CN108047327B - 一种检测骨关节炎的生物标志物及其应用 - Google Patents

一种检测骨关节炎的生物标志物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测骨关节炎的生物标志物，所述生物标志物包括CRISP3蛋白和/或CALML3蛋白。本发明公开了一种与骨关节炎相关的蛋白CRISP3和/CALML3，并进一步证实该CRISP3蛋白和/或CALML3蛋白在尿液中表达下调。利用该蛋白检测骨关节炎不仅能够快速有效的做到早期检测，而且为基因治疗、药物治疗等临床应用提供了治疗靶点和重要依据。

Description

一种检测骨关节炎的生物标志物及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种检测骨关节炎的生物标志物及其应用。
背景技术
骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种多因素导致发病的在中老年人群中十分常见的慢性退行性关节疾病，在全球分布广泛，女性多于男性，常见于膝关节、手指小关节、髋关节，也可见于肩关节、腕关节、踝关节等。骨关节炎是以关节软骨磨损、退变和关节周缘骨质增生为特征，急性期还常伴有滑膜炎。据调查，骨关节炎在60岁以上人群中患病率达50％以上，75岁以上人群患病率高达80％，该疾病的致残率可达53％。
膝关节骨关节炎造成膝关节疼痛、肿胀、僵硬、膝关节活动度受限和功能障碍等，严重影响患者的生活质量，最终也间接影响其预期寿命。目前，由于对OA的病因学尚缺乏根本性的认识，医学界对其根治仍然缺乏行之有效的药物手段，关节置换手术往往成为患者最终必须选择的治疗方式。为了走出OA治疗方面的困境，阐明OA的病因学机理并在其基础上探索治疗OA的有效方案，成为了医学界有待突破的研究方向。
蛋白质组的定义是指一个基因组、一个或多个细胞或某些组织所表达的所有蛋白质，无论是小到一个细胞还是大到一个生物体，都是从一个整体水平去研究参与生命活动的所有蛋白质。这些所有蛋白质并不是一个一成不变的集合，而是随时随地变化着的，因为随着生命活动的进行和稳态的调节总有不同的蛋白质在被表达或修饰。蛋白质是生命活动的承担者，也是大多数生物体结构的组成部分，蛋白质的形成要经过一系列的转录后修饰，因此，从基因组和转录组并不能直接推导出蛋白质组的情况。
蛋白质组学研究的标本可以是组织、细胞、血液、关节液、尿液等，早年对尿蛋白质组学的研究往往局限于泌尿系统疾病，后来逐渐扩展到全身性的以代谢紊乱为表现的疾病。由于尿液中很少有高丰度蛋白的影响，相比血液和关节液而言，尿蛋白质组学更有利于寻找疾病的生物标志物，同时可能在疾病机理上有所发现。
目前骨科关节领域用尿液为标本进行尿蛋白质组学的研究并不多，随着以iTRAQ技术等高通量蛋白质组学技术的出现和发展，这一领域的尿蛋白质组学研究呈现出逐渐增多的趋势。如前言所述，越来越多的证据表明骨关节炎的发生和发展与代谢因素有关，与此同时，很多学者多年来也在试图寻找骨关节炎的生物标志物未果，因此，很适合用尿蛋白质组学的方法来探索骨关节炎的生物标志物和研究其相关病理机制。
发明内容
为了实现骨关节炎的早期发现，早期干预，本发明的目的在于提供CRISP3蛋白和/或CALML3蛋白在作为骨关节炎生物标志物中的应用。
为实现上述目的，本发明首先提供了一种检测骨关节炎的生物标志物，所述生物标志物包括CRISP3蛋白和/或CALML3蛋白；编码所述CRISP3蛋白和/或CALML3蛋白的mRNA；编码所述CRISP3蛋白和/或CALML3蛋白的基因。
本发明的第二方面提供了所述生物标志物在诊断骨关节炎和/或评估罹患骨关节炎风险的产品中的应用。
优选的，所述产品包括芯片或试剂盒。
优选的，所述CRISP3蛋白和/或CALML3蛋白在骨关节炎生物样品中表达下调。
优选的，所述检测包括基因水平的检测和蛋白水平的检测。如，所述基因水平的检测包括real-time PCR法、Northernblot、Southernblot、基因芯片、原位杂交或RNA酶保护实验等。所述蛋白水平的检测包括免疫检测、Westernblot或蛋白芯片等。为了简化实验程序，所述蛋白水平的检测还包括蛋白检测试剂盒，如ELISA检测试剂盒、胶体金检测试剂盒、免疫共沉淀试剂盒、化学发光试剂盒、免疫荧光试剂盒等。所述试剂盒中一般配备有相应的使用说明书，说明书一般包括公司标志及名称、试剂盒名称、试剂盒组成、保质期、使用领域、使用方法等项目，用户按照说明书不需或只需少量的优化即可得到满意的结果。
优选的，所述免疫方法为ELISA法检测和/或胶体金检测。
所述ELISA法为使用ELISA检测试剂盒，所述的试剂盒包括：包被CRISP3单克隆抗体的固相载体，酶标抗体，酶的底物，蛋白标准品，阴性对照品，稀释液，洗涤液，酶反应终止液等。
