JP2008002894A - ネフローゼ症候群の疾患関連たんぱく質およびその使用 - Google Patents

Abstract

【課題】ネフローゼ症候群の病態判定に有効であり治療効果を迅速に反映する血清たんぱく質を見出し、それを用いた本疾患の治療モニタリング法や予後方法、そのためのキット、ならびにネフローゼ症候群の治療薬のスクリーニング方法を提供する。
【解決手段】ネフローゼ症候群の病態の判定方法であって、ネフローゼ症候群の被験者から試料を得ること、次いで試料中のzinc alpha−２−glycoprotein 1（ＺＡＧ）の量を調べることを含む方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、本発明は、ネフローゼ症候群の疾患関連たんぱく質、ネフローゼ症候群の病態の判定方法におけるその使用、ネフローゼ症候群の病態判定用キット、ネフローゼ症候群の治療薬のスクリーニング方法等に関する。

ネフローゼ症候群は多量の蛋白尿と低蛋白血症等を呈することが知られている。ネフローゼ症候群には微小変化型のもの、巣状糸球体硬化症、膜性腎症、膜性増殖性糸球体腎炎を発症するもの等が含まれる。なかでも微小変化型ネフローゼ症候群（minimal change nephritic syndrome: ＭＣＮＳ）は、小児期の腎症の大部分および成年期の腎症の約１５％を占め、小児において重篤な場合には死に至る。

ＭＣＮＳなどのネフローゼ症候群においては、糸球体のろ過機能に異常が認められるが、他の腎症と異なり、糸球体には殆ど組織学的な変化が見られず、また、免疫グロブリンや、補体の沈着も認められない。多くの症例では、急性に発症し、副腎皮質ステロイドホルモン（ステロイド）や免疫抑制剤の投与により寛解するが再発しやすいなどの特徴点を有する。その発症原因仮説としては、Ｔ細胞機能異常（非特許文献１）やヘモペキシンなどの糸球体透過性亢進因子の異常等（非特許文献２）スリット膜関連たんぱく質の低下等（非特許文献３）が提唱されているが、未だ完全には解明されていない。また本疾患の病態判定に有効な方法として、血清中の総蛋白質量及びアルブミン／グロブリン比を測定することが知られているが、特異的で迅速な病態を反映する判定法としては充分ではない。

ネフローゼ症候群においては、尿中に比較的低分子の血清蛋白質が多量に漏出するため、血清中の総たんぱく質量およびアルブミン/グロブリン比が低下することが知られている。従って、ネフローゼ症候群の病態判定には、血清総たんぱく質量及びアルブミン/グロブリン比を測定することが従来から行われている。しかし、ステロイド投与や安静食事療法等の治療により、腎臓糸球体のろ過機能が改善し、尿中へのたんぱく質の漏出が停止しても、血清総たんぱく質量及びアルブミン/グロブリン比は、すぐに著しくは回復しない。それゆえ、これらの測定値によってはネフローゼ症候群の治療効果等の病態があまり迅速には反映されず、定量性にも問題があった。そこで、ネフローゼ症候群の治療効果等の病態をより迅速に反映し、定量性にも優れた血清中のマーカーたんぱく質を特定することが切望されていた。
Boulton-Jones J.M. et al. Clinical Nephrol, 20, 72-76(1983) Winston, W. et al. Kidney International, 68, 603-610(2005) Koop K, et al: J. Am. Soc. Nephrol, 14, 2063-2071(2003)

本発明は、ネフローゼ症候群の病態判定に有効であり、治療効果を迅速に反映し、予後にも用いることにできる血清たんぱく質を見出し、それを用いたネフローゼ症候群の治療モニタリング法や予後方法、そのためのキット、ならびにネフローゼ症候群の治療薬のスクリーニング方法等を提供することを課題とした。

