CN108152508A - 一种无创伤胃癌唾液生物标记物的筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种无创伤胃癌唾液生物标记物的筛选方法，具体步骤包括蛋白样品的准备、蛋白定量、蛋白酶解及冷冻干燥、iTRAQ标记样品、C18脱盐、液相分离及质谱鉴定和数据分析；数据分析时利用Panther Classificition System对筛选出的差异蛋白进行包括生物学进程、分子功能的以及细胞组分的GO功能富集；接着利用STRING分析软件对差异蛋白进行蛋白相互作用分析；随后对差异蛋白进行KEGG信号通路分析。本发明能够快速、可靠的蛋白质组学技术方案来发现胃癌中的特异性蛋白标记物，为胃癌早期诊治、术后复发、转移及预后观察建立一种无创、简便、快捷实用的检测评估手段。

Description

一种无创伤胃癌唾液生物标记物的筛选方法

技术领域

本发明涉及一种生物标记物的筛选方法，具体是一种无创伤胃癌唾液生物标记物的筛选方法。

背景技术

胃癌是全球最常见的恶性消化道肿瘤之一。胃癌起病隐匿、早期症状和体征均不明显，需要依靠辅助检查确诊。目前，常规胃镜检查并在镜下获取病理组织进行活检被公认为是胃癌诊断的金标准，但是在我国尚难以作为普查方式大规模开展。通过胃部荧光照相术对无症状个体执行的大量筛选项目已增加了早期胃癌病例的检测数量，将总体5年存活率提高至超过50％。其灵敏度和特异度较佳，然而，成本效益研究指出，胃部荧光照相术在胃癌发生率较低的西方国家并不可行。另外，钡餐造影、螺旋CT等影像学检查，肿瘤标记物、幽门螺杆菌、单克隆抗体、基因诊断、端粒酶以及微卫星不稳定性等分子生物学指标检查以及色素内镜、超声内镜等其他辅助检查手段的诊断率均不理想，加之在高危人群中健康宣教匮乏，致使我国早期胃癌诊断率仅为5％～15％，虽然早期胃癌治疗后5年生存率可达80.2％～93.7％，但是一半以上的患者在确诊时已为中晚期，常伴有淋巴转移及远处转移，而文献报道可以手术治疗的进展期胃癌5年生存率仅为约10.8％～65.7％，大部分进展期胃癌已失去手术机会，。因此对胃癌患者的早期无创伤诊断于临床有重要的积极意义。

唾液是人体不可缺少的一种重要体液，血液成分如多种激素、氨基酸、电解质、免疫球蛋白等均可通过毛细血管壁的唾液血液屏障进入唾液作为人体体液的一部分，其成分含量的变化，受体内各种病理生理变化的影响。若将唾液唾液代替血液作为诊断指标，不仅取材方便，无创伤性，可随时进行动态观察，且实验结果稳定，方法灵敏度高，重复性好。同位素的相对与绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)技术是2004年美国应用公司研发的一种体外同种同位素的4种标记技术，该技术可用于筛选和寻找任何因素引起的不同种样本间的差异表达蛋白，结合生物信息学揭示细胞生理功能，同时也可对某些关键蛋白进行定性和定量分析。随后该公司为了增加检测样本的通量进一步推出了8个样本的试剂盒。该技术不仅降低了实验过程中所引入的技术误差，还克服了2-DE不能对低丰度、极大和极小、极碱性和疏水蛋白进行有效分离的问题，使得全面分析蛋白质组的变化成为可能。因此为克服现有技术的不足，我们引入iTRAQ这种高通量蛋白质组学技术从唾液蛋白中来筛选胃癌的生物标志物以提高早期胃癌患者的发现率和诊断率是一种新的方便、快捷、无创且特异性、敏感性均高的检测评估手段。

唾液是唾液俗称口涎、口水，是由人体唾液腺分泌的无色稀薄的液体，其成分多而复杂。研究发现唾液成分与血清相关，特别是研究证实作为唾液主要成分的蛋白质与血清成正相关。作为诊断液，唾液的采集优于血清，因为唾液的收集对象可以是通过简单培训的个人，并且唾液检测为大量人群疾病的筛查提供了降低成本，提高效益的方法。另外，唾液的采集可极大地降低交叉感染的风险，而且很容易从婴儿及无意识的或烦躁患者的口中获得。随着生化微量分析技术的进步，使人们开始考虑用唾液代替血液作为诊断指标唾液研究方面走在前列的美国现正致力于开展一项重点研究计划——创立唾液诊断学(salivarydiagnostics)，即在研究正常人唾液中的全部蛋白质组分的基础上，创建以唾液为研究对象，快速实时(real-time)反映机体状态的，可检测各种系统性疾病和口腔疾病的蛋白质研究体系，如蛋白质芯片等基于唾液的检验诊断技术将会对临床医学及肿瘤学、分子生物学、内分泌学、病毒学、细胞生物学、免疫学、微生物学、流行病学、法医学、生物芯片以及生物信息学等多个学科的基础研究产生深远的影响。在未来，唾液诊断可能会彻底改变对疾病筛选、风险评估和治疗管理的方法。这种方法希望可以使医疗服务水平得到巨大提升，以提供更多的个性化治疗。相信在不久的将来，唾液诊断将会不断完善，尤其是在肿瘤的诊断方面带来新的革新，为肿瘤的普查、筛选、早期诊断、鉴别诊断提供准确的、精确的、可靠的方法。

在20世纪80年代以前，胃癌的诊断方法常常采用上消化道钡餐成像技术，这是一种侵入性诊断胃癌的方法，在检查时，需要患者吞服硫酸钡后，由放射科医师在放射线下，根据不同的位置和角度，观察胃的形状、轮廓和运动的变化，从而确诊胃癌病变。消化道钡餐成像技术对晚期胃癌患者的诊断率比较高，但是对于早期胃癌的诊断，成功率较低。目前，胃镜检查是临床上最有价值的胃癌诊断方法，对于直径在4mm以上的早期胃癌病灶都可以被发现。窄带成像(NBI)技术能发现直径更小的早期胃癌病灶，NBI的发明能准确地检查出早期胃癌病变，极大地提高了胃癌的诊断率。但是NBI检查是一种侵入性检查，患者有强烈的不适感，并且NBI技术成本较高，患者依从性差，从而限制了其在大规模胃癌筛查中的应用。

目前，发现了一些胃癌相关肿瘤标志物，并且有一些已经应用于临床，但是单一的肿瘤标志物检测特异性不高，阳性率较低，并且传统的血清肿瘤标志物如NSE、TRF、CA242在胃癌中表达无特异性。近些年，逐渐发现了一些胃癌相对特异的标记物，包括MG7-抗原和胃蛋白酶原(pepsinogen，PG)等。目前，日本已经将PG作为早期诊断和普查胃癌的肿瘤标记物，但是在我国尚无大样本的证据支持，且血清中的PG水平受多种因素(地域差异、膳食结构、种族等)的影响，并且对于不同的检测群体可能有不同的诊断标准，因此，国内采用检测血清中PG水平来筛选胃癌的价值仍需要大样本的长期纵向研究结果来证实。

发明内容

本发明的目的在于提供一种安全可靠、有效率高的无创伤胃癌唾液生物标记物的筛选方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种无创伤胃癌唾液生物标记物的筛选方法，具体步骤如下：

(1)蛋白样品的准备：向冻存的唾液蛋白样品中加入600μL的1X裂解液，以超声波2秒停3秒，Amp20％的条件在超声破碎仪上超声2min，直至样品全部溶解变澄清；再继续在冰上裂解30min后，用提前预冷到4℃的离心机以20，000g离心40min；弃沉淀取上清，加入3kDa的超滤管中，用4℃离心机以14000g离心超滤30min，浓缩蛋白；完成后再向超滤管中加入200μL1X裂解液，在4℃状态下，以14000g超滤20min，重复3次；超滤结束后，收集蛋白溶液，做好命名标记保存于-20℃冰箱；

(2)蛋白定量：蛋白定量使用标准BCA定量试剂盒，取96孔板，制作BSA标准曲线；然后根据样品数量配制工作液并充分混匀；每孔加入200μLBCA工作液，每个样品及标准品3个重复孔；完成后将96孔板放入37℃温箱孵育30min；检测562nm波长下光吸收值，绘制标准曲线并得到该曲线公式，利用标准曲线公式及吸光度计算蛋白样品浓度；

(3)蛋白酶解及冷冻干燥：100μg的蛋白样品用6M的尿素稀释至500μL，并将稀释后的样品放入3k超滤管；使用提前预冷的4℃离心机以14000g离心15min后丢弃滤液，加入500μL的10mmol/LDTT+25mmol/LTEAB混合液，再以同样速度离心15min后丢弃滤液，重复三次后将3k超滤管中的样品置于室温孵育，时间为1h；再加入500μL20mmol/LIAA+25mmol/LTEAB混合液，以14000g于4℃离心机离心15min，弃滤液，重复三次将3k超滤管中样品置于室温避光孵育45min；再加入500μL25mmol/LTEAB，以14000g于4℃离心机离心15min；弃滤液重复步骤6两次后将3k超滤管中的样品，以1000g于4℃离心1min转移至新的1.5mlEP管中；加入100mmol/LTEAB调整pH至8.5，并向每个样品加入2μg的胰蛋白酶，置于37℃温箱孵育过夜；酶解后的样品以-5℃进行真空干燥过夜；样品完全干燥后于4℃离心机以12000g离心10min，去掉封口膜做好命名标记后放置于-80℃保存；

