准品，阴性对照品，稀释液，洗涤液，酶反应终止液等。

进一步，所述检测ODAM蛋白的胶体金法为使用检测试剂盒，所述的抗体可采用市售的ODAM单克隆抗体或多克隆抗体。进一步，所述的胶体金检测试剂盒采用胶体金免疫层析技术或胶体金渗滤法。进一步，所述的胶体金检测试剂盒硝酸纤维素膜上的检测区(T)喷点有抗ODAM抗体、质控区(C)喷点有免疫球蛋白IgG。

优选的，检测样本为动脉瘤壁组织和/或外周血。

本发明的目的在于提供上述颅内动脉瘤诊断制剂在制备颅内动脉瘤诊断工具中的应用。

本发明的目的在于提供一种治疗颅内动脉瘤的制剂，所述制剂中含有促进ODAM基因的转录或表达的试剂或化合物。优选的，制剂中含有药剂学可接受的载体。

进一步的，所述的ODAM基因和/或基因的表达产物在颅内动脉瘤组织中低表达。

本领域人员熟知促进基因及其表达产物的表达通常可以采用下述方法中的一种和/或几种：激活分子标志物的启动子、激活分子标志物表达的蛋白或因子、导入促进分子标志物转录或表达的载体。

优选的，所述治疗颅内动脉瘤的制剂中含有促进ODAM基因的转录或表达的载体和/或激活ODAM基因的启动子和/或激活ODAM基因表达的蛋白或因子。

本发明的目的在于提供上述治疗颅内动脉瘤的制剂在制备颅内动脉瘤治疗药物或试剂中的应用。

为实现上述目的，本发明首先通过高通量测序结合生物信息学方法筛选到候选基因ODAM基因，进而通过分子生物学方法验证了ODAM基因与颅内动脉瘤的关系：ODAM基因与颅内动脉瘤具有很好的相关性，可用于制备颅内动脉瘤辅助诊断制剂，具有重要的临床应用价值。

荧光定量PCR法是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。荧光定量PCR的出现，极大地简化了定量检测的过程，而且真正实现了绝对定量。多种检测系统的出现，使实验的选择性更强。自动化操作提高了工作效率，反应快速、重复性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰。

基因芯片又称为DNA微阵列(DNAmicroarray)，可分为三种主要类型：1)固定在聚合物基片(尼龙膜，硝酸纤维膜等)表面上的核酸探针或cDNA片段，通常用同位素标记的靶基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。2)用点样法固定在玻璃板上的DNA探针阵列，通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测。3)在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针阵列，与荧光标记的靶基因杂交进行检测。基因芯片作为一种先进的、大规模、高通量检测技术，应用于疾病的诊断，其优点有以下几个方面：一是高度的灵敏性和准确性；二是快速简便；三是可同时检测多种疾病。

酶联免疫吸附实验(ELISA)即将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。该技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体等，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。ELISA检测试剂盒根据检测目的和操作步骤可分为间接法、双抗夹心法、竞争法、双位点一步法、捕获法测IgM抗体、应用亲和素和生物素的ELISA。ELISA检测试剂盒中生色底物可选择辣根过氧化物酶(HRP)或者碱性磷酸酶(AP)。

常用的免疫胶体金检测技术：(1)免疫胶体金光镜染色法细胞悬液涂片或组织切片，可用胶体金标记的抗体进行染色，也可在胶体金标记的基础上，以银显影液增强标记，使被还原的银原子沉积于已标记的金颗粒表面，可明显增强胶体金标记的敏感性。(2)免疫胶体金电镜染色法可用胶体金标记的抗体或抗抗体与负染病毒样本或组织超薄切片结合，然后进行负染。可用于病毒形态的观察和病毒检测。(3)斑点免疫金渗滤法应用微孔滤膜作载体，先将抗原或抗体点于膜上，封闭后加待检样本，洗涤后用胶体金标记的抗体检测相应的抗原或抗体。(4)胶体金免疫层析法将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂(抗体或单克隆抗体)吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，当移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。该法现已发展成为诊断试纸条，使用十分方便。

