CN107870245A - 基于唾液蛋白质组学的慢性肾炎生物标志物检测的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于唾液蛋白质组学的慢性肾炎生物标志物检测的方法，具体步骤如下：样品蛋白提取；采用Brad ford法测定提取的蛋白浓度；蛋白酶解；iTRAQ标记；真空冷冻离心干燥；高pH条件下的反相色谱分离；ABI‑5600进行蛋白质分析；质谱数据分析：在选择数据库时，若为已经测序生物，直接选用该物种数据库，若为非测序生物，则选择与被测样品最为相关的大类蛋白质组数据库；采用ABI‑5600型质谱仪进行iTRAQ的质谱分析。本发明能够快速、可靠的蛋白质组学技术方案来发现慢性肾炎中的特异性蛋白标记物，为慢性肾炎早期诊治、术后复发、转移及预后观察建立一种无创、简便、快捷实用的检测评估手段。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物标志物检测方法，具体是一种基于唾液蛋白质组学的慢性肾炎生 物标志物检测的方法。
背景技术
肾炎是肾脏的炎症，可能包括肾小球、肾小管间质，或肾小球和肾小管周围组织，由 免疫介导的、炎症介质(如补体、细胞因子、活性氧等)参与的，最后导致肾固有组织发生炎性改变，引起不同程度肾功能减退的一组肾脏疾病，可由多种病因引起，在慢性过程中也有非免疫、非炎症机制参与。如何诊断肾病,并进行早期干预是临床上迫切需要解决的问题。生物标志物的检测可以实现肾病的早期诊断、患者的预后诊断评估和患者对治疗的反应。目前，肾炎的生物标志物主要以检测尿液中的尿蛋白以及相关的蛋白组学分析为主。尿微量白蛋白，人脂质运载蛋白2，胱抑素C，β微球蛋白等在尿液中的含量检测已 经成为评价肾脏疾病的主要标志物。但这些标志物在尿液中能够检测到时，肾脏已经发生 了损伤，对早期诊断，从而进行相应的治疗干预帮助不大。寻找新的生物标志物，使得能 够早期诊断肾炎，意义重大。由于尿液中的蛋白质与肾脏功能息息相关，尿液中的蛋白质 发生改变，表明肾脏已经发生了损伤，因此，在尿液中找肾炎的生物标志物，没有实际意 义。唾液是人体及其他哺乳动物一种重要且必需的体液,近年,成为除血浆、血清、尿液以 外另一种检测人体生理、病理状态的有效工具。唾液主要由腮腺、舌下腺、下颌下腺三对 大唾液腺和大量口腔黏膜下的小唾液腺分泌，并含有部分非唾液腺来源成分,主要包括龈 沟液、口腔固有菌群及其产物、上呼吸道分泌物、口腔屏障渗透而来的血浆及血细胞、脱 落的口腔上皮细胞以及食物残渣等。安静状态下唾液成分主要来源于舌下腺和颌下腺,而 刺激状态下则主要由腮腺分泌的唾液组成。唾液因其取材方便，无痛苦等特性已被广泛用 于生物标志物的研究。在唾液中寻找肾炎的生物标志物，有可能实现肾炎的早期诊断，以 及对肾炎患者的预后评估有促进作用。
随着人类基因组计划(human genomic project，HGP)的完成，人们逐渐将研究靶向转 变对蛋白质组(proteome)的研究。蛋白质组一词是在1994年由Williams和Wilkins提出， 指基因组编码的所有蛋白质，即某一物种、个体、器官、组织乃至细胞的全部蛋白质，强调基因组对应的所有蛋白质构成的整体。2001年，Nature和Science在公布人类基因组草图的同时，分别发表了Abbott和Fields的评述与展望。随之，蛋白质组学的地位提升到了前所未有的高度，被认为是功能基因组学前沿研究战略的制高点、决胜点。蛋白质组学(proteomics)是一种新兴的科学研究技术，其有别于传统的单个基因或单个蛋白的研究模式，而是从整体水平分析机体或细胞全部蛋白质组成成分、表达、修饰、结构功能和相互 作用，以及蛋白质和核酸之间的相互作用，对生命的复杂活动有全面和本质的认识，从整 体层次上对蛋白质进行动态研究。
蛋白质是生命活动的执行者，是基因表达的产物，其表达、修饰、功能以及彼此相互 作用均受到遗传及环境因素的影响，于是机体出现疾病状态必然会引起蛋白质含量或者存 在形式的变化，这些变化的蛋白质分子可以为临床疾病诊断的物质基础提供依据。蛋白质 组学主要是运用现代先进的检测技术，检测机体从小到一个细胞到大至整个机体的全部基 因所表达的蛋白质的特性，比较分析生理或病理状态、用药及不用药状态下的差异表达蛋 白质，找出不同状态下个体表达差异的蛋白质，从而为生命的物质基础、疾病的早期检测 与诊断等研究寻找分子诊断标志物提供依据。
近年来，随着现代科学及生物化学的微量检测分析技术的发展创新，唾液作为一种临 床容易采集而且操作过程完全没有创伤性的体液逐渐进入了人们研究活动的视角，且具有 无法估计的科研潜力以及临床应用前景。首先，相比血清标本而言，唾液标本的采集更安 全，具有无创性，采集过程中患者无痛苦，易于接受，而且无血源性疾病传播的风险存在； 与尿液标本相比，唾液标本具有可实时采样、更方便的优点。此外，唾液检测需要的样本 量小、成本低、易于储存和运输。最重要的是，唾液标本成分与血液、尿液等体液成分具 有极高的相似性，对疾病诊断具有极强的敏感性和特异性。
唾液是人体常见的一种重要体液，其包涵大量的激素、蛋白质、酶、抗体、补体、细胞因子及各种微生物等血液成分，这些血液成分通过顺浓度梯度被动的跨细胞膜转运或逆浓度梯度的主动转运等途径分泌在唾液当中，且随体内病理生理变化的影响而呈动态变化过程。研究唾液的PH值、电解质、生化指标、微生物、免疫指标、蛋白质等成分变化与 疾病的关系，发现唾液成分的变化可作为疾病诊断、疗效判断、药物监测的参考指标，在 临床疾病的诊治活动中具有重要的潜在应用价值。根据目前的文献资料显示，唾液不仅能 够作为艾滋病、乙型肝炎等传染性疾病、口腔恶性肿瘤及乳腺癌等恶性肿瘤的诊断标志， 而且也可以应用于糖尿病、关节炎、心脏病及肾脏疾病等各个系统疾病的诊断，从而成为 目前西方国家研究者热衷的取代血清学检查的首选标本。
唾液具有消化食物、润滑、防御保护、缓冲、机械清洗、抗菌以及内分泌等生物作用， 而蛋白质和多肽是唾液成分中最主要的具有生物学功能的物质，目前已发现唾液蛋白质和 多肽有2300多种，主要有α-淀粉酶、白蛋白、半胱氨酸蛋白酶、IgA、溶菌酶、乳铁蛋白、黏蛋白等蛋白质，其中有98％的唾液蛋白质是富酪蛋白及转铁蛋白。然而，通过对已发现的唾液蛋白质的功能进行分类，发现功能未知的蛋白质占有28.7％(比例最大)，与免疫 功能相关的蛋白质占21％，与蛋白质复制及修复相关的蛋白质占1.6％，与细胞动力及分泌相关的蛋白质占4.8％，与转录和核糖体相关的蛋白质占2.3％，与细胞繁殖及细胞循环相关的占4.2％，而与信号传导、代谢、细胞骨架及内膜相关的蛋白质分别占9.7％、5.2％、7.1％等。可见，生物功能尚处于未知状态的唾液蛋白质仍占有相当大的比例，需要进一步研究挖掘，且意义重大。新近研究证实，大通量、大精度的蛋白组学技术的应用，使唾液 蛋白质生物标记用于疾病的早期诊断预防、生物蛋白质靶向治疗、预后监测判断等均成为 可能。
发明内容
本发明的目的在于提供一种安全可靠、有效率高的基于唾液蛋白质组学的慢性肾炎生 物标志物检测的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
基于唾液蛋白质组学的慢性肾炎生物标志物检测的方法，具体步骤如下：
(1)样品蛋白提取：样本中加入5％的裂解缓冲液进行涡旋混匀，超声60s，振幅22％ 室温提取30min；15000r/min、4℃离心20min，取出上清；收集上清，分装分装后冻存于-80℃；
(2)蛋白定量：采用Bradford法测定提取的蛋白浓度，先将样本用裂解缓冲液进行一定倍数稀释使其终浓度落在标曲范围内，稀释好的样本和标准品各取10μl分别和300μl蛋白定量染料避光反应20min，用酶标仪同时测定标准品和样本在595nm下的吸光值，根 据标准品每管吸光值和浓度的关系绘制标准曲线，根据曲线公式计算各样品蛋白浓度；
(3)蛋白酶解：蛋白定量后取200μg蛋白溶液置于离心管中；加入4μl还原剂，60℃反应1h；加入2μl的半胱氨酸阻断剂，室温反应10min；将还原烷基化后的蛋白溶液加入 10K的超滤管中，12000r/min离心20min，弃掉收集管底部溶液；加入iTRAQ试剂盒中的 溶液缓冲液100μl，12000转离心20min，弃掉收集管底部溶液，重复3次；更换新的收集 管，在超滤管中加入胰蛋白酶，总量4μg，体积50μl，37℃反应过夜；次日，12000r/min 离心20min，酶解消化后的肽段溶液离心于收集管底部；在超滤管中加入50μl溶解缓冲液， 12000r/min再次离心20min，与上步合并，收集管底部共得到100μl酶解后的样品；
(4)iTRAQ标记：从冰箱中取出iTRAQ试剂，平衡到室温，将iTRAQ试剂离心至 管底；向每管iTRAQ试剂中加入150μl异丙醇，涡旋振荡，离心至管底；取50μl酶解后 的样品转移到新的离心管中；将iTRAQ试剂添加到样品中，涡旋振荡，离心至管底，室 温反应2h；加入100μl水终止反应；从4组样品中各取出1ul混合，用Ziptip脱盐后进行 MALDI-TOF-TOF鉴定，确认标记反应良好；混合标记后的样品，涡旋振荡，离心至管底； 真空冷冻离心干燥；抽干后的样品冷冻保存待用；
(5)高pH条件下的反相色谱分离：所需试剂的调配：流动相A：98％ddH2O，2％乙腈，pH10；流动相B：98％乙腈，2％ddH2O，pH10；ddH2O用氨水调pH值到10；混合 标记后的样品用100ul流动相A溶解，14000r/min离心20min，取上清待用；使用400μg 酶解好的BSA进行分离，检测系统情况；取100ul准备好的样本上样；流速0.7ml/min， 得到分离梯度数据；
(6)ABI-5600进行蛋白质分析：所需试剂的调配：流动相A：100％超纯水，0.1％甲酸；流动相B：100％乙腈，0.1％甲酸；将高pH反相分离得到的组份用20μl2％甲醇，0.1％ 甲酸复溶；12000r/min离心10min，吸取上清上样，上样体积10μl，采取夹心法上样；装 载泵流速350nl/min，15min；分离流速350nl/min，得到分离梯度数据；
(7)质谱数据分析：在选择数据库时，若为已经测序生物，直接选用该物种数据库，若为非测序生物，则选择与被测样品最为相关的大类蛋白质组数据库；采用ABI-5600型 质谱仪进行iTRAQ的质谱分析得到差异表达蛋白；
(8)检测结果：对慢性肾炎和正常对照组进行对比实验，定量蛋白质组学研究结果显示：鉴定1297个蛋白；与正常对照组相比，慢性肾炎中鉴定到的1.5倍以上表达差异的 显著差异蛋白共140个，其中上调蛋白64个，下调蛋白76个；差异蛋白如下：
上调蛋白如下：
1)检索号为P13489，基因注释为Ribonuclease inhibitor；
2)检索号为Q96QR1，基因注释为Secretoglobin family 3A member 1；
3)检索号为P59665，基因注释为Neutrophil defensin 1；
4)检索号为E7EPB3，基因注释为60S ribosomal protein L14；
5)检索号为Q12841，基因注释为Follistatin-related protein 1；
6)检索号为A0A0A0MT74，基因注释为Protein IGKV1-16；
7)检索号为P04746，基因注释为Pancreatic alpha-amylase；
8)检索号为Q5T985，基因注释为Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chainH2；
9)检索号为A0A0A0MTQ6，基因注释为Protein IGKV2D-28；
10)检索号为E9PJK1，基因注释为Tetraspanin；
11)检索号为P68371，基因注释为Tubulin beta-4B chain；
12)检索号为P07437，基因注释为Tubulin beta chain；
13)检索号为P01609，基因注释为Ig kappa chain V-I region Scw；
14)检索号为G3XAM2，基因注释为Complement factor I；
15)检索号为A0A0C4DH35，基因注释为Protein IGHV3-35；
16)检索号为Q9HC84，基因注释为Mucin-5B；
17)检索号为P36955，基因注释为Pigment epithelium-derived factor；
18)检索号为G3XAI7，基因注释为Myosin-binding protein C,slow-type；
19)检索号为P02652，基因注释为Apolipoprotein A-II；
20)检索号为P05546，基因注释为Heparin cofactor 2；
21)检索号为B3KQV6，基因注释为Serine/threonine-protein phosphatase 2A65kDa regulatory subunit A alpha isoform；
22)检索号为Q53FA7，基因注释为Quinone oxidoreductase PIG3；
