JP2014527187A - 脂肪酸シンターゼタンパク質に対するsrm/mrmアッセイ - Google Patents
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Abstract
Description
脂肪酸シンターゼタンパク質(本明細書ではFASNと呼ばれ、FASとも呼ばれる)の下位配列から派生する特異ペプチドが提供されている。ペプチド配列および各ペプチドの断片化/遷移イオンは、質量分析ベースの選択反応モニタリング(SRM)アッセイで特に有用であり、これは多重反応モニタリング(MRM)アッセイとも呼ばれる。このようなアッセイは本明細書ではSRM/MRMと呼ばれる。FASNタンパク質のSRM/MRMによる定量分析に対するペプチドの使用が記述されている。
SRM/MRMアッセイ法は、例えば、ホルマリン固定組織などの患者由来組織中のがんの病期を直接診断するのに役立ち、また、その患者の治療に使用するために最も有利な治療薬の決定の一助として使用できる。腫瘍の部分的または全体の治療的除去などの手術によって、または疑われる疾患の有無を決定するために実施される生検方法のいずれかによって、患者から取り出されるがん組織を分析し、特異タンパク質がその患者組織に存在するかどうか、またどの形態のタンパク質が存在するかを決定する。さらに、タンパク質または複数のタンパク質の発現レベルを決定し、健常組織に見られる「正常」または参照レベルと比較できる。健常組織に見られるタンパク質の正常または参照レベルは、例えば、がんを持たない1人以上の人の関連組織から由来しうる。または、がんを持つ人の正常または参照レベルは、がんの影響を受けていない関連組織の分析によって得られうる。
1. FASNタンパク質に対するSRM/MRM候補断片ペプチドの特定:
a. タンパク質を消化するために、プロテアーゼ(トリプシンを含むことも含まないこともある)を使用してホルマリン固定生体試料からLiquid TissueTMタンパク質溶解物を調製する。
b. Liquid TissueTM溶解物のすべてのタンパク質断片をイオントラップタンデム質量分析計で分析し、FASNタンパク質からのすべての断片ペプチドを特定するが、 ここでは個別の断片ペプチドは、リン酸化またはグリコシル化などのいかなるペプチド修飾も含まない。
c. Liquid TissueTM溶解物のすべてのタンパク質断片をイオントラップタンデム質量分析計で分析し、例えばリン酸化またはグリコシル化残基などのペプチド修飾を持つFASNタンパク質からのすべての断片ペプチドを特定する。
d. 全長FASNタンパク質の全体から特定の消化方法で生成されたすべてのペプチドを測定できる可能性があるが、SRM/MRMアッセイの開発に使用される好ましいペプチドは、ホルマリン固定生体試料から調製された複合Liquid TissueTMタンパク質溶解物中で直接、質量分析によって特定されるものである。
e. 患者組織で特異的に修飾(リン酸化、グリコシル化など)され、ホルマリン固定生体試料からのLiquid TissueTM溶解物を分析する時、質量分析計内でイオン化され、そのため検出されるペプチドは、FASNタンパク質のペプチド修飾のアッセイのための候補ペプチドとして特定される。
a. Liquid TissueTM溶解物で特定された個別の断片ペプチドに対する三連四重極質量分析計でのSRM/MRMアッセイが、FASNタンパク質からのペプチドに適用される。
i. ゲル電気泳動、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー、または逆相高性能液体クロマトグラフィーを含むがこれに限定されない最適なクロマトグラフィー条件に対して、断片ペプチドの最適保持時間を決定する。
ii. 各ペプチドに対するSRM/MRMアッセイを開発するために、ペプチドのモノアイソトピック質量、各ペプチドの前駆体の荷電状態、各ペプチドの前駆体のm/z値、各ペプチドのm/z遷移イオン、および各断片ペプチドの各遷移イオンのイオン型を決定する。
iii. 次にSRM/MRMアッセイは、(i)および(ii)からの情報を使用して三連四重極質量分析計で実施できるが、ここで各ペプチドは、三連四重極質量分析計で実施した時、固有のSRM/MRMアッセイを正確に定義する特徴および固有SRM/MRM特徴ピークを持つ。