本発明者らは、上記課題に鑑みて鋭意研究を重ね、健常人および微小変化型ネフローゼ症候群患者の治療前と治療後の血清中のたんぱく質の比較定量解析を行ったところ、血清循環糖蛋白質（common circulating blood protein）の一種である、zinc alpha−２−glycoprotein 1（以下、「ＺＡＧ」ということがある）(GI番号：4502337)が、ネフローゼ症候群の病態判定に有効なマーカーであり、治療効果を迅速に反映し、予後にも用いることにできる血清たんぱく質であることを見出し、本発明を完成させた。

ＺＡＧは血清循環糖たんぱく質として知られており、膀胱癌において血清レベルが上昇することも知られている（Bing, C et al: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 2500-2505 (2004)、Irmak, S et al: Proteomics. 5, 4296-4304 (2005)）。しかしながら、ＺＡＧのレベルがネフローゼ症候群の病態と密接な関連性を有することは本発明により初めて明らかとなった。

すなわち、本発明は、下記のものを提供する。
（１）ネフローゼ症候群の病態の判定方法であって、ネフローゼ症候群の被験者から得た試料中のzinc alpha−２−glycoprotein 1（ＺＡＧ）の量を調べることを含む方法；
（２）治療中の被験者から得た試料中のＺＡＧ量と、治療前および／または治療後の同じ被験者、および／または正常個体から得た試料中のＺＡＧ量とを比較すること
をさらに含む（１）記載の方法。
（３）ＺＡＧ量の測定が同位体標識法を用いて行われる（１）または（２）の方法。
（４）同位体標識法がｃＩＣＡＴ法である（３）記載の方法。
（５）病態の判定がネフローゼ症候群の治療モニタリングである（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）病態の判定がネフローゼ症候群の予後である（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（７）ネフローゼ症候群が微小変化型ネフローゼ症候群である（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）（１）〜（７）のいずれか１項記載に方法において試料中のＺＡＧ量を測定するための手段を必須として含む、ネフローゼ症候群の病態の判定用キット。
（９）ＺＡＧ量の測定が同位体標識法を用いて行われる（８）記載のキット。
（１０）同位体標識法がｃＩＣＡＴ法である（９）記載のキット。
（１１）病態の判定がネフローゼ症候群の治療モニタリングである（８）〜（１０）のいずれかに記載のキット。
（１２）病態の判定がネフローゼ症候群の予後である（８）〜（１０）のいずれかに記載のキット。
（１３）ネフローゼ症候群が微小変化型ネフローゼ症候群である（８）〜（１２）のいずれかに記載のキット。
（１４）ネフローゼ症候群の治療薬のスクリーニング方法であって、
（ａ）ネフローゼ症候群にかかっている動物に候補薬剤を投与すること、および
（ｂ）該候補薬剤の投与前および投与後に該動物から採取した試料中のＺＡＧ量を調べること
を含む方法。
（１５）（１４）に記載の方法により得られるネフローゼ症候群治療薬。

本発明によれば、対象から得た試料中のＺＡＧのレベルを測定することにより、ネフローゼ症候群の病態の判定、例えば治療モニタリング、予後などを迅速かつ正確に行うことができ、さらにはネフローゼ症候群の治療薬のスクリーニングを行うこともできる。

本発明は、ネフローゼ症候群の病態の判定方法を提供する。該方法は、ネフローゼ症候群の被験者から得た試料を中のＺＡＧの量を調べることを含む。「ネフローゼ症候群の被験者」、「ネフローゼ症候群患者」とは、ネフローゼ症候群にかかっていると判定された者である。かかる判定は、既知の方法、例えば、血清中の総蛋白質量及びアルブミン／グロブリン比を測定すること、あるいは血尿があることなどにより行うことができる。