本发明的药剂学上可接受的载体为在制剂时通常利用的载体，该载体包含乳糖(lactose)、右旋糖(dextrose)、蔗糖(sucrose)、山梨醇(sorbitol)、甘露醇(mannitol)、淀粉、阿拉伯橡胶、磷酸钙、藻酸盐(alginate)、凝胶(gelatin)、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)、纤维素(cellulose)、水、糖浆、甲基纤维素(methylcellulose)、羟基苯甲酸甲酯(methylhydroxybenzoate)、丙基羟基苯甲酸丙酯(propylhydroxybenzoate)、滑石、硬脂酸镁(stearicacidmagnesium)及矿物油(mineraloil)等，但并非局限于此。

本发明的药剂学可接受的载体除了上述成分以外还可以包含润滑剂、湿润剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。药剂学上许可的适合的载体和制剂详细记载于雷明登氏药学全书。

本发明的药剂学组合物能通过口服或非口服进行给药，作为非口服给药时，能通过静脉内注射，鼻腔内注射，局部注射，脑室内注射，脊髓腔注射，皮下注射，腹腔注射，经皮给药等方式进行给药。

本发明的药剂学组合物的适合的给药剂量根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、食物、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏性之类的因素而可以进行多种处方，通常，熟练的医生能够容易地决定及处方对所希望的治疗或预防有效的给药剂量。

本发明的药剂学组合物根据本发明所属技术领域的普通技术人员可以容易实施的方法，利用药剂学上能接受的载体和/或赋形剂来进行制剂化，从而能够以单位用量形态制备或者内装在多容量容器内来制备。此时，剂型是油性或者水性介质中的溶液、悬浮液或乳化液形态，或者也可以是浸膏剂、粉末剂、颗粒剂、片剂或者胶囊剂形态，还可以包括分散剂或者稳定剂。

本发明的目的在于提供一种检测颅内动脉瘤的基因检测试剂盒，所述试剂盒检测基因ODAM，采用特异的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQIDNO.1，下游引物序列为SEQIDNO.2。

进一步，该PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，灵敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。

进一步，上述荧光定量PCR试剂盒组分包括：特异性引物、内参引物、荧光定量PCR反应液。所述内参为GAPDH。

所述的试剂盒还包含RNA抽提试剂。

本发明目的是提供了一种颅内动脉瘤蛋白检测试剂盒，所述的检测试剂盒检测ODAM蛋白。进一步的，所述的试剂盒还包括其他检测试剂。

本发明目的是提供了一种检测颅内动脉瘤的基因芯片，所述的基因芯片包括与ODAM基因的核酸序列杂交的探针。

附图说明

图1颅内动脉瘤患者组及对照组ODAMmRNA表达情况

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

实施例1病例的收集

所有组织标本均来医院神经外科2012年10月至2014年5月经DSA确诊的颅内动脉瘤患者，并进行显微手术开颅治疗。其中动脉瘤组织样本系显微手术中切除的动脉瘤壁组织，对照的正常脑血管样本组织系同一时期，脑肿瘤开颅病人的颞浅动脉(STA)和/或脑膜中动脉(MMA)。为尽量减小样本间差异，选取的所有动脉瘤组织样本均系囊状动脉瘤。获取的样本组织立即置于液氮罐中。

实施例2提取样本中的总RNA

1)动脉瘤(正常对照血管)组织小块放在培养皿中，加入1mlTrizol，用眼科剪剪碎后，移至匀浆器中匀浆；

2)匀浆完成后，取出匀浆液置于EP管中，定容至lml，可冻存与-70℃；

3)15-30℃放置5min，加入200μl氯仿，剧烈震荡15sec，15-30℃放置10min；

4)2-8℃，低于12000g/min离心l0min，弃上清，加入lml75％乙醇，低于7500g/min离心5min，弃上清后，点离；

5)待沉淀干燥(呈半透明状，不用完全干燥，否则会降低稳定性)，用RNase-freewater55-60℃溶解，冻存于-70℃。

实施例3高通量测序及分析

RNA提取后琼脂糖凝胶电泳，从电泳结果可以初步判定提取的RNA样品质量合格与否，是否可以用于进一步的转录组测序。进而通过NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品的提取情况，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。样品合格后送往测序公司进行测序，测序平台为Illumina公司的HiSeq2500高通量测序平台，进行高通量转录组深度测序，测序公司提供数据分析的结果结合文献我们筛选了差异表达基因ODAM。