b. SRM/MRM質量分析からの固有SRM/MRM特徴ピーク面積の関数として検出されるFASNタンパク質の断片ペプチドの量が、特定のタンパク質溶解物中のタンパク質の相対的および絶対的量の両方を示すことができるように、SRM/MRM分析を実施する。
i. 相対的定量は以下によって達成しうる。
1. 1つのホルマリン固定生体試料からのLiquid TissueTM溶解物中で検出される所定のFASNペプチドからのSRM/MRM特徴ピーク面積を、少なくとも第二、第三、第四またはそれ以上のホルマリン固定生体試料からの少なくとも第二、第三、第四またはそれ以上のLiquid TissueTM溶解物中の同じFASN断片ペプチドの同じSRM/MRM特徴ピーク面積と比較することによって、FASNタンパク質の存在の増加または減少を決定する。
2. 1つのホルマリン固定生体試料からのLiquid TissueTM溶解物で検出された所定のFASNペプチドからのSRM/MRM特徴ピーク面積を、異なる別の生体起源から由来するその他のサンプルのその他のタンパク質の断片ペプチドから作成されたSRM/MRM特徴ピーク面積と比較することによって、FASNタンパク質の存在の増加または減少を決定するが、ここでペプチド断片に対する2つのサンプル間のSRM/MRM特徴ピーク面積の比較は、各サンプルで分析されたタンパク質の量に対して正規化される。
3. さまざまな細胞条件下で発現レベルが変化しないその他のタンパク質に対してFASNタンパク質の変化するレベルを正規化するために、所定のFASNペプチドに対するSRM/MRM特徴ピーク面積を、ホルマリン固定生体試料の同じLiquid TissueTM溶解物内の異なるタンパク質に由来するその他の断片ペプチドからのSRM/MRM特徴ピーク面積と比較することによって、FASNタンパク質の存在の増加または減少を決定する。
4. これらのアッセイは、FASNタンパク質の未修飾断片ペプチドおよび修飾断片ペプチドの両方に適用でき、修飾には、リン酸化および/またはグリコシル化を含むがこれに限定されず、修飾ペプチドの相対的レベルは、未修飾ペプチドの相対的量を決定するのと同じ方法で決定される。
ii. 所定のペプチドの絶対的定量は、個別の生体試料のFASNタンパク質からの所定の断片ペプチドに対するSRM/MRM特徴ピーク面積を、その生体試料からのタンパク質溶解物に添加した断片ペプチド内部標準のSRM/MRM特徴ピーク面積と比較することによって達成されうる。
1. 内部標準は、調査しているFASNタンパク質からの断片ペプチドの標識合成版である。この標準は既知量をサンプルに混入し、SRM/MRM特徴ピーク面積は、生体試料中の断片ペプチド内部標準および天然断片ペプチドの両方に対して別々に決定して、その後両方のピーク面積を比較できる。
2. 修飾がリン酸化および/またはグリコシル化を含むがこれに限定されず、修飾ペプチドの絶対レベルが未修飾ペプチドの絶対レベルを決定するのと同じ方法で決定できる場合、これは未修飾断片ペプチドおよび修飾断片ペプチドに適用できる。
a. FASNタンパク質の断片ペプチドレベルの相対的および/または絶対的定量を実施し、がん分野でよく知られた、FASNタンパク質発現と患者腫瘍組織のがんの病期/悪性度/状態との以前に決定された関連性が確認されることを実証する。
b. FASNタンパク質の断片ペプチドレベルの相対的および/または絶対的定量を実施し、異なる治療戦略の臨床転帰との相関関係を実証するが、この相関関係は本分野ですでに実証されているか、または患者のコホートおよびこれらの患者からの組織にわたる相関関係研究を通して将来実証できる。以前に確立された相関関係または将来生じる相関関係のいずれかがこのアッセイによって確認されたら、次にこのアッセイ方法を使用して最適な治療戦略を決定できる。
1. 生体試料の脂肪酸シンターゼ(FASN)タンパク質レベルを測定する方法であって、前記生体試料から調製されたタンパク質消化物中の1つ以上の修飾または未修飾FASN断片ペプチドの量を、質量分析を使用して検出および/または定量すること、および前記試料中の修飾または未修飾FASNタンパク質のレベルを計算することを含み、前記量が相対的量または絶対的量である方法。
