CN111337688A - 健康衰老血清蛋白标志物及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种健康衰老血清蛋白标志物及应用，该标志物包括19种蛋白质。本发明首次从血清蛋白质层次提出健康衰老的蛋白标志物，它们具有准确性高，灵敏度高(AUC均大于0.800，最高0.878)的特点。可以直接作为健康衰老的评估指标。

Description

健康衰老血清蛋白标志物及应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体地说，涉及一种健康衰老血清蛋白标志物及应用。

背景技术

我国人口的老龄化速度是西方国家2倍以上，其中65岁以上的老人将从2010年1.19亿增加到2050年3.6亿(占总人口25.6％)。普通65岁以上的老年人群，随着年龄的增长，其衰老相关疾病发病率指数增高，最终导致其因衰老疾病致死。但在自然衰老的人群中，有一群特殊的人群——长寿老人：他或她们在能活到90岁以上的年龄基础上，很少患有衰老相关疾病。相对于普通衰老人群，长寿老人这样的衰老模式称之为“健康衰老”。老龄化进程的加剧及老年疾病的高发严重影响了国人生活质量，加重家庭、社会负担。但如果老人健康每年比上一年相对改善1％，那么我国2050年家庭照料总成本将节省22,100亿元。如加上医疗费用，健康老龄化所可能节省的开支将更加惊人。健康老龄的研究工作已被提升为国家战略需求。考虑到老年病发生后往往难以治愈，且治疗过程中仍会消耗大量社会资源和成本。

目前国际上公认已知的健康老龄的因子研究主要集中在长寿基因的发掘方面，如长寿基因FOXO3及APOE等。但已有的研究表明，基因对健康老龄的贡献只占15～25％，更多健康老龄是环境与遗传互作的结果，因此除了鉴定健康老龄相关基因外，更应关注能实时指征或评估健康老龄的其它因子，如表观遗传因子、转录特征、血清蛋白质特征，以及内源性代谢小分子特征。目前国内和国际上还没有关于上述能实时指征健康老龄的标志物的报道。

循环系统中的血液是人类组织中最易采集和信息含量丰富的样本，对鉴定分子标志物非常重要。其中经分离得到的血清包含了人体各器官分泌和交流的载体——代谢小分子和蛋白质。而作为生物体功能的行使者，生命活动的细微变化会直接通过蛋白质反应出来。因此，有必要开发新的基于蛋白质的健康衰老标志物。

发明内容

有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种健康衰老血清蛋白标志物及应用。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种健康衰老血清蛋白标志物，包括载脂蛋白L1，胰岛素样生长因子结合蛋白3，胰岛素样生长因子结合蛋白复合体酸不稳定亚基，玻连蛋白，血纤维蛋白溶酶原，原纤蛋白-1，巨噬细胞甘露糖受体1，补体因子D，含EGF的纤维蛋白样细胞外基质蛋白1，层粘连蛋白亚基γ1，血管细胞粘附蛋白，胱抑素C，免疫球蛋白G Fc绑定蛋白，桥粒胶蛋白2，间α-胰蛋白酶抑制剂重链H3，胰核糖核酸酶，富亮氨酸α2糖蛋白，胰岛素样生长因子结合蛋白2，Sushi-A型血管性血友病因子-EGF-穿透素域包含蛋白中的一种或几种。

本发明还公开了一种所述的健康衰老血清蛋白标志物在制备健康衰老诊断产品中的应用，所述诊断产品包含检测所述一种或多种标志物的试剂，所述试剂通过检测受试者体内的一种或多种标志物的浓度来判断受试者是否具有健康衰老可能。

可选地，所述标志物原纤蛋白-1，巨噬细胞甘露糖受体1，补体因子D，含EGF的纤维蛋白样细胞外基质蛋白1，层粘连蛋白亚基γ1，血管细胞粘附蛋白，胱抑素C，免疫球蛋白GFc绑定蛋白，桥粒胶蛋白2，间α-胰蛋白酶抑制剂重链H3，富亮氨酸α2糖蛋白，SVEP1，胰核糖核酸酶，胰岛素样生长因子结合蛋白2在健康衰老人群中的蛋白丰度显著增高。