(4)iTRAQ标记样品：将iTRAQ的6个标记试剂经50ul异丙醇稀释后以1000g离心1min使iTRAQ试剂离心到试管底部；将标记物与对应样品混合，并用100mmol/LTEAB将所有样品的pH值调整至8.5左右；室温避光放置1h后向各管中加入100ul超纯水使标记物失活，混合6组样品，冻干保存；

(5)C18脱盐：在C18填充的SPE管中加入200μL50％乙腈，以1200g条件室温离心1min，重复一次；用5％乙腈和0.1％TFA溶液将样品重新溶解，并用此溶液润洗C18填充的SPE管；完成后再以1200g条件室温离心1min，重复润洗步骤三次；随后用70％乙腈30μL洗脱结合在C18填充材料上的多肽，为了提高洗脱效率以1200g的条件室温离心1min，重复两次；脱盐的样品中的乙腈在真空浓缩仪中去除，并等待上机检测；

(6)液相分离及质谱鉴定：样品经脱盐处理后以SolventA为流动相，设紫外检测波长为214nm/280nm，流速为2uL/min，10min进样让样品充分富集在脱盐柱上，线性梯度洗脱后真空离心浓缩；利用5-55％梯度的Solvent B将样品通过分析柱，90min后停止；质谱鉴定：质谱检测器使用Triple TOF 5600System，所得串级质谱数据通过Protein PilotSoftware 4.5检索SwissProt数据，并以Mascot为检索引擎进行搜库；

(7)数据分析：利用Panther ClassificitionSystem对筛选出的差异蛋白进行包括生物学进程、分子功能的以及细胞组分的GO功能富集；接着利用STRING分析软件对差异蛋白进行蛋白相互作用分析；随后对差异蛋白进行KEGG信号通路分析；

(8)检测结果：对胃癌组和正常对照组进行对比实验，定量蛋白质组学研究结果显示：鉴定1297个蛋白；与正常对照组相比，胃癌组中鉴定到的1.5倍以上表达差异的显著差异蛋白共140个，其中上调蛋白64个，下调蛋白76个；差异蛋白列表如下：上调蛋白如下：