2. 1つ以上の修飾または未修飾FASN断片ペプチドの量を検出および/または定量する前に、前記タンパク質消化物を分画するステップをさらに含む、実施形態1の方法。
3. 前記分画ステップが、ゲル電気泳動、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー、または逆相高性能液体クロマトグラフィーから成るグループから選択される、実施形態2の方法。
4. 前記生体試料の前記タンパク質消化物がLiquid TissueTMプロトコルによって調製される、実施形態1〜3のいずれかの方法。
5. 前記タンパク質消化物がプロテアーゼ消化物を含む、実施形態1〜3のいずれかの方法。
6. 前記タンパク質消化物がトリプシン消化物を含む、実施形態5の方法。
7. 前記質量分析が、タンデム質量分析、イオントラップ質量分析、三連四重極質量分析、MALDI-TOF質量分析、MALDI質量分析、および/または飛行時間型質量分析を含む、実施形態1〜6のいずれかの方法。
8. 使用される質量分析のモードが、選択反応モニタリング(SRM)、多重反応モニタリング(MRM)、および/または多重選択反応モニタリング(mSRM)、またはその任意の組み合わせである、実施形態7の方法。
9. 1つ以上の修飾または未修飾FASN断片ペプチドが、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、およびSEQ ID NO:11として規定されるものから独立して選択される異なるアミノ酸配列を含む、実施形態1〜8のいずれかの方法。
10. 生体試料が血液サンプル、尿サンプル、血清サンプル、腹水サンプル、喀痰サンプル、リンパ液、唾液サンプル、細胞、または固体組織である、実施形態1〜9のいずれかの方法。
11. 組織がホルマリン固定組織である、実施形態10の方法。
12. 組織がパラフィン包埋組織である、実施形態10または11の方法。
13. 組織が腫瘍から取得される、実施形態10の方法。
14. 腫瘍が原発腫瘍である、実施形態13の方法。
15. 腫瘍が二次腫瘍である、実施形態13の方法。
16. 修飾または未修飾FASN断片ペプチドを定量することをさらに含む、実施形態1〜15のいずれかの方法。
17. FASN断片ペプチドの定量に、1つの生体試料中の、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、またはSEQ ID NO:11として示されるFASNのアミノ酸残基約8〜約45のアミノ酸配列を含む、1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、または5つ以上のFASN断片ペプチドの量を、異なる別個の生体試料中の同じFASN断片ペプチドの量と比較することを含む、実施形態16の方法。
18. 1つ以上のFASN断片ペプチドの定量に、既知量の追加内部標準ペプチドと比較することによって、生体試料中のFASN断片ペプチドのそれぞれの量を決定することを含み、生体試料中のFASN断片ペプチドのそれぞれが、同じアミノ酸配列を持つ内部標準ペプチドと比較される、実施形態17の方法。
19. 内部標準ペプチドが同位体標識ペプチドである、実施形態18の方法。
20. 同位体標識内部標準ペプチドが、18O、17O、34S、15N、13C、2H、またはその任意の組み合わせから選択される1つ以上の安定重同位体を含む、実施形態19の方法。
21. タンパク質消化物中の1つ以上の修飾または未修飾FASN断片ペプチドの量の検出および/または定量が、修飾または未修飾FASNタンパク質の存在および被験者におけるがんとの関連性を示す、実施形態1〜20のいずれかの方法。
22. 1つ以上の修飾または未修飾FASN断片ペプチドの量の前記検出および/または定量の結果、または前記FASNタンパク質の量を、がんの診断病期/悪性度/状態と関連付けることをさらに含む、実施形態21の方法。
23. 1つ以上の修飾または未修飾FASN断片ペプチドの量の前記検出および/または定量の結果、または前記FASNタンパク質の量を、がんの診断病期/悪性度/状態と関連付けることが、その他のタンパク質、またはその他のタンパク質からのペプチドの量の検出および/または定量と多重フォーマットで組み合わされて、がんの診断病期/悪性度/状態についての追加情報を提供する、実施形態22の方法。