23)检索号为A0A0B4J1X8，基因注释为Protein IGHV3-43；
24)检索号为Q29718，基因注释为HLA class I histocompatibility antigen,B-82alpha chain；
25)检索号为Q96PD5，基因注释为N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase；
26)检索号为Q07654，基因注释为Trefoil factor 3；
27)检索号为K7ERI9，基因注释为Apolipoprotein C-I；
28)检索号为P02774，基因注释为Vitamin D-binding protein；
29)检索号为Q14508，基因注释为WAP four-disulfide core domain protein 2；
30)检索号为A0A0E3D6N1，基因注释为Protein IGKV1-37(Fragment)OS＝Homosapiens；
31)检索号为A0A087WSY6，基因注释为Protein IGKV3D-15；
32)检索号为E5RG43，基因注释为Carbonic anhydrase 1；
33)检索号为P00739，基因注释为Haptoglobin-related protein；
34)检索号为Q99643，基因注释为Succinate dehydrogenase cytochromeb560subunit ；
35)检索号为P02790，基因注释为Hemopexin；
36)检索号为P68871，基因注释为Hemoglobin subunit beta；
37)检索号为M0R0N1，基因注释为Zinc finger protein 257；
38)检索号为Q13217，基因注释为DnaJ homolog subfamily C member 3；
39)检索号为A0A0G2JPE1，基因注释为Uncharacterized protein；
40)检索号为P25398，基因注释为40S ribosomal protein S12；
41)检索号为Q969G9，基因注释为Protein naked cuticle homolog 1；
42)检索号为A0A0C4DGV7，基因注释为Retinol-binding protein 4；
43)检索号为H0Y2Q8，基因注释为Doublecortin domain-containing protein 1；
44)检索号为P01019，基因注释为Angiotensinogen；
45)检索号为P00738，基因注释为Haptoglobin；
46)检索号为A0A087WYC5，基因注释为Ig gamma-1chain C region OS＝Homosapiens；
47)检索号为P45974，基因注释为Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 5；
48)检索号为A0A0G2JPR0，基因注释为Complement C4-A；
49)检索号为A5A3E0，基因注释为POTE ankyrin domain family member F；
50)检索号为P02647，基因注释为Apolipoprotein A-I；
51)检索号为P02768，基因注释为Serum albumin；
52)检索号为Q6AWB1，基因注释为Dynactin subunit 1；
53)检索号为E9PNW4，基因注释为CD59glycoprotein；
54)检索号为E9PDU6，基因注释为Calponin；
55)检索号为Q5RHS7，基因注释为Protein S100-A2；
56)检索号为I3L397，基因注释为Eukaryotic translation initiation factor5A；
57)检索号为A0A0A0MRA3，基因注释为Titin；
58)检索号为P62873，基因注释为Guanine nucleotide-binding protein G(I)/G(S)/G(T) subunit beta-1；
59)检索号为C9JCI2，基因注释为Protein Wnt；
60)检索号为K7EM38，基因注释为Actin,cytoplasmic 2；
61)检索号为A0A087WVZ3，基因注释为Guanine nucleotide-binding proteinsubunit alpha-11；
62)检索号为P05451，基因注释为Lithostathine-1-alpha；
63)检索号为P02795，基因注释为Metallothionein-2；
64)检索号为A0A087WYL9，基因注释为Ig kappa chain C region；
65)检索号为P27348，基因注释为14-3-3protein theta；
66)检索号为Q15327，基因注释为Ankyrin repeat domain-containing protein1；
67)检索号为P02749，基因注释为Beta-2-glycoprotein 1；
68)检索号为P02763，基因注释为Alpha-1-acid glycoprotein 1；
69)检索号为B4DPG6，基因注释为Gamma-glutamyltransferase 6；
70)检索号为H0Y9E6，基因注释为Centromere protein H；
71)检索号为Q5TH69，基因注释为Brefeldin A-inhibited guanine nucleotide-exchange protein 3；
72)检索号为H0Y897，基因注释为Target of Nesh-SH3；
73)检索号为I3L0K3，基因注释为LisH domain-containing protein FOPNL；
74)检索号为P31151，基因注释为Protein S100-A7；
75)检索号为E9PQ96，基因注释为40S ribosomal protein S3；
76)检索号为P03973，基因注释为Antileukoproteinase；
77)检索号为P80188，基因注释为Neutrophil gelatinase-associatedlipocalin；
78)检索号为P19827，基因注释为Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chainH1；
79)检索号为P04003，基因注释为C4b-binding protein alpha chain；
80)检索号为Q8IWV8，基因注释为E3ubiquitin-protein ligase UBR2；
81)检索号为P11717，基因注释为Cation-independent mannose-6-phosphaterecepto；
82)检索号为C9JXI5，基因注释为Transmembrane protein 198；
83)检索号为A0A0G2JN06，基因注释为Uncharacterized protein；
84)检索号为P01708，基因注释为Ig lambda chain V-II region BUR；
85)检索号为P01042，基因注释为Kininogen-1；
86)检索号为Q86X76，基因注释为Nitrilase homolog 1；
87)检索号为P27169，基因注释为Serum paraoxonase/arylesterase 1；
88)检索号为I3L3N5，基因注释为Platelet-activating factoracetylhydrolase IB subunit alpha；
89)检索号为A0A0G2JMB2，基因注释为Uncharacterized protein；
90)检索号为P01583，基因注释为Interleukin-1alpha；
91)检索号为A0A087WVM2，基因注释为CD177antigen；
92)检索号为P20851，基因注释为C4b-binding protein beta chain；
93)检索号为Q6UXB8，基因注释为Peptidase inhibitor 16；
94)检索号为G3V1M9，基因注释为Basic salivary proline-rich protein 1；
95)检索号为P05160，基因注释为Coagulation factor XIII B chain；
96)检索号为A0A0B4J1Z7，基因注释为Protein IGKV1-39；
97)检索号为O43866，基因注释为CD5antigen-like；
98)检索号为Q8WWX8，基因注释为Sodium/myo-inositol cotransporter 2；
99)检索号为P61769，基因注释为Beta-2-microglobulin；
100)检索号为P08603，基因注释为Complement factor H；
101)检索号为Q9NZ53，基因注释为Podocalyxin-like protein 2；
102)检索号为Q5SRP5，基因注释为Apolipoprotein M；
103)检索号为P02812，基因注释为Basic salivary proline-rich protein 2；
104)检索号为A0A0B4J2H3，基因注释为Protein IGHV2-70；
105)检索号为P08118，基因注释为Beta-microseminoprotein；
106)检索号为X6R6Z1，基因注释为Interleukin enhancer-binding factor 2；
107)检索号为P05109，基因注释为Protein S100-A8；
108)检索号为P02760，基因注释为Protein AMBP；
109)检索号为Q96M27，基因注释为Protein PRRC1；
110)检索号为H7BZG2，基因注释为Polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase 13；
111)检索号为P49643，基因注释为DNA primase large subunit；
112)检索号为H0YLA7，基因注释为Small kinetochore-associated protein；
113)检索号为P26196，基因注释为Probable ATP-dependent RNA helicaseDDX6；
114)检索号为Q9NQW7，基因注释为Xaa-Pro aminopeptidase 1；
115)检索号为P01779，基因注释为Ig heavy chain V-III region TUR；
116)检索号为C9JWK7，基因注释为Alpha-amylase 2B；
117)检索号为A0A0A0MSY2，基因注释为General transcription factor II-Irepeat domain-containing protein 2A；
118)检索号为P62244，基因注释为40S ribosomal protein S15a；
119)检索号为P06702，基因注释为Protein S100-A9；
120)检索号为Q96QK1，基因注释为Vacuolar protein sorting-associatedprotein 35；
121)检索号为P48668，基因注释为Keratin,type II cytoskeletal 6C；
122)检索号为Q5VWK5，基因注释为Interleukin-23receptor；
123)检索号为B1AP58，基因注释为Carboxypeptidase N catalytic chain；
124)检索号为Q9UL25，基因注释为Ras-related protein Rab-21；
125)检索号为P12277，基因注释为Creatine kinase B-type；
126)检索号为C9J7T9，基因注释为Troponin C type 2(Fast),isoform CRA_a；
127)检索号为A0A0G2JQH3，基因注释为Cytoplasmic FMR1-interacting protein1；
128)检索号为H0Y5U4，基因注释为DNA mismatch repair protein Mlh1；
129)检索号为B7WNR0，基因注释为Serum albumin；
130)检索号为A2RRP1，基因注释为Neuroblastoma-amplified sequence；
131)检索号为A0A087WTD2，基因注释为24-hydroxycholesterol 7-alpha-hydroxylase；
132)检索号为H0YKQ2，基因注释为Alpha-mannosidase 2x；
下调蛋白如下：
1)检索号为Q8WX92，基因注释为Negative elongation factor B；
2)检索号为E9PNV5，基因注释为Neuron navigator 2；