ネフローゼ症候群患者の治療前、治療中、治療後の試料中のＺＡＧ量は、患者によらず図１に示すように同様のパターンで経時変化をすることがわかった。すなわち、試料中のＺＡＧは、治療効果が発揮されるに伴って（患者尿中たんぱく質の消失とともに）増加し、治療効果が良好であれば同じ患者の治療前の値または治療後の値あるいは正常個体の標準値から著しく（約３倍に）増加する。そして緩解期に入ると治療前の値あるいは正常個体の標準値と等しいレベルにまで減少する（表２も参照のこと）。かかるＺＡＧの変動パターンはいずれの患者においても見られるので、ネフローゼ症候群患者の試料中のＺＡＧ量を測定し、上記のような試料中のＺＡＧの変動パターンを検量線のようにして利用することにより、患者におけるネフローゼ症候群の病態を解析することができる。例えば、患者が治療を受けている場合であれば、治療に対する患者の応答の有無、程度、あるいは患者がいずれの治療段階にあるのか等の状況を判定することができ、今後の病態の予測も可能である。

上で説明した本発明の方法において、治療中の被験者から得た試料中のＺＡＧ量と、治療前および／または治療後の同じ被験者、および／または正常個体から同様に得て同様に調べた試料中のＺＡＧ量とを比較してもよい。本明細書において、治療中とは、ステロイド投与や食事療法などの処置を患者に施している期間をいう。治療前、治療中および／または治療後の各々において少なくとも１回患者から試料を得る。好ましくは、治療前、治療中そして治療後の各々において数回、適当な時間間隔を置いて患者から試料をサンプリングする。そうすることによってネフローゼ症候群患者の試料中のＺＡＧ量の経時変化をより詳細に調べることができ、ネフローゼ症候群の病態をさらに詳細に解析することができる。例えば、治療に対する患者の応答の有無、程度、あるいは患者がいずれの治療段階にあるのか等の状況をさらに詳細に調べることができ、今後の病態の変化をさらに高い精度で予測することができる。

したがって、本発明のネフローゼ病態解析方法は、ネフローゼ症候群の治療モニタリングならびに予後にも用いることができる。

本発明のネフローゼ症候群の病態解析方法はいずれの種類のネフローゼ症候群の病態解析においても効果的であるが、なかでも微小変化型ネフローゼ症候群（ＭＣＮＳ）の病態解析に適している。

本発明の方法を適用する対象は、哺乳動物、好ましくは霊長類、特に好ましくはヒトである。被験者からの試料の種類は特に限定されない。試料は体液であってもよく、組織試料であってもよい。組織試料の採取は被験者に負担がかかる場合があるので、体液試料が好ましい。体液試料としては全血、血清、尿、汗、唾液、腹水などが例示され、ＺＡＧが多く含まれることから血清が好ましい。対照として、正常個体から被験者と同様の方法で試料を採取する。試料の採取方法は当該分野において様々なものが知られ、用いられており、適宜選択して用いることができる。例えば、血清試料を得る場合には、腕の静脈から採血し、遠心分離等の通常の分離方法により血清を得ることができる。好ましくは、被験者および／または正常個体において、同じ採取方法にて試料を得て、同じ測定方法にてＺＡＧを測定することが、テータの精度向上の点から好ましい。

また、ネフローゼ症候群において正常値から変動することが知られているたんぱく質、例えば、腎糸球体のろ過機能能改善と相関するレチノール結合たんぱく質４（Fex. G. and Hasson, B.: Eur. J. Biochem. 94, 307-313 (1979)）、トランスシレチン（Fex. G. and Hasson, B.: Eur. J. Biochem. 94, 307-313 (1979)）、アンチスロンビン（Malyszko J, et al: Blood Coagul Fibrinolysis 13, 615-621(2002)）等のたんぱく質、あるいは糸球体のろ過機能の低下に相関するプロスタグランジンＤ２シンターゼ（Donadio C, et al: J. Phar. Biome. Anal. 32, 1099-1104 (2003)）等のたんぱく質に関しても測定を行って、これらのデータとＺＡＧのデータを併用することにより、本発明の方法においてさらに精度の高いネフローゼ病態判定を行うことができる。