本发明的第三方面提供了所述生物标志物在筛选预防或治疗骨关节炎的药物的应用。
优选的，所述CRISP3蛋白和/或CALML3蛋白在骨关节炎生物样品中表达下调。
优选的，所述的样品为尿液。
本发明的第四方面提供了能够抑制尿液中CRISP3蛋白和/或CALML3蛋白表达的物质在制备预防或治疗骨关节炎药物中的应用。
本发明的第五方面提供了用于检测骨关节炎发生的系统，该系统包括检测CRISP3蛋白和/或CALML3蛋白。
优选的，所述系统包括数据处理装置，所述数据处理装置内设采集比较模块a和处理模块b，所述采集比较模块a的功能为：采集并比较待测者与对照者的尿液样本中所述CRISP3蛋白和/或CALML3蛋白的表达量；所述处理模块b的功能为根据比较的结果按照如下方法确定待测者是否为骨关节炎患者：若所述待测者的尿液样本中所述CRISP3蛋白和/或CALML3蛋白的表达量显著低于所述对照组的尿液样本中所述CRISP3蛋白和/或CALML3蛋白的表达量，则所述待测者为或候选为骨关节炎患者；反之，则所述待测者不为或候选不为骨关节炎患者；所述对照者为健康人。
优选地，处理模块b中判断下调的标准是待测者的尿液中所述CRISP3蛋白和/或CALML3蛋白的表达量比对照者至少降低30％。
优选地，处理模块b中判断下调的标准是待测者的尿液样本中所述CRISP3蛋白和/或CALML3蛋白的表达量比对照者至少降低60％。
优选地，处理模块b中判断下调的标准是待测者的尿液样本中所述CRISP3蛋白和/或CALML3蛋白的表达量比对照者至少降低90％。
本发明的有益效果如下：
本发明公开了一种与骨关节炎相关的蛋白CRISP3和/或CALML3，并进一步证实该CRISP3蛋白和/或CALML3蛋白在骨关节炎患者尿液中表达下调。利用该蛋白检测骨关节炎不仅能够快速有效的做到早期检测，而且为基因治疗、药物治疗等临床应用提供了治疗靶点和重要依据。
附图说明
图1本发明实施例3中的CALML3表达量标准曲线；
图2本发明实施例3中的CRISP3表达量标准曲线。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用的试剂可以商业购买得到。
实施例中未注明具体条件的实验方法，通常为本领域常规方法。
本发明的发明人对4例骨关节炎样本及4例对照样本进行iTRAQ实验，结合生物信息学方法进行筛选，挑选出候选蛋白CRISP3和/或CALML3，现有研究中并没有CRISP3蛋白和/或CALML3蛋白和骨关节炎相关的报道，进一步，发明人进行了分子生物学方法验证，证实了CRISP3蛋白和/或CALML3蛋白在骨关节炎患者尿液中表达下调，其相关产品可用于诊断、治疗骨关节炎。
本发明的CRISP3蛋白和/或CALML3蛋白是在本发明之前的已知蛋白，其基本信息如下：
CRISP3NCBI Reference Sequence:NP_001177915.1；NP_006052.2。
CALML3NCBI Reference Sequence:NP_005176.1。
本发明还采用ELISA检测试剂盒检测上述蛋白在骨关节炎和正常人群中的表达，并验证了该蛋白为骨关节炎中表达下调。
本发明应用iTRAQ联合质谱的方法鉴定性骨关节炎患者尿液中的蛋白标志物。同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)技术由AB SCIEX公司研发的一种体外同种同位素标记的相对与绝对定量技术。该技术利用多种同位素试剂标记蛋白多肽N末端或赖氨酸侧链基团，经高精度质谱仪串联分析，可同时比较多达8种样品之间的蛋白表达量，是近年来定量蛋白质组学常用的高通量筛选技术。iTRAQ定量蛋白质组学是蛋白酶切后形成多肽，用iTRAQ同位素试剂标记多肽N末端或赖氨酸侧链基团。标记后的肽段经过液相分离，进行一级质谱和二级质谱分析，在二级质谱前，被标记的不同样本中的同一肽段表现为相同的质荷比和其他理化性质。而在二级质谱中，信号离子表现为不同质荷比(114～121)的峰，根据波峰的高度及面积，可以鉴定出蛋白质和分析出同一蛋白质不同处理的定量信息。
iTRAQ试剂包括三部分：报告部分、肽反应部分、平衡部分。(1)报告部分有八种：113-121(无120)，因此iTRAQ试剂可同时标记8组样品。(2)肽反应部分：能与肽段N端及赖氨酸侧链氨基发生共价连接而标记上肽段。(3)平衡部分：保证被标记的同一肽段的质荷比相同。与传统的双向电泳定量分析相比，iTRAQ具有以下技术服务优势：(1)灵敏度高，检测限低，可检测出低丰度蛋白；(2)分离能力强，分析范围广，iTRAQ可以对任何类型的蛋白质进行分离鉴定，包括高分子量蛋白质、酸性蛋白和碱性蛋白，膜蛋白和不溶性蛋白；(3)高通量：同时对8个样本进行分析，提高了实验通量，可同时对多个时间点或不同处理的蛋白质进行分析；(4)结果可靠：定性与定量分析结果更加可靠；(5)自动化程度高：液相与质谱连用，自动化操作，分析速度快，分离效果好。