3)检索号为P40937，基因注释为Replication factor C subunit 5；
4)检索号为P02808，基因注释为Statherin；
5)检索号为F1T0C9，基因注释为Homeobox protein OTX2；
6)检索号为Q7Z591，基因注释为AT-hook-containing transcription factor；
7)检索号为Q15746，基因注释为Myosin light chain kinase,smooth muscle；
8)检索号为C9JEE0，基因注释为Immunoglobulin lambda-like polypeptide 1；
9)检索号为B7Z4N4，基因注释为Zinc finger protein 346；
10)检索号为Q8IXZ2，基因注释为Zinc finger CCCH domain-containingprotein 3；
11)检索号为Q8IYW2，基因注释为Cilia-and flagella-associated protein 46；
12)检索号为P51948，基因注释为CDK-activating kinase assembly factorMAT1；
13)检索号为F8W0V3，基因注释为Extracellular glycoprotein lacritin；
14)检索号为P24534，基因注释为Elongation factor 1-beta；
15)检索号为H3BM85，基因注释为UPF0235protein C15orf40[H3BM85_HUMAN]；
16)检索号为H0YLF3，基因注释为Beta-2-microglobulin；
17)检索号为H0YN26，基因注释为Acidic leucine-rich nuclearphosphoprotein 32family member A；
18)检索号为P31948，基因注释为Stress-induced-phosphoprotein 1；
19)检索号为P53367，基因注释为Arfaptin-1；
20)检索号为P68032，基因注释为Actin,alpha cardiac muscle 1；
21)检索号为A0A087X185，基因注释为Recombining-binding proteinsuppressor of hairless-like protein；
22)检索号为P62328，基因注释为Thymosin beta-4；
23)检索号为Q9Y2Q0，基因注释为Phospholipid-transporting ATPase IA；
24)检索号为H0YGX7，基因注释为Rho GDP-dissociation inhibitor 2；
25)检索号为Q96C23，基因注释为Aldose 1-epimerase；
26)检索号为E5RIX8，基因注释为Tubulin-specific chaperone A；
27)检索号为G3V5Q9，基因注释为Plasma serine protease inhibitor；
28)检索号为A0A0B4J1V7，基因注释为Protein IGHV7-81；
29)检索号为Q6ZWB5，基因注释为C3orf57；
30)检索号为H7BZN3，基因注释为Telomere-associated protein RIF1；
31)检索号为O43852，基因注释为Calumenin；
32)检索号为P30740，基因注释为Leukocyte elastase inhibitor；
33)检索号为Q5VU61，基因注释为Tropomyosin alpha-3chain；
34)检索号为H0YMB1，基因注释为Regulator of microtubule dynamics protein3；
35)检索号为P98160，基因注释为Basement membrane-specific heparansulfate proteoglycan core protein；
36)检索号为Q5TA02，基因注释为Glutathione S-transferase omega-1；
37)检索号为C9JTV7，基因注释为Ephexin-1；
38)检索号为A0A075B6V5，基因注释为Protein TRAV36DV7；
39)检索号为O75663，基因注释为TIP41-like protein；
40)检索号为H0YIB8，基因注释为2'-5'-oligoadenylate synthase 1；
41)检索号为O75695，基因注释为Protein XRP2；
42)检索号为P61956，基因注释为Small ubiquitin-related modifier 2；
43)检索号为P30044，基因注释为Peroxiredoxin-5；
44)检索号为A0A087WSV8，基因注释为Nucleobindin 2,isoform CRA_b；
45)检索号为C9JH92，基因注释为Quinone oxidoreductase；
46)检索号为Q8WXG9，基因注释为G-protein coupled receptor 98；
47)检索号为P35237，基因注释为Serpin B6；
48)检索号为P07711，基因注释为Cathepsin L1；
49)检索号为S4R3W3，基因注释为Calcium uptake protein 1；
50)检索号为Q99497，基因注释为Protein deglycase DJ-1；
51)检索号为P07737，基因注释为Profilin-1；
52)检索号为P0C0S5，基因注释为Histone H2A.Z；
53)检索号为H7C0J0，基因注释为Neural cell adhesion molecule L1-likeprotein ；
54)检索号为H0YG30，基因注释为Heat shock protein beta-8；
55)检索号为Q3MHB9，基因注释为Short transient receptor potentialchannel 4；
56)检索号为H0YKU1，基因注释为Tropomodulin-3；
57)检索号为Q5T123，基因注释为SH3domain-binding glutamic acid-rich-likeprotein 3；
58)检索号为Q9Y490，基因注释为Talin-1；
59)检索号为Q96TA1，基因注释为Niban-like protein 1；
60)检索号为Q9BYX7，基因注释为Putative beta-actin-like protein 3；
61)检索号为H0Y368，基因注释为Dolichol-phosphate mannosyltransferasesubunit 1；
62)检索号为Q8N474，基因注释为Secreted frizzled-related protein 1；
63)检索号为Q9UIV8，基因注释为Serpin B13；
64)检索号为M0R213，基因注释为Alpha-soluble NSF attachment protein；
65)检索号为P01703，基因注释为Ig lambda chain V-I region NEWM；
66)检索号为B0YJC4，基因注释为Vimentin；
67)检索号为P26038，基因注释为Moesin；
68)检索号为D6RD83，基因注释为Heterogeneous nuclear ribonucleoproteinD0；
69)检索号为A0A0B4J278，基因注释为Alpha-1-antitrypsin；
70)检索号为H3BQF7，基因注释为IST1homolog；
71)检索号为P01771，基因注释为Ig heavy chain V-III region HIL；
72)检索号为A0A0A0MQW3，基因注释为Serpin B13；
73)检索号为A8MVU1，基因注释为Putative neutrophil cytosol factor 1C；
74)检索号为O95498，基因注释为Vascular non-inflammatory molecule 2；
75)检索号为Q9ULZ3，基因注释为Apoptosis-associated speck-like proteincontaining a CARD；
76)检索号为O95716，基因注释为Ras-related protein Rab-3D；
77)检索号为H3BTU6，基因注释为Coronin；
78)检索号为P78559，基因注释为Microtubule-associated protein 1A；
79)检索号为Q9H3M0，基因注释为Potassium voltage-gated channel subfamilyF member 1；
80)检索号为G3V2B9，基因注释为Alpha-1-antitrypsin；
81)检索号为P35527，基因注释为Keratin,type I cytoskeletal 9；
82)检索号为Q92521，基因注释为GPI mannosyltransferase 3；
83)检索号为P80723，基因注释为Brain acid soluble protein 1；
84)检索号为O43505，基因注释为Beta-1,4-glucuronyltransferase 1；
85)检索号为P20700，基因注释为Lamin-B1。
作为本发明进一步的方案：差异表达蛋白通过Gene Ontology程序分析，具有显著的 聚类的1种或多种组合，为肾炎的生物标志物。
作为本发明进一步的方案：差异表达蛋白通过STRING程序进行相关性网络分析，提 示相关性强的蛋白，为肾炎的生物标志物。
作为本发明再进一步的方案：差异表达蛋白通过KEGG进行途径分析，提示参与相关 代谢途径的蛋白为肾炎的生物标志物。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明能够快速、可靠的蛋白质组学技术方案来发现慢性肾炎中的特异性蛋白标记 物，为慢性肾炎早期诊治、术后复发、转移及预后观察建立一种无创、简便、快捷实用的检测评估手段。
附图说明
图1为本发明中iTRAQ定量蛋白质组学实验的基本流程示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
请参阅图1，基于唾液蛋白质组学的慢性肾炎生物标志物检测的方法，具体步骤如下：
(1)样品蛋白提取：样本中加入5％的裂解缓冲液进行涡旋混匀，超声60s，振幅22％ 室温提取30min；15000r/min、4℃离心20min，取出上清；收集上清，分装分装后冻存于-80℃；
(2)蛋白定量：采用Bradford法测定提取的蛋白浓度，先将样本用裂解缓冲液进行一定倍数稀释使其终浓度落在标曲范围内，稀释好的样本和标准品各取10μl分别和300μl蛋白定量染料避光反应20min，用酶标仪同时测定标准品和样本在595nm下的吸光值，根 据标准品每管吸光值和浓度的关系绘制标准曲线，根据曲线公式计算各样品蛋白浓度；
(3)蛋白酶解：蛋白定量后取200μg蛋白溶液置于离心管中；加入4μl还原剂，60℃反应1h；加入2μl的半胱氨酸阻断剂，室温反应10min；将还原烷基化后的蛋白溶液加入 10K的超滤管中，12000r/min离心20min，弃掉收集管底部溶液；加入iTRAQ试剂盒中的 溶液缓冲液100μl，12000转离心20min，弃掉收集管底部溶液，重复3次；更换新的收集 管，在超滤管中加入胰蛋白酶，总量4μg，体积50μl，37℃反应过夜；次日，12000r/min 离心20min，酶解消化后的肽段溶液离心于收集管底部；在超滤管中加入50μl溶解缓冲液， 12000r/min再次离心20min，与上步合并，收集管底部共得到100μl酶解后的样品；
(4)iTRAQ标记：从冰箱中取出iTRAQ试剂，平衡到室温，将iTRAQ试剂离心至 管底；向每管iTRAQ试剂中加入150μl异丙醇，涡旋振荡，离心至管底；取50μl酶解后 的样品转移到新的离心管中；将iTRAQ试剂添加到样品中，涡旋振荡，离心至管底，室 温反应2h；加入100μl水终止反应；从4组样品中各取出1ul混合，用Ziptip脱盐后进行 MALDI-TOF-TOF鉴定，确认标记反应良好；混合标记后的样品，涡旋振荡，离心至管底； 真空冷冻离心干燥；抽干后的样品冷冻保存待用。
(5)高pH条件下的反相色谱分离：所需试剂的调配：流动相A：98％ddH2O，2％乙腈，pH10；流动相B：98％乙腈，2％ddH2O，pH10；ddH2O用氨水调pH值到10；混合 标记后的样品用100ul流动相A溶解，14000r/min离心20min，取上清待用；使用400μg 酶解好的BSA进行分离，检测系统情况；取100ul准备好的样本上样；流速0.7ml/min， 得到分离梯度数据；