实施例4颅内动脉瘤患者组及对照组ODAM基因表达情况

一、材料和方法

1、材料

选取23例颅内动脉瘤患者动脉瘤壁组织及11例对照正常脑血管样本组织，对其进行分组及编号。样本收集标准见实施例1。

2、方法

2.1RNA的提取

见实施例2。

2.2逆转录合成cDNA

采用IIIReverseTranscriptase(invitrogen，货号18080-044)进行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：

使用逆转录试剂盒，用逆转录缓冲液对lμg总RNA进行逆反录合成cDNA。

采用25μl反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA。获得的cDNA保存放-20℃冰箱备用。

2.3Real-TimePCR

2.3.1仪器及分析方法

用ABI7500型荧光定量PCR仪，采用2-ΔΔCT法进行数据的相对定量分析。

2.3.2引物设计

采用在线引物设计软件，基因序列参照NCBI:NM_017855.3(ODAM)，内参选GAPDH，引物设计后由invitrogen公司合成。具体引物序列如下：

表1引物序列

操作过程如下：

(一)反应体系：用PowerGreenPCRMasterMix(invitrogen，货号4367659)进行扩增，实验操作按产品说明书进行。扩增程序为：95℃5min，(95℃15sec，57℃45sec)×35个循环。

表2RealTime反应体系

组分	加入量
		2×mix	10μl
上游引物(10uM)	0.5μl
		下游引物(10uM)	0.5μl
模板	2μl
		加入灭菌蒸馏水	至25μl

(二)引物筛选

将各样本cDNA混合后，以此为模板进行5倍梯度稀释，稀释后样品各取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增，同时在60-95℃进行融解曲线分析，根据扩增效率高和溶解曲线单峰原则进行引物筛选。

(三)样品RealTimePCR检测

将各样品cDNA10倍稀释后取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增。同时在60-95℃进行溶解曲线分析。

二、实验结果

实时定量PCR扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；根据qRT-PCR的相对定量公式：2-ΔCt×100％，比较ODAM基因在颅内动脉瘤组和对照组中的表达水平。结果显示：qRT-PCR扩增结果稳定，其中ODAM基因在颅内动脉瘤组中的表达水平仅为对照组的约0.3倍，见图1所述，以上结果验证了高通量转录组表达数据的整合分析ODAM基因在颅内动脉瘤患者中低表达的结果。

实施例5颅内动脉瘤模型制作

1.实验动物：

成年健康新西兰大白兔30只，雌雄不限，体重3.0-3.5kg。

2.实验方法：

1)兔的麻醉：从兔耳缘静脉建立静脉通道，静滴2.5％戊巴比妥钠2.5ml-4.5ml(按30mg/kg准确计算)，5分钟后兔睫毛反射消失，进入全麻状态。用绷带固定兔于手术台上，置兔于仰卧，颈过伸位。给兔备皮消毒，2％利多卡因2m1局部麻醉。

2)新西兰大白兔用戊巴比妥钠(30mg/kg)自兔耳缘静脉麻醉后，颈前剪毛备皮，常规消毒铺无菌巾，取颈部正中切口长约5-6cm，先于正中切开皮肤、剪开皮下和颈阔肌，自左侧胸锁乳突肌内侧间隙找到并打开左颈总动脉鞘，在手术显微镜下用显微器械分离左颈总动脉与迷走神经，游离颈总动脉，游离后在其下方穿过一纱布条隔离周围组织。游离颈总动脉范围上至颈总动脉分叉上方2cm处，下至距颈总动脉分叉处下方约2cm。同时按同样的方法显露右侧颈总动脉并游离之。

3)颈总动脉分叉内膜损伤法是在高氏法大鼠动脉瘤模型制作基础上稍作改进：用动脉临时阻断夹将左侧颈总动脉及颈内、颈外动脉临时阻断，在动脉近中线一侧正对分叉部位切开动脉全层0.2-0.3cm，暴露分叉部位的内膜，用显微镊子损伤动脉分叉部位的内膜及内弹力层，用10个0的丝线缝合动脉壁1-2针，松开临时阻断夹。