可选地，所述标志物载脂蛋白L1，胰岛素样生长因子结合蛋白3,胰岛素样生长因子结合蛋白复合体酸不稳定亚基,玻连蛋白,血纤维蛋白溶酶在健康衰老人群中的蛋白丰度显著降低。

本发明还公开了一种健康衰老诊断组合物，包括上述的健康衰老血清蛋白标志物中的一种或几种。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

目前还没有指征健康衰老的血液标志物，本发明利用蛋白质组学数据，首次从血清蛋白质层次提出健康衰老的蛋白标志物。它们具有准确性高，灵敏度高(AUC均大于0.800，最高0.878)的特点。可以直接作为健康衰老的评估指标。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明健康衰老标志物富亮氨酸α2糖蛋白预测健康衰老的ROC曲线图及在正常和健康衰老病人血清中的详细变化箱线图，其中，A为富亮氨酸α2糖蛋白的ROC曲线图，B为富亮氨酸α2糖蛋白在正常和健康衰老病人血清中的详细变化箱线图；

图2是本发明健康衰老标志物载脂蛋白L1预测健康衰老的ROC曲线图及在正常和健康衰老病人血清中的详细变化箱线图，其中，A为载脂蛋白L1的ROC曲线图，B为载脂蛋白L1在正常和健康衰老病人血清中的详细变化箱线图；

图3是本发明健康衰老标志物载胰岛素样生长因子结合蛋白2预测健康衰老的ROC曲线图及在正常和健康衰老病人血清中的详细变化箱线图，其中，A为胰岛素样生长因子结合蛋白2的ROC曲线图，B为胰岛素样生长因子结合蛋白2在正常和健康衰老病人血清中的详细变化箱线图；

图4是本发明健康衰老标志物胰核糖核酸酶预测健康衰老的ROC曲线图及在正常和健康衰老病人血清中的详细变化箱线图，其中，A为胰核糖核酸酶的ROC曲线图，B为胰核糖核酸酶在正常和健康衰老病人血清中的详细变化箱线图；

图5是本发明健康衰老标志物SVEP1预测健康衰老的ROC曲线图及在正常和健康衰老病人血清中的详细变化箱线图，其中，A为SVEP1的ROC曲线图，B为SVEP1在正常和健康衰老病人血清中的详细变化箱线图；

图6是本发明健康衰老标志物胱抑素C预测健康衰老的ROC曲线图及在正常和健康衰老病人血清中的详细变化箱线图，其中，A为胱抑素C的ROC曲线图，B为胱抑素C在正常和健康衰老病人血清中的详细变化箱线图；

图7是本发明健康衰老标志物间α-胰蛋白酶抑制剂重链H3预测健康衰老的ROC曲线图及在正常和健康衰老病人血清中的详细变化箱线图，其中，A为间α-胰蛋白酶抑制剂重链H3的ROC曲线图，B为间α-胰蛋白酶抑制剂重链H3在正常和健康衰老病人血清中的详细变化箱线图；

图8是本发明健康衰老标志物含EGF的纤维蛋白样细胞外基质蛋白1预测健康衰老的ROC曲线图及在正常和健康衰老病人血清中的详细变化箱线图，其中，A为含EGF的纤维蛋白样细胞外基质蛋白1的ROC曲线图，B为含EGF的纤维蛋白样细胞外基质蛋白1在正常和健康衰老病人血清中的详细变化箱线图；

图9是本发明健康衰老标志物胰岛素样生长因子结合蛋白3预测健康衰老的ROC曲线图及在正常和健康衰老病人血清中的详细变化箱线图，其中，A为胰岛素样生长因子结合蛋白3的ROC曲线图，B为胰岛素样生长因子结合蛋白3在正常和健康衰老病人血清中的详细变化箱线图；