1)检索号为O43617，基因注释为Trafficking protein particlecomplexsubunit3；

2)检索号为O43847，基因注释为Nardilysin；

3)检索号为O60635，基因注释为Tetraspanin-1；

4)检索号为O75531，基因注释为Barrier-to-autointegration factor；

5)检索号为O95969，基因注释为Secretoglobin family 1D member 2；

6)检索号为P00480，基因注释为Ornithine carbamoyltransferase,mitochondrial；

7)检索号为P01040，基因注释为Cystatin-A；

8)检索号为P01699，基因注释为Ig lambda chainV-I regionVOR；

9)检索号为P01764，基因注释为Igheavy chain V-III region 23；

10)检索号为P01773，基因注释为Ig heavy chain V-III region BUR；

11)检索号为P02538，基因注释为Keratin,type II cytoskeletal 6A；

12)检索号为P02549，基因注释为Spectrin alpha chain,erythrocytic 1；

13)检索号为P02795，基因注释为Metallothionein-2；

14)检索号为P05109，基因注释为Protein S100-A8；

15)检索号为P06702，基因注释为Protein S100-A9；

16)检索号为P06703，基因注释为Protein S100-A6；

17)检索号为P08246，基因注释为Neutrophil elastase；

18)检索号为P12532，基因注释为Creatine kinase U-type,mitochondrial；

19)检索号为P13646，基因注释为Keratin,type I cytoskeletal 13；

20)检索号为P13987，基因注释为CD59glycoprotein OS＝Homo sapiens；

21)检索号为P19013，基因注释为Keratin,type II cytoskeletal 4；

22)检索号为P22528，基因注释为Cornifin-B OS＝Homo sapiens；

23)检索号为P27918，基因注释为Properdin OS＝Homo sapiens；

24)检索号为P30050，基因注释为60S ribosomal protein L12；

25)检索号为P31151，基因注释为Protein S100-A7；

26)检索号为P35321，基因注释为Cornifin-A；

27)检索号为P47755，基因注释为F-actin-capping protein subunitalpha-2；

28)检索号为P49643，基因注释为DNAprimase large subunit；

29)检索号为P50452，基因注释为Serpin B8；

30)检索号为P58062，基因注释为Serine protease inhibitor Kazal-type 7；

31)检索号为P59665，基因注释为Neutrophil defensin 1；

32)检索号为P80188，基因注释为Neutrophil gelatinase-associatedlipocalin；

33)检索号为Q00872，基因注释为Myosin-binding protein C,slow-type；

34)检索号为Q07654，基因注释为Trefoil factor 3；

35)检索号为Q13232，基因注释为Nucleoside diphosphate kinase 3；

36)检索号为Q14210，基因注释为Lymphocyte antigen 6D；

37)检索号为Q14314，基因注释为Fibroleukin；

38)检索号为Q14766，基因注释为Latent-transforming growth factor beta-bindingprotein 1；

39)检索号为Q53FA7，基因注释为Quinone oxidoreductase PIG3；

40)检索号为Q5T7N2，基因注释为LINE-1type transposase domain-containingprotein1；

41)检索号为Q6ZWK6，基因注释为Transmembrane protease serine 11F；

42)检索号为Q86SG5，基因注释为Protein S100-A7A；

43)检索号为Q86UR5，基因注释为Regulating synaptic membrane exocytosisprotein 1；

44)检索号为Q8N4H5TOM5，基因注释为Mitochondrial import receptor subunitTOM5homolog；

45)检索号为Q8NFT8，基因注释为Delta and Notch-like epidermal growthfactor-relatedreceptor；

46)检索号为Q92876，基因注释为Kallikrein-6；

47)检索号为Q96RM1，基因注释为Small proline-rich protein 2F；

48)检索号为Q99523，基因注释为Sortilin；

49)检索号为Q9BXX3，基因注释为Ankyrin repeat domain-containing protein30A；

50)检索号为Q9GZP4，基因注释为PITH domain-containing protein 1；

51)检索号为Q9H583，基因注释为HEAT repeat-containing protein1；

52)检索号为Q9HB71，基因注释为Calcyclin-binding protein；

53)检索号为Q9NR99，基因注释为Matrix-remodeling-associated protein 5；

54)检索号为Q9NX78，基因注释为Transmembrane protein 260；

55)检索号为Q9UFN0，基因注释为Protein NipSnap homolog 3A；

56)检索号为Q9UHV9，基因注释为Prefoldin subunit 2；

57)检索号为Q9ULS5，基因注释为Transmembrane and coiled-coildomainsprotein3；

58)检索号为Q9Y546，基因注释为Leucine-richrepeat-containing protein42；

59)检索号为Q9Y6Q9，基因注释为Nuclear receptor coactivator 3；

下调蛋白如下：

1)检索号为O00764，基因注释为Pyridoxal kinase；

2)检索号为O14497，基因注释为AT-richinteractive domain-containingprotein1A；

3)检索号为O15111，基因注释为Inhibitor of nuclear factor kappa-B kinasesubunitalpha；

4)检索号为O43852，基因注释为Calumenin；

5)检索号为O60610，基因注释为Protein diaphanous homolog 1；

6)检索号为O76070，基因注释为Gamma-synuclein；

7)检索号为O95817，基因注释为BAG family molecular chaperone regulator3；

8)检索号为P01036，基因注释为Cystatin-S；

9)检索号为P02748，基因注释为Complement component C9；

10)检索号为P02808，基因注释为Statherin；

11)检索号为P04062，基因注释为Glucosylceramidase；

12)检索号为P04745，基因注释为Alpha-amylase 1；

13)检索号为P06733，基因注释为Alpha-enolase；

14)检索号为P07360，基因注释为Complement component C8gamma chain；

15)检索号为P07711，基因注释为Cathepsin L1；

16)检索号为P08697，基因注释为Alpha-2-antiplasmin；

17)检索号为P0C0S5，基因注释为Histone H2A.Z；

18)检索号为P15309，基因注释为Prostatic acid phosphatase；

19)检索号为P15515，基因注释为Histatin-1；

20)检索号为P16278，基因注释为Beta-galactosidase；

21)检索号为P16870，基因注释为Carboxypeptidase E；

22)检索号为P23219，基因注释为Prostaglandin G/H synthase 1；

23)检索号为P23280，基因注释为Carbonic anhydrase 6；

24)检索号为P28325，基因注释为Cystatin-D；

25)检索号为P30085，基因注释为UMP-CMP kinase；

26)检索号为P30408，基因注释为Transmembrane 4L6family member 1；

27)检索号为P30740，基因注释为Leukocyte elastase inhibitor；

28)检索号为P41218，基因注释为Myeloid cell nuclear differentiationantigen；

29)检索号为P42025，基因注释为Beta-centractin；

30)检索号为P50747，基因注释为Biotin--protein ligase；

31)检索号为P51610，基因注释为Host cell factor 1；

32)检索号为P58499，基因注释为Protein FAM3B；

33)检索号为P62328，基因注释为Thymosin beta-4；

34)检索号为P63313，基因注释为Thymosin beta-10；

35)检索号为P68032，基因注释为Actin,alpha cardiac muscle 1；

36)检索号为P68431，基因注释为Histone H3.1；

37)检索号为P80303，基因注释为Nucleobindin-2；

38)检索号为Q01813，基因注释为ATP-dependent 6-phosphofructokinase,platelet type；

39)检索号为Q04118，基因注释为Basic salivary proline-rich protein 3；

40)检索号为Q05315，基因注释为Galectin-10；

41)检索号为Q09MP3，基因注释为RAD51-associated protein 2；

42)检索号为Q15008，基因注释为26S proteasome non-ATPase regulatorysubunit 6；

43)检索号为Q15370，基因注释为Transcription elongation factor Bpolypeptide 2；

44)检索号为Q15782，基因注释为Chitinase-3-like protein 2；

45)检索号为Q15942，基因注释为Zyxin；

46)检索号为Q2QGD7，基因注释为Zinc finger protein ZXDC；

47)检索号为Q3ZCW2，基因注释为Galectin-related protein；

48)检索号为Q53EP0，基因注释为Fibronectin type III domain-containingprotein 3B；

49)检索号为Q5SNV9，基因注释为Uncharacterized protein C1orf167；

50)检索号为Q6PIF6，基因注释为Unconventional myosin-VIIb；

51)检索号为Q6ZSZ6，基因注释为Teashirt homolog 1；

52)检索号为Q8IUE6，基因注释为Histone H2A type 2-B；

53)检索号为Q8IWQ3，基因注释为Serine/threonine-protein kinase BRSK2；

54)检索号为Q8IZF0，基因注释为Sodiumleak channel non-selective protein；

55)检索号为Q8N4F0，基因注释为BPI fold-containing family B member 2；

56)检索号为Q8NBJ4，基因注释为Golgi membrane protein1；

57)检索号为Q8NBS9，基因注释为Thioredoxin domain-containing protein5；

58)检索号为Q8TAX7，基因注释为Mucin-7；

59)检索号为Q8TBY0，基因注释为Probable RNA-binding protein46；

60)检索号为Q8WWL2，基因注释为Protein spire homolog2；

61)检索号为Q8WWY7，基因注释为WAP four-disulfide core domain protein12；

62)检索号为Q92485，基因注释为Acid sphingomyelinase-likephosphodiesterase 3b；

63)检索号为Q92521，基因注释为GPI mannosyltransferase 3；

64)检索号为Q92747，基因注释为Actin-related protein2/3complex subunit1A；

65)检索号为Q96CN5，基因注释为Leucine-rich repeat-containing protein45；

66)检索号为Q96DA0，基因注释为Zymogen granule protein 16homolog B；

67)检索号为Q96DR5，基因注释为BPI fold-containing family A member 2；

68)检索号为Q96G27，基因注释为WW domain-binding protein 1；

69)检索号为Q96P20，基因注释为NACHT,LRR and PYD domains-containingprotein3；

70)检索号为Q96Q06，基因注释为Perilipin-4；

71)检索号为Q99592，基因注释为Zinc finger and BTB domain-containingprotein 18；

72)检索号为Q99832，基因注释为T-complex protein 1subunit eta OS＝Homosapiens；

73)检索号为Q9BYX7，基因注释为Putative beta-actin-like protein 3；

74)检索号为Q9BZ71，基因注释为Membrane-associated phosphatidylinositoltransfer protein 3；

75)检索号为Q9HBR0，基因注释为Putative sodium-coupled neutral aminoacid transporter 10；

76)检索号为Q9HC38，基因注释为Glyoxalase domain-containing protein 4；

77)检索号为Q9NR45，基因注释为Sialic acid synthase；

78)检索号为Q9NW08，基因注释为DNA-directed RNA polymerase III subunitRPC2；

79)检索号为Q9UGN4，基因注释为CMRF35-like molecule 8；

80)检索号为Q9Y287，基因注释为Integral membrane protein 2B；

81)检索号为Q9Y2J8，基因注释为Protein-arginine deiminase type-2；

82)检索号为Q9Y2K3，基因注释为Myosin-15OS＝Homo sapiens；

83)检索号为Q9Y496，基因注释为Kinesin-like protein KIF3A；

84)检索号为Q9Y4U1，基因注释为Methylmalonic aciduria and homocystinuriatype C protein；

85)检索号为Q9Y646，基因注释为Carboxypeptidase Q。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明能够快速、可靠的蛋白质组学技术方案来发现胃癌中的特异性蛋白标记物，为胃癌早期诊治、术后复发、转移及预后观察建立一种无创、简便、快捷实用的检测评估手段。

附图说明

图1为主题的结构示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。

请参阅图1，一种无创伤胃癌唾液生物标记物的筛选方法，具体步骤如下：

(1)蛋白样品的准备：向冻存的唾液蛋白样品中加入600μL的1X裂解液，以超声波2秒停3秒，Amp20％的条件在超声破碎仪上超声2min，直至样品全部溶解变澄清；再继续在冰上裂解30min后，用提前预冷到4℃的离心机以20，000g离心40min；弃沉淀取上清，加入3kDa的超滤管中，用4℃离心机以14000g离心超滤30min，浓缩蛋白；完成后再向超滤管中加入200μL1X裂解液，在4℃状态下，以14000g超滤20min，重复3次；超滤结束后，收集蛋白溶液，做好命名标记保存于-20℃冰箱；

(2)蛋白定量：蛋白定量使用标准BCA定量试剂盒，取96孔板，制作BSA标准曲线；然后根据样品数量配制工作液并充分混匀；每孔加入200μLBCA工作液，每个样品及标准品3个重复孔；完成后将96孔板放入37℃温箱孵育30min；检测562nm波长下光吸收值，绘制标准曲线并得到该曲线公式，利用标准曲线公式及吸光度计算蛋白样品浓度；

(3)蛋白酶解及冷冻干燥：100μg的蛋白样品用6M的尿素稀释至500μL，并将稀释后的样品放入3k超滤管；使用提前预冷的4℃离心机以14000g离心15min后丢弃滤液，加入500μL的10mmol/LDTT+25mmol/LTEAB混合液，再以同样速度离心15min后丢弃滤液，重复三次后将3k超滤管中的样品置于室温孵育，时间为1h；再加入500μL20mmol/LIAA+25mmol/LTEAB混合液，以14000g于4℃离心机离心15min，弃滤液，重复三次将3k超滤管中样品置于室温避光孵育45min；再加入500μL25mmol/LTEAB，以14000g于4℃离心机离心15min；弃滤液重复步骤6两次后将3k超滤管中的样品，以1000g于4℃离心1min转移至新的1.5mlEP管中；加入100mmol/LTEAB调整pH至8.5，并向每个样品加入2μg的胰蛋白酶，置于37℃温箱孵育过夜；酶解后的样品以-5℃进行真空干燥过夜；样品完全干燥后于4℃离心机以12000g离心10min，去掉封口膜做好命名标记后放置于-80℃保存；

(4)iTRAQ标记样品：将iTRAQ的6个标记试剂经50ul异丙醇稀释后以1000g离心1min使iTRAQ试剂离心到试管底部；将标记物与对应样品混合，并用100mmol/LTEAB将所有样品的pH值调整至8.5左右；室温避光放置1h后向各管中加入100ul超纯水使标记物失活，混合6组样品，冻干保存；

(5)C18脱盐：在C18填充的SPE管中加入200μL50％乙腈，以1200g条件室温离心1min，重复一次；用5％乙腈和0.1％TFA溶液将样品重新溶解，并用此溶液润洗C18填充的SPE管；完成后再以1200g条件室温离心1min，重复润洗步骤三次；随后用70％乙腈30μL洗脱结合在C18填充材料上的多肽，为了提高洗脱效率以1200g的条件室温离心1min，重复两次；脱盐的样品中的乙腈在真空浓缩仪中去除，并等待上机检测；

(6)液相分离及质谱鉴定：样品经脱盐处理后以SolventA为流动相，设紫外检测波长为214nm/280nm，流速为2uL/min，10min进样让样品充分富集在脱盐柱上，线性梯度洗脱后真空离心浓缩；利用5-55％梯度的Solvent B将样品通过分析柱，90min后停止；质谱鉴定：质谱检测器使用Triple TOF 5600System，所得串级质谱数据通过Protein PilotSoftware 4.5检索SwissProt数据，并以Mascot为检索引擎进行搜库；