4)胰弹力蛋白酶浸泡法：将EA溶于生理盐水(0.9％NS)中，并配制成5.0U/μL浓度的溶液，用微量滴定泵持续滴注5.0U/μL胰弹力酶浸泡孵化颈内外动脉分叉处20分钟。将动脉壁缝合处用小片无菌油沙条覆盖，滴定完毕后用生理盐水冲洗干净。全组均用5ml注射器抽取生理盐水反复冲洗该动脉段后，松开动脉夹。用庆大霉素浸润术区，并用碘伏擦拭术区，之后逐层缝合皮下组织及皮肤。之后，于兔右耳记录实验口期及名称，送回动物房。新西兰大白兔于术后2天用2％盐水饮用。

5)动物分组：

A组：同期新西兰大白兔6只，不进行任何处理+术后2天用2％盐水；

B组：新西兰大白兔12只，结扎对侧颈总动脉+术后2天用2％盐水；

C组：新西兰大白兔12只，分叉内膜损伤法+胰弹力蛋白酶浸泡法+B组法。

6)动脉瘤模型造影：动脉瘤模型制作4周后，从动物房取出己作动脉瘤模型制作术的兔至CT室。从兔耳缘静脉推注2.5％戊巴比妥钠3.5-5ml(按30mg/kg准确计算)，3分钟后兔进入全麻状态。用绷带固定兔，置兔于CT摄片床，俯卧位，前腿尽量后伸。从兔耳缘静脉用20m1高压注射器快速推注8-12m1泛影葡胺进行CT颈部血管造影。造影扫描完毕，送兔回动物中心实验室，备取标本及测量。

7)每组兔均经耳缘静脉注射过量戊巴比妥钠处死。

3.实验结果

A组CTA造影检查并没无动脉瘤形成；B组CTA造影检查发现存在2例动脉瘤前期表现，1例动脉瘤样改变，其余无动脉瘤形成；C组CTA造影检查发现动脉瘤形成7例，2例存在动脉瘤前期表现，其余无动脉瘤形成，C组成瘤率达75％。

实施例6用Westernblot技术方法检测各组中ODAM蛋白的表达

一、样品蛋白的制备及定量

把各组颅内动脉瘤壁组织和正常动脉血管壁组织置于冰上剪碎。在抽提蛋白样品前先将蛋白抽提试剂置于冰上预冷，并按照99:1:1的比例先后加入蛋白抽提液和蛋白酶抑制剂混合物以及蛋白磷酸酶抑制剂配制成工作液，使蛋白酶抑制剂混合物和蛋白磷酸酶抑制剂在抽提试剂中成1×工作液(在蛋白抽提前2-3min内加入蛋白酶抑制剂混合物和蛋白磷酸酶抑制剂)。常规方法称重并提取组织蛋白，加入工作液(以每孔细胞加入30u1的量来计算每次实验所需工作液的总量)；冰上孵育20min；4℃20000rpm离心20min；小心收集上清，-80℃保存样品。

采用Bradford方法测定总蛋白浓度。

二、SDS-聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

1.蛋白质样品变性：

a)根据蛋白质浓度测定结果，每个凝胶加样孔中加入相同质量的总蛋白提取物。按照每1微升蛋白样品加入0.25微升蛋白上样缓冲液的比例，混合蛋白样品和蛋白上样缓冲液(5×)。

b)100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。

c)冷却到室温后，直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。

2.胶板制备：

采用Bio-Rad公司的微型垂直板电泳装置制备0.75mm厚的凝胶，照说明书安装好玻璃板后，先在小烧杯中配制5ml10％的分离胶，配方如下：

表3分离胶配方

混匀后立即灌胶，然后加lml蒸馏水覆盖，室温下放置约30min待胶聚合后，用蒸馏水洗2-3次，再用滤纸吸干。然后制备2m15％的浓缩胶，配方如下：

表4浓缩胶配方

组分	用量
		30％丙烯酰胺溶液	0.33ml
Tris-HCl(1.0M，pH6.8)	0.25ml
		10％SDS	0.02ml
10％AP	0.02ml
		TEMED	0.002ml
灭菌ddH2O	补充至2ml

混匀后立即灌胶，插入样品梳，避免产生气泡，待胶凝固后，取出样品梳，后用蒸馏水和1×蛋白电泳缓冲液先后冲洗样品孔。

三、上样及电泳

将凝胶板装在电泳装置上，内槽中加满l×蛋白电泳缓冲液，外槽中l×蛋白电泳缓冲液应超过铂丝，按顺序上样。在末端泳道中加入蛋白质质量标准蛋白梯度。电泳时蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