(6)ABI-5600进行蛋白质分析：所需试剂的调配：流动相A：100％超纯水，0.1％甲酸；流动相B：100％乙腈，0.1％甲酸；将高pH反相分离得到的组份用20μl2％甲醇，0.1％ 甲酸复溶；12000r/min离心10min，吸取上清上样，上样体积10μl，采取夹心法上样；装 载泵流速350nl/min，15min；分离流速350nl/min，得到分离梯度数据；
(7)质谱数据分析：在选择数据库时，若为已经测序生物，直接选用该物种数据库，若为非测序生物，则选择与被测样品最为相关的大类蛋白质组数据库；采用ABI-5600型 质谱仪进行iTRAQ的质谱分析采用ABI-5600型质谱仪进行iTRAQ的质谱分析得到差异 表达蛋白。
进一步的，差异表达蛋白通过Gene Ontology程序分析，具有显著的聚类的1种或多 种组合，为肾炎的生物标志物。
进一步的，差异表达蛋白通过STRING程序进行相关性网络分析，提示相关性强的蛋 白，为肾炎的生物标志物。
进一步的，差异表达蛋白通过KEGG进行途径分析，提示参与相关代谢途径的蛋白为 肾炎的生物标志物。
iTRAQ技术是一种同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relativeand absolute quantitation，iTRAQ)技术，可用于蛋白质的相对和绝对定量研究。本研究是基于iTRAQ 技术，联合串联质谱蛋白质组学方法((liquid chromatography coupledwith tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)，主要目的是通过慢性肾炎与正常健康人群对照，定量检测唾液 中的差异蛋白表达情况，同时为进一步筛选与慢性肾炎证候相关的蛋白质或蛋白质组提供 研究参考，从蛋白水平研究慢性肾炎的证候本质。
1.材料与方法
1.1病例选择
1.1.1诊断标准
(1)疾病诊断标准
慢性肾炎的诊断根据《内科学》的诊断标准。
1.2病例资料
本研究自2014年12月-2015年04月共收集符合诊断和纳入标准的慢性肾炎患者11例，全部病例来源于湖南省肿瘤医院胃十二指肠胰腺外科，均经病理检查确诊。患者年龄24-73岁，中位年龄56岁，男39例，女18例，肿瘤类型(低分化腺癌35例，中-低分化 腺癌5例，高分化腺癌1例，中分化腺癌2例，其他类型14例)。正常对照组45例，其 中男28例，女17例，年龄23—72岁，中位年龄52岁，均来自于湖南中医药大学附属第 一医院体检科健康自愿者。该研究方案符合人体试验伦理学标准，并得到伦理委员会的批 准，受试者在受试前已知情，且获得书面同意。
1.3分组设计
慢性肾炎组VS正常对照组，为减少实验误差，慢性肾炎组和正常对照组各进行2组技术重复。
1.4主要仪器及试剂耗材
1.4.1主要仪器(表1)
表1主要仪器
1.4.2主要试剂与耗材(表2)
表2主要试剂与耗材
1.5实验方法与技术
1.5.1取材
按照本课题专用临床观察表进行临床观察记录。取材前一天晚上临睡前清水漱口三次 (不再进任何食物和药物)，采用非刺激性唾液采集方式，第二天晨起后漱口前空腹取材。 由经过培训的课题组专人取材，前5min内的唾液自然吞下后开始收集，患者将已经过消 毒的无菌小圆柱形棉花含入口中，口腔唾液积聚至一定量后，将该棉花吐入置于冰浴中的 15mL唾液离心管内，4℃下静置1h后，3000r/min、4℃下离心10min，冰浴上分装在1mLEP管中，每管200μL，于-80℃冰箱冷冻保存。实验时取出样本，冰上解冻，所有检测唾液样 本均1次冻融。
1.5.2iTRAQ工作流程
1.5.2.1样本处理及iTRAQ定量实验流程
如图1所示：(1)样品蛋白提取；(2)蛋白定量；(3)蛋白酶解；(4)iTRAQ标 记；(5)高pH条件下的反相色谱分离；(6)ABI-5600进行蛋白质分析；(7)质谱数 据分析。
1.5.2.2样品蛋白提取过程
①样本中加入适量裂解缓冲液(7M尿素，2M硫脲，0.1％CHAPS)，涡旋混匀；
②超声60s，0.2son、2soff，振幅22％；
③室温提取30min；
④15000r/min、4℃离心20min，小心取出上清；
⑤收集上清，分装分装后冻存于-80℃。
1.5.2.3蛋白定量
采用Bradford法[Marion M.Bradford.Analytical Biochemistry，1976，72:248-254]测定 提取的蛋白浓度。先将样本用裂解缓冲液进行一定倍数稀释使其终浓度落在标曲范围内， 稀释好的样本和标准品(将BSA用裂解缓冲液溶解成系列浓度的标准蛋白)各取10μl分 别和300μl蛋白定量染料避光反应20min，用酶标仪同时测定标准品和样本在595nm下的 吸光值(见表1)，根据标准品每管吸光值和浓度的关系绘制标准曲线。根据曲线公式计 算各样品蛋白浓度。
1.5.2.4蛋白酶解(Filter Aided Sample Preparation，FASP)
①蛋白定量后取200μg蛋白溶液置于离心管中。
②加入4μl还原剂，60℃反应1h。
③加入2μl半胱氨酸阻断剂，室温10min。
④将还原烷基化后的蛋白溶液加入10K的超滤管中，12000r/min离心20min，弃掉收 集管底部溶液。
⑤加入iTRAQ试剂盒中的溶解缓冲液100μl，12000r/min离心20min，弃掉收集管底部溶液，重复3次(为节省试剂，这步可以将溶解缓冲液用水稀释5倍后使用)。
⑥更换新的收集管，在超滤管中加入胰蛋白酶，总量4μg(与蛋白质量比1:50)，体积50μl，37℃反应过夜。
⑦次日，12000r/min离心20min，酶解消化后的肽段溶液离心于收集管底部。
⑧在超滤管中加入50μl溶解缓冲液5，12000r/min再次离心20min，与上步合并，收集管底部共得到100μl酶解后的样品。
1.5.2.5iTRAQ标记
1.5.2.5.1iTRAQ标记实验步骤
①从冰箱中取出iTRAQ试剂，平衡到室温，将试剂离心至管底。
②向每管试剂中加入150μl异丙醇，涡旋振荡，离心至管底。
③取50μl样品(100μg酶解产物)转移到新的离心管中。
④将iTRAQ试剂填加到样品中，涡旋振荡，离心至管底，室温反应2h。
⑤加入100μl水终止反应。
⑥为了检测标记效率及定量准确性，从4组样品中各取出1ul混合，用Ziptip脱盐后 进行MALDI-TOF-TOF(ABSCIEX4800Plus)鉴定，确认标记反应良好。
⑦混合标记后的样品，涡旋振荡，离心至管底。
⑧真空冷冻离心干燥。
⑨抽干后的样品冷冻保存待用。
1.5.2.5.2样品标记情况(表3)
表3样品标记情况
1.5.2.6酶解肽段离线预分离及LC-MS/MS质谱分析
1.5.2.6.1高pH条件下的反相色谱分离
(1)所需试剂的调配
流动相A：98％ddH2O，2％乙腈(pH10)
流动相B：98％乙腈，2％ddH2O(pH10)
ddH2O用氨水调pH值到10。
(2)实验步骤
①混合标记后的样品用100ul流动相A溶解，14000r/min离心20min，取上清待用。
②使用400μg酶解好的BSA进行分离(柱温45℃，检测波长214nm)，检测系统情 况。
③取100ul准备好的样本上样。
④流速0.7ml/min，分离梯度如下(表4)：
表4第一次分离梯度
| 时间(min) | 流动相B比例(％) |
| 0 | 5 |
| 5 | 8 |
| 35 | 18 |
| 62 | 32 |
| 64 | 95 |
| 68 | 95 |
| 72 | 5 |
1.5.2.6.2ABI-5600质谱进行蛋白质分析
(1)所需试剂的调配
流动相A：100％超纯水，0.1％甲酸
流动相B：100％乙腈，0.1％甲酸
(2)实验步骤
①将高pH反相分离得到的组份用20μl2％甲醇，0.1％甲酸复溶。
②12000r/min离心10min，吸取上清上样。
③上样体积10μl，采取夹心法上样。
④装载泵流速350nl/min，15min。
⑤分离流速350nl/min，分离梯度如下(表5)：
表5第二次分离梯度
| 时间(min) | 流动相B比例(％) |
| 0 | 4 |
| 5 | 15 |
| 40 | 25 |
| 65 | 35 |
| 70 | 95 |
| 82 | 95 |
| 85 | 4 |
| 90 | 4 |
(3)质谱参数设置
a)离子源参数：
喷涂电压：2.1kv；毛细管温度：250℃；离子源：简单喷雾源；DP：100；
b)Full MS：分辨率：70000FWHM；全扫描控制目标：1e6；全扫描Max.IT：60ms； 扫描范围：350-1800m/z；
c)dd-MS2：分辨率：17500FWHM；AGC目标：5e6；最大IT：70ms；强度阈值： 5.00E+03；破碎方法：HCD；NCE：29％；TopN：20。
1.5.2.7质谱数据分析
(1)数据库
数据库的选择是以所需物种、数据库注释完备性及序列可靠性为参考依据的。在选择 数据库时，遵循如下原则，若为已经测序生物，直接选用该物种数据库，若为非测序生物， 则选择与被测样品最为相关的大类蛋白质组数据库。本次使用数据库uniprot数据库。
(2)检索软件
iTRAQ的质谱分析是由ABI-5600型质谱完成，产生的质谱原始文件采用ABI公司的配套商用软件Protein Pilot处理。
2.结果
经iTRAQ检出蛋白的数据，通过疾病组与对照组对比，对比值<0.67，认为是蛋白表达下调，对比值>1.5，认为是蛋白表达上调。经数据处理后结果显示，检测到肾炎病人的 差异蛋白表达，共有85个蛋白下调，132个蛋白上调。这些差异蛋白表达的1个或者多个 的组合，可为诊断肾炎的生物标志物。
差异蛋白如下：
上调蛋白如下：
1)检索号为P13489，基因注释为Ribonuclease inhibitor；
2)检索号为Q96QR1，基因注释为Secretoglobin family 3A member 1；
3)检索号为P59665，基因注释为Neutrophil defensin 1；
4)检索号为E7EPB3，基因注释为60S ribosomal protein L14；
5)检索号为Q12841，基因注释为Follistatin-related protein 1；
6)检索号为A0A0A0MT74，基因注释为Protein IGKV1-16；
7)检索号为P04746，基因注释为Pancreatic alpha-amylase；
8)检索号为Q5T985，基因注释为Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chainH2；
9)检索号为A0A0A0MTQ6，基因注释为Protein IGKV2D-28；
10)检索号为E9PJK1，基因注释为Tetraspanin；
11)检索号为P68371，基因注释为Tubulin beta-4B chain；
12)检索号为P07437，基因注释为Tubulin beta chain；
13)检索号为P01609，基因注释为Ig kappa chain V-I region Scw；
14)检索号为G3XAM2，基因注释为Complement factor I；
15)检索号为A0A0C4DH35，基因注释为Protein IGHV3-35；
16)检索号为Q9HC84，基因注释为Mucin-5B；
17)检索号为P36955，基因注释为Pigment epithelium-derived factor；
18)检索号为G3XAI7，基因注释为Myosin-binding protein C,slow-type；
19)检索号为P02652，基因注释为Apolipoprotein A-II；
20)检索号为P05546，基因注释为Heparin cofactor 2；
21)检索号为B3KQV6，基因注释为Serine/threonine-protein phosphatase 2A65kDa regulatory subunit A alpha isoform；
22)检索号为Q53FA7，基因注释为Quinone oxidoreductase PIG3；
23)检索号为A0A0B4J1X8，基因注释为Protein IGHV3-43；
24)检索号为Q29718，基因注释为HLA class I histocompatibility antigen,B-82alpha chain；
25)检索号为Q96PD5，基因注释为N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase；
26)检索号为Q07654，基因注释为Trefoil factor 3；
27)检索号为K7ERI9，基因注释为Apolipoprotein C-I；
28)检索号为P02774，基因注释为Vitamin D-binding protein；
29)检索号为Q14508，基因注释为WAP four-disulfide core domain protein 2；
30)检索号为A0A0E3D6N1，基因注释为Protein IGKV1-37(Fragment)OS＝Homosapiens；
