CN111500701B

CN111500701B - 非编码rna作为诊治骨关节炎的分子标志物的用途

Info

Publication number: CN111500701B
Application number: CN202010334255.7A
Authority: CN
Inventors: 杨承刚; 向常娟
Original assignee: Gu'an Bojian Biotechnology Co ltd
Current assignee: Gu'an Bojian Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-04-24
Filing date: 2020-04-24
Publication date: 2021-01-22
Anticipated expiration: 2040-04-24
Also published as: CN111500701A

Abstract

本发明公开了非编码RNA作为诊治骨关节炎的分子标志物的用途。使用本发明的非编码RNA诊断骨关节炎的敏感度为80.7％，特异性为82.5％。本发明还公开了一种治疗骨关节炎的新药物靶标，从而为开发治疗骨关节炎药物提供了理论基础。

Description

非编码RNA作为诊治骨关节炎的分子标志物的用途

技术领域

本发明属于生物医学领域，涉及非编码RNA作为诊治骨关节炎的分子标志物的用途。

背景技术

骨关节炎(osteoarthritis，OA)，又称骨关节病，最早称增生性关节炎或肥大性关节炎等，多发于中老年人，随着全社会人口老龄化进程加剧，该病的发生率越来越高。骨关节炎好发于负重较大、活动较多的关节，膝关节是骨关节炎最常见的发病部位之一，据有关资料统计，在全球50岁以上的人口中，其发病率仅次于心脏病而居第二，世界卫生组织将2000-2010年的全球健康主题确定为“骨与关节十年”。骨关节炎不仅作为医学问题，也成为社会问题，日益引起人们重视。

滑膜组织是位于关节腔内面的内衬结构，各种关节内疾病均会累及滑膜。而滑膜细胞是维持关节正常功能的重要组织结构，同时在各种关节疾患中也是主要病变部位。骨关节炎(OA)以关节软骨退行性变为特征，其病理改变累及关节的各个组成部分，但绝不仅局限于软骨，还包括软骨下骨、滑膜、半月板和韧带。各组成部分的病理改变相互影响，相互作用，共同加速关节的退变。近几年来随着对OA的深入研究，发现滑膜参与了OA的整个病变过程。在OA早期，滑膜的增生和纤维化，分泌炎症介质和软骨降解酶，是OA发病的重要因素，随着OA的进一步发展，滑膜始终参与其病理过程。滑膜成纤维细胞是滑膜组织最活跃的组成细胞，它可通过自分泌或旁分泌方式产生大量的炎性细胞因子及免疫反应介质，加速软骨基质的降解，是引起各种临床症状的主要因素。OA关节滑膜中滑膜下层成纤维细胞增殖，尤其是包绕血管的纤维增生，从而造成滑膜的血管通透性下降，阻碍滑液与血浆正常的交换，使关节内滑液成分不能得到血液中氧和营养物质。关节内软骨细胞缺乏营养而功能萎缩，合成基质能力下降，对力的缓冲能力继续下降,软骨细胞生存的微环境进一步恶化。因此，抑制滑膜细胞增殖有望成为治疗骨关节炎的新策略。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于诊治骨关节炎的长链非编码RNA标志物。本发明QPCR实验证明LINC01220在骨关节炎患者血液中的表达水平明显低于健康对照血液中的水平，另外体外细胞证明过表达LINC01220可抑制滑膜细胞增殖，因此可以将LINC01220作为诊治骨关节炎的分子标志物。

为了实验上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明提供了检测长链非编码RNA表达的试剂在制备骨关节炎诊断产品的应用；所述长链非编码RNA的编码基因Gene ID：731223。

本发明的长链非编码RNA在NCBI中的命名为LINC01220。属于基因ID：731223编码产物的LINC01220转录本为NR_038421.1，序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步，所述试剂包括利用SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、或复合探针检测LINC01220表达量时使用的PCR扩增引物。

在本发明的具体实施方案中，所述引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

本发明提供了一种用于骨关节炎诊断的产品，所述产品包括检测LINC01220表达水平的试剂。

进一步，所述试剂包括SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、或复合探针检测LINC01220表达量时使用的PCR扩增引物。

进一步，前面所述的产品包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断骨关节炎的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的RNA表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的RNA表达谱，容易分析出哪个RNA的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知LINC01220表达异常与骨关节炎相关也属于LINC01220的用途，同样在本发明的保护范围之内。

所述试剂盒包括检测LINC01220表达量的试剂，所述试剂包括与LINC01220或其DNA序列结合的核酸，所述核酸包括SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、或复合探针检测LINC01220表达量时使用的PCR扩增引物。