图10是本发明健康衰老标志物胰岛素样生长因子结合蛋白复合体酸不稳定亚基预测健康衰老的ROC曲线图及在正常和健康衰老病人血清中的详细变化箱线图，其中，A为胰岛素样生长因子结合蛋白复合体酸不稳定亚基的ROC曲线图，B为胰岛素样生长因子结合蛋白复合体酸不稳定亚基在正常和健康衰老病人血清中的详细变化箱线图；

图11是本发明健康衰老标志物层粘连蛋白亚基γ1预测健康衰老的ROC曲线图及在正常和健康衰老病人血清中的详细变化箱线图，其中，A为层粘连蛋白亚基γ1的ROC曲线图，B为层粘连蛋白亚基γ1在正常和健康衰老病人血清中的详细变化箱线图；

图12是本发明健康衰老标志物巨噬细胞甘露糖受体1预测健康衰老的ROC曲线图及在正常和健康衰老病人血清中的详细变化箱线图，其中，A为巨噬细胞甘露糖受体1的ROC曲线图，B为巨噬细胞甘露糖受体1在正常和健康衰老病人血清中的详细变化箱线图；

图13是本发明健康衰老标志物免疫球蛋白G Fc绑定蛋白预测健康衰老的ROC曲线图及在正常和健康衰老病人血清中的详细变化箱线图，其中，A为免疫球蛋白G Fc绑定蛋白的ROC曲线图，B为免疫球蛋白G Fc绑定蛋白在正常和健康衰老病人血清中的详细变化箱线图；

图14是本发明健康衰老标志物血纤维蛋白溶酶原预测健康衰老的ROC曲线图及在正常和健康衰老病人血清中的详细变化箱线图，其中，A为血纤维蛋白溶酶原的ROC曲线图，B为血纤维蛋白溶酶原在正常和健康衰老病人血清中的详细变化箱线图；

图15是本发明健康衰老标志物补体因子D预测健康衰老的ROC曲线图及在正常和健康衰老病人血清中的详细变化箱线图，其中，A为补体因子D的ROC曲线图，B为补体因子D在正常和健康衰老病人血清中的详细变化箱线图；

图16是本发明健康衰老标志物血管细胞粘附蛋白预测健康衰老的ROC曲线图及在正常和健康衰老病人血清中的详细变化箱线图，其中，A为血管细胞粘附蛋白的ROC曲线图，B为血管细胞粘附蛋白在正常和健康衰老病人血清中的详细变化箱线图；

图17是本发明健康衰老标志物桥粒胶蛋白2预测健康衰老的ROC曲线图及在正常和健康衰老病人血清中的详细变化箱线图，其中，A为桥粒胶蛋白2的ROC曲线图，B为桥粒胶蛋白2在正常和健康衰老病人血清中的详细变化箱线图；

图18是本发明健康衰老标志物玻连蛋白预测健康衰老的ROC曲线图及在正常和健康衰老病人血清中的详细变化箱线图，其中，A为玻连蛋白的ROC曲线图，B为玻连蛋白在正常和健康衰老病人血清中的详细变化箱线图；

图19是本发明健康衰老标志物原纤蛋白-1预测健康衰老的ROC曲线图及在正常和健康衰老病人血清中的详细变化箱线图，其中，A为原纤蛋白-1的ROC曲线图，B为原纤蛋白-1在正常和健康衰老病人血清中的详细变化箱线图。

具体实施方式

本发明通过以下实施例作进一步说明，实施例不应解释为进一步限制。如具体实施方式中需获取血清中特定蛋白质含量的信息，既可用基于质谱的蛋白组定量方法，也可用其它任何能够获取血清蛋白质表达含量的测量方法。参选以下本发明的实施方法的详述以及包括的实施例可更容易地理解本发明的内容。除非另有限定，本文使用的所有技术以及科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。

世界卫生组织将健康衰老定义为：在老年阶段，能够维持一系列功能能力(包括可自我满足自身需求；可以学习并作出决定；可以活动、建立和维持人际关系，能够对社会有所贡献)而使自身得到有价值的生活的过程(https://www.who.int/ageing/healthy-ageing/en/)。

