CN111560427A - lncRNA作为新生儿肠外营养相关性肝病特异性标志物的应用 - Google Patents

lncRNA作为新生儿肠外营养相关性肝病特异性标志物的应用 Download PDF

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汪健
刘刚
胡筱涵
王华伟
耿海峰
许云云
方芳
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Abstract

本发明公开了lncRNA作为新生儿肠外营养相关性肝病特异性标志物的应用。lncRNA有组织特异性与时空特异性，不同组织之间的lncRNA表达量不同，同一组织或器官在不同生长阶段，其中的lncRNA表达量也会变化，本发明首次公开了lncRNA作为新生儿肠外营养相关性肝病特异性标志物，利用临床上比较容易直接获得的全血标本，结合设计的引物对进行qRT‑PCR验证lncRNA的差异表达，具有快速、简单、省时、检测灵敏度高，样品消耗少的优点，是非常适合的利用差异表达的lncRNA诊断新生儿肠外营养相关性肝病的方法；尤其是，本发明通过平行实验验证了lncRNA作为新生儿肠外营养相关性肝病特异性标志物的准确性以及特异性。

Description

lncRNA作为新生儿肠外营养相关性肝病特异性标志物的应用
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种制备新生儿肠外营养相关性肝病特异性lncRNA的方法。
背景技术
肠外营养(parenteral nutrition, PN)对不能通过正常肠道方式来满足生长的新生儿带来了革命性关爱。 美国自60 年代首次报道长期 PN应用于一例新生女婴，至今已有数十万患者依赖 PN得以生存。但长时间(＞2 周) PN应用也存在许多相关问题, 肠外营养相关性肝病 (total parenteral nutrition-associated liverdisease, PNALD) 是一种最常见的并发症，随着长时间PN的应用，PNALD 发生率增加，主要表现为肝脂肪变性、胆汁淤积和转氨酶升高。约有 30％-60％的患儿因长期 PN 发生 PNALD，伴有肝功能异常和肝细胞损害，严重者发展为肝硬化危及生命。而新生儿发生 PNALD 更早、肝功能下降更快，死亡率高达38%～51%。因此，PNALD 是严重威胁新生儿健康的重大疾病，如何防治该病是新生儿临床焏待解决的问题。PNALD临床主要表现为黄疸、肝脾肿大，可有白陶土样大便，肝功等化验检查多提示丙氨酸转移酶、天冬氨酸转移酶、碱性磷酸酶、血总胆红素、直接胆红素升高。
lncRNA是一类转录本长度大于200bp的非编码RNA产物，在转录、转录后和染色体修饰等多个层面，调控胚胎发育、细胞增殖、转移和分化等各种生命活动，其异常表达与多种疾病的发生发展密切相关。lncRNA有组织特异性与时空特异性，不同组织之间的lncRNA表达量不同，同一组织或器官在不同生长阶段，其中的lncRNA表达量也会变化，lncRNA可从染色质重塑、转录调控及转录后加工等多种层面实现对基因表达的调控。lncRNA启动子同样可以结合转录因子，如Oct3/4、Nanog、CREB、Sp1、c-myc、Sox2与p53，局部染色质组蛋白同样具有特征性的修饰方式与结构特征，序列上保守性较低，只有约12%的lncRNA可在人类之外的其它生物中找到，其作用机制非常复杂，至今尚未完全清楚，比如已有许多研究证实了miRNAs参与调节TGFβ表达量和EMT过程，但参与此过程的lncRNA并不清楚。另外，一些在线网站比如starBase 2.0网站预测准确率低，比如现在已经比较明确的GAS5和miRNA21都预测不到，而且人血清中存在多达1400个lncRNA，还有变化，导致lncRNA无法有效利用，因此针对新生儿肠外营养相关性肝病，研发合适的特异性lncRNA作为标志物在调控基因转录、作为疾病诊断标志物等方面具有重要的研究和临床意义。
发明内容
本发明提供一种作为针对新生儿肠外营养相关性肝病特异性标志物的lncRNA及其应用。本发明首次公开了lncRNA RP11-372K14.2作为新生儿肠外营养相关性肝病特异性标志物，利用临床上比较容易直接获得的全血标本，结合设计的引物对进行qRT-PCR验证lncRNA的差异表达，具有快速、简单、省时、检测灵敏度高，样品消耗少的优点，是一种准确特异诊断新生儿肠外营养相关性肝病的方法。
本发明的技术方案如下：
lncRNA作为新生儿肠外营养相关性肝病特异性标志物的应用；所述lncRNA为lncRNARP11-372K14.2。
lncRNA在制备新生儿肠外营养相关性肝病特异性标志物中的应用；所述lncRNA为lncRNA RP11-372K14.2。
lncRNA在制备新生儿肠外营养相关性肝病特异性诊断试剂中的应用；所述lncRNA为lncRNA RP11-372K14.2。
本发明中，通过检测人体全血样本中的lncRNA RP11-372K14.2的表达情况即可诊断新生儿肠外营养相关性肝病，与现有临床检测手段结果吻合。
本发明公开了新生儿肠外营养相关性肝病诊断试剂盒，该试剂盒含有能够对lncRNA的表达量进行定量的试剂，所述lncRNA为lncRNA RP11-372K14.2；优选的，所述能够对lncRNA的表达量进行定量的试剂包括qRT-PCR引物对；所述qRT-PCR引物对的序列为SEQID NO：1、SEQ ID NO：2。