本発明におけるＺＡＧの検出および量の測定には当該分野で知られた種々の方法を適用することができる。ＺＡＧの検出および測定方法としては、特に限定されるものではなく、当該分野で知られた方法を使用することができる。例としてはアフィニティークロマト法、二次元電気泳動法、ｃＩＣＡＴ法などの同位体標識法、ＺＡＧに特異的な抗体を用いる免疫学的方法等が挙げられる。二次元電気泳動法や同位体標識法等のプロテオーム解析に用いられる方法を適用することが好ましい。

同位体標識法は定性のみならず定量性にも優れた方法である。同位体標識法のなかでもｃＩＣＡＴ法（Hansen, K.C. et al, Mol. Cell Proteomics, 2, 299-314(2003)）がさらに好ましい。ｃＩＣＡＴ法は、患者と健常人あるいは治療前と治療後のたんぱく質の網羅的発現差解析を行うことにより、疾患関連たんぱく質を分析する有効な手段として用いられており、本発明にも有効に用いられる。同位体標識法には質量分析法（ＭＳ）を組み合わせるのが一般的である。ＭＳの手段・方法は種々のものがあり、装置も多数市販されているので、適宜選択して使用することができる。また、分離能力と定性能力の向上を図るために、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）や液体クロマトグラフィー（ＬＣ）とＭＳとを組み合わせた分析方法（ＧＣ／ＭＳ、ＬＣ／ＭＳあるいはＬＣ／ＭＳ／ＭＳなど）も開発されており、そのための装置の多数市販されている。

免疫学的手法を用いてＺＡＧを検出および測定してもよい。ＺＡＧに対する抗体を公知の方法により調製して、ＥＬＩＳＡ法などの公知の手法により分析を行うことができる。マイクロチップやマイクロタイターディッシュ、あるいはビーズ等の当該分野で公知の器具・装置、ならびに公知の固定化手段等を用いてハイスループット分析を行って大量の検体を分析することもできる。試料中のたんぱく質を適宜標識してもよく、種々の標識（例えば、同位体標識、蛍光標識、発光標識、呈色標識、金コロイド標識、ビオチンなどの特異的結合物質での標識等）が当該分野で知られており、それらの標識を付加する方法も公知である。

さらに本発明は、ネフローゼ症候群の病態の判定用キットを提供する。該キットは、上記の本発明の方法において試料中のＺＡＧ量を測定するための手段を必須として含む。試料中のＺＡＧ量の測定方法は上述のごとく種々のものが公知であり、適宜選択して用いることができる。例えばＺＡＧの測定がＥＬＩＳＡ法を用いて行われる場合には、本発明のキットは、ＺＡＧ特異的モノクローナル抗体、ＥＬＩＳＡ用マイクロタイタープレート、適当な発色試薬等を含む。本発明のキットの好ましい具体例の１つは、ＺＡＧの測定が同位体標識法、特にｃＩＣＡＴ法を用いて行われるものである。本発明のキットはＭＣＮＳの病態の解析に好ましく用いられる。

さらに本発明は、ネフローゼ症候群の治療薬のスクリーニング方法を提供する。該方法は、ネフローゼ症候群にかかっている動物に候補薬剤を投与すること、そして該候補薬剤の投与前および投与後に該動物から採取した試料中のＺＡＧ量を調べることを含む。治療効果の良否は、動物から得た試料中のＺＡＧ量の増加の程度から判断することができる。緩解期に入ったことは試料中のＺＡＧ量の減少により確認することができる。かかる方法により得られたネフローゼ治療薬もまた本発明に包含される。

