CN111239416B - 一种与妊娠期肝内胆汁淤积症辅助诊断相关的血清/血浆蛋白质分子标志物及其应用 - Google Patents

一种与妊娠期肝内胆汁淤积症辅助诊断相关的血清/血浆蛋白质分子标志物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种与妊娠期肝内胆汁淤积症辅助诊断相关的血清/血浆蛋白质分子标志物及其应用。一种与ICP辅助诊断相关的血清/血浆蛋白质分子标志物，由S10A9_HUMAN(人S100钙结合蛋白A9)，CHLE_HUMAN(人胆碱酯酶)和APOA1_HUMAN(人载脂蛋白A1)组成。发明人通过分离和研究初产、单胎妊娠的ICP病例和与其年龄匹配的健康孕妇对照血清/血浆中的蛋白质分子标志物，寻找一组与ICP发病高度相关的高特异性和敏感性的蛋白质分子标志物，为ICP的筛查和诊断治疗提供实验室支持。

Description

一种与妊娠期肝内胆汁淤积症辅助诊断相关的血清/血浆蛋 白质分子标志物及其应用
发明领域
本发明属于基因工程及生殖医学领域，涉及一种与妊娠期肝内胆汁淤积症辅助诊断相关的血清/血浆蛋白质分子标志物及其应用。
背景技术
妊娠期肝内胆汁淤积症(Intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP)是一种常见的且严重的妊娠期特发性肝病，通常发生在妊娠中、晚期，临床上以总胆汁酸(TBA)水平升高、肝功能异常及皮肤瘙痒为特征。该病的主要危害是影响围产儿预后，导致早产、羊水粪染、胎儿宫内窘迫，甚至不明原因的胎儿宫内死亡等。ICP在我国的发生率最近估计为1.2％，其中重庆、成都和上海发病率较高，为3.2％-6.3％。大量的流行病学和实验研究表明，ICP的发生主要与雌激素、遗传、免疫和环境因素等有关，但迄今仍没有一种学说可以独立、系统地解释ICP的发病机制
对ICP人群进行早期诊断、早期干预及合理治疗可以有效降低该病的发病风险和母婴并发症，大大降低ICP给母婴和其家庭带来的疾病痛苦和经济压力。目前，上升的血清总胆汁酸(TBA)水平被认为是最为敏感的实验室检测ICP异常的指标，然而，有研究表明血清TBA 水平会随着受试人群的不同而改变，这使得仅仅依据血清总胆汁酸水平作为临床上ICP诊断的生化指标可能并不全面，因此，探索新的、更为精确的适合妊娠期肝内胆汁淤积症的诊断指标迫在眉睫。
蛋白质组学是在高通量水平上的研究，从蛋白质表达水平的变化，不同类型的修饰及蛋白间相互作用等方面入手，探索疾病的发生过程，为筛选疾病的辅助诊断分子标志物提供帮助。目前，蛋白质组学技术在妊娠期相关疾病中的研究逐年增多，包括妊娠期糖尿病，妊娠期高血压等疾病均通过蛋白质组学实验筛选出了有效的诊断标志物，提高了疾病的诊断效率。因此，通过蛋白质组学筛选诊断ICP有效的生物标志物是一个新的，可行的实验手段。目前国、内外还没有用于ICP辅助诊断的较为稳定的生物标志物的报道，若能通过蛋白质组学技术筛选出ICP特异或异常表达的蛋白质分子作为生物标志物，并研制相应的辅助诊断试剂盒，将极大改善我国ICP的诊断现状。
发明内容
本发明的首要目的是针对上述技术问题，提出一组与ICP辅助诊断相关的血清/血浆蛋白质分子标志物。
本发明的第二个目的是提供上述血清/血浆蛋白质分子标志物在制备ICP辅助诊断试剂盒中的应用。
本发明第三个目的是提供用于ICP辅助诊断的试剂盒。
本发明的目的是通过下列技术方案实现的：
一组与ICP辅助诊断相关的血清/血浆蛋白质分子标志物，该标志物选自S10A9_HUMAN (人S100钙结合蛋白A9)，CHLE_HUMAN(人胆碱酯酶)，APOA1_HUMAN(人载脂蛋白 A1)中的任意一种或多种。
作为本发明的一种优选，该标志物选自S10A9_HUMAN，CHLE_HUMAN和 APOA1_HUMAN中的任意两种的组合。
作为本发明的一种优选，该标志物由S10A9_HUMAN，CHLE_HUMAN和 APOA1_HUMAN组成。