24. 前記生体試料が取得された被験者に対して、1つ以上のFASN断片ペプチドの有無またはその量、またはFASNタンパク質の量に基づいて治療を選択することをさらに含む、実施形態1〜23の方法。
25. 前記生体試料が取得された患者に治療有効量の治療薬を投与することをさらに含み、治療薬および/または投与された治療薬の量が、1つ以上の修飾または未修飾FASN断片ペプチドの量またはFASNタンパク質の量に基づいている、実施形態1〜24のいずれか1つに記載の方法。
26. 治療または治療薬が、FASNタンパク質を発現しているがん細胞に対するものである、実施形態24および25の方法。
27. 生体試料が、Liquid TissueTMプロトコルおよび試薬を用いて、1つ以上の修飾または未修飾FASN断片ペプチドの量を定量するために処理されたホルマリン固定腫瘍組織である、実施形態1〜26の方法。
28. 前記1つ以上の修飾または未修飾FASN断片ペプチドが、表1のペプチドの2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、8つ以上、または10以上である、実施形態1〜27のいずれかの方法。
29. 表2のペプチドの1つ、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、8つ以上、または10以上の量を定量することを含む、実施形態1〜28のいずれかの方法。
30. 表1のペプチドまたはその抗体の1つ、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、8つ以上、または10以上を含む組成物であって、前記組成物がFASNの1つ、2つ、3つまたはそれ以上のその他のペプチドを随意に除外する組成物。
31. 表2のペプチドまたはその抗体の1つ、2つ、または3つを含む、実施形態30の組成物。
Claims (31)
- 生体試料の脂肪酸シンターゼ(FASN)タンパク質レベルを測定する方法であって、前記生体試料から調製されたタンパク質消化物中の1つ以上の修飾または未修飾FASN断片ペプチドの量を、質量分析を使用して検出および/または定量すること、および前記試料中の修飾または未修飾FASNタンパク質のレベルを計算することを含み、
前記量が相対的量または絶対的量である方法。 - 1つ以上の修飾または未修飾FASN断片ペプチドの量を検出および/または定量する前に、前記タンパク質消化物を分画するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記分画ステップが、ゲル電気泳動、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー、または逆相高性能液体クロマトグラフィーから成るグループから選択される、請求項2に記載の方法。
- 前記生体試料の前記タンパク質消化物がLiquid TissueTMプロトコルによって調製される、請求項1に記載の方法。
- 前記タンパク質消化物がプロテアーゼ消化物を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記タンパク質消化物がトリプシン消化物を含む、請求項5に記載の方法。
- 前記質量分析が、タンデム質量分析、イオントラップ質量分析、三連四重極質量分析、MALDI-TOF質量分析、MALDI質量分析、および/または飛行時間型質量分析を含む、請求項1に記載の方法。
- 使用される質量分析のモードが、選択反応モニタリング(SRM)、多重反応モニタリング(MRM)、および/または多重選択反応モニタリング(mSRM)、またはその任意の組み合わせである、請求項7に記載の方法。
- 前記1つ以上の修飾または未修飾FASN断片ペプチドが、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、およびSEQ ID NO:11として規定されるものから独立して選択される異なるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記生体試料が血液サンプル、尿サンプル、血清サンプル、腹水サンプル、喀痰サンプル、リンパ液、唾液サンプル、細胞、または固体組織である、請求項1に記載の方法。