所述芯片包括检测LINC01220表达量的试剂，所述试剂包括与LINC01220或其DNA序列结合的核酸，所述核酸包括能够检测LINC01220表达量的探针。

所述试纸包括检测LINC01220表达量的试剂，所述试剂包括与LINC01220或其DNA序列结合的核酸，所述核酸包括能够检测LINC01220表达量的探针。

本发明提供了一种用于治疗骨关节炎的药物组合物，所述药物组合物包括促进LINC01220的试剂。

进一步，所述试剂不受限制，只要是可以促进LINC01220表达水平或促进LINC01220功能活性即可。

在本发明的具体实施方案中，促进LINC01220的试剂是促进LINC01220表达的试剂。促进LINC01220表达的试剂包括LINC01220的过表达载体。

本发明的药物组合物可以作为医药单独施用或与其它药物一起施用。可以与本发明的药物组合物一起施用的其它药物不受限制，只要它不损害本发明的治疗性或预防性药物组合物的效果即可。

本发明的药物组合物可根据需要制备成各种剂型。包括但不限于，经皮、粘膜、鼻、口颊、舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。

本发明的药物组合物的施用途径不受限制，只要它能发挥期望的治疗效果或预防效果即可，包括但不限于静脉内，腹膜内，眼内，动脉内，肺内，口服，小泡内，肌肉内，气管内，皮下的，通过皮肤，通过胸膜，局部的，吸入，通过粘膜，皮肤，肠胃，关节内，心室内，直肠，阴道，颅骨内，尿道内，肝内，瘤内。在某些情况下，可以系统地给药。在某些情况下是局部地给药。

本发明的药物组合物的剂量不受限制，只要获得期望的治疗效果或者预防效果即可，可以依据症状、性别、年龄等来恰当的确定。本发明的治疗药物组合物或预防药物组合物的剂量可以使用例如对疾病的治疗效果或者预防效果作为指标来确定。

本发明还提供了前面所述的长链非编码RNA在制备治疗骨关节炎的药物中的应用。

本发明还提供了促进LINC01220表达的试剂在制备治疗骨关节炎的药物中的应用。

本发明还提供了一种诊断骨关节炎的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)获取受试者的样品；

(2)检测受试者样品中LINC01220的表达水平；

(3)将测得的LINC01220的表达水平与受试者的患病与否关联起来。

(4)与正常对照相比，LINC01220的表达水平显著降低，则该受试者被判断患有骨关节炎、或判断该受试者患有骨关节炎的风险高。

本发明还提供了一种骨关节炎的治疗方法，所述方法包括促进LINC01220表达量或者促进LINC01220的调节活性。

在本发明的上下文中，“诊断骨关节炎”包括判断受试者是否已经患有骨关节炎、判断受试者是否存在患有骨关节炎的风险。

本文所用的“治疗”涵盖患有相关疾病或病症的哺乳动物例如人类中治疗相关的疾病或疾病状态，并且包括：

(1)预防疾病或疾病状态在哺乳动物中发生，尤其是当该哺乳动物易感于所述疾病状态，但尚未被诊断出患有这种疾病状态时；

(2)抑制疾病或疾病状态，即阻止其发生；或者

(3)缓解疾病或疾病状态，即使疾病或疾病状态消退。

术语“治疗”通常涉及治疗人类或动物(例如，被兽医所应用)，其中可达到某些预期的治疗效果，例如，抑制病症的发展(包括降低发展速度、使发展停止)、改善病症和治愈病症。还包括作为预防措施(例如预防)的治疗。对还没有发展为病症但有发展为该病症危险的患者的用途，也包括在术语“治疗”中。

如本文所用，术语“LncRNA”、“长链非编码RNA”、“Long non-coding RNA”含义相同，互换使用，都是指一种由RNA聚合酶II转录、不编码蛋白的、一般长度大于200bp的RNA片段。

本发明的优点和有益效果：

本发明发现了一种诊断骨关节炎的分子标志物，使用该分子标志物可以在骨关节炎发生的早期即可作为判断，提高了患者治愈率。

本发明发现了一种治疗骨关节炎的新药物靶标，从而为开发治疗骨关节炎药物提供理论基础。

附图说明

图1显示利用QPCR检测LINC01220的差异表达情况的统计图；

图2显示利用QPCR检测LINC01220过表达情况的统计图。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1非编码RNA在骨关节炎患者中的差异表达