本发明所述的血清/血浆蛋白质分子标志物作为检测靶标在制备妊娠期肝内胆汁淤积症血清/血浆辅助诊断试剂盒中的应用。
本发明所述的血清/血浆蛋白质分子标志物的检测试剂在制备妊娠期肝内胆汁淤积症血清 /血浆辅助诊断试剂盒中的应用。
一组妊娠期肝内胆汁淤积症辅助诊断试剂盒，该试剂盒包括检测血清/血浆蛋白质分子标志物S10A9_HUMAN(人S100钙结合蛋白A9)，CHLE_HUMAN(人胆碱酯酶)， APOA1_HUMAN(人载脂蛋白A1)中任意一种或多种的试剂；优选包括检测CHLE_HUMAN (人胆碱酯酶)，APOA1_HUMAN(人载脂蛋白A1)中任意两种的试剂；或者优选检测 S10A9_HUMAN(人S100钙结合蛋白A9)，CHLE_HUMAN(人胆碱酯酶)和APOA1_HUMAN (人载脂蛋白A1)的检测试剂。
本发明的发明点在于发现S10A9_HUMAN(人S100钙结合蛋白A9)，CHLE_HUMAN(人胆碱酯酶)，APOA1_HUMAN(人载脂蛋白A1)中的任意两个、三个可以作为妊娠期肝内胆汁淤积症辅助诊断相关的血清/血浆蛋白质分子标志物。
本发明血清/血浆蛋白分子标志物通过以下方法筛选得到：
1.研究样本的选择
(1)纳入病例组：ICP诊断标准参照ICP患者诊疗指南(第一版)，具体标准如下：1)妊娠中晚期出现皮肤瘙痒，或伴有不同程度的黄疸；2)实验室检查：血清/血浆总胆汁酸(TBA) 增高(>40μmol/L)，或伴转氨酶(ALT及AST)轻到中度升高，可伴胆红素升高；3)妊娠是引起皮肤瘙痒和生化异常的唯一原因；4)患者一般情况良好，无明显呕吐、食欲不佳、虚弱及其他疾病症状；5)分娩后上述症状、体征、血清/血浆生化指标迅速恢复正常。收集临床资料完整的ICP患者50例。
(2)纳入正常对照组：无妊娠并发症及合并症，剖宫产指征为臀位、骨盆异常和社会因素等，收集临床资料完整的正常孕妇50例。
(3)两组排除标准：1)患其它肝胆疾病；2)有其它妊娠并发症如妊娠期高血压疾病或有不能用ICP解释的血、尿或生化异常；3)有全身疾病如糖尿病、高血压、精神及神经疾病等；4)患有遗传性或免疫性疾病；5)有输血、移植或免疫治疗史者；6)有口服避孕药史者。
本研究共采用100例符合标准的样本进行研究。
2.DIA定量蛋白质检测
(1)提取血清/血浆样本中的蛋白质进行预实验
(2)选取预实验中质控合格的样本进行DDA建库
(3)DIA质谱分析
(4)DIA数据分析
3.差异蛋白质验证实验
(1)酶联免疫吸附实验
(2)全自动生化分析仪检测
(3)比较ICP病例与健康对照血清/血浆样本中S10A9_HUMAN、APOA1_HUMAN、ITIH3_HUMAN(人间-α-胰蛋白酶抑制剂重链H3)和CHLE_HUMAN的量的变化。
4.统计分析方法
运用student t检验比较人口学特征，TBA(μmol/L)、ALT(IU/L)、AST(IU/L)水平和蛋白质分子平均表达水平在研究对象组间分布的差异。
我们在探索性样本人群(10例ICP病例和10例健康对照)中运用DIA定量技术的研究结果初步筛选发现12个蛋白质分子上调、19个蛋白质分子下调。验证差异表达的四种蛋白质分子(S10A9_HUMAN、ITIH3_HUMAN、APOA1_HUMAN和CHLE_HUMAN)与ICP 发病情况的关联性。选择每组内至少有一半数据为非空值的数据进行显著性差异分析，筛选表达差异倍数大于1.5倍(上下调)且P value(t test)小于0.05的蛋白质作为差异表达蛋白质。对有统计学显著差异的蛋白质分子在另外50例病例和50例对照中进一步应用酶联免疫吸附实验和全自动生化分析仪进行验证。
统计学分析均应用SPSS16.0统计学分析软件完成。统计学显著性水平P值设为0.05，所有统计学检验均为双侧检验。
以下是本发明进一步的说明：
在上述10例符合条件的ICP病例及10例健康对照中，两组年龄按个体精确匹配。我们将这两组人群作为探索性样本经DIA蛋白质定量检测获得相关结果。