31)检索号为A0A087WSY6，基因注释为Protein IGKV3D-15；
32)检索号为E5RG43，基因注释为Carbonic anhydrase 1；
33)检索号为P00739，基因注释为Haptoglobin-related protein；
34)检索号为Q99643，基因注释为Succinate dehydrogenase cytochromeb560subunit ；
35)检索号为P02790，基因注释为Hemopexin；
36)检索号为P68871，基因注释为Hemoglobin subunit beta；
37)检索号为M0R0N1，基因注释为Zinc finger protein 257；
38)检索号为Q13217，基因注释为DnaJ homolog subfamily C member 3；
39)检索号为A0A0G2JPE1，基因注释为Uncharacterized protein；
40)检索号为P25398，基因注释为40S ribosomal protein S12；
41)检索号为Q969G9，基因注释为Protein naked cuticle homolog 1；
42)检索号为A0A0C4DGV7，基因注释为Retinol-binding protein 4；
43)检索号为H0Y2Q8，基因注释为Doublecortin domain-containing protein 1；
44)检索号为P01019，基因注释为Angiotensinogen；
45)检索号为P00738，基因注释为Haptoglobin；
46)检索号为A0A087WYC5，基因注释为Ig gamma-1chain C region OS＝Homosapiens；
47)检索号为P45974，基因注释为Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 5；
48)检索号为A0A0G2JPR0，基因注释为Complement C4-A；
49)检索号为A5A3E0，基因注释为POTE ankyrin domain family member F；
50)检索号为P02647，基因注释为Apolipoprotein A-I；
51)检索号为P02768，基因注释为Serum albumin；
52)检索号为Q6AWB1，基因注释为Dynactin subunit 1；
53)检索号为E9PNW4，基因注释为CD59glycoprotein；
54)检索号为E9PDU6，基因注释为Calponin；
55)检索号为Q5RHS7，基因注释为Protein S100-A2；
56)检索号为I3L397，基因注释为Eukaryotic translation initiation factor5A；
57)检索号为A0A0A0MRA3，基因注释为Titin；
58)检索号为P62873，基因注释为Guanine nucleotide-binding protein G(I)/G(S)/G(T) subunit beta-1；
59)检索号为C9JCI2，基因注释为Protein Wnt；
60)检索号为K7EM38，基因注释为Actin,cytoplasmic 2；
61)检索号为A0A087WVZ3，基因注释为Guanine nucleotide-binding proteinsubunit alpha-11；
62)检索号为P05451，基因注释为Lithostathine-1-alpha；
63)检索号为P02795，基因注释为Metallothionein-2；
64)检索号为A0A087WYL9，基因注释为Ig kappa chain C region；
65)检索号为P27348，基因注释为14-3-3protein theta；
66)检索号为Q15327，基因注释为Ankyrin repeat domain-containing protein1；
67)检索号为P02749，基因注释为Beta-2-glycoprotein 1；
68)检索号为P02763，基因注释为Alpha-1-acid glycoprotein 1；
69)检索号为B4DPG6，基因注释为Gamma-glutamyltransferase 6；
70)检索号为H0Y9E6，基因注释为Centromere protein H；
71)检索号为Q5TH69，基因注释为Brefeldin A-inhibited guanine nucleotide-exchange protein 3；
72)检索号为H0Y897，基因注释为Target of Nesh-SH3；
73)检索号为I3L0K3，基因注释为LisH domain-containing protein FOPNL；
74)检索号为P31151，基因注释为Protein S100-A7；
75)检索号为E9PQ96，基因注释为40S ribosomal protein S3；
76)检索号为P03973，基因注释为Antileukoproteinase；
77)检索号为P80188，基因注释为Neutrophil gelatinase-associatedlipocalin；
78)检索号为P19827，基因注释为Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chainH1；
79)检索号为P04003，基因注释为C4b-binding protein alpha chain；
80)检索号为Q8IWV8，基因注释为E3ubiquitin-protein ligase UBR2；
81)检索号为P11717，基因注释为Cation-independent mannose-6-phosphaterecepto；
82)检索号为C9JXI5，基因注释为Transmembrane protein 198；
83)检索号为A0A0G2JN06，基因注释为Uncharacterized protein；
84)检索号为P01708，基因注释为Ig lambda chain V-II region BUR；
85)检索号为P01042，基因注释为Kininogen-1；
86)检索号为Q86X76，基因注释为Nitrilase homolog 1；
87)检索号为P27169，基因注释为Serum paraoxonase/arylesterase 1；
88)检索号为I3L3N5，基因注释为Platelet-activating factoracetylhydrolase IB subunit alpha；
89)检索号为A0A0G2JMB2，基因注释为Uncharacterized protein；
90)检索号为P01583，基因注释为Interleukin-1alpha；
91)检索号为A0A087WVM2，基因注释为CD177antigen；
92)检索号为P20851，基因注释为C4b-binding protein beta chain；
93)检索号为Q6UXB8，基因注释为Peptidase inhibitor 16；
94)检索号为G3V1M9，基因注释为Basic salivary proline-rich protein 1；
95)检索号为P05160，基因注释为Coagulation factor XIII B chain；
96)检索号为A0A0B4J1Z7，基因注释为Protein IGKV1-39；
97)检索号为O43866，基因注释为CD5antigen-like；
98)检索号为Q8WWX8，基因注释为Sodium/myo-inositol cotransporter 2；
99)检索号为P61769，基因注释为Beta-2-microglobulin；
100)检索号为P08603，基因注释为Complement factor H；
101)检索号为Q9NZ53，基因注释为Podocalyxin-like protein 2；
102)检索号为Q5SRP5，基因注释为Apolipoprotein M；
103)检索号为P02812，基因注释为Basic salivary proline-rich protein 2；
104)检索号为A0A0B4J2H3，基因注释为Protein IGHV2-70；
105)检索号为P08118，基因注释为Beta-microseminoprotein；
106)检索号为X6R6Z1，基因注释为Interleukin enhancer-binding factor 2；
107)检索号为P05109，基因注释为Protein S100-A8；
108)检索号为P02760，基因注释为Protein AMBP；
109)检索号为Q96M27，基因注释为Protein PRRC1；
110)检索号为H7BZG2，基因注释为Polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase 13；
111)检索号为P49643，基因注释为DNA primase large subunit；
112)检索号为H0YLA7，基因注释为Small kinetochore-associated protein；
113)检索号为P26196，基因注释为Probable ATP-dependent RNA helicaseDDX6；
114)检索号为Q9NQW7，基因注释为Xaa-Pro aminopeptidase 1；
115)检索号为P01779，基因注释为Ig heavy chain V-III region TUR；
116)检索号为C9JWK7，基因注释为Alpha-amylase 2B；
117)检索号为A0A0A0MSY2，基因注释为General transcription factor II-Irepeat domain-containing protein 2A；
118)检索号为P62244，基因注释为40S ribosomal protein S15a；
119)检索号为P06702，基因注释为Protein S100-A9；
120)检索号为Q96QK1，基因注释为Vacuolar protein sorting-associatedprotein 35；
121)检索号为P48668，基因注释为Keratin,type II cytoskeletal 6C；
122)检索号为Q5VWK5，基因注释为Interleukin-23receptor；
123)检索号为B1AP58，基因注释为Carboxypeptidase N catalytic chain；
124)检索号为Q9UL25，基因注释为Ras-related protein Rab-21；
125)检索号为P12277，基因注释为Creatine kinase B-type；
126)检索号为C9J7T9，基因注释为Troponin C type 2(Fast),isoform CRA_a；
127)检索号为A0A0G2JQH3，基因注释为Cytoplasmic FMR1-interacting protein1；
128)检索号为H0Y5U4，基因注释为DNA mismatch repair protein Mlh1；
129)检索号为B7WNR0，基因注释为Serum albumin；
130)检索号为A2RRP1，基因注释为Neuroblastoma-amplified sequence；
131)检索号为A0A087WTD2，基因注释为24-hydroxycholesterol 7-alpha-hydroxylase；
132)检索号为H0YKQ2，基因注释为Alpha-mannosidase 2x；
下调蛋白如下：
1)检索号为Q8WX92，基因注释为Negative elongation factor B；
2)检索号为E9PNV5，基因注释为Neuron navigator 2；
3)检索号为P40937，基因注释为Replication factor C subunit 5；
4)检索号为P02808，基因注释为Statherin；
5)检索号为F1T0C9，基因注释为Homeobox protein OTX2；
6)检索号为Q7Z591，基因注释为AT-hook-containing transcription factor；
7)检索号为Q15746，基因注释为Myosin light chain kinase,smooth muscle；
8)检索号为C9JEE0，基因注释为Immunoglobulin lambda-like polypeptide 1；
9)检索号为B7Z4N4，基因注释为Zinc finger protein 346；
10)检索号为Q8IXZ2，基因注释为Zinc finger CCCH domain-containingprotein 3；
11)检索号为Q8IYW2，基因注释为Cilia-and flagella-associated protein 46；