要达到健康衰老，最基本的是在衰老过程中，能够规避老年性疾病(老年疾病[M].科学出版社，2011年1月1日)以及重大疾病(2007年4月3日起开始实施的《重大疾病保险的疾病定义使用规范》中所定义的)，以很少患病、住院率极低的状态度过老年阶段。

实施例1健康衰老蛋白标志物

通过对海南省119个长寿老人(95～111岁，中位数100岁)及151个同地区的老年对照人群(32～80岁，中位数61岁)血清蛋白组的前瞻性研究，本发明提供了一种健康衰老血清蛋白质标志物，这类标志物可以单独或两种或两种以上的组合来进行健康衰老的分子评估，包括载脂蛋白L1(Apolipoprotein L1，APOL1)，胰岛素样生长因子结合蛋白3(Insulin-like growth factor-binding protein 3，IGFBP3)，胰岛素样生长因子结合蛋白复合体酸不稳定亚基(Insulin-like growth factor-binding protein complex acid labilesubunit，IGFALS)，玻连蛋白(Vitronectin，VTN)，血纤维蛋白溶酶原(Plasminogen，PLG)，原纤蛋白-1(Fibrillin-1，FBN1)，巨噬细胞甘露糖受体1(Macrophage mannose receptor1，MRC1)，补体因子D(Complement factor D，CFD)，含EGF的纤维蛋白样细胞外基质蛋白1(EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1，EFEMP1)，层粘连蛋白亚基γ1(Laminin subunit gamma-1，LAMC1)，血管细胞粘附蛋白(Vascular celladhesion protein 1，VCAM1)，胱抑素C(Cystatin-C，CST3)，免疫球蛋白G Fc绑定蛋白(IgGFc-binding protein，FCGBP)，桥粒胶蛋白2(Desmocollin-2，DSC2)，间α-胰蛋白酶抑制剂重链H3(Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H3，ITIH3)，胰核糖核酸酶(Ribonuclease pancreatic，RNASE1)，富亮氨酸α2糖蛋白(Leucine-rich alpha-2-glycoprotein，LRG1)，胰岛素样生长因子结合蛋白2(Insulin-like growth factor-binding protein 2，IGFBP2)，Sushi-A型血管性血友病因子-EGF和穿透素域包含蛋白1(Sushi，von Willebrand factor type A，EGF and pentraxin domain-containingprotein 1，SVEP1)。

上述19种标志物在健康衰老人群中的变化情况及对应的预测线下面积AUC如表1。每一行代表一个健康衰老标志物，其中Uniport标识号是此蛋白质在Uniport蛋白数据库的公认识别号；log2(差异倍数)为正代表标志物在健康衰老人群中相较于普通衰老人群高表达，为负代表标志物在健康衰老人群中高表达；线下面积(AUC)表示该标志物预测受试者受试者健康衰老的准确性，如LRG1预测健康衰老的准确度是87.8％。这些血清蛋白质(都有较高的AUC，大于等于0.8)能直接作为指征健康衰老的标志物。

表1各蛋白标志物在健康衰老人群的表达情况及其预测健康衰老的准确性

上述19种健康衰老标志物中，在健康衰老人群与普通衰老人群相比显著增加的是：原纤蛋白-1，巨噬细胞甘露糖受体1，补体因子D，含EGF的纤维蛋白样细胞外基质蛋白1，层粘连蛋白亚基γ1，血管细胞粘附蛋白，胱抑素C，免疫球蛋白G Fc绑定蛋白，桥粒胶蛋白2，间α-胰蛋白酶抑制剂重链H3，富亮氨酸α2糖蛋白，SVEP1，胰核糖核酸酶，胰岛素样生长因子结合蛋白2共14种。上述19种健康衰老标志物中，在健康衰老人群中显著降低的是：载脂蛋白L1，胰岛素样生长因子结合蛋白3，胰岛素样生长因子结合蛋白复合体酸不稳定亚基，玻连蛋白，血纤维蛋白溶酶原共5种。