根据DIA蛋白质定量检测，本发明人检测到在“妊娠期肝内胆汁淤积症病例”组和“健康女性对照”组的血清/血浆中存在差异表达(相对于对照组>1.5倍上调或＜0.67倍下调)的蛋白质分子包括：S10A9_HUMAN、ITIH3_HUMAN、CHLE_HUMAN、APOA1_HUMAN等。
选择DIA蛋白质定量检测中在各组样本个体间表达信号相对均一的蛋白质分子用酶联免疫吸附实验和全自动生化分析法进一步验证，以提高检测效率。
满足上述条件的蛋白质分子包括：S10A9_HUMAN、ITIH3_HUMAN、CHLE_HUMAN、APOA1_HUMAN。
酶联免疫吸附实验和全自动生化分析仪检测结果发现在50例ICP病例和50例健康对照中，有3种蛋白质分子在“ICP病例”组和“健康对照”组中的表达情况存在显著性差异(S10A9_HUMAN、CHLE_HUMAN、APOA1_HUMAN)，有1种蛋白质分子在“ICP 病例”组和“健康对照”组中的表达情况无显著性差异(ITIH3_HUMAN)。
多因素Logistic回归分析结果(图1和图2)表明，S10A9_HUMAN、CHLE_HUMAN 和APOA1_HUMAN均与ICP的发病存在着显著关联，这3种蛋白质分子标志物中任意两种及以上的组合作为ICP的生物标记物更加有效。
具体而言，这3种蛋白质分子的组构成的相关诊断试剂盒有助于ICP的早期诊断，为临床医生准确诊断ICP，及时采取防治方案提供支持，从而最大限度地降低ICP导致不良妊娠结局的风险。
本发明的有益效果：
本发明提供的血清/血浆蛋白质分子标志物作为ICP诊断的标志物的优越性在于：
发明人通过分离和研究初产、单胎妊娠的ICP病例和与其年龄匹配的健康孕妇对照血清/血浆中的蛋白质分子，寻找一组与ICP发病高度相关的高特异性和敏感性的蛋白质分子标志物，为ICP的筛查和诊断治疗提供实验室支持。
本发明初期采用DIA蛋白定量技术检测获取疾病特异和异常表达的血清/血浆蛋白分子表达谱，并应用酶联免疫吸附实验和全自动生化分析仪测定的方法在大样本中进行了验证；发现多个蛋白分子联用更具诊断价值。以上方法和策略的应用加速和保证了血清/血浆蛋白质分子生物标志物和诊断试剂盒的应用，也为其他疾病生物标志物的研制提供方法和策略上的借鉴。
本发明通过控制年龄等对疾病发展的影响因素，研究血清/血浆蛋白质分子在ICP诊断的应用前景，阐述异常表达的蛋白质分子对于ICP进展的影响，揭示其对ICP的诊断价值。因此，本发明获得了ICP发病特异性血清/血浆蛋白质分子表达数据库和特异性标志物；通过血清/血浆蛋白质分子标志物和诊断试剂盒的研制和应用，可使得ICP的诊断更加方便易行，为临床医生快速准确诊断ICP及采取治疗措施奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。
附图说明
图1单个血清蛋白质分子的ROC曲线
图2多个血清蛋白质分子指标的ROC曲线
具体实施方式
实施例1样品的收集和样品资料的整理
发明人于2016年10月至2017年9月从南京医科大学附属无锡妇幼保健院收集了大量 ICP患者及健康对照孕妇的外周血样品(用于研究的样本为同期收取，采样、分装、保存条件均一)，通过对样品资料的整理，发明人从中选择了100例符合下列标准的样本作为DIA蛋白质定量检测和后续一系列酶联免疫吸附实验和全自动生化分析仪验证的实验样品：
1、上述研究对象在妊娠中晚期ICP筛查时(参照ICP患者诊疗指南(第一版))确认为ICP的孕妇定义为病例。
2、上述研究对象在妊娠中晚期孕周ICP筛查时未发生ICP，与病例组年龄、孕周匹配的健康孕妇定义为对照。
并系统采集了这些样本的人口学资料、临床资料等情况。
实施例2血清/血浆中蛋白质分子标志物的DIA蛋白质定量检测
将上述符合条件的10例ICP病例和10例健康对照经DIA蛋白质定量检测获得相关结果。具体步骤为：
1.样本制备