12)检索号为P51948，基因注释为CDK-activating kinase assembly factorMAT1；
13)检索号为F8W0V3，基因注释为Extracellular glycoprotein lacritin；
14)检索号为P24534，基因注释为Elongation factor 1-beta；
15)检索号为H3BM85，基因注释为UPF0235protein C15orf40[H3BM85_HUMAN]；
16)检索号为H0YLF3，基因注释为Beta-2-microglobulin；
17)检索号为H0YN26，基因注释为Acidic leucine-rich nuclearphosphoprotein 32family member A；
18)检索号为P31948，基因注释为Stress-induced-phosphoprotein 1；
19)检索号为P53367，基因注释为Arfaptin-1；
20)检索号为P68032，基因注释为Actin,alpha cardiac muscle 1；
21)检索号为A0A087X185，基因注释为Recombining-binding proteinsuppressor of hairless-like protein；
22)检索号为P62328，基因注释为Thymosin beta-4；
23)检索号为Q9Y2Q0，基因注释为Phospholipid-transporting ATPase IA；
24)检索号为H0YGX7，基因注释为Rho GDP-dissociation inhibitor 2；
25)检索号为Q96C23，基因注释为Aldose 1-epimerase；
26)检索号为E5RIX8，基因注释为Tubulin-specific chaperone A；
27)检索号为G3V5Q9，基因注释为Plasma serine protease inhibitor；
28)检索号为A0A0B4J1V7，基因注释为Protein IGHV7-81；
29)检索号为Q6ZWB5，基因注释为C3orf57；
30)检索号为H7BZN3，基因注释为Telomere-associated protein RIF1；
31)检索号为O43852，基因注释为Calumenin；
32)检索号为P30740，基因注释为Leukocyte elastase inhibitor；
33)检索号为Q5VU61，基因注释为Tropomyosin alpha-3chain；
34)检索号为H0YMB1，基因注释为Regulator of microtubule dynamics protein3；
35)检索号为P98160，基因注释为Basement membrane-specific heparansulfate proteoglycan core protein；
36)检索号为Q5TA02，基因注释为Glutathione S-transferase omega-1；
37)检索号为C9JTV7，基因注释为Ephexin-1；
38)检索号为A0A075B6V5，基因注释为Protein TRAV36DV7；
39)检索号为O75663，基因注释为TIP41-like protein；
40)检索号为H0YIB8，基因注释为2'-5'-oligoadenylate synthase 1；
41)检索号为O75695，基因注释为Protein XRP2；
42)检索号为P61956，基因注释为Small ubiquitin-related modifier 2；
43)检索号为P30044，基因注释为Peroxiredoxin-5；
44)检索号为A0A087WSV8，基因注释为Nucleobindin 2,isoform CRA_b；
45)检索号为C9JH92，基因注释为Quinone oxidoreductase；
46)检索号为Q8WXG9，基因注释为G-protein coupled receptor 98；
47)检索号为P35237，基因注释为Serpin B6；
48)检索号为P07711，基因注释为Cathepsin L1；
49)检索号为S4R3W3，基因注释为Calcium uptake protein 1；
50)检索号为Q99497，基因注释为Protein deglycase DJ-1；
51)检索号为P07737，基因注释为Profilin-1；
52)检索号为P0C0S5，基因注释为Histone H2A.Z；
53)检索号为H7C0J0，基因注释为Neural cell adhesion molecule L1-likeprotein ；
54)检索号为H0YG30，基因注释为Heat shock protein beta-8；
55)检索号为Q3MHB9，基因注释为Short transient receptor potentialchannel 4；
56)检索号为H0YKU1，基因注释为Tropomodulin-3；
57)检索号为Q5T123，基因注释为SH3domain-binding glutamic acid-rich-likeprotein 3；
58)检索号为Q9Y490，基因注释为Talin-1；
59)检索号为Q96TA1，基因注释为Niban-like protein 1；
60)检索号为Q9BYX7，基因注释为Putative beta-actin-like protein 3；
61)检索号为H0Y368，基因注释为Dolichol-phosphate mannosyltransferasesubunit 1；
62)检索号为Q8N474，基因注释为Secreted frizzled-related protein 1；
63)检索号为Q9UIV8，基因注释为Serpin B13；
64)检索号为M0R213，基因注释为Alpha-soluble NSF attachment protein；
65)检索号为P01703，基因注释为Ig lambda chain V-I region NEWM；
66)检索号为B0YJC4，基因注释为Vimentin；
67)检索号为P26038，基因注释为Moesin；
68)检索号为D6RD83，基因注释为Heterogeneous nuclear ribonucleoproteinD0；
69)检索号为A0A0B4J278，基因注释为Alpha-1-antitrypsin；
70)检索号为H3BQF7，基因注释为IST1homolog；
71)检索号为P01771，基因注释为Ig heavy chain V-III region HIL；
72)检索号为A0A0A0MQW3，基因注释为Serpin B13；
73)检索号为A8MVU1，基因注释为Putative neutrophil cytosol factor 1C；
74)检索号为O95498，基因注释为Vascular non-inflammatory molecule 2；
75)检索号为Q9ULZ3，基因注释为Apoptosis-associated speck-like proteincontaining a CARD；
76)检索号为O95716，基因注释为Ras-related protein Rab-3D；
77)检索号为H3BTU6，基因注释为Coronin；
78)检索号为P78559，基因注释为Microtubule-associated protein 1A；
79)检索号为Q9H3M0，基因注释为Potassium voltage-gated channel subfamilyF member 1；
80)检索号为G3V2B9，基因注释为Alpha-1-antitrypsin；
81)检索号为P35527，基因注释为Keratin,type I cytoskeletal 9；
82)检索号为Q92521，基因注释为GPI mannosyltransferase 3；
83)检索号为P80723，基因注释为Brain acid soluble protein 1；
84)检索号为O43505，基因注释为Beta-1,4-glucuronyltransferase 1；
85)检索号为P20700，基因注释为Lamin-B1。
进一步的，通过Gene Ontology程序分析，差异表达的蛋白，具有显著的聚类的1种或多种组合，更能为作肾炎的生物标志物。
进一步的，差异表达的蛋白通过STRING程序进行相关性网络分析，提示相关性较强 的蛋白，更可能与肾炎的疾病相关。
进一步的，差异表达的蛋白通过KEGG进行途径分析，提示有蛋白参与相关代谢途径， 提示这些蛋白与肾炎可能具有更高的相关性，最可作为肾炎的生物标志物。
根据差异蛋白的途径分析，1个或多个途径中的蛋白组合最可能与肾炎相关，更可作 为肾炎的生物标志物。
iTRAQ标记技术可同时分离和鉴定上千种蛋白质，能够最大程度地反映蛋白质组的信 息。应用iTRAQ定量蛋白质组学研究发现了多个可能极具价值的慢性肾炎早期唾液无创 伤分子诊断生物标志物；进一步揭示了慢性肾炎分子组学水平的物质基础与科学内涵，为 其进一步的发生发展机制及其生物标志物研究打下了良好的基础。
本发明能够快速、可靠的蛋白质组学技术方案来发现慢性肾炎中的特异性蛋白标记 物，为慢性肾炎早期诊治、术后复发、转移及预后观察建立一种无创、简便、快捷实用的检测评估手段。
上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明，但是本专利并不限于上述实施方式，在 本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本专利宗旨的前提下作出各 种变化。
Claims (4)
1.基于唾液蛋白质组学的慢性肾炎生物标志物检测的方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)样品蛋白提取：样本中加入5％的裂解缓冲液进行涡旋混匀，超声60s，振幅22％室温提取30min；15000r/min、4℃离心20min，取出上清；收集上清，分装分装后冻存于-80℃；
(2)蛋白定量：采用Bradford法测定提取的蛋白浓度，先将样本用裂解缓冲液进行一定倍数稀释使其终浓度落在标曲范围内，稀释好的样本和标准品各取10μl分别和300μl蛋白定量染料避光反应20min，用酶标仪同时测定标准品和样本在595nm下的吸光值，根据标准品每管吸光值和浓度的关系绘制标准曲线，根据曲线公式计算各样品蛋白浓度；
(3)蛋白酶解：蛋白定量后取200μg蛋白溶液置于离心管中；加入4μl还原剂，60℃反应1h；加入2μl的半胱氨酸阻断剂，室温反应10min；将还原烷基化后的蛋白溶液加入10K的超滤管中，12000r/min离心20min，弃掉收集管底部溶液；加入iTRAQ试剂盒中的溶液缓冲液100μl，12000转离心20min，弃掉收集管底部溶液，重复3次；更换新的收集管，在超滤管中加入胰蛋白酶，总量4μg，体积50μl，37℃反应过夜；次日，12000r/min离心20min，酶解消化后的肽段溶液离心于收集管底部；在超滤管中加入50μl溶解缓冲液，12000r/min再次离心20min，与上步合并，收集管底部共得到100μl酶解后的样品；
(4)iTRAQ标记：从冰箱中取出iTRAQ试剂，平衡到室温，将iTRAQ试剂离心至管底；向每管iTRAQ试剂中加入150μl异丙醇，涡旋振荡，离心至管底；取50μl酶解后的样品转移到新的离心管中；将iTRAQ试剂添加到样品中，涡旋振荡，离心至管底，室温反应2h；加入100μl水终止反应；从4组样品中各取出1ul混合，用Ziptip脱盐后进行MALDI-TOF-TOF鉴定，确认标记反应良好；混合标记后的样品，涡旋振荡，离心至管底；真空冷冻离心干燥；抽干后的样品冷冻保存待用；
(5)高pH条件下的反相色谱分离：所需试剂的调配：流动相A：98％ddH2O，2％乙腈，pH10；流动相B：98％乙腈，2％ddH2O，pH10；ddH2O用氨水调pH值到10；混合标记后的样品用100ul流动相A溶解，14000r/min离心20min，取上清待用；使用400μg酶解好的BSA进行分离，检测系统情况；取100ul准备好的样本上样；流速0.7ml/min，得到分离梯度数据；
(6)ABI-5600进行蛋白质分析：所需试剂的调配：流动相A：100％超纯水，0.1％甲酸；流动相B：100％乙腈，0.1％甲酸；将高pH反相分离得到的组份用20μl2％甲醇，0.1％甲酸复溶；12000r/min离心10min，吸取上清上样，上样体积10μl，采取夹心法上样；装载泵流速350nl/min，15min；分离流速350nl/min，得到分离梯度数据；
(7)质谱数据分析：在选择数据库时，若为已经测序生物，直接选用该物种数据库，若为非测序生物，则选择与被测样品最为相关的大类蛋白质组数据库；采用ABI-5600型质谱仪进行iTRAQ的质谱分析得到差异表达蛋白。