本发明的CRISP3和/或CALML3基因的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA作为模板，扩增而得到有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次扩增，然后再将多次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来编码本发明的蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中的各种DNA分子(如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明蛋白的片段除了可用重组法产生之外，还可用固相技术通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人,(1969)Soliod-Phase Peptide Synthesis,WH Freeman Co.,SanFrancisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 85:2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。
本文使用的术语“表达下调”指对应于所表达基因的序列，其中序列量的测量证明，与从正常个体或从通过骨关节炎分期确定与骨关节炎不同的已鉴定疾病状态的个体中分离的生物学样品中的同一蛋白相比，所述基因在从患骨关节炎或通过骨关节炎分期确定的骨关节炎已鉴定疾病状态的个体中分离的生物学样品中的表达水平降低。根据本发明，“表达下调”是指通过本发明方法杂交强度测量的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或更多的表达降低，例如20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更低。
本文使用的术语“表达水平”指通过本领域技术人员已知和本文所述的方法测定的给定核酸或蛋白质的可测量。涉及本发明生物标志物对应的RNA、hnRNA、mRNA或mRNA剪接变体时，表达水平可以通过杂交或更多定量测量来测定，例如包括使用SYBR Green、TaqMan和分子信标技术的定量实时RT PCR。
本文使用的“对照”指未显示任何OA症状并且未诊断为骨关节炎或OA的个体或个体组。优选地，所述对照个体未使用影响OA的药物，并且未诊断为患有任何其他疾病。更优选地，对照个体具有与测试样本相比相似的性别、年龄和体重指标(BMI)。根据本发明，“对照”还指分离自正常个体的样品，包括分离自正常个体的总RNA或mRNA。
CALML3(Calmodulin-like protein 3，钙调蛋白样蛋白3)蛋白是在组织(如乳腺，前列腺和皮肤)中高度表达的上皮特异性钙感应蛋白；近来的研究表明，它是非常规肌球蛋白-10(MYO10)的调节剂，在细胞粘附和运动中起重要作用。
CRISP3(Cysteine-rich secretory protein 3，富含半胱氨酸分泌蛋白3)是CRISP富含半胱氨酸的分泌蛋白(CRISPs)家族成员，富含半胱氨酸的分泌蛋白(CRISPs)家族属于CAP蛋白超家族(CRISPs、Antigen 5proteins、pathogenesis-related 1proteins)，依据组织特异性和序列同源性CRISPs可分为CRISP-1、CRISP-2、CRISP-3和CRISP-4四类。CRISP-3蛋白具有N末端CRISP，Antigen5和pathogenesis-related 1蛋白质结构域，铰链区和C末端离子通道调节结构域。该蛋白质含有半胱氨酸残基，位于N末端和C末端结构域中，形成八个二硫键，这是该家族的显着特征；该蛋白参与防御反应、先天免疫反应和中性粒细胞脱颗粒等的生命过程；研究表明CRISP3在某些类型的前列腺癌中表达下调。
实施例1样本的收集
病例-对照研究是本研究所采用的方法。实验组的研究对象为2015年度在北京协和医院骨科住院的患严重骨关节炎的但还未接受手术治疗的患者4例，对照组的研究对象为不患有骨关节炎的相对健康者4例，实验组符合中华医学会骨科学分会骨关节炎诊断标准。实验组的年龄为58.5±2.0岁(56-61岁)，对照组的年龄为57.6±2.1岁(55-61岁)。根据中华人民共和国国家卫生与计划生育委员会2013年制定的《成人体重判定》标准，两组均选取BMI在24-28之间的超重者。实验方案经北京协和医院伦理委员会同意，并取得每位受试者的书面知情同意。实验组和对照组基本资料见表1。收集实验组和对照组的晨起第二次中段尿，首先用无菌广口容器盛装，后转移至离心管，4,000g离心10min(4℃)，上清液被等分进50mL无菌管，-80℃保存备用。