1、病例收集

收集骨关节炎患者57例，其中男性28例，女性29例，平均年龄约61岁，排除类风湿性关节炎、风湿性关节炎、化脓性关节炎等疾病。另收集40例体检健康人作为对照。

骨关节炎诊断按照中华医学会颁布的《骨关节炎诊疗指南》中的诊断标准进行。

2、血液总RNA提取

1、提取全血总RNA

1.1匀浆处理：用含EDTA的抗凝真空管采集受试者lml血液，按照1：3的比例加入3m1 TRIpure LS Reagent(Bioteke)，用漩涡混合器震荡涡旋15-20s以帮助，裂解血液中的细胞。同时打开高速低温离心机预冷。

1.2在15-30℃条件下孵育5min以使核蛋白体完全分解。

1.3加入0.6m1三氯甲烷，盖紧样品管盖，剧烈震荡15s并在室温下孵育3min。

1.4在4℃ 12000rpm的高速低温离心机上离心10min，之后样品会分为三层，此时RNA便溶在上层的水相中，将上清液移入到新的离心管中。

1.5加入等体积的75％的乙醇，轻柔颠倒混匀，可能会有沉淀，将沉淀和液体一起分次倒入套着收集管的吸附柱RA中。

1.6反复于4℃ 10000rpm离心45s，弃掉废液，直至所有沉淀与溶液都过柱。

1.7加入500μl去蛋白液RE(Bioteke)，12000rpm离心45s，弃掉废液。

1.8加入700μl漂洗液RW(Bioteke)，12000rpm离心60s，弃掉废液。

1.9于4℃ 12,000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

1.10取出吸附柱RA，放入RNase free的离心管中，加入80μl RNase free water(提前65-70℃热浴)，室温下放置2min，12000rpm离心1min。

4、QPCR

试剂：反转录试剂盒(DDR037A)购自宝生物工程(大连)有限公司。荧光实时(Real-time)定量PCR(polymerase chain reaction)所用的SYBR Premix Ex Taq^TM(Tli RNaseHPlus)试剂盒为日本Takara公司生产。

4.1逆转录

以提取的总RNA(1μg)为模板，加入以下反应体系，具体为：

Buffer4μL，

RT Enzyme Mix 1μL，Oligo dT Primer(50μM)1μL，Random 6mers(100μM)1μL，以无RNA酶的ddH₂O将反应体积补足为20μL。将上述混合液置于37℃ 15min，85℃5s，即获得cDNA。该cDNA可用于lncRNA Real-time PCR检测。

4.2QPCR

按照日本Takara公司的

Premix Ex Taq^TM(Tli RNaseH Plus)试剂盒说明书进行操作。

反应体系：SYBR Premix Ex Taq^TM(2×)25μL，ROX Reference Dye(50×)1μL，PCR上游引物(10μM)1μL，PCR下游引物(10μM)1μL，cDNA 4μL，灭菌ddH₂O 18μL。

反应程序：95℃ 20s预变性，按95℃ 10s变性、56℃ 20s退火、70℃ 10s延伸过程循环35次，获得Ct值。

结果釆用相对定量法，运用公式2^-△△ct计算。实验重复3次。

引物设计：根据LINC01220转录本序列，通过NCBI的引物设计工具(Primer BLAST)设计引物，引物序列如下所示：上游引物：5’-ATTCCTGCTTCAACTCAA-3’(SEQ ID NO.2)；下游引物：5’-CAGTCGTCTTCTTAGTCC-3’(SEQ ID NO.3)。根据GAPDH(内参基因)序列设计引物，上游引物：5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3’(SEQ ID NO.4)；5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’(SEQID NO.5)。

5、结果

结果如图1显示，与健康对照相比，骨关节炎患者血液中LINC01220表达显著降低，差异具有统计学意义(*P<0.05)。健康对照中有7例LINC01220表达水平降低，骨关节炎患者中有46例LINC01220表达水平降低，使用LINC01220诊断骨关节炎的敏感度为80.7％，特异性为82.5％。

实施例2 LINC01220对滑膜细胞增殖的影响

1、细胞培养

细胞：人骨关节炎滑膜细胞(货号：408OA-05A)购自Cell applications公司。

培养基：滑膜细胞生长培养基(货号：415-500)购自Cell applications公司。

培养方法：滑膜细胞生长培养基中加入10％胎牛血清和双抗配制成完全培养基；将冻存细胞从液氮中取出后，置于37℃恒温水浴箱内，摇动数分钟至完全溶解；吸出细胞悬液，转移至离心管内，1000rpm，离心5min，弃上清；加入完全培养基，重悬细胞后进行细胞计数，接种于培养瓶内，37℃，5％CO₂的细胞培养箱中培养；24h后换液，以后每2-3天换液一次。