四、蛋白质印迹

1.按照上述方法先进行SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白。

2.预先用转印缓冲液浸泡NC膜、滤纸、海棉垫。SDS-PAGE结束后取出凝胶，去除浓缩胶，在Tris/甘氨酸缓冲液中漂洗数秒，然后置于转印缓冲液中浸泡15-30min。打开电转印夹，每侧垫上一块专用的用转印缓冲液浸泡透的海棉垫，再各放一块转印液浸透的滤纸，滤纸与海面垫大小相同或与NC膜，凝胶大小相同均可，将凝胶平放在阴极侧滤纸上，最后将NC膜平放在凝胶上，去除气泡，夹好电转印夹。在电泳槽加满电转印液，插入电转印夹，将电泳槽放入冰箱内(电转印液之前要放入冰箱内预冷)，连接好电极，接通电流，转印夹的NC膜应对电泳槽的正极。

3.封闭：用1×TBS漂洗一次。加入含5％的无脂奶粉TBS封闭缓冲液，置于振荡培养箱中进行封闭；

4.一抗杂交：弃封闭液，加入用一抗稀释液稀释的一抗(Anti-ODAMantibody(ab169694))杂交溶液，置于4℃杂交过夜，第二天在振荡培养箱中进行杂交；

5.回收一抗杂交液，用TBST洗膜3次；

6.弃TBST，加入用封闭缓冲液稀释的二抗(GoatAnti-MouseIgG,HRPConjugated，CW0102)杂交溶液，置于振荡培养箱中进行杂交；

7.弃二抗溶液，用TBST洗膜3次；

8.ECL化学发光及图像采集和分析：按照高灵敏度化学发光检测试剂盒(康为世纪货号CW0049B)，具体步骤参照说明书。

9.以β-Actin作为内参进行数据标准化，以对照组组织中ODAM作为参照样本，计算实验组中ODAM蛋白的相对表达水平。

五、实验结果

蛋白印迹结果经β-Actin标化后显示ODAM蛋白在正常组和动脉瘤组中表达的灰度值分别为0.41±0.013和0.26±0.011，动脉瘤组中ODAM蛋白的表达量明显低于正常组，蛋白表达结果趋势与实时定量PCR结果一致。

Claims (10)

1.一种颅内动脉瘤诊断制剂，其特征在于，颅内动脉瘤诊断制剂检测ODAM基因和/或ODAM基因的表达产物。

2.根据权利要求1所述的颅内动脉瘤诊断制剂，其特征在于，所述颅内动脉瘤诊断制剂采用荧光定量PCR试剂盒、基因芯片、免疫方法检测颅内动脉瘤组织中ODAM基因的表达。

3.根据权利要求2所述的颅内动脉瘤诊断制剂，其特征在于，荧光定量PCR试剂盒内含有特异性检测ODAM基因的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQIDNO.1，下游引物序列为SEQIDNO.2。

4.根据权利要求1所述的颅内动脉瘤诊断制剂，其特征在于，所述的颅内动脉瘤的诊断制剂采用免疫方法检测颅内动脉瘤滑膜组织中ODAM基因的表达产物。

5.根据权利要求4所述的颅内动脉瘤诊断制剂，其特征在于，所述免疫方法为ELISA检测和/或胶体金检测。

6.权利要求1-5任意一项所述的颅内动脉瘤诊断制剂在制备颅内动脉瘤诊断工具中的应用。

7.一种治疗颅内动脉瘤的制剂，其特征在于，制剂中含有促进ODAM基因的转录或表达的试剂或化合物。

8.根据权利要求7所述的制剂，其特征在于，所述治疗颅内动脉瘤的制剂中含有促进ODAM基因的转录或表达的载体和/或激活ODAM基因的启动子和/或激活ODAM基因表达的蛋白或因子。

9.根据权利要求7所述的制剂，其特征在于，所述治疗颅内动脉瘤的制剂中含有药剂学可接受的载体。

10.权利要求7-9任意一项所述的制剂在制备颅内动脉瘤治疗药物或试剂中的应用。