表1样本的基本资料
Figure BDA0001487832270000081
OA病例组的纳入标准：
有完整的临床资料和影像学资料(双膝正侧位加髌骨轴位X线片)，根据病史和诊断标准诊断为严重骨关节炎(K-L分级4级)的体重超重女性患者，并签署知情同意书。
OA病例组的排除标准：
膝外伤手术史、膝关节感染、成年前膝关节畸形、代谢性骨病、下肢不等长、膝关节肿瘤史，骨质疏松症，肝肾疾病、高脂血症、高血压、糖尿病、甲状腺功能亢进、甲状旁腺功能亢进病史，近期服用雌激素、孕激素治疗者，痛风、类风湿关节炎等其它关节疾病，接受过改变病情抗风湿药或免疫抑制治疗，近6个月内接受过关节内注射药物治疗。BMI小于24或大于28。
对照组的纳入标准：
对照组选取的是不患有骨关节炎的超重女性患者，对照组的性别、年龄和BMI与OA病例组相匹配，并签署知情同意书。
对照组的排除标准：
膝外伤手术史、膝关节感染、成年前膝关节畸形、代谢性骨病、下肢不等长、膝关节肿瘤史，骨质疏松症，肝肾疾病、高脂血症、高血压、糖尿病、甲状腺功能亢进、甲状旁腺功能亢进病史，近期服用雌激素、孕激素治疗者，痛风、类风湿关节炎等其它关节疾病，接受过改变病情抗风湿药或免疫抑制治疗，近6个月内接受过关节内注射药物治疗。BMI小于24或大于28。
实施例2iTRAQ实验筛选差异蛋白
一、所用仪器和试剂
涡旋振荡器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司，型号：QL-901)
离心机(Thermo，型号：PICO17)
超声波细胞破碎仪(南京先欧仪器制造有限公司，型号：XO)
酶标仪(Thermo，型号：MultiskanMK3)
恒温孵浴器(上海浦东荣丰科学仪器有限公司，型号：HH.S4)
真空冷冻干燥机(Thermo，型号：SPD2010-230)
RIGOL L-3000高效液相色谱系统(北京普源精电科技有限公司)，流动相A：98％ddH2O，2％乙腈(pH 10)；流动相B：98％乙腈，2％ddH2O(pH 10)高效液相色谱仪：(ThermoScientic EASY-nLC 1000System(Nano HPLC))，流动相A：100％超纯水，0.1％甲酸；流动相B：100％乙腈，0.1％甲酸质谱系统(Thermo，型号：Q-Exactive)
尿素(Bio-Rad，货号：161-0731，美国)
硫尿(Sigma-Aldrich，货号：T7875，美国)
CHAPS(Bio-Rad，货号：161-0460，美国)
Protease Inhibitor Cocktail(Roche，货号：04693116001，美国)
蛋白定量染液(Thermo Scientific，货号：23238，美国)
牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)(Sigma-Aldrich，货号：A2058，美国)
DTT(Bio-Rad，货号：161-0611，美国)
碘乙酰胺(Bio-Rad，货号：163-2109，美国)
Figure BDA0001487832270000101
试剂盒中的DissolutionBuffer(AB Sciex，PN：4381664)
胰酶(Promega，货号：V5111，美国)
10K超滤管(milipore，PN：UFC5010BK)
8标
Figure BDA0001487832270000102
试剂盒(AB Sciex，PN：4390812，PN：4381664)
Ziptip(Millipore，PN：ZTC18M096(2μg))
色谱柱：Durashell-C18，4.6mm×250mm，5μm，
Figure BDA0001487832270000103
(Agela，货号：DC952505-0)
乙腈(Merck，货号：100030，德国)
氨水(Sigma-Aldrich，货号：17837，美国)
预柱(Acclaim PepMap100column，2cm x 100μm，C18，5μm)
色谱柱(EASY-Spray column，12cm x 75μm，C18，3μm)
进样瓶(Thermo，11190533)
瓶盖(Thermo，11150635)
喷针(Thermo，PN：ES542)
二、iTRAQ定量实验流程
1.样品蛋白提取
1)将样本按照1：10(W/V)加入lysis buffer(7M尿素，2M硫脲，0.1％CHAPS，片/50ml Protease Inhibitor Cocktail)，涡旋混匀。