(7)数据分析：利用Panther Classificition System对筛选出的差异蛋白进行包括生物学进程、分子功能的以及细胞组分的GO功能富集；接着利用STRING分析软件对差异蛋白进行蛋白相互作用分析；随后对差异蛋白进行KEGG信号通路分析。

iTRAQ，即四重用于相对和绝对定量的等量异位标记(isobaric tags forrelative and absolute quantification)是近年来蛋白质组学研究的一项新的技术。样品以四种同位素作为编码标签，通过同位素特异性标记蛋白多肽的氨基基团，串联质谱分析后可同时比较四种不同样品中蛋白质的相对水平。研究显示，与近年来出现的双向荧光差异凝胶电泳(two dimensional fluorescent difference gel electrophoresis，2D-DIGE)等技术相比，iTRAQ是更为灵敏的方法。iTRAQ具有重复性好，高通量，高灵敏度等突出优点，可以快速地分析各种生物样品中蛋白质组的组成，在生物标志物的研究中具有其独特的优势。iTRAQ技术的出现使高灵敏的蛋白质组学分析成为可能，为筛选疾病早期诊断的高特异性及敏感性分子(或联合)标志物提供了重要技术支持。

(一)病例选择及分组设计

1诊断标准

(1)疾病诊断标准

胃癌与慢性胃炎(包括慢性浅表性胃炎和慢性萎缩性胃炎)的诊断均根据《内科学》的诊断标准。

(2)中医证型诊断标准

1)脾虚证诊断标准(同第三部分脾虚证诊断标准)；

2)湿热蕴脾证诊断标准：

根据中华人民共和国中医临床术语所列的证候诊断标准(1997年)为了使辨证更具客观性，尽可能减少人为因素干扰，本研究以证素辨证为基础，运用“中医智能(辅助)诊疗系统”(第一代产品为“WF-Ⅲ中医辅助诊疗系统”)进行辨证，提取证素。

湿热蕴脾证临床表现：脘腹痞闷，纳呆呕恶，大便溏泄而不爽，肢体困重，渴不多饮，身热不扬，汗出不解，或身目鲜黄，或皮肤发痒，舌质红，苔黄腻，脉濡数。

2纳入标准

符合诊断标准，年龄在20-75岁之间；未经手术和放化疗；自愿且能够配合参加的受试对象。以上3项必须全部符合才能纳入。

3排除标准：不符合上述诊断标准者；年龄＜20或＞75岁者；患有口腔局部及唾液腺的炎症、消化道溃疡、肿瘤及先天性疾病；患有舍格伦综合征、囊性纤维病；患有其他系统严重并发疾病。

4质量控制：釆用统一诊断标准、统一调查表格、统一调查方法；调査者在调査时严格按照“标准化”执行，减少调查者偏倚，确保资料的一致性和真实性；电子胃镜及病理结果均由1月内三级甲等医院诊断。

5.病例资料

本研究自2014年12月-2015年04月共收集符合诊断和纳入标准的胃癌患者51例，全部病例来源于湖南省肿瘤医院胃十二指肠胰腺外科，均经病理检查确诊。胃癌脾虚证40例，年龄24-73岁，中位年龄57岁，肿瘤类型(低分化腺癌22例，中-低分化腺癌5例，中分化腺癌1例，其他类型5例)；胃癌湿热证11例，年龄44-65岁，中位年龄57岁，肿瘤类型(低分化腺癌2例，中-低分化腺癌1例，其他类型3例)；正常对照组45例，年龄23—72岁，中位年龄52岁，均来自于湖南中医药大学附属第一医院体检科健康自愿者。该研究方案符合人体试验伦理学标准，并得到伦理委员会的批准，受试者在受试前已知情，且获得书面同意。

6.分组设计

胃癌脾虚证组VS正常对照组，胃癌脾虚证组VS胃癌湿热蕴脾证组，为减少实验误差，胃癌脾虚证组、正常对照组及胃癌湿热证组各设置2个组别，每个对照共进行4组实验重复。

(二)唾液标本的收集及处理

按照本课题专用临床观察表进行临床观察记录。取材前一天晚上临睡前清水漱口三次(不再进任何食物和药物)，采用非刺激性唾液采集方式，第二天晨起后漱口前空腹取材。由经过培训的课题组专人取材，前5min内的唾液自然吞下后开始收集，患者将已经过消毒的无菌小圆柱形棉花含入口中，口腔唾液积聚至一定量后，将该棉花吐入置于冰浴中的15ml唾液离心管内，4℃下静置1h后，3000r/min、4℃下离心10min，冰浴上分装在1mlEP管中，每管200μl，于-80℃冰箱冷冻保存。实验时取出样本，冰上解冻，所有检测唾液样本均1次冻融。

(三)iTRAQ实验操作步骤：

1.蛋白样品的准备

(1)向冻存的唾液蛋白样品中加入600μL的1X裂解液，以超2秒停3秒，Amp20％的条件在超声破碎仪上超声2min，直至样品全部溶解变澄清；

(2)再继续在冰上裂解30min后，用提前预冷到4℃的离心机以20，000g离心40min；

(3)弃沉淀取上清，加入3kDa的超滤管中，用4℃离心机以14，000g离心超滤30min，浓缩蛋白；

(4)完成后再向超滤管中加入200μL1X裂解液，在4℃状态下，以14，000g超滤20min，重复3次；

(5)超滤结束后，收集蛋白溶液，做好命名标记保存于-20℃冰箱。

2.蛋白定量

蛋白定量使用标准BCA定量试剂盒：

(1)取96孔板，制作BSA标准曲线；

表1蛋白浓度梯度

(2)然后根据样品数量配制工作液(A液:B液＝50:1)并充分混匀；

(3)每孔加入200μLBCA工作液，每个样品及标准品3个重复孔；

(4)完成后将96孔板放入37℃温箱孵育30min；

(5)检测562nm波长下光吸收值，绘制标准曲线并得到该曲线公式，利用标准曲线公式及吸光度计算蛋白样品浓度。

3.蛋白酶解及冷冻干燥

(1)100μg的蛋白样品用6M的尿素稀释至500μL，并将稀释后的样品放入3k超滤管；

(2)使用提前预冷的4℃离心机以14000g离心15min后丢弃滤液，加入500μL的10mmol/LDTT+25mmol/LTEAB混合液，再以同样速度离心15min后丢弃滤液；

(3)步骤2重复三次后将3k超滤管中的样品置于室温孵育，时间为1h；

(4)再加入500μL20mmol/LIAA+25mmol/LTEAB混合液，以14000g于4℃离心机离心15min；

(5)弃滤液，步骤4重复三次将3k超滤管中样品置于室温避光孵育45min；

(6)再加入500μL25mmol/LTEAB，以14000g于4℃离心机离心15min；

(7)弃滤液重复步骤6两次后将3k超滤管中的样品，以1000g于4℃离心1min转移至新的1.5mlEP管中；

(8)加入100mmol/LTEAB调整pH至8.5，并向每个样品加入2μg的胰蛋白酶，置于37℃温箱孵育过夜；

(9)酶解后的样品以-5℃进行真空干燥过夜；

(10)样品完全干燥后于4℃离心机以12000g离心10min，去掉封口膜做好命名标记后放置于-80℃保存。

4.iTRAQ标记样品

(1)将iTRAQ的6个标记试剂经50ul异丙醇稀释后以1000g离心1min使iTRAQ试剂离心到试管底部；

(2)将标记物与对应样品混合(标记试剂113、114、117、118、119和121分别对应6个样品)，并用100mmol/LTEAB将所有样品的pH值调整至8.5左右；

(3)室温避光放置1h后向各管中加入100ul超纯水使标记物失活，混合6组样品，冻干保存。

5.C18脱盐

(1)在C18填充的SPE管中加入200μL50％乙腈，以1200g条件室温离心1min，重复一次；

(2)用5％乙腈和0.1％TFA溶液将样品重新溶解，并用此溶液润洗C18填充的SPE管；

(3)完成后再以1200g条件室温离心1min，重复润洗步骤三次；

(4)随后用70％乙腈30μL洗脱结合在C18填充材料上的多肽，为了提高洗脱效率以1200g的条件室温离心1min，重复两次；

(5)脱盐的样品中的乙腈在真空浓缩仪中去除，并等待上机检测。

6.液相分离及质谱鉴定

(1)样品经脱盐处理后以SolventA为流动相，设紫外检测波长为214nm/280nm，流速为2uL/min，10min进样让样品充分富集在脱盐柱上，线性梯度洗脱后真空离心浓缩。

(2)利用5-55％梯度的Solvent B将样品通过分析柱，90min后停止。

(3)质谱鉴定：质谱检测器使用Triple TOF 5600System，所得串级质谱数据通过Protein Pilot Software 4.5检索SwissProt数据，并以Mascot为检索引擎进行搜库。