2.根据权利要求1所述的基于唾液蛋白质组学的慢性肾炎生物标志物检测的方法，其特征在于，差异表达蛋白通过Gene Ontology程序分析，具有显著的聚类的1种或多种组合，为肾炎的生物标志物；
(8)检测结果：对慢性肾炎和正常对照组进行对比实验，定量蛋白质组学研究结果显示：鉴定1297个蛋白；与正常对照组相比，慢性肾炎中鉴定到的1.5倍以上表达差异的显著差异蛋白共140个，其中上调蛋白64个，下调蛋白76个；差异蛋白如下：
上调蛋白如下：
1)检索号为P13489，基因注释为Ribonuclease inhibitor；
2)检索号为Q96QR1，基因注释为Secretoglobin family 3A member 1；
3)检索号为P59665，基因注释为Neutrophil defensin 1；
4)检索号为E7EPB3，基因注释为60S ribosomal protein L14；
5)检索号为Q12841，基因注释为Follistatin-related protein 1；
6)检索号为A0A0A0MT74，基因注释为Protein IGKV1-16；
7)检索号为P04746，基因注释为Pancreatic alpha-amylase；
8)检索号为Q5T985，基因注释为Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H2；
9)检索号为A0A0A0MTQ6，基因注释为Protein IGKV2D-28；
10)检索号为E9PJK1，基因注释为Tetraspanin；
11)检索号为P68371，基因注释为Tubulin beta-4B chain；
12)检索号为P07437，基因注释为Tubulin beta chain；
13)检索号为P01609，基因注释为Ig kappa chain V-I region Scw；
14)检索号为G3XAM2，基因注释为Complement factor I；
15)检索号为A0A0C4DH35，基因注释为Protein IGHV3-35；
16)检索号为Q9HC84，基因注释为Mucin-5B；
17)检索号为P36955，基因注释为Pigment epithelium-derived factor；
18)检索号为G3XAI7，基因注释为Myosin-binding protein C,slow-type；
19)检索号为P02652，基因注释为Apolipoprotein A-II；
20)检索号为P05546，基因注释为Heparin cofactor 2；
21)检索号为B3KQV6，基因注释为Serine/threonine-protein phosphatase 2A 65kDa regulatory subunit A alpha isoform；
22)检索号为Q53FA7，基因注释为Quinone oxidoreductase PIG3；
23)检索号为A0A0B4J1X8，基因注释为Protein IGHV3-43；
24)检索号为Q29718，基因注释为HLA class I histocompatibility antigen,B-82alpha chain；
25)检索号为Q96PD5，基因注释为N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase；
26)检索号为Q07654，基因注释为Trefoil factor 3；
27)检索号为K7ERI9，基因注释为Apolipoprotein C-I；
28)检索号为P02774，基因注释为Vitamin D-binding protein；
29)检索号为Q14508，基因注释为WAP four-disulfide core domain protein 2；
30)检索号为A0A0E3D6N1，基因注释为Protein IGKV1-37(Fragment)OS＝Homosapiens；
31)检索号为A0A087WSY6，基因注释为Protein IGKV3D-15；
32)检索号为E5RG43，基因注释为Carbonic anhydrase 1；
33)检索号为P00739，基因注释为Haptoglobin-related protein；
34)检索号为Q99643，基因注释为Succinate dehydrogenase cytochrome b560subunit；
35)检索号为P02790，基因注释为Hemopexin；
36)检索号为P68871，基因注释为Hemoglobin subunit beta；
37)检索号为M0R0N1，基因注释为Zinc finger protein 257；
38)检索号为Q13217，基因注释为DnaJ homolog subfamily C member 3；
39)检索号为A0A0G2JPE1，基因注释为Uncharacterized protein；
40)检索号为P25398，基因注释为40S ribosomal protein S12；
41)检索号为Q969G9，基因注释为Protein naked cuticle homolog 1；
42)检索号为A0A0C4DGV7，基因注释为Retinol-binding protein 4；
43)检索号为H0Y2Q8，基因注释为Doublecortin domain-containing protein 1；
44)检索号为P01019，基因注释为Angiotensinogen；
45)检索号为P00738，基因注释为Haptoglobin；
46)检索号为A0A087WYC5，基因注释为Ig gamma-1 chain C region OS＝Homosapiens；
47)检索号为P45974，基因注释为Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 5；
48)检索号为A0A0G2JPR0，基因注释为Complement C4-A；
49)检索号为A5A3E0，基因注释为POTE ankyrin domain family member F；
50)检索号为P02647，基因注释为Apolipoprotein A-I；
51)检索号为P02768，基因注释为Serum albumin；
52)检索号为Q6AWB1，基因注释为Dynactin subunit 1；
53)检索号为E9PNW4，基因注释为CD59 glycoprotein；
54)检索号为E9PDU6，基因注释为Calponin；
55)检索号为Q5RHS7，基因注释为Protein S100-A2；
56)检索号为I3L397，基因注释为Eukaryotic translation initiation factor 5A；
57)检索号为A0A0A0MRA3，基因注释为Titin；
58)检索号为P62873，基因注释为Guanine nucleotide-binding protein G(I)/G(S)/G(T)subunit beta-1；
59)检索号为C9JCI2，基因注释为Protein Wnt；
60)检索号为K7EM38，基因注释为Actin,cytoplasmic 2；
61)检索号为A0A087WVZ3，基因注释为Guanine nucleotide-binding proteinsubunit alpha-11；
62)检索号为P05451，基因注释为Lithostathine-1-alpha；
63)检索号为P02795，基因注释为Metallothionein-2；
64)检索号为A0A087WYL9，基因注释为Ig kappa chain C region；
65)检索号为P27348，基因注释为14-3-3protein theta；
66)检索号为Q15327，基因注释为Ankyrin repeat domain-containing protein 1；
67)检索号为P02749，基因注释为Beta-2-glycoprotein 1；
68)检索号为P02763，基因注释为Alpha-1-acid glycoprotein 1；
69)检索号为B4DPG6，基因注释为Gamma-glutamyltransferase 6；
70)检索号为H0Y9E6，基因注释为Centromere protein H；
71)检索号为Q5TH69，基因注释为Brefeldin A-inhibited guanine nucleotide-exchange protein 3；
72)检索号为H0Y897，基因注释为Target of Nesh-SH3；
73)检索号为I3L0K3，基因注释为LisH domain-containing protein FOPNL；
74)检索号为P31151，基因注释为Protein S100-A7；
75)检索号为E9PQ96，基因注释为40S ribosomal protein S3；
76)检索号为P03973，基因注释为Antileukoproteinase；
77)检索号为P80188，基因注释为Neutrophil gelatinase-associated lipocalin；
78)检索号为P19827，基因注释为Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1；
79)检索号为P04003，基因注释为C4b-binding protein alpha chain；
80)检索号为Q8IWV8，基因注释为E3 ubiquitin-protein ligase UBR2；
81)检索号为P11717，基因注释为Cation-independent mannose-6-phosphaterecepto；
82)检索号为C9JXI5，基因注释为Transmembrane protein 198；
83)检索号为A0A0G2JN06，基因注释为Uncharacterized protein；
84)检索号为P01708，基因注释为Ig lambda chain V-II region BUR；
85)检索号为P01042，基因注释为Kininogen-1；
86)检索号为Q86X76，基因注释为Nitrilase homolog 1；
87)检索号为P27169，基因注释为Serum paraoxonase/arylesterase 1；
88)检索号为I3L3N5，基因注释为Platelet-activating factor acetylhydrolase IBsubunit alpha；
89)检索号为A0A0G2JMB2，基因注释为Uncharacterized protein；
90)检索号为P01583，基因注释为Interleukin-1 alpha；
91)检索号为A0A087WVM2，基因注释为CD177 antigen；
92)检索号为P20851，基因注释为C4b-binding protein beta chain；
93)检索号为Q6UXB8，基因注释为Peptidase inhibitor 16；
94)检索号为G3V1M9，基因注释为Basic salivary proline-rich protein 1；
95)检索号为P05160，基因注释为Coagulation factor XIII B chain；
96)检索号为A0A0B4J1Z7，基因注释为Protein IGKV1-39；
97)检索号为O43866，基因注释为CD5 antigen-like；
98)检索号为Q8WWX8，基因注释为Sodium/myo-inositol cotransporter 2；
99)检索号为P61769，基因注释为Beta-2-microglobulin；
100)检索号为P08603，基因注释为Complement factor H；
101)检索号为Q9NZ53，基因注释为Podocalyxin-like protein 2；
102)检索号为Q5SRP5，基因注释为Apolipoprotein M；
103)检索号为P02812，基因注释为Basic salivary proline-rich protein 2；
104)检索号为A0A0B4J2H3，基因注释为Protein IGHV2-70；
105)检索号为P08118，基因注释为Beta-microseminoprotein；
106)检索号为X6R6Z1，基因注释为Interleukin enhancer-binding factor 2；
107)检索号为P05109，基因注释为Protein S100-A8；
108)检索号为P02760，基因注释为Protein AMBP；
109)检索号为Q96M27，基因注释为Protein PRRC1；
110)检索号为H7BZG2，基因注释为Polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase 13；