2)超声60s(0.2s on、2s off)，振幅22％。
3)室温提取30分钟。
4)15,000g，4℃离心20min，小心取出上清，分装后冻存于-80℃。
2.蛋白定量(Bradford法)
1)采用Bradford法[Marion M.Bradford.Analytical Biochemistry,1976,72:248-254]测定样本提取的蛋白浓度。先将样本用lysis buffer(7M尿素、2M硫脲、0.1％CHAPS)进行一定倍数稀释使其终浓度落在标曲范围内，稀释好的样本和标准品(将BSA用lysis buffer溶解成系列浓度的标准蛋白)各取10ul分别和300ul蛋白定量染料避光反应20min，用酶标仪同时测定标准品和样本在595nm下的吸光值，根据标准品每管吸光值和浓度的关系绘制标准曲线(曲线公式：y＝1.4337×x2+0.0406×x+0.03728，R2＝0.98906)。
2)根据曲线公式计算各样品蛋白浓度。
3.蛋白酶解(Filter Aided Sample Preparation，FASP)
1)蛋白定量后取200μg蛋白溶液置于离心管中；
2)加入终浓度25mM DTT，60度反应1小时；
3)加入终浓度50mM碘乙酰胺，室温10分钟；
4)将还原烷基化后的蛋白溶液加入10K的超滤管中，12,000转离心20分钟，弃掉收集管底部溶液；
5)加入iTRAQ试剂盒中的DissolutionBuffer 100μl，12,000转离心20分钟，弃掉收集管底部溶液，重复3次；
6)更换新的收集管，在超滤管中加入胰蛋白酶，总量4μg(与蛋白质量比1:50)，体积50μl，37℃反应过夜；
7)次日，12,000转离心20分钟，酶解消化后的肽段溶液离心于收集管底部；
8)在超滤管中加入50μl DissolutionBuffer，12,000转再次离心20分钟，与上步合并，收集管底部共得到100μl酶解后的样品。
4.iTRAQ标记
1)从冰箱中取出iTRAQ试剂，平衡到室温，将
Figure BDA0001487832270000121
试剂离心至管底。
2)向每管
Figure BDA0001487832270000122
试剂中加入150μl异丙醇，涡旋振荡，离心至管底。
3)取50μl样品(100μg酶解产物)转移到新的离心管中。
4)将iTRAQ试剂填加到样品中，涡旋振荡，离心至管底，室温反应2小时。
5)加入100μl水终止反应。
6)为了检测标记效率及定量准确性，从4组样品中各取出1ul混合，用Ziptip脱盐后进行MALDI-TOF-TOF(AB SCIEX 4800Plus)鉴定，确认标记反应良好；
7)混合标记后的样品，涡旋振荡，离心至管底。
8)真空冷冻离心干燥。
9)抽干后的样品冷冻保存待用。
5.酶解肽段离线预分离及LC-MS/MS质谱分析
5.1高pH条件下的反相色谱分离
1)混合标记后的样品用100ul流动相A溶解，14000g离心20min，取上清待用。
2)使用400μg酶解好的BSA进行分离(柱温45℃，检测波长214nm)，检测系统情况。
3)取100ul准备好的样本上样、分离，流速0.7ml/min。
5.2纳升级反相色谱-Q Exactive进行蛋白质分析
1)将高pH反相分离得到的组份用20μl 2％甲醇，0.1％甲酸复溶。
2)12,000rpm离心10分钟，吸取上清上样。
3)上样体积10μl，采取夹心法上样。
4)Loading Pump流速350nl/min，15分钟。
5)分离流速300nl/min，分离梯度如下表2：
表2纳升级反相色谱分离梯度
Figure BDA0001487832270000131
三、质谱数据分析和结果
数据库的选择是以所需物种、数据库注释完备性及序列可靠性为参考依据的。在本次实验中选择的数据库来自UniProt(http://www.uniprot.org/)，数据库本版为：UniProt.Rat.201509.fasta。iTRAQ的质谱分析是由Thermo Q-Exactive型质谱完成，产生的质谱原始文件*.RAW采用Mascot 2.5.1软件搜库处理，采用scaffold软件对搜库结果进行质控。
基于iTRAQ技术，我们总共从实验组和对照组的尿液中鉴定到了1413种蛋白质，其中两组间的差异蛋白总共有394个，170个蛋白质在OA实验组中下调，224个蛋白质在OA实验组中下调。为了更好的理解差异蛋白的功能，我们对差异蛋白进行了Gene Onlogy和信号通路分析，并对差异蛋白进行功能注释和蛋白质互相作用网络分析，鉴于以上数据分析的结果，结合文献我们筛选了2个差异蛋白即CALML3(Calmodulin-like protein 3，钙调蛋白样蛋白3)和CRISP3(Cysteine-rich secretoryprotein 3，富含半胱氨酸分泌蛋白3)在骨关节炎患者的尿液中均呈现下调。