1.1将血液标本加入适量SDT裂解液，转移至Lysing Matrix A管中，应用MP匀浆仪进行匀浆破碎(24×2，6.0M/S，60s，两次)。
1.2超声后，沸水浴10min。14000g离心15min，取上清采用0.22μm离心管过滤，收集滤液。
1.3采用BCA法进行蛋白质定量。分装样品，-80℃保存。
2.SDS-PAGE电泳
各样品取蛋白质20μg分别加入6X上样缓冲液，沸水浴5min，进行12％SDS-PAGE 电泳(恒压250V，40min)，考马斯亮蓝染色。
3.FASP酶解
3.1各样品取200ug蛋白质溶液，分别加入DTT至终浓度为100mM，沸水浴5min，冷却至室温。
3.2加入200μL UA buffer混匀，转入30kD超滤离心管中，离心12500g 25min，弃滤液(重复该步骤两次)。
3.3加入100μL IAA buffer(100mM IAA in UA)，600rpm振荡1min，室温避光反应30min，离心12500g 25min。
3.4加入100μL UA buffer离心12500g 15min，重复该步骤两次。
3.5加入100μL 0.1M TEAB溶液，离心12500g 15min，重复该步骤两次。
3.6加入40μL Trypsin buffer(4μg Trypsin in 40μL 0.1M TEAB溶液)，600rpm振荡1min，37℃放置16-18h。
3.7换新收集管，离心12500g 15min；再加入20μL 0.1M TEAB溶液，离心12500g15min，收集滤液。
3.8采用C18Cartridge对肽段进行脱盐，肽段冻干后加入40μL 0.1％甲酸溶液复溶，肽段定量。
4.High PH RP分级
4.1取所有样品的肽段混合物，采用Agilent 1260infinity II HPLC系统进行分级。
4.2缓冲液A液为10mM HCOONH4,5％ACN,pH 10.0，B液为10mM HCOONH4,85％ACN,pH 10.0。色谱柱以A液平衡，样品由自动进样器上样到色谱柱(Waters，XBridge PeptideBEH C18Column,
Figure BDA0002386526690000071
5μm,4.6mm X 100mm)进行分离，流速为1mL/min。
4.3液相梯度如下：使用线性梯度，40min内5％B至45％B，柱温维持在30℃。收集到36个组分，各个组分在真空浓缩仪中干燥待用。将样品冻干后用0.1％甲酸水溶液复溶合并为6个Fraction。
5.DDA质谱建库
5.1从各Fraction中取出6ul加入1ul 10×iRT肽段，混合后进样6ul，用nano-LC分离，经在线电喷雾串联质谱分析。
5.2整套液质串联系统为：1)液相系统：Easy nLC系统(Thermo FisherScientific)2) 质谱系统：Q-Exactive HF-X(Thermo Fisher Scientific)。
5.3缓冲液A液为0.1％甲酸水溶液，B液为0.1％甲酸乙腈水溶液(乙腈为80％)。样品以300nL/min的流速经分析柱(Thermo Fisher Scientific，Acclaim PepMap RSLC 50umX 15cm,nanoviper,P/N164943)中以非线性增长的梯度分离：0-5min，1％B；5-95min，1％B至28％B；95-110min，28％B至38％B；110-115min，38％B至100％B，115-120min，100％ B。电喷雾电压2.0kV。
5.4质谱参数设置如下：(1)MS:scan range(m/z)＝350–1500；resolution＝60,000；AGC target＝3e6；maximum injection time＝30ms；include charge states＝2-7；Filter Dynamic Exclusion: exclusion duration＝30s；(2)dd-MS2:Isolation window＝1.6m/z,resolution＝15,000；AGC target＝1e5；maximum injection time＝45ms；NCE＝28％。