(四)数据分析

(1)利用Panther Classificition System对筛选出的差异蛋白进行包括生物学进程、分子功能的以及细胞组分的GO功能富集；

(2)接着利用STRING分析软件对差异蛋白进行蛋白相互作用分析

(3)随后对差异蛋白进行KEGG信号通路分析；

(五)研究结果

1、鉴定出的差异蛋白

采用具有高通量、高灵敏度的iTRAQ联合MALDI-TOF-MS/MS技术，筛选并鉴定了胃癌患者组与正常组唾液差异表达的蛋白。胃癌脾虚组共鉴定出1258个非冗余蛋白，相对于正常组，表达上调的差异蛋白有133种，下调的有169种。在胃癌湿热组共鉴定出1265个非冗余蛋白,相对于正常组，表达上调的差异蛋白有133种，下调的有153种。其中，在胃癌脾虚组和胃癌湿热组中均表达上调的差异蛋白有59种，下调的有85种。表1和表2分别列出了上调和下调差异表达的蛋白。

2、差异蛋白的Gene Ontology(GO)富集分析

对胃癌患者和正常人唾液差异表达蛋白分别从细胞组件、分子功能及生物过程进行GO功能富集分析。发现差异蛋白在细胞组件富集中，细胞外泌体、膜小泡、细胞外蛋白以及细胞器等显示了较好的富集效果。分子功能富集中，肽链内切酶抑制剂活性、RAGE受体结合以及蛋白结合等功能富集明显。而在生物过程富集中，细菌防御反应、真菌防御反应、生物质量调控、蛋白水解调节以及炎症反应的调节等过程中有较好的富集效果。

3、差异蛋白质显著性功能分析

利用PANTHER蛋白相关通路分析软件对胃癌患者与正常人唾液差异表达蛋白进行进行GO功能聚类注释分析，分别从差异蛋白的分子功能(Molecular Function)、参与的生物过程(Biological Process)以及所属细胞组件(Cellular Component)三个角度进行具体分析。发现在经鉴定得到的144个差异蛋白，按所属不同的细胞组件分类主要有七大类蛋白，根据所占比例的多少依次依次为细胞内蛋白(39.40％)、细胞器蛋白(32.40％)、细胞外蛋白(9.90％)、膜蛋白(8.50％)、高分子配合物蛋白(5.60％)细胞连接蛋白(2.80％)、细胞外基质蛋白(1.40％)。对于已鉴定出的差异蛋白分子功能归类分析，发现共涉及8项功能，其中以催化功能(35.60％)和结合功能(31.10％)相关蛋白为主，另外，具结构分子功能蛋白占11.90％，具有酶调节活性的差异蛋白占10.40％，还有一些差异蛋白具有受体活性、转运分子功能以及等其他的功能。此外，它们还具有的生理功能或参与的病理生理过程有：参与代谢、多细胞生物过程、定位、调节细胞增殖、细胞凋亡、调节免疫系统、细胞附着等。

4、蛋白相互作用分析

为了研究胃癌患者与正常人唾液差异表达蛋白间的互相作用，我们对144个差异表达蛋白进行了STRING分析。结果显示，上调差异蛋白中，S100A系列蛋白之间的相互作用较强加上蛋白LCN2，形成一个相对完整的蛋白网络。其次，在下调差异蛋白中，处于中心位置的ENO1与其周围的PFKP、CCT7以及ACTC1等蛋白形成了一个复杂而庞大的蛋白网络，此外，STATH、HTN1、CST4以及MUC7等四个蛋白之间存在较为紧密的相互作用，并且形成一个相对独立的蛋白网路。以此提示在胃癌的形成过程中，蛋白之间的相互作用较为复杂，但这些处于蛋白相互作用网络节点及中心的蛋白能在胃癌病理过程中发挥重要作用。