实施例3ELISA验证骨关节炎患者中CRISP3和CALML3蛋白的表达
1、取样
参照实施例1中挑选样本的标准，2015年在北京协和医院骨科住院选取10例骨关节炎病人，分别标号为A1-A10，对照组的研究对象为不患有骨关节炎的相对健康者10例分别标号为B1-B10。收集实验组和对照组的晨起第二次中段尿20ml，首先用无菌广口容器盛装，后转移至离心管，4,000g离心10min(4℃)，取上清液1ml分装后置于-80℃保存备用。
2、实验过程
实验选人CALML3 ELISA试剂盒和人CRISP3 ELISA试剂盒(购买Abcam公司)
CALML3ELISA检测试剂盒操作步骤如下：
(1)标准品的稀释：用1.0mL标准稀释液重新配制标准品，室内保存10分钟温度，轻轻摇动(不要起泡)。原液标准品浓度为100ng/mL。首先将原液稀释至10ng/mL，做系列倍比稀释后，建立10ng/mL，5ng/mL，2.5ng/mL，1.25ng/mL，0.625ng/mL，0.312ng/mL，0.156ng/mL稀释标准品7个，标准稀释液作为标准浓度0ng/mL，临用前15分钟内配制。
(2)加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。
(3)弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加Detection Reagent A的工作液100μl(取1μl Detection Reagent A加99μl Assay Diluent A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制)，37℃,60分钟。
(4)温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。
(5)每孔加Detection Reagent B工作液(取1μl Detection Reagent B加99μlAssay DiluentB的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制)100μl，37℃，60分钟。
(6)温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。
(7)依序每孔加底物溶液(TMB)90μl，37℃避光显色(30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显，即可终止)。
(8)依序每孔加终止溶液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。
(9)用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。在加终止液后15分钟以内进行检测。
CRISP3 ELISA检测试剂盒操作步骤如下：
(1)建立100ng/mL,50ng/mL,25ng/mL,12.5ng/mL,6.25ng/mL,3.125ng/mL和1.5625ng/mL稀释标准品7个，标准稀释液作为标准浓度0ng/mL，临用前15分钟内配制。
(2)加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应90分钟。
(3)弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液100μl(取1μl生物素标记抗体加99μl生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制)，37℃,60分钟。
(4)温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。
(5)每孔加ABC工作液100μl(取1μl Avidin-Biotin-Peroxidase Complex(ABC)加99μl ABC稀释液的比例配制)，37℃，60分钟。
(6)温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。
(7)依序每孔加底物溶液(TMB)90μl，37℃避光显色(30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显，即可终止)。
(8)依序每孔加终止溶液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。
(9)用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。在加终止液后15分钟以内进行检测。