上述19种血清蛋白标志物预测健康衰老的ROC曲线如附图1A、2A、3A-19A所示，展示了每个标志物预测健康衰老的准确性；上述19种健康衰老标志物在正常和健康衰老病人血清中的详细变化箱线图如附图1B、2B、3B-19B所示，展示了每个标志物在健康衰老中的表达变化情况(高或低表达)。

实施例2以单标志物如载脂蛋白L1进行健康衰老的评估：

具体实施方法如下：

1、由专业的医护人员抽取至少3个受试者血液(计算蛋白平均丰度需要至少3个样本)，经离心获取血清样本，放入-80℃保存；

2、测量血清样本中载脂蛋白L1的表达丰度。如通过基于质谱平台(Q-Exactive)的相对定量方法——TMT，来获取载脂蛋白L1的表达丰度，详细步骤如下：

a).蛋白提取：血清样品从－80℃取出，4℃，12000g离心10分钟，去除细胞碎片，上清液转移至新的离心管，用Thermo公司生产的试剂盒参照Pierce^TMTop 12AbundantProtein Depletion Spin Columns Kit说明书去除高丰度蛋白。利用BCA试剂盒进行蛋白浓度测定。

b).胰酶酶解：蛋白溶液中加入二硫苏糖醇使其终浓度为5mM，56℃还原30min。之后加入碘代乙酰胺使其终浓度为11mM，室温避光孵育15min。最后将样品的尿素浓度稀释至低于2M。以1:50的质量比例(胰酶：蛋白)加入胰酶，37℃酶解过夜。再以1:100的质量比例(胰酶：蛋白)加入胰酶，继续酶解4h。

c).TMT标记：胰酶酶解的肽段用Strata X C18(Phenomenex)除盐后真空冷冻干燥。以0.5M TEAB溶解肽段，根据TMT试剂盒操作说明标记肽段。简单的操作如下：标记试剂解冻后用乙腈溶解，与肽段混合后室温孵育2h，标记后的肽段混合后除盐，真空冷冻干燥。

d).HPLC分级：肽段用高pH反向HPLC分级，色谱柱为Agilent300Extend C18(5μm粒径，4.6mm内径，250mm长)。操作如下：肽段分级梯度为8％-32％乙腈、pH 9，60min时间分离60个组分，随后肽段合并为18个组分，合并后的组分经真空冷冻干燥后进行后续操作。

e).液相色谱-质谱联用分析：肽段用液相色谱流动相A相(0.1％(v/v)甲酸水溶液)溶解后使用EASY-nLC 1200超高效液相系统进行分离。流动相A为含0.1％甲酸和2％乙腈的水溶液；流动相B为含0.1％甲酸和90％乙腈的水溶液。液相梯度设置：0～50min，7％-24％B；50～67min，24％-35％B；67～71min，35％-80％B；71～75min，80％B，流速维持在400nL/min。肽段经由超高效液相系统分离后被注入NSI离子源中进行电离然后进QExactiveTM HF-X质谱进行分析。离子源电压设置为2.0kV，肽段母离子及其二级碎片都使用高分辨的Orbitrap进行检测和分析。一级质谱扫描范围设置为350-1600m/z，扫描分辨率设置为120,000；二级质谱扫描范围则固定起点为100m/z，二级扫描分辨率设置为30,000。数据采集模式使用数据依赖型扫描(DDA)程序，即在一级扫描后选择信号强度最高的前20肽段母离子依次进入HCD碰撞池使用28％的碎裂能量进行碎裂，同样依次进行二级质谱分析。为了提高质谱的有效利用率，自动增益控制(AGC)设置为1E5，信号阈值设置为83000ions/s，最大注入时间设置为60ms，串联质谱扫描的动态排除时间设置为30秒避免母离子的重复扫描。

f).数据库搜索：二级质谱数据使用Maxquant进行检索。检索参数设置：数据库为Human_UniProt(去污染库)，添加了反库以计算随机匹配造成的假阳性率(FDR)，并且在数据库中加入了常见的污染库，用于消除鉴定结果中污染蛋白的影响；酶切方式设置为Trypsin/P；漏切位点数设为2；肽段最小长度设置为7个氨基酸残基；肽段最大修饰数设为5；First search和Main search的一级母离子质量误差容忍度分别设为20ppm和5ppm，二级碎片离子的质量误差容忍度为0.02Da。将半胱氨酸烷基化设置为固定修饰，可变修饰为甲硫氨酸的氧化，蛋白N端的乙酰化,脱酰胺化(NQ)。定量方法设置为TMT-11plex，蛋白鉴定、PSM鉴定的FDR都设置为1％。