5.5质谱原始数据通过SpectronautPulsar X(version 12,Biognosys AG)合并分析搜库并建立谱图数据库，数据库为:Uniprot_HomoSapiens_20386_20180905，下载时间：2018-09，下载链接：http://www.uniprot.org。设置Trypsin酶解,允许两个漏切位点。搜库参数固定修饰：Carbamidomethyl(C)，可变修饰：Oxidation(M)氧化,acetyl(Protein N-term)蛋白N端乙酰化。建库标准为1％Precursor FDR，1％Protein FDR，1％Peptide FDR。
6.DIA质谱分析
6.1各样品取出6ul加入1ul 10×iRT肽段，混合后进样6ul，用nano-LC分离，经在线电喷雾串联质谱分析。
6.2整套液质串联系统为：1)液相系统：Easy nLC系统(Thermo FisherScientific)2) 质谱系统：Q-Exactive HF-X(Thermo Fisher Scientific)。缓冲液A液为0.1％甲酸水溶液，B 液为0.1％甲酸乙腈水溶液(乙腈为80％)。
6.3样品以300nL/min的流速经分析柱(Thermo Fisher Scientific，AcclaimPepMap RSLC 50um X 15cm,nanoviper,P/N164943)中以非线性增长的梯度分离：0-5min，1％B；5-95min， 1％B至28％B；95-110min，28％B至38％B；110-115min，38％B至100％B，115-120min， 100％B。电喷雾电压2.0kV。
6.4质谱参数设置如下：(1)MS:scan range(m/z)＝350–1500；resolution＝60,000；AGC target＝3e6；maximum injection time＝50ms；(2)DIA:resolution＝15,000；AGC target＝2e5； maximum injection time＝45ms；NCE＝28％。
7.数据分析
选择每组内至少有一半数据为非空值的数据进行显著性差异分析，筛选表达差异倍数大于1.5倍(上下调)且P value(t test)小于0.05的蛋白质作为差异表达蛋白质。
我们在10例ICP病例和10例健康对照中运用DIA蛋白质定量的研究结果初步筛选发现12个蛋白质分子上调和19个蛋白质分子下调。
实施例3血清/血浆中蛋白质分子的验证实验
1.酶联免疫吸附实验
选取符合实施例1条件的50例ICP患者和50例健康对照者，通过酶联免疫吸附实验检测两组血清/血浆样本中蛋白质分子标志物S10A9_HUMAN、ITIH3_HUMAN的表达水平，分析比较其差异，并绘制ROC曲线。具体方法为：
1.1标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列表在小试管中进行稀释。
Figure BDA0002386526690000091
1.2加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
1.3温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
1.4配液：将30倍(48T的20倍)浓缩洗涤液用蒸馏水30倍(48T的20倍)稀释后备用。
1.5洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