111)检索号为P49643，基因注释为DNA primase large subunit；
112)检索号为H0YLA7，基因注释为Small kinetochore-associated protein；
113)检索号为P26196，基因注释为Probable ATP-dependent RNA helicase DDX6；
114)检索号为Q9NQW7，基因注释为Xaa-Pro aminopeptidase 1；
115)检索号为P01779，基因注释为Ig heavy chain V-III region TUR；
116)检索号为C9JWK7，基因注释为Alpha-amylase 2B；
117)检索号为A0A0A0MSY2，基因注释为General transcription factor II-I repeatdomain-containing protein 2A；
118)检索号为P62244，基因注释为40S ribosomal protein S15a；
119)检索号为P06702，基因注释为Protein S100-A9；
120)检索号为Q96QK1，基因注释为Vacuolar protein sorting-associated protein35；
121)检索号为P48668，基因注释为Keratin,type II cytoskeletal 6C；
122)检索号为Q5VWK5，基因注释为Interleukin-23 receptor；
123)检索号为B1AP58，基因注释为Carboxypeptidase N catalytic chain；
124)检索号为Q9UL25，基因注释为Ras-related protein Rab-21；
125)检索号为P12277，基因注释为Creatine kinase B-type；
126)检索号为C9J7T9，基因注释为Troponin C type 2(Fast),isoform CRA_a；
127)检索号为A0A0G2JQH3，基因注释为Cytoplasmic FMR1-interacting protein 1；
128)检索号为H0Y5U4，基因注释为DNA mismatch repair protein Mlh1；
129)检索号为B7WNR0，基因注释为Serum albumin；
130)检索号为A2RRP1，基因注释为Neuroblastoma-amplified sequence；
131)检索号为A0A087WTD2，基因注释为24-hydroxycholesterol 7-alpha-hydroxylase；
132)检索号为H0YKQ2，基因注释为Alpha-mannosidase 2x；
下调蛋白如下：
1)检索号为Q8WX92，基因注释为Negative elongation factor B；
2)检索号为E9PNV5，基因注释为Neuron navigator 2；
3)检索号为P40937，基因注释为Replication factor C subunit 5；
4)检索号为P02808，基因注释为Statherin；
5)检索号为F1T0C9，基因注释为Homeobox protein OTX2；
6)检索号为Q7Z591，基因注释为AT-hook-containing transcription factor；
7)检索号为Q15746，基因注释为Myosin light chain kinase,smooth muscle；
8)检索号为C9JEE0，基因注释为Immunoglobulin lambda-like polypeptide 1；
9)检索号为B7Z4N4，基因注释为Zinc finger protein 346；
10)检索号为Q8IXZ2，基因注释为Zinc finger CCCH domain-containing protein 3；
11)检索号为Q8IYW2，基因注释为Cilia-and flagella-associated protein 46；
12)检索号为P51948，基因注释为CDK-activating kinase assembly factor MAT1；
13)检索号为F8W0V3，基因注释为Extracellular glycoprotein lacritin；
14)检索号为P24534，基因注释为Elongation factor 1-beta；
15)检索号为H3BM85，基因注释为UPF0235 protein C15orf40[H3BM85_HUMAN]；
16)检索号为H0YLF3，基因注释为Beta-2-microglobulin；
17)检索号为H0YN26，基因注释为Acidic leucine-rich nuclear phosphoprotein 32family member A；
18)检索号为P31948，基因注释为Stress-induced-phosphoprotein 1；
19)检索号为P53367，基因注释为Arfaptin-1；
20)检索号为P68032，基因注释为Actin,alpha cardiac muscle 1；
21)检索号为A0A087X185，基因注释为Recombining-binding protein suppressor ofhairless-like protein；
22)检索号为P62328，基因注释为Thymosin beta-4；
23)检索号为Q9Y2Q0，基因注释为Phospholipid-transporting ATPase IA；
24)检索号为H0YGX7，基因注释为Rho GDP-dissociation inhibitor 2；
25)检索号为Q96C23，基因注释为Aldose 1-epimerase；
26)检索号为E5RIX8，基因注释为Tubulin-specific chaperone A；
27)检索号为G3V5Q9，基因注释为Plasma serine protease inhibitor；
28)检索号为A0A0B4J1V7，基因注释为Protein IGHV7-81；
29)检索号为Q6ZWB5，基因注释为C3orf57；
30)检索号为H7BZN3，基因注释为Telomere-associated protein RIF1；
31)检索号为O43852，基因注释为Calumenin；
32)检索号为P30740，基因注释为Leukocyte elastase inhibitor；
33)检索号为Q5VU61，基因注释为Tropomyosin alpha-3 chain；
34)检索号为H0YMB1，基因注释为Regulator of microtubule dynamics protein 3；
35)检索号为P98160，基因注释为Basement membrane-specific heparan sulfateproteoglycan core protein；
36)检索号为Q5TA02，基因注释为Glutathione S-transferase omega-1；
37)检索号为C9JTV7，基因注释为Ephexin-1；
38)检索号为A0A075B6V5，基因注释为Protein TRAV36DV7；
39)检索号为O75663，基因注释为TIP41-like protein；
40)检索号为H0YIB8，基因注释为2'-5'-oligoadenylate synthase 1；
41)检索号为O75695，基因注释为Protein XRP2；
42)检索号为P61956，基因注释为Small ubiquitin-related modifier 2；
43)检索号为P30044，基因注释为Peroxiredoxin-5；
44)检索号为A0A087WSV8，基因注释为Nucleobindin 2,isoform CRA_b；
45)检索号为C9JH92，基因注释为Quinone oxidoreductase；
46)检索号为Q8WXG9，基因注释为G-protein coupled receptor 98；
47)检索号为P35237，基因注释为Serpin B6；
48)检索号为P07711，基因注释为Cathepsin L1；
49)检索号为S4R3W3，基因注释为Calcium uptake protein 1；
50)检索号为Q99497，基因注释为Protein deglycase DJ-1；
51)检索号为P07737，基因注释为Profilin-1；
52)检索号为P0C0S5，基因注释为Histone H2A.Z；
53)检索号为H7C0J0，基因注释为Neural cell adhesion molecule L1-like protein；
54)检索号为H0YG30，基因注释为Heat shock protein beta-8；
55)检索号为Q3MHB9，基因注释为Short transient receptor potential channel 4；
56)检索号为H0YKU1，基因注释为Tropomodulin-3；
57)检索号为Q5T123，基因注释为SH3 domain-binding glutamic acid-rich-likeprotein 3；
58)检索号为Q9Y490，基因注释为Talin-1；
59)检索号为Q96TA1，基因注释为Niban-like protein 1；
60)检索号为Q9BYX7，基因注释为Putative beta-actin-like protein 3；
61)检索号为H0Y368，基因注释为Dolichol-phosphate mannosyltransferasesubunit 1；
62)检索号为Q8N474，基因注释为Secreted frizzled-related protein 1；
63)检索号为Q9UIV8，基因注释为Serpin B13；
64)检索号为M0R213，基因注释为Alpha-soluble NSF attachment protein；
65)检索号为P01703，基因注释为Ig lambda chain V-I region NEWM；
66)检索号为B0YJC4，基因注释为Vimentin；
67)检索号为P26038，基因注释为Moesin；
68)检索号为D6RD83，基因注释为Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein D0；
69)检索号为A0A0B4J278，基因注释为Alpha-1-antitrypsin；
70)检索号为H3BQF7，基因注释为IST1 homolog；
71)检索号为P01771，基因注释为Ig heavy chain V-III region HIL；
72)检索号为A0A0A0MQW3，基因注释为Serpin B13；
73)检索号为A8MVU1，基因注释为Putative neutrophil cytosol factor 1C；
74)检索号为O95498，基因注释为Vascular non-inflammatory molecule 2；
75)检索号为Q9ULZ3，基因注释为Apoptosis-associated speck-like proteincontaining a CARD；
76)检索号为O95716，基因注释为Ras-related protein Rab-3D；
77)检索号为H3BTU6，基因注释为Coronin；
78)检索号为P78559，基因注释为Microtubule-associated protein 1A；
79)检索号为Q9H3M0，基因注释为Potassium voltage-gated channel subfamily Fmember 1；
80)检索号为G3V2B9，基因注释为Alpha-1-antitrypsin；
81)检索号为P35527，基因注释为Keratin,type I cytoskeletal 9；
82)检索号为Q92521，基因注释为GPI mannosyltransferase 3；
83)检索号为P80723，基因注释为Brain acid soluble protein 1；
84)检索号为O43505，基因注释为Beta-1,4-glucuronyltransferase 1；
85)检索号为P20700，基因注释为Lamin-B1。
3.根据权利要求1所述的基于唾液蛋白质组学的慢性肾炎生物标志物检测的方法，其特征在于，差异表达蛋白通过STRING程序进行相关性网络分析，提示相关性强的蛋白，为肾炎的生物标志物。
4.根据权利要求1所述的基于唾液蛋白质组学的慢性肾炎生物标志物检测的方法，其特征在于，差异表达蛋白通过KEGG进行途径分析，提示参与相关代谢途径的蛋白为肾炎的生物标志物。
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