3、结果
CALML3：
获得7个标准品的OD值，如表3所示，制作的标准曲线如图1所示。实验得到了10个样本的OD值，根据标准曲线，计算样品中CALML3的浓度，其结果如表4所示。其中，样品的OD值为三个副孔去背景后的OD均值。统计学分析表4中数据，可知10个样本的浓度值在0.708-0.804ng/ml之间，对照样本的浓度均值为1.1535ng/ml，上述差异具有统计学意义(P<0.05)，上述结果表明，CALML3蛋白在骨关节炎患者尿液样本中表达水平下调，下调在30％以上。
表3 7个标准品的OD值
标准品 1 2 3 4 5 6 7
浓度(ng/mL) 0.156 0.312 0.625 1.25 2.5 5 10
OD值 0.081 0.183 0.308 0.514 0.874 1.497 2.521
表4样品和对照的OD值和浓度值
样品编号 A1 A2 A3 A4 A5
OD均值 0.346 0.335 0.323 0.350 0.317
浓度(ng/ml) 0.792 0.760 0.726 0.804 0.708
样品编号 A6 A7 A8 A9 A10
OD均值 0.332 0.349 0.338 0.341 0.326
浓度(ng/ml) 0.752 0.801 0.769 0.778 0.734
对照编号 B1 B2 B3 B4 B5
OD均值 0.462 0.458 0.465 0.471 0.463
浓度(ng/ml) 1.138 1.125 1.147 1.165 1.141
对照编号 B6 B7 B8 B9 B10
OD均值 0.475 0.467 0.478 0.464 0.469
浓度(ng/ml) 1.177 1.153 1.186 1.144 1.159
CRISP3：
获得7个标准品的OD值，如表5所示，制作的标准曲线如图2所示。实验得到了10个样本的OD值，根据标准曲线，计算样品中CRISP3的浓度，其结果如表6所示。其中，样品的OD值为三个副孔去背景后的OD均值。统计学分析表6中数据，可知10个样本的浓度值在9.896-11.119ng/ml之间，对照样本的浓度均值为20.468ng/ml，上述差异具有统计学意义(P<0.05)，上述结果表明，CRISP3蛋白在骨关节炎患者尿液样本中表达水平下调，下调在50％左右。
表5标准品的OD值
标准品 0 1 2 3 4 5 6 7
浓度(ng/ml) 0 1.56 3.12 6.25 12.5 25 50 100
OD值 0.004 0.045 0.085 0.177 0.354 0.738 1.44 2.245
表6样品和对照的OD值和浓度值
样品编号 A1 A2 A3 A4 A5
OD均值 0.323 0.319 0.306 0.345 0.312
浓度(ng/ml) 10.428 10.302 9.896 11.119 10.083
样品编号 A6 A7 A8 A9 A10
OD均值 0.311 0.325 0.331 0.342 0.328
浓度(ng/ml) 10.052 10.490 10.679 11.024 10.584
对照编号 B1 B2 B3 B4 B5
OD均值 0.631 0.647 0.615 0.632 0.636
浓度(ng/ml) 20.444 20.986 19.904 20.478 20.613
对照编号 B6 B7 B8 B9 B10
OD均值 0.625 0.648 0.637 0.627 0.619
浓度(ng/ml) 20.241 21.020 20.647 20.309 20.039
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (6)

1.一种检测骨关节炎的生物标志物在制备诊断骨关节炎和/或评估罹患骨关节炎风险的产品中的应用，其特征在于，所述生物标志物为CRISP3蛋白和/或CALML3蛋白。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括芯片或试剂盒。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述CRISP3蛋白和/或CALML3蛋白在骨关节炎生物样品中表达下调。
4.CRISP3蛋白和/或CALML3蛋白在筛选预防或治疗骨关节炎的药物中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述CRISP3蛋白和/或CALML3蛋白在骨关节炎生物样品中表达下调。
6.如权利要求5的应用，其特征在于，所述的样品为尿液。
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