差异蛋白列表如下：上调蛋白如下：

1)检索号为O43617，基因注释为Trafficking protein particle complexsubunit 3；

2)检索号为O43847，基因注释为Nardilysin；

3)检索号为O60635，基因注释为Tetraspanin-1；

4)检索号为O75531，基因注释为Barrier-to-autointegration factor；

5)检索号为O95969，基因注释为Secretoglobin family 1D member 2；

6)检索号为P00480，基因注释为Ornithine carbamoyltransferase,mitochondrial；

7)检索号为P01040，基因注释为Cystatin-A；

8)检索号为P01699，基因注释为Ig lambda chain V-I region VOR；

9)检索号为P01764，基因注释为Ig heavy chain V-III region 23；

10)检索号为P01773，基因注释为Ig heavy chain V-III region BUR；

11)检索号为P02538，基因注释为Keratin,type II cytoskeletal 6A；

12)检索号为P02549，基因注释为Spectrin alpha chain,erythrocytic 1；

13)检索号为P02795，基因注释为Metallothionein-2；

14)检索号为P05109，基因注释为Protein S100-A8；

15)检索号为P06702，基因注释为Protein S100-A9；

16)检索号为P06703，基因注释为Protein S100-A6；

17)检索号为P08246，基因注释为Neutrophil elastase；

18)检索号为P12532，基因注释为Creatine kinase U-type,mitochondrial；

19)检索号为P13646，基因注释为Keratin,type I cytoskeletal 13；

20)检索号为P13987，基因注释为CD59glycoprotein OS＝Homo sapiens；

21)检索号为P19013，基因注释为Keratin,type II cytoskeletal 4；

22)检索号为P22528，基因注释为Cornifin-B OS＝Homo sapiens；

23)检索号为P27918，基因注释为Properdin OS＝Homo sapiens；

24)检索号为P30050，基因注释为60S ribosomal protein L12；

25)检索号为P31151，基因注释为Protein S100-A7；

26)检索号为P35321，基因注释为Cornifin-A；

27)检索号为P47755，基因注释为F-actin-capping protein subunit alpha-2；

28)检索号为P49643，基因注释为DNA primase large subunit；

29)检索号为P50452，基因注释为Serpin B8；

30)检索号为P58062，基因注释为Serine protease inhibitor Kazal-type 7；

31)检索号为P59665，基因注释为Neutrophil defensin 1；

32)检索号为P80188，基因注释为Neutrophil gelatinase-associatedlipocalin；

33)检索号为Q00872，基因注释为Myosin-binding protein C,slow-type；

34)检索号为Q07654，基因注释为Trefoil factor 3；

35)检索号为Q13232，基因注释为Nucleoside diphosphate kinase 3；

36)检索号为Q14210，基因注释为Lymphocyte antigen 6D；

37)检索号为Q14314，基因注释为Fibroleukin；

38)检索号为Q14766，基因注释为Latent-transforming growth factor beta-binding protein 1；

39)检索号为Q53FA7，基因注释为Quinone oxidoreductase PIG3；

40)检索号为Q5T7N2，基因注释为LINE-1type transposase domain-containingprotein 1；

41)检索号为Q6ZWK6，基因注释为Transmembrane protease serine 11F；

42)检索号为Q86SG5，基因注释为Protein S100-A7A；

43)检索号为Q86UR5，基因注释为Regulating synaptic membrane exocytosisprotein 1；

44)检索号为Q8N4H5TOM5，基因注释为MitochondrialimportreceptorsubunitTOM5homolog；

45)检索号为Q8NFT8，基因注释为Delta and Notch-likeepidermalgrowthfactor-related receptor；

46)检索号为Q92876，基因注释为Kallikrein-6；

47)检索号为Q96RM1，基因注释为Smallproline-richprotein2F；

48)检索号为Q99523，基因注释为Sortilin；

49)检索号为Q9BXX3，基因注释为Ankyrin repeatdomain-containingprotein30A；

50)检索号为Q9GZP4，基因注释为PITH domain-containing protein 1；

51)检索号为Q9H583，基因注释为HEAT repeat-containing protein1；

52)检索号为Q9HB71，基因注释为Calcyclin-binding protein；

53)检索号为Q9NR99，基因注释为Matrix-remodeling-associated protein 5；

54)检索号为Q9NX78，基因注释为Transmembrane protein260；

55)检索号为Q9UFN0，基因注释为Protein NipSnap homolog 3A；

56)检索号为Q9UHV9，基因注释为Prefoldin subunit 2；

57)检索号为Q9ULS5，基因注释为Transmembrane and coiled-coil domainsprotein 3；

58)检索号为Q9Y546，基因注释为Leucine-rich repeat-containing protein42；

59)检索号为Q9Y6Q9，基因注释为Nuclear receptor coactivator 3；

下调蛋白如下：

1)检索号为O00764，基因注释为Pyridoxal kinase；

2)检索号为O14497，基因注释为AT-rich interactive domain-containingprotein 1A；

3)检索号为O15111，基因注释为Inhibitor of nuclear factor kappa-B kinasesubunit alpha；

4)检索号为O43852，基因注释为Calumenin；

5)检索号为O60610，基因注释为Protein diaphanous homolog 1；

6)检索号为O76070，基因注释为Gamma-synuclein；

7)检索号为O95817，基因注释为BAG family molecular chaperone regulator3；

8)检索号为P01036，基因注释为Cystatin-S；

9)检索号为P02748，基因注释为Complement component C9；

10)检索号为P02808，基因注释为Statherin；

11)检索号为P04062，基因注释为Glucosylceramidase；

12)检索号为P04745，基因注释为Alpha-amylase 1；

13)检索号为P06733，基因注释为Alpha-enolase；

14)检索号为P07360，基因注释为Complement component C8gamma chain；

15)检索号为P07711，基因注释为CathepsinL1；

16)检索号为P08697，基因注释为Alpha-2-antiplasmin；

17)检索号为P0C0S5，基因注释为Histone H2A.Z；

18)检索号为P15309，基因注释为Prostatic acid phosphatase；

19)检索号为P15515，基因注释为Histatin-1；

20)检索号为P16278，基因注释为Beta-galactosidase；

21)检索号为P16870，基因注释为Carboxypeptidase E；

22)检索号为P23219，基因注释为Prostaglandin G/H synthase 1；

23)检索号为P23280，基因注释为Carbonic anhydrase 6；

24)检索号为P28325，基因注释为Cystatin-D；

25)检索号为P30085，基因注释为UMP-CMP kinase；

26)检索号为P30408，基因注释为Transmembrane 4L6family member 1；

27)检索号为P30740，基因注释为Leukocyte elastase inhibitor；

28)检索号为P41218，基因注释为Myeloid cell nuclear differentiationantigen；

29)检索号为P42025，基因注释为Beta-centractin；

30)检索号为P50747，基因注释为Biotin--protein ligase；

31)检索号为P51610，基因注释为Host cell factor 1；

32)检索号为P58499，基因注释为Protein FAM3B；

33)检索号为P62328，基因注释为Thymosin beta-4；

34)检索号为P63313，基因注释为Thymosin beta-10；

35)检索号为P68032，基因注释为Actin,alpha cardiac muscle 1；

36)检索号为P68431，基因注释为Histone H3.1；

37)检索号为P80303，基因注释为Nucleobindin-2；

38)检索号为Q01813，基因注释为ATP-dependent 6-phosphofructokinase,platelettype；

39)检索号为Q04118，基因注释为Basic salivary proline-richprotein 3；

40)检索号为Q05315，基因注释为Galectin-10；

41)检索号为Q09MP3，基因注释为RAD51-associated protein2；

42)检索号为Q15008，基因注释为26S proteasome non-ATPase regulatorysubunit6；

43)检索号为Q15370，基因注释为Transcriptionelongationfactor Bpolypeptide 2；

44)检索号为Q15782，基因注释为Chitinase-3-like protein2；

45)检索号为Q15942，基因注释为Zyxin；

46)检索号为Q2QGD7，基因注释为Zinc finger proteinZXDC；

47)检索号为Q3ZCW2，基因注释为Galectin-related protein；

48)检索号为Q53EP0，基因注释为Fibronectintype III domain-containingprotein3B；

49)检索号为Q5SNV9，基因注释为Uncharacterized protein C1orf167；

50)检索号为Q6PIF6，基因注释为Unconventional myosin-VIIb；

51)检索号为Q6ZSZ6，基因注释为Teashirthomolog 1；

52)检索号为Q8IUE6，基因注释为Histone H2A type 2-B；

53)检索号为Q8IWQ3，基因注释为Serine/threonine-protein kinase BRSK2；

54)检索号为Q8IZF0，基因注释为Sodium leak channel non-selectiveprotein；

55)检索号为Q8N4F0，基因注释为BPI fold-containing family B member 2；

56)检索号为Q8NBJ4，基因注释为Golgi membrane protein 1；

57)检索号为Q8NBS9，基因注释为Thioredoxin domain-containing protein 5；

58)检索号为Q8TAX7，基因注释为Mucin-7；

59)检索号为Q8TBY0，基因注释为Probable RNA-binding protein 46；

60)检索号为Q8WWL2，基因注释为Protein spire homolog 2；

61)检索号为Q8WWY7，基因注释为WAP four-disulfide core domain protein12；

62)检索号为Q92485，基因注释为Acid sphingomyelinase-likephosphodiesterase 3b；

63)检索号为Q92521，基因注释为GPI mannosyltransferase 3；

64)检索号为Q92747，基因注释为Actin-related protein 2/3complex subunit1A；

65)检索号为Q96CN5，基因注释为Leucine-rich repeat-containing protein45；

66)检索号为Q96DA0，基因注释为Zymogen granule protein16homologB；

67)检索号为Q96DR5，基因注释为BPI fold-containingfamily Amember 2；

68)检索号为Q96G27，基因注释为WW domain-binding protein1；

69)检索号为Q96P20，基因注释为NACHT,LRRand PYD domains-containingprotein3；

70)检索号为Q96Q06，基因注释为Perilipin-4；

71)检索号为Q99592，基因注释为Zinc finger and BTB domain-containingprotein 18；

72)检索号为Q99832，基因注释为T-complexprotein1subuniteta OS＝Homosapiens；

73)检索号为Q9BYX7，基因注释为Putative beta-actin-like protein 3；

74)检索号为Q9BZ71，基因注释为Membrane-associated phosphatidylinositoltransferprotein3；

75)检索号为Q9HBR0，基因注释为Putative sodium-coupled neutral aminoacidtransporter 10；

76)检索号为Q9HC38，基因注释为Glyoxalase domain-containing protein 4；

77)检索号为Q9NR45，基因注释为Sialic acid synthase；

78)检索号为Q9NW08，基因注释为DNA-directed RNA polymerase III subunitRPC2；

79)检索号为Q9UGN4，基因注释为CMRF35-like molecule 8；

80)检索号为Q9Y287，基因注释为Integral membrane protein 2B；

81)检索号为Q9Y2J8，基因注释为Protein-arginine deiminase type-2；

82)检索号为Q9Y2K3，基因注释为Myosin-15OS＝Homo sapiens；

83)检索号为Q9Y496，基因注释为Kinesin-like protein KIF3A；

84)检索号为Q9Y4U1，基因注释为Methylmalonic aciduria and homocystinuriatype Cprotein；

85)检索号为Q9Y646，基因注释为Carboxypeptidase Q。

5、差异蛋白KEGG通路分析

通过查阅KEGG有关Pathway的主要公共数据库，共发现144例差异蛋白主要参与的信号通路包括代谢、唾液分泌、系统性红斑狼疮、溶酶体、嘧啶代谢、补充和凝血级联、酒精中毒、细胞凋亡、病毒感染、肌动蛋白细胞骨架的监管、志贺氏菌病NOD受体信号通路、癌症转录错误调节、癌症通路、RNA降解等。其中以蛋白IKK为例，同时参与癌症通路以及细胞凋亡通路之中。

6、关键性蛋白的筛选

S100蛋白基因家族，该家族有20多个成员，越来越多的证据表明S100家族中的许多基因与肿瘤的发生、发展密切相关。S100钙结合蛋白A6(S100calcium-binding proteinA6，S100A6)是具有EF-手型结构的钙结合蛋白，是一种酸性、小分子、稳定性蛋白，主要通过与Ca ²⁺以及靶向蛋白相互作用广泛参与细胞的增值，周期调节，基因转录以及细胞分化等过程。有相关研究表明，血清S100A6的升高有助于提高胃癌患者的诊断。S100A7作为S100家族成员之一，在多种不同的肿瘤中呈现高表达，提示S100A7可能与肿瘤的发生、发展关系十分密切，有望成为多种不同肿瘤的分子治疗靶点。S100A8/S100A9在体内多以异二聚体的形式存在，与机体的防御和损伤修复功能有关。最近在几种常见的恶性肿瘤中也相继发现其上调表达，例如胃癌、前列腺癌和结直肠癌，涉及调节肿瘤细胞增值。S100A8和S100A9也涉及肿瘤转移过程。S100A8和S100A9的表达和其在炎症和肿瘤中类似细胞因子的功能意味着他们在炎症相关的肿瘤中发挥着重要的作用。S100A9蛋白同大部分S100蛋白家族成员类似，均具有两个EF手型结构，可与Ca2+结合后构相发生改变，进而与相应靶蛋白结合发挥生物学效应，功能涉及细胞分化、增殖、蛋白磷酸化、突变细胞的侵袭与转移。S100A9蛋白可参与调节细胞信号传导通路，从而在肿瘤进展过程中发挥作用。在本研究中，与正常人唾液相比，胃癌患者唾液中的S100A家族的这些蛋白都呈现明显上调的趋势，以此提示我们S100A家族蛋白S100A6、S100A7、S100A8以及S100A9都可成为胃癌的潜在生物表标志物。

三叶因子家族(trefoil factor family,TFF)是一群主要由胃肠道黏液细胞分泌的小分子多肽，三叶因子家族包括乳癌相关肽(TFF1)、解痉多肽(TFF2)和肠三叶因子(TFF3)。三叶因子主要功能是维持胃肠道黏膜的完整性和促进损伤上皮修复，此外还具有细胞信号转导,调节细胞凋亡和促进肿瘤侵袭的功能，从而在炎症和肿瘤过程中都起到了重要作用。TFF3在正常胃黏膜组织不表达或少量表达，但在发生胃癌时,其表达明显增加。Dhar et al报道TFF3阴性的进展期胃癌的5年无病生存率为91.3％，而TFF3阳性患者的5年无病生存率仅为42.8％,其中女性中TFF3阴性的进展期胃癌与早期胃癌的生存期大致相当,提示TFF3表达阳性是胃癌预后不良的独立性预测因子。研究发现胃中有25％的肠化生非癌组织表达TFF3,而62％的胃癌组织及24％的临近组织有TFF3的表达，表明TFF3阳性表达与胃癌密切相关。因此TFF3与胃癌关系密切，并可能作为胃癌的独立预后因子之一。