以下に実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明を限定するものではない。

微小変化型ネフローゼ症候群患者５名（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ）の治療前（発症中）、治療中（ステロイド等投与中）或いは治療後（ステロイド投与終了、緩解期）の患者血清（合計１５検体）と健常人標準血清（健常人１０名の血清をプールしたもの）中の血清たんぱく質を、ｃＩＣＡＴ法により、比較定量解析を行った。すなわち、金子 勲：疾患関連たんぱく質解析研究 平成１７年度 総括・分担研究報告書 ｐ．１０４−１４４に記載の方法により、アジレント社製抗体カラムで、アルブミン、ＩｇＧ、α１−アンチトリプシン、ＩｇＡ、トランスフェリン、ハプトグロビンを除去した患者血清画分（１ｍｇ）及び健常人標準血清画分（１ｍｇ）を、それぞれｃＩＣＡＴ−Ｈ鎖試薬およびｃＩＣＡＴ−Ｌ鎖試薬で標識した。標識した各画分を混合後、トリプシン処理を行い、得られたペプチド断片をＳＣＸカラム、アビジンカラムで精製し、さらにＴＦＡ処理でビオチン部分切断することにより、ｃＩＣＡＴ標識ペプチド（Ｈ鎖、Ｌ鎖）を得た。本標識ペプチドをＳＣＸカラム（４．６ｘ１００ｍｍ）で分画（２５分画）し、各画分のｃＩＣＡＴペプチドはnano-LC/Q-Star XL（Applied Biosystems (AB), ESI-Q/TOF）で質量分析測定を行い、生データをチェック後、統合データベースシステム（HiSpec）を用いてペプチドおよびたんぱく質の同定・比較定量解析を行い、患者血清（Ｈ鎖標識）と健常人標準血清（Ｌ鎖標識）との各たんぱく質の比較定量比（Ｈ／Ｌ）を計算した。

その結果、何れの場合も、Refseqのデータベースを用いて、ｃＩＣＡＴペプチドレベルでランク１、スコア２０以上を示すたんぱく質を同定たんぱく質とすると、約１２０種類の血清たんぱく質の同定と比較定量比（Ｈ／Ｌ）が可能であった。治療前ネフローゼ患者（５名）血清と健常人標準血清とで比較した場合、その発現比率（Ｈ／Ｌ）値が０．６０〜１．６７の範囲に入るケースが占める割合は、治療前で８１．５％、治療中で７８．８％、治療後では８０．６％であった。一方、ｃＩＣＡＴ法の定量誤差範囲の閾値を超えて、Ｈ／Ｌ値が０．５よりも小、または２．０よりも大を示すケースの割合は、治療前で８．４％，治療中で１１．４％、治療後では１１．４％であり、いずれも日本人健常人４名の場合（３．５％）よりも多かった。この閾値を超えたものの中で、治療前、治療中、治療後で変動がみられるものを患者毎に調べた。また、常法により、患者の治療前（発症中）、治療中（ステロイド投与中）および治療後（ステロイド投与終了、緩解期）のたんぱく尿検査値、血清総蛋白質量及びアルブミン／グロブリン比を測定した（表１）。

その結果、患者全例において、ステロイド投与治療により、尿中へのたんぱく質の漏洩は完全に停止（＋＋＋から−に改善）したが、それととともに、血清循環糖たんぱく質の一種であるＺＡＧ（Ｈ／Ｌ比）は治療前では平均１．１８±０．６８であったのが、治療により平均３．２７±０．８２と著しく増加した（図１）。一方、他の血清循環糖たんぱく質のビトロネクチン、α−１Ｂグリコプロテイン、ヘモペキシンのＨ／Ｌ比は治療により、殆ど変化はしなかった（データ示さず）。また、腎臓の糸球体の機能改善に伴い増加すると報告されているアンチスロンビンIII、レチノール結合たんぱく質４のＨ／Ｌ比は、それぞれ、治療前では０．８５±０．１７および０．７３±０．１７であり、治療により、１．０８±０．１８および１．０５±０．１６になった（治療中の値）。しかし、これらのたんぱく質の変化は、ＺＡＧの変化と比べると微小なものといえる。