2、重组质粒构建

从genebank检索出LINC01220的转录本，获得相应的cDNA，根据Primer设计软件设计扩增引物，两端引入BamH I和Xbar I酶切位点；采用TRIZOL试剂裂解人骨关节炎滑膜细胞提取总RNA，经RT-PCR方法扩增LINC01220的cDNA后回收；将扩增片段与pcDNA3.1质粒用BamH I和Xbar I双酶切，胶回收酶切产物并连接，将连接产物转化至大肠杆菌，抽提质粒，酶切菌落PCR，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性重组子。

3、细胞转染

中量抽提鉴定正确的pcDNA3.1-LINC01220真核表达质粒，纯化，取培养于6cm培养板中处于对数生长期的人骨关节炎滑膜细胞经Fugene转染(具体操作参考Fugene转染说明书)。转染后培养48h，于倒置荧光显微镜下观察、计数发绿色荧光细胞数，每孔取5个视野，取其平均值计算转染效率，计算公式为：细胞转染率＝(同一高倍镜下绿色荧光细胞总数/同一高倍镜下细胞总数)×100％。结果显示细胞转染率约为52％。收集细胞并利用QPCR检测LINC01220过表达情况，结果显示相比空载体对照，转染pcDNA3.1-LINC01220可有效提高LINC01220表达，差异具有统计学意义(P*<0.05)(图2)。

4、CCK-8测定细胞增殖活性

1)取细胞，常规消化，配制成细胞悬液后进行细胞计数。

2)按照1*10⁴/ml的浓度将细胞悬液进行稀释，接种于96孔板中，每孔200μl，每组设置3个复孔。

3)按照前面描述的方式进行细胞转染。

4)细胞转染后不同时间在每孔中加入10μl CCK-8溶液，轻轻敲击培养板以帮助混匀，置于孵箱中培养4h。取出后在酶标仪上检测450nm波长的吸光度值(OD值)。

5)最后以时间为横坐标，OD值为纵坐标绘制生长曲线。

5、统计学分析

所有数据均用SPSS19.0软件进行统计学计算分析，计量数据均使用均数±标准差的形式表示，两组之间的差异采用双因素方差分析，如果P<0.05则被认为具有显著性差异，具有统计学意义。

6、结果

采用CCK-8法检测滑膜细胞的增殖活性，结果如表1所示，转染pcDNA3.1-LINC01220的细胞(B组)增殖速度比转染pcDNA3.1的细胞(A组)要慢，经过统计学检验分析，差异具有统计学意义(P*<0.05)。上述结果表明，促进pcDNA3.1-LINC01220表达可抑制骨关节炎滑膜细胞增殖，从而有效抑制骨关节炎。

表1CCK8结果统计

天

1

2

3*

4*

5*

6*

7*

A

0.161±0.008

0.202±0.019

0.342±0.025

0.517±0.009

0.656±0.019

0.815±0.078

0.924±0.012

B

0.147±0.007

0.172±0.003

0.268±0.006

0.351±0.014

0.457±0.028

0.525±0.016

0.618±0.017

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 固安博健生物技术有限公司

<120> 非编码RNA作为诊治骨关节炎的分子标志物的用途

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 501

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aatgctgggc gaaggctccg agccacgaga cccccgcctc ctgtcccggg acccacccag 60

gcggaggcaa gggcaggggc gctgggggcc cagagagagg gcgccgcgat ggatgaatga 120

gctgtttcca gcattcctgc ttcaactcaa aattttcctt catggcacag tggaaagctt 180

tgaagacggc ggttctgggg ctgaatatga aggcaactcg gactaagaag acgactgctt 240

tccaactgcc ctcccgtcct gcagccgcct gatttgagga aggggctggg atccttcccc 300

ttgccctctg gttgttcttg gagttacagc agccccgcgg cagctctgcc ccctagtgca 360

catgtgaggc agcgcgccct tctccaatcc agaagcctcg tcgcggtgct gccagcaagg 420

gagtttttct gtattcactt tggtggaaat agcaaaactt gacagaaaaa aaacccaagc 480

caaaccaaaa aaaaaaaaaa a 501

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

attcctgctt caactcaa 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cagtcgtctt cttagtcc 18

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agaaggctgg ggctcatttg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aggggccatc cacagtcttc 20

Claims

1.检测长链非编码RNA表达的试剂在制备人骨关节炎的诊断产品中的应用；所述长链非编码RNA是LINC01220，其转录本序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括利用SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针或复合探针检测所述长链非编码RNA表达量时使用的PCR扩增引物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3所示。

4.促进权利要求1所述的长链非编码RNA表达的试剂在制备治疗人骨关节炎的药物中的应用。