3、利用第2步(f)获取的蛋白丰度信息，随机从实施例1提及的151个老年群体中抽取3个个体：受试者a，受试者b，受试者c，他们的蛋白相对表达值分别为：0.307，0.500，0.996，计算所有受试者的蛋白表达平均值为0.601，作为载脂蛋白L1在这一组受试者中的参考水平。对于其中某一个单一受试者如受试者a，其载脂蛋白L1的表达水平0.307远低于0.601。且查表1可知健康衰老会低表达这一蛋白，推测受试者a具有更高健康衰老的概率。

实施例3以单标志物如富亮氨酸α2糖蛋白进行健康衰老的评估：

直接设计测量富亮氨酸α2糖蛋白丰度的试剂盒或试纸，利用试剂盒或试纸测量受试者少量血液中的富亮氨酸α2糖蛋白丰度(类似血糖仪通过一滴血直接测量血糖丰度的方式)随机从实施例1提及的151个老年群体中抽取3个个体：受试者a，受试者b，受试者c，他们的蛋白相对表达值分别为：3.662 2.796 1.706。计算所有受试者的蛋白表达平均值为2.721，作为富亮氨酸α2糖蛋白在这一组受试者中的参考水平。对于其中某一个单一受试者如受试者a，其富亮氨酸α2糖蛋白的表达水平3.662高于2.721，查表1可知健康衰老会高表达这一蛋白，推测受试者a具有更高健康衰老的概率。

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (6)

1.一种健康衰老血清蛋白标志物，其特征在于，包括载脂蛋白L1，胰岛素样生长因子结合蛋白3，胰岛素样生长因子结合蛋白复合体酸不稳定亚基，玻连蛋白，血纤维蛋白溶酶原，原纤蛋白-1，巨噬细胞甘露糖受体1，补体因子D，含EGF的纤维蛋白样细胞外基质蛋白1，层粘连蛋白亚基γ1，血管细胞粘附蛋白，胱抑素C，免疫球蛋白G Fc绑定蛋白，桥粒胶蛋白2，间α-胰蛋白酶抑制剂重链H3，胰核糖核酸酶，富亮氨酸α2糖蛋白，胰岛素样生长因子结合蛋白2，Sushi-A型血管性血友病因子-EGF-穿透素域包含蛋白中的一种或几种。

2.权利要求1中所述的健康衰老血清蛋白标志物在制备健康衰老诊断产品中的应用，其特征在于，所述诊断产品包含检测所述一种或多种标志物的试剂，所述试剂通过检测受试者体内的一种或多种标志物的浓度来判断受试者是否具有健康衰老可能。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，具体是检测受试者血清中的一种或多种标志物的蛋白丰度。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述标志物原纤蛋白-1，巨噬细胞甘露糖受体1，补体因子D，含EGF的纤维蛋白样细胞外基质蛋白1，层粘连蛋白亚基γ1，血管细胞粘附蛋白，胱抑素C，免疫球蛋白G Fc绑定蛋白，桥粒胶蛋白2，间α-胰蛋白酶抑制剂重链H3，富亮氨酸α2糖蛋白，SVEP1，胰核糖核酸酶，胰岛素样生长因子结合蛋白2在健康衰老人群中的蛋白丰度显著增高。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述标志物载脂蛋白L1，胰岛素样生长因子结合蛋白3,胰岛素样生长因子结合蛋白复合体酸不稳定亚基,玻连蛋白,血纤维蛋白溶酶在健康衰老人群中的蛋白丰度显著降低。

6.一种健康衰老诊断组合物，其特征在于，包括权利要求1所述的健康衰老血清蛋白标志物中的一种或几种。

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