- 前記組織がホルマリン固定組織である、請求項10に記載の方法。
- 前記組織がパラフィン包埋組織である、請求項10に記載の方法。
- 前記組織が腫瘍から取得される、請求項10に記載の方法。
- 前記腫瘍が原発腫瘍である、請求項13に記載の方法。
- 前記腫瘍が二次腫瘍である、請求項13に記載の方法。
- 修飾または未修飾FASN断片ペプチドを定量することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記FASN断片ペプチドの定量に、1つの生体試料中の、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、またはSEQ ID NO:11として示されるFASNのアミノ酸残基約8〜約45のアミノ酸配列を含む、1つ以上のFASN断片ペプチドの量を、異なる別個の生体試料中の同じFASN断片ペプチドの量と比較することを含む、請求項16に記載の方法。
- 1つ以上のFASN断片ペプチドの定量に、既知量の追加内部標準ペプチドと比較することによって、生体試料中の前記1つ以上のFASN断片ペプチドのそれぞれの量を決定することを含み、前記生体試料中の前記FASN断片ペプチドのそれぞれが、同じアミノ酸配列を持つ内部標準ペプチドと比較される、請求項17に記載の方法。
- 前記内部標準ペプチドが同位体標識ペプチドである、請求項18に記載の方法。
- 前記同位体標識内部標準ペプチドが、18O、17O、34S、15N、13C、2Hまたはその任意の組み合わせから選択される1つ以上の安定重同位体を含む、請求項19に記載の方法。
- 前記タンパク質消化物中の1つ以上の修飾または未修飾FASN断片ペプチドの量の検出および/または定量が、修飾または未修飾FASNタンパク質の存在および被験者におけるがんとの関連性を示す、請求項1に記載の方法。
- 1つ以上の修飾または未修飾FASN断片ペプチドの量の前記検出および/または定量の結果、または前記FASNタンパク質の量を、前記がんの診断病期/悪性度/状態と関連付けることをさらに含む、請求項21に記載の方法。
- 1つ以上の修飾または未修飾FASN断片ペプチドの量の前記検出および/または定量の結果、または前記FASNタンパク質の量を前記がんの診断病期/悪性度/状態と関連付けることが、その他のタンパク質、またはその他のタンパク質からのペプチドの量の検出および/または定量と多重フォーマットで組み合わされて、前記がんの診断病期/悪性度/状態についての追加情報を提供する、請求項22に記載の方法。
- 前記生体試料が取得された前記被験者に対して、1つ以上のFASN断片ペプチドの有無またはその量、またはFASNタンパク質の量に基づいて治療を選択することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記生体試料が取得された前記患者に治療有効量の治療薬を投与することをさらに含み、前記治療薬および/または投与された前記治療薬の量が、1つ以上の修飾または未修飾FASN断片ペプチドの量またはFASNタンパク質の量に基づいている、請求項1に記載の方法。
- 前記治療または前記治療薬が、前記FASNタンパク質を発現しているがん細胞に対するものである、請求項24に記載の方法。
- 前記生体試料が、Liquid TissueTMプロトコルおよび試薬を用いて、1つ以上の修飾または未修飾FASN断片ペプチドの量を定量するために処理されたホルマリン固定腫瘍組織である、請求項1に記載の方法。
- 前記1つ以上の修飾または未修飾FASN断片ペプチドが、表1のペプチドの2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、8つ以上、または10以上である、請求項1に記載の方法。
- 表2の前記ペプチドの量の定量を含む、請求項1に記載の方法。
- 表1のペプチドまたはその抗体の1つ、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、8つ以上、または10以上を含む組成物。
- 表2のペプチドの1つ、2つ、または3つ、またはそれらペプチドの任意の組み合わせに対する抗体を含む、請求項30に記載の組成物。
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