表１に示すように、治療による蛋白尿は陰性になり、血清総たんぱく質量およびアルブミン／グロブリン比は上昇するものの治療中の時点では緩解期のレベルまでには回復していなかった。従って、治療によるＺＡＧの増加は血清総たんぱく質量及びアルブミン／グロブリン比の正常値までの変化よりも先行した。また、治療後（緩解期）には、本たんぱく質のＨ／Ｌ比は正常値に戻った。このことから、本発明のネフローゼ病態解析方法は、より迅速に病態の変化を捉えることができることがわかる。

治療前と治療中の血清たんぱく質解析データに関して、本たんぱく質と他の血清たんぱく質との相関性を調べたところ、本たんぱく質のＨ／Ｌ比と、腎糸球体のろ過機能能改善と相関することが知られているレチノール結合たんぱく質４、トランスシレチン、アンチスロンビンIIIのＨ／Ｌ比とは正の相関関係が認められ、逆に、糸球体のろ過機能の低下に相関するプロスタグランジンＤ２シンターゼのＨ／Ｌ比とは負の相関関係が認められた（図２）。このことは、当該蛋白質がネフローゼ症候群の治療による病態変化を迅速反映する蛋白質であることを示すものである。したがって、ＺＡＧの血清中の濃度を測定することにより、ネフローゼ症候群の病態の判定、例えば、治療モニタリング、予後、治療効果の予測などを行うことができる。

本発明は、ネフローゼ病態の研究分野ならびにその病態判定のためのキットの製造などの分野、さらにはネフローゼの新規治療薬の創薬やスクリーニングの分野において利用可能である。

図１は、５人の患者についての、治療前、治療中、治療後における血清中のＺＡＧ量の変動、並びにそれらの平均を示すグラフである。 図２は、レチノール結合たんぱく質４（左上パネル）、トランスシレチン（右上パネル）、アンチスロンビンＩＩＩ（左下パネル）およびプロスタグランジンＤ２シンターゼ（右下パネル）の血清中の量とＺＡＧの血清中の量との相関性を示すグラフである。

Claims (15)

1. ネフローゼ症候群の病態の判定方法であって、ネフローゼ症候群の被験者から得た試料中のzinc alpha−２−glycoprotein 1（ＺＡＧ）の量を調べることを含む方法。
2. 治療中の被験者から得た試料中のＺＡＧ量と、治療前および／または治療後の同じ被験者、および／または正常個体から得た試料中のＺＡＧ量とを比較すること
   をさらに含む請求項１記載の方法。
3. ＺＡＧ量の測定が同位体標識法を用いて行われる請求項１または２記載の方法。
4. 同位体標識法がｃＩＣＡＴ法である請求項３記載の方法。
5. 病態の判定がネフローゼ症候群の治療モニタリングである請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
6. 病態の判定がネフローゼ症候群の予後である請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
7. ネフローゼ症候群が微小変化型ネフローゼ症候群である請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
8. 請求項１〜７のいずれか１項記載に方法において試料中のＺＡＧ量を測定するための手段を必須として含む、ネフローゼ症候群の病態の判定用キット。
9. ＺＡＧ量の測定が同位体標識法を用いて行われる請求項８記載のキット。
10. 同位体標識法がｃＩＣＡＴ法である請求項９記載のキット。
11. 病態の判定がネフローゼ症候群の治療モニタリングである請求項８〜１０のいずれか１項記載のキット。
12. 病態の判定がネフローゼ症候群の予後である請求項８〜１０のいずれか１項記載のキット。
13. ネフローゼ症候群が微小変化型ネフローゼ症候群である請求項８〜１２のいずれか１項記載のキット。
14. ネフローゼ症候群の治療薬のスクリーニング方法であって、
    （ａ）ネフローゼ症候群にかかっている動物に候補薬剤を投与すること、および
    （ｂ）該候補薬剤の投与前および投与後に該動物から採取した試料中のＺＡＧ量を調べること
    を含む方法。
15. 請求項１４記載の方法により得られるネフローゼ症候群治療薬。

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