IKKα作为IKK家族成员之一，在大部分情况下和IKKβ形成异源二聚体，在少数情况下和IKKα形成同源二聚从而行使其功能。在特定情况下IKKα能够调控NF-kB的活性，而后者作为一个重要的转录因子，能够调控一系列生物学过程，而它的异常激活通常能够导致肿瘤的发生。研究证明IKKα能够调控相关靶基因的表达，这些靶基因涉及细胞转化、肿瘤发展、血管生成，因此它在肿瘤的发生发展过程中有着极为重要的作用。

ENO1是一个高度保守的胞浆糖酵解酶，由两个含有433个氨基酸，分子量约47kDa的亚单位构成的二聚体，在细胞质中起催化作用，形成磷酸烯醇式丙酮酸。Kim JW等最近研究表明，ENO1是一个多功能蛋白；ENO1不仅表达于胞浆，也表达与细胞膜的表面，除了在胞质中发挥糖酵解的作用外，细胞膜表面ENO1起着纤溶酶原的受体的作用，参与结合、活化、稳定纤溶酶原以及肿瘤细胞的侵袭和转移。此外，ENO1的高表达可以增强单核巨噬细胞的浸润能力，提高穿透基质的能力，还可能通过Notch信号通路控制C-MYC癌蛋白的表达，参与肿瘤的形成过程。缺氧诱导因子HIF-1α参与机体对缺氧的反应，是一个转录因子，能激活编码葡萄糖转运蛋白，糖酵解酶，VEGF的基因转录。多项研究显示，ENO1、PKM2基因同为HIF-1α作用的靶基因。在缺氧的情况下，HIF-1α通过不同的途径启动ENO1、M2-PK基因表达。因此，ENO1对调控恶性肿瘤的发生、发展可能起着重要作用。

本发明能够快速、可靠的蛋白质组学技术方案来发现胃癌中的特异性蛋白标记物，为胃癌早期诊治、术后复发、转移及预后观察建立一种无创、简便、快捷实用的检测评估手段。

上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明，但是本专利并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本专利宗旨的前提下作出各种变化。

Claims (1)

1.一种无创伤胃癌唾液生物标记物的筛选方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)蛋白样品的准备：向冻存的唾液蛋白样品中加入600μL的1X裂解液，以超声波2秒停3秒，Amp20％的条件在超声破碎仪上超声2min，直至样品全部溶解变澄清；再继续在冰上裂解30min后，用提前预冷到4℃的离心机以20，000g离心40min；弃沉淀取上清，加入3kDa的超滤管中，用4℃离心机以14000g离心超滤30min，浓缩蛋白；完成后再向超滤管中加入200μL1X裂解液，在4℃状态下，以14000g超滤20min，重复3次；超滤结束后，收集蛋白溶液，做好命名标记保存于-20℃冰箱；

(2)蛋白定量：蛋白定量使用标准BCA定量试剂盒，取96孔板，制作BSA标准曲线；然后根据样品数量配制工作液并充分混匀；每孔加入200μLBCA工作液，每个样品及标准品3个重复孔；完成后将96孔板放入37℃温箱孵育30min；检测562nm波长下光吸收值，绘制标准曲线并得到该曲线公式，利用标准曲线公式及吸光度计算蛋白样品浓度；

(3)蛋白酶解及冷冻干燥：100μg的蛋白样品用6M的尿素稀释至500μL，并将稀释后的样品放入3k超滤管；使用提前预冷的4℃离心机以14000g离心15min后丢弃滤液，加入500μL的10mmol/LDTT+25mmol/LTEAB混合液，再以同样速度离心15min后丢弃滤液，重复三次后将3k超滤管中的样品置于室温孵育，时间为1h；再加入500μL20mmol/LIAA+25mmol/LTEAB混合液，以14000g于4℃离心机离心15min，弃滤液，重复三次将3k超滤管中样品置于室温避光孵育45min；再加入500μL25mmol/LTEAB，以14000g于4℃离心机离心15min；弃滤液重复步骤6两次后将3k超滤管中的样品，以1000g于4℃离心1min转移至新的1.5mlEP管中；加入100mmol/LTEAB调整pH至8.5，并向每个样品加入2μg的胰蛋白酶，置于37℃温箱孵育过夜；酶解后的样品以-5℃进行真空干燥过夜；样品完全干燥后于4℃离心机以12000g离心10min，去掉封口膜做好命名标记后放置于-80℃保存；

(4)iTRAQ标记样品：将iTRAQ的6个标记试剂经50ul异丙醇稀释后以1000g离心1min使iTRAQ试剂离心到试管底部；将标记物与对应样品混合，并用100mmol/LTEAB将所有样品的pH值调整至8.5左右；室温避光放置1h后向各管中加入100ul超纯水使标记物失活，混合6组样品，冻干保存；

(5)C18脱盐：在C18填充的SPE管中加入200μL50％乙腈，以1200g条件室温离心1min，重复一次；用5％乙腈和0.1％TFA溶液将样品重新溶解，并用此溶液润洗C18填充的SPE管；完成后再以1200g条件室温离心1min，重复润洗步骤三次；随后用70％乙腈30μL洗脱结合在C18填充材料上的多肽，为了提高洗脱效率以1200g的条件室温离心1min，重复两次；脱盐的样品中的乙腈在真空浓缩仪中去除，并等待上机检测；

(6)液相分离及质谱鉴定：样品经脱盐处理后以SolventA为流动相，设紫外检测波长为214nm/280nm，流速为2uL/min，10min进样让样品充分富集在脱盐柱上，线性梯度洗脱后真空离心浓缩；利用5-55％梯度的Solvent B将样品通过分析柱，90min后停止；质谱鉴定：质谱检测器使用Triple TOF 5600 System，所得串级质谱数据通过Protein Pilot Software4.5检索SwissProt数据，并以Mascot为检索引擎进行搜库；

(7)数据分析：利用Panther Classificition System对筛选出的差异蛋白进行包括生物学进程、分子功能的以及细胞组分的GO功能富集；接着利用STRING分析软件对差异蛋白进行蛋白相互作用分析；随后对差异蛋白进行KEGG信号通路分析；

(8)检测结果：对胃癌组和正常对照组进行对比实验，定量蛋白质组学研究结果显示：鉴定1297个蛋白；与正常对照组相比，胃癌组中鉴定到的1.5倍以上表达差异的显著差异蛋白共140个，其中上调蛋白64个，下调蛋白76个；差异蛋白列表如下：上调蛋白如下：

1)检索号为O43617，基因注释为Trafficking protein particle complex subunit3；

2)检索号为O43847，基因注释为Nardilysin；

3)检索号为O60635，基因注释为Tetraspanin-1；

4)检索号为O75531，基因注释为Barrier-to-autointegration factor；

5)检索号为O95969，基因注释为Secretoglobin family 1D member 2；

6)检索号为P00480，基因注释为Ornithine carbamoyltransferase,mitochondrial；

7)检索号为P01040，基因注释为Cystatin-A；

8)检索号为P01699，基因注释为Ig lambda chain V-I region VOR；

9)检索号为P01764，基因注释为Ig heavy chain V-III region 23；

10)检索号为P01773，基因注释为Ig heavy chain V-III region BUR；

11)检索号为P02538，基因注释为Keratin,type II cytoskeletal 6A；

12)检索号为P02549，基因注释为Spectrin alpha chain,erythrocytic 1；

13)检索号为P02795，基因注释为Metallothionein-2；

14)检索号为P05109，基因注释为Protein S100-A8；

15)检索号为P06702，基因注释为Protein S100-A9；

16)检索号为P06703，基因注释为Protein S100-A6；

17)检索号为P08246，基因注释为Neutrophil elastase；

18)检索号为P12532，基因注释为Creatine kinase U-type,mitochondrial；

19)检索号为P13646，基因注释为Keratin,type I cytoskeletal 13；

20)检索号为P13987，基因注释为CD59 glycoprotein OS＝Homo sapiens；

21)检索号为P19013，基因注释为Keratin,type II cytoskeletal 4；

22)检索号为P22528，基因注释为Cornifin-B OS＝Homo sapiens；

23)检索号为P27918，基因注释为Properdin OS＝Homo sapiens；

24)检索号为P30050，基因注释为60S ribosomal protein L12；

25)检索号为P31151，基因注释为Protein S100-A7；

26)检索号为P35321，基因注释为Cornifin-A；

27)检索号为P47755，基因注释为F-actin-capping protein subunit alpha-2；

28)检索号为P49643，基因注释为DNA primase large subunit；

29)检索号为P50452，基因注释为Serpin B8；

30)检索号为P58062，基因注释为Serine protease inhibitor Kazal-type 7；

31)检索号为P59665，基因注释为Neutrophil defensin 1；

32)检索号为P80188，基因注释为Neutrophil gelatinase-associated lipocalin；

33)检索号为Q00872，基因注释为Myosin-binding protein C,slow-type；

34)检索号为Q07654，基因注释为Trefoil factor 3；

35)检索号为Q13232，基因注释为Nucleoside diphosphate kinase 3；

36)检索号为Q14210，基因注释为Lymphocyte antigen 6D；

37)检索号为Q14314，基因注释为Fibroleukin；

38)检索号为Q14766，基因注释为Latent-transforming growth factor beta-binding protein 1；

39)检索号为Q53FA7，基因注释为Quinone oxidoreductase PIG3；

40)检索号为Q5T7N2，基因注释为LINE-1type transposase domain-containingprotein 1；

41)检索号为Q6ZWK6，基因注释为Transmembrane protease serine 11F；

42)检索号为Q86SG5，基因注释为Protein S100-A7A；

43)检索号为Q86UR5，基因注释为Regulating synaptic membrane exocytosisprotein 1；

44)检索号为Q8N4H5TOM5，基因注释为Mitochondrial import receptor subunitTOM5 homolog；

45)检索号为Q8NFT8，基因注释为Delta and Notch-like epidermal growth factor-related receptor；