1.6加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
1.7温育：操作同1.3。
1.8洗涤：操作同1.5。
1.9显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟。
1.10终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。
1.11测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。
2.全自动生化分析仪定量检测实验
通过全自动生化分析仪定量检测两组血清/血浆样本中蛋白质分子标志物
CHLE_HUMAN、APOA1_HUMAN的表达水平，分析比较其差异，并绘制ROC
曲线。具体方法为：
2.1试剂准备：本试剂为液体双试剂(R1、R2)，可直接上机使用。
2.2测定条件
2.2.1 APOA1_HUMAN测定条件：
Figure BDA0002386526690000101
2.2.2 CHLE_HUMAN测定条件：
Figure BDA0002386526690000102
2.3操作步骤
2.3.1 APOA1_HUMAN操作步骤：
Figure BDA0002386526690000103
2.3.2 CHLE_HUMAN操作步骤
Figure BDA0002386526690000104
Figure BDA0002386526690000111
2.4校准程序：采用试剂盒配套校准品或其他具有溯源性的校准品进行定标测定，在自动分析仪上，采用线性模式建立校准线。
2.5质量控制：首次使用试剂以及每次测定样本前需要检测质控品，建议使用正常值和异常值质控品进行内部质量控制。
2.6结果计算
2.6.1APOA1_HUMAN结果计算：APOA1_HUMAN(g/L)＝CS*△AT/△AS(g/L)
式中：△AT以空白管吸光度作对照的样品管吸光度值；△AS以空白管吸光度作对照的校准管吸光度值；CS校准液中APOA1的浓度。
2.6.2CHLE_HUMAN结果计算：CHLE_HUMAN(U/L)＝△A/分钟 *Vt*1000/13.60*1.0*VS＝△A/分钟*11103。
式中:△A/分钟：△A测定/分钟-△A空白/分钟；Vt：总体积；VS：样本体积。
3.数据处理与分析
运用student t检验比较人口学特征和血清/血浆样本中蛋白质分子标志物S10A9_HUMAN、ITIH3_HUMAN、CHLE_HUMAN、APOA1_HUMAN平均表达水平在研究对象组间分布的差异。
统计学分析均应用SPSS16.0统计学分析软件完成。统计学显著性水平P值设为0.05，所有统计学检验均为双侧检验。
根据验证实验的结果，检测到在“妊娠期肝内胆汁淤积症病例”组和“健康女性对照”组的血清中蛋白质分子标志物S10A9_HUMAN、CHLE_HUMAN、APOA1_HUMAN表达均存在显著差异(P＜0.05)，检测到在“妊娠期肝内胆汁淤积症病例”组和“健康女性对照”组的血清中蛋白质分子标志物ITIH3_HUMAN表达无显著差异(P＞0.05)，结果见表1。
根据验证实验的结果，绘制蛋白质分子标志物S10A9_HUMAN、CHLE_HUMAN、 APOA1_HUMAN每个指标和多个指标的ROC曲线，并计算AUC面积。结果见图1和图2。说明本发明无论单个蛋白质分子标志物还是其组合均具备诊断价值。
表1:验证样本表达结果
Figure BDA0002386526690000121
*Student's t test。

Claims (2)

1.S10A9_HUMAN作为检测靶标在制备妊娠期肝内胆汁淤积症血清/血浆辅助诊断试剂盒中的应用。
2.检测S10A9_HUMAN的试剂在制备妊娠期肝内胆汁淤积症血清/血浆辅助诊断试剂盒中的应用。
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