46)检索号为Q92876，基因注释为Kallikrein-6；

47)检索号为Q96RM1，基因注释为Small proline-rich protein 2F；

48)检索号为Q99523，基因注释为Sortilin；

49)检索号为Q9BXX3，基因注释为Ankyrin repeat domain-containing protein 30A；

50)检索号为Q9GZP4，基因注释为PITH domain-containing protein 1；

51)检索号为Q9H583，基因注释为HEAT repeat-containing protein 1；

52)检索号为Q9HB71，基因注释为Calcyclin-binding protein；

53)检索号为Q9NR99，基因注释为Matrix-remodeling-associated protein 5；

54)检索号为Q9NX78，基因注释为Transmembrane protein 260；

55)检索号为Q9UFN0，基因注释为Protein NipSnap homolog 3A；

56)检索号为Q9UHV9，基因注释为Prefoldin subunit 2；

57)检索号为Q9ULS5，基因注释为Transmembrane and coiled-coil domains protein3；

58)检索号为Q9Y546，基因注释为Leucine-rich repeat-containing protein 42；

59)检索号为Q9Y6Q9，基因注释为Nuclear receptor coactivator 3；

下调蛋白如下：

1)检索号为O00764，基因注释为Pyridoxal kinase；

2)检索号为O14497，基因注释为AT-rich interactive domain-containing protein1A；

3)检索号为O15111，基因注释为Inhibitor of nuclear factor kappa-B kinasesubunit alpha；

4)检索号为O43852，基因注释为Calumenin；

5)检索号为O60610，基因注释为Protein diaphanous homolog 1；

6)检索号为O76070，基因注释为Gamma-synuclein；

7)检索号为O95817，基因注释为BAG family molecular chaperone regulator 3；

8)检索号为P01036，基因注释为Cystatin-S；

9)检索号为P02748，基因注释为Complement component C9；

10)检索号为P02808，基因注释为Statherin；

11)检索号为P04062，基因注释为Glucosylceramidase；

12)检索号为P04745，基因注释为Alpha-amylase 1；

13)检索号为P06733，基因注释为Alpha-enolase；

14)检索号为P07360，基因注释为Complement component C8 gamma chain；

15)检索号为P07711，基因注释为Cathepsin L1；

16)检索号为P08697，基因注释为Alpha-2-antiplasmin；

17)检索号为P0C0S5，基因注释为Histone H2A.Z；

18)检索号为P15309，基因注释为Prostatic acid phosphatase；

19)检索号为P15515，基因注释为Histatin-1；

20)检索号为P16278，基因注释为Beta-galactosidase；

21)检索号为P16870，基因注释为Carboxypeptidase E；

22)检索号为P23219，基因注释为Prostaglandin G/H synthase 1；

23)检索号为P23280，基因注释为Carbonic anhydrase 6；

24)检索号为P28325，基因注释为Cystatin-D；

25)检索号为P30085，基因注释为UMP-CMP kinase；

26)检索号为P30408，基因注释为Transmembrane 4 L6 family member 1；

27)检索号为P30740，基因注释为Leukocyte elastase inhibitor；

28)检索号为P41218，基因注释为Myeloid cell nuclear differentiation antigen；

29)检索号为P42025，基因注释为Beta-centractin；

30)检索号为P50747，基因注释为Biotin--protein ligase；

31)检索号为P51610，基因注释为Host cell factor 1；

32)检索号为P58499，基因注释为Protein FAM3B；

33)检索号为P62328，基因注释为Thymosin beta-4；

34)检索号为P63313，基因注释为Thymosin beta-10；

35)检索号为P68032，基因注释为Actin,alpha cardiac muscle 1；

36)检索号为P68431，基因注释为Histone H3.1；

37)检索号为P80303，基因注释为Nucleobindin-2；

38)检索号为Q01813，基因注释为ATP-dependent 6-phosphofructokinase,platelettype；

39)检索号为Q04118，基因注释为Basic salivary proline-rich protein 3；

40)检索号为Q05315，基因注释为Galectin-10；

41)检索号为Q09MP3，基因注释为RAD51-associated protein 2；

42)检索号为Q15008，基因注释为26S proteasome non-ATPase regulatory subunit6；

43)检索号为Q15370，基因注释为Transcription elongation factor B polypeptide2；

44)检索号为Q15782，基因注释为Chitinase-3-like protein 2；

45)检索号为Q15942，基因注释为Zyxin；

46)检索号为Q2QGD7，基因注释为Zinc finger protein ZXDC；

47)检索号为Q3ZCW2，基因注释为Galectin-related protein；

48)检索号为Q53EP0，基因注释为Fibronectin type III domain-containingprotein 3B；

49)检索号为Q5SNV9，基因注释为Uncharacterized protein C 1orf167；

50)检索号为Q6PIF6，基因注释为Unconventional myosin-VIIb；

51)检索号为Q6ZSZ6，基因注释为Teashirt homolog 1；

52)检索号为Q8IUE6，基因注释为Histone H2A type 2-B；

53)检索号为Q8IWQ3，基因注释为Serine/threonine-protein kinase BRSK2；

54)检索号为Q8IZF0，基因注释为Sodium leak channel non-selective protein；

55)检索号为Q8N4F0，基因注释为BPI fold-containing family B member 2；

56)检索号为Q8NBJ4，基因注释为Golgi membrane protein 1；

57)检索号为Q8NBS9，基因注释为Thioredoxin domain-containing protein 5；

58)检索号为Q8TAX7，基因注释为Mucin-7；

59)检索号为Q8TBY0，基因注释为Probable RNA-binding protein 46；

60)检索号为Q8WWL2，基因注释为Protein spire homolog 2；

61)检索号为Q8WWY7，基因注释为WAP four-disulfide core domain protein 12；

62)检索号为Q92485，基因注释为Acid sphingomyelinase-like phosphodiesterase3b；

63)检索号为Q92521，基因注释为GPI mannosyltransferase 3；

64)检索号为Q92747，基因注释为Actin-related protein 2/3complex subunit 1A；

65)检索号为Q96CN5，基因注释为Leucine-rich repeat-containing protein 45；

66)检索号为Q96DA0，基因注释为Zymogen granule protein 16 homolog B；

67)检索号为Q96DR5，基因注释为BPI fold-containing family A member 2；

68)检索号为Q96G27，基因注释为WW domain-binding protein 1；

69)检索号为Q96P20，基因注释为NACHT,LRR and PYD domains-containing protein3；

70)检索号为Q96Q06，基因注释为Perilipin-4；

71)检索号为Q99592，基因注释为Zinc finger and BTB domain-containing protein18；

72)检索号为Q99832，基因注释为T-complex protein 1 subunit eta OS＝Homosapiens；

73)检索号为Q9BYX7，基因注释为Putative beta-actin-like protein 3；

74)检索号为Q9BZ71，基因注释为Membrane-associated phosphatidylinositoltransfer protein 3；

75)检索号为Q9HBR0，基因注释为Putative sodium-coupled neutral amino acidtransporter 10；

76)检索号为Q9HC38，基因注释为Glyoxalase domain-containing protein 4；

77)检索号为Q9NR45，基因注释为Sialic acid synthase；

78)检索号为Q9NW08，基因注释为DNA-directed RNA polymerase III subunit RPC2；

79)检索号为Q9UGN4，基因注释为CMRF35-like molecule 8；

80)检索号为Q9Y287，基因注释为Integral membrane protein 2B；

81)检索号为Q9Y2J8，基因注释为Protein-arginine deiminase type-2；

82)检索号为Q9Y2K3，基因注释为Myosin-15 OS＝Homo sapiens；

83)检索号为Q9Y496，基因注释为Kinesin-like protein KIF3A；

84)检索号为Q9Y4U1，基因注释为Methylmalonic aciduria and homocystinuriatype C protein；

85)检索号为Q9Y646，基因注释为Carboxypeptidase Q。