本发明还公开了新生儿肠外营养相关性肝病诊断试剂盒在制备新生儿肠外营养相关性肝病诊断试剂中的应用，该试剂盒含有能够对lncRNA的表达量进行定量的试剂，所述lncRNA为lncRNA RP11-372K14.2；优选的，所述能够对lncRNA的表达量进行定量的试剂包括qRT-PCR引物对；所述qRT-PCR引物对的序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2。
本发明公开了能够对lncRNA的表达量进行定量的试剂在制备新生儿肠外营养相关性肝病诊断试剂盒中的应用或者能够对lncRNA的表达量进行定量的试剂在制备新生儿肠外营养相关性肝病诊断试剂中的应用，所述lncRNA为lncRNA RP11-372K14.2；优选的，所述能够对lncRNA的表达量进行定量的试剂包括qRT-PCR引物对；所述qRT-PCR引物对的序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2。
实施例中，本发明通过提取新生儿肠外营养相关性肝病患者和健康对照者全血样本的总RNA，设计qRT-PCR特异性引物，并通过常规qRT-PCR检测特异性lncRNA RP11-372K14.2的表达量，结果显示在新生儿肠外营养相关性肝病患儿中lncRNA RP11-372K14.2发生了显著性的上调表达；由此说明，通过检测lncRNA RP11-372K14.2的表达水平，可以有效区分新生儿肠外营养相关性肝患儿和正常健康人。
本发明中，lncRNA RP11-372K14.2序列为SEQ ID NO：3，具体如下：
AGCCAAACAAGGGAATTATTATCAAGTTGAAGAAGAATGTGTCCTTGCTAAGGGAGGATGAAAATCTCAATTAAAATATCCCCCAGTATGTTTTCTTTTTGCTTTTTTAAGCTGAGAGAGTAAAACAAAAGGGAACTGTTTATTTATTTTGAAACAGTATCTATTCTACCCCAAAGTAGTGGTTTTTGACCTCTTTCCCTTTCAAGGATAGCTTTTTCCTTAAAACTGTGATCAAGACAGAGTCTTAAAAGTTGTGTCTTTATTAGGATGGGAAAAGAAGAAAGTTCTATGATTTATGCTCTTGCCTTTTGTAATGAAAGGAGCTAATGACTTTCAACAGAAGTATAATTCACAAAAAGTAAAATCCATTTCATTTATTACCACTTAACTAAGTGCTTTTTCTAATTTGAAAGCAATGCTACCTCCCATGCCTGGTCTGCATTTTGTATTTAATCTGAATGGTTTATTCAACAGTAGTTCTAAATAAATTAGCAAAAAGAATCTAACATTCTCTATCCATCTAGCCAAATGCCGAGATTGGCCAGAGGATAAGGCAAAGCTGAAGAGCGACCTCTTCTTATTGACTAGCAATTGTTATTCTTAGTTTCTTTATATCAAGAGACAGGCTTATCCTCATCATCATCAAATCCCACTGAAGGATATTATTTGGAGTTATAACTTAACACTCTTCAACACTGGCAAGCCTGTGAAATAAATAAAGGCAGATTTTTGTGCCCTTTCTTGTCTCTTCACCTCCTCTAATAACTCTTGTCCCCTTAGAGACGTCCTGACACATCTATACCTCTGCCCTTCCCCTGGCCATGATGCACCAGGCTGATTGCAGCGCACTGTGAATGATGGTCCACTTTCTCCATTTCAACCCTGCAGCACCTTTGCTGAGATCTTTTCTAAATCTCAGCTGCTCTTTCAACCAAAATGCACCTGCAGAAACAAAACTTTCATTCTCTCAAGTTAGGTAAACTGAAATATAACTTAAGACTCTAATGGCTAATGTAGCTTACTATATTAGCTTACTAAGAAGACCCTAACATTTTTTCATGGACTGCTTAATGCTTTTCTCTAAATAAATGAACAATATGGAAATTTCATGAA
本发明中，lncRNA相对表达量分析采用GraphPad Prism 5软件，采用软件中单样本T检验和独立样本T检验，P < 0.05时，认为结果在统计学上具有显著性差异，P < 0.01时，结果在统计学上具有极显著性差异。研究发现，相对健康人样本，新生儿肠外营养相关性肝病人lncRNA RP11-372K14.2的表达量都发生了显著性的上调表达，在统计学上具有极显著性差异，可以说明lncRNA RP11-372K14.2可以作为新生儿肠外营养相关性肝病特异性标志物用于诊断。
附图说明
图1为lncRNA RP11-372K14.2在PNALD组病人和正常健康人之间的差异表达图；
图2为lncRNA RP11-372K14.2在新生儿高胆红素血症病人和正常健康人之间的差异表达图；
图3为lncRNA RP11-372K14.2在脂肪肝儿童和正常健康人之间的差异表达图。
具体实施方式
总RNA提取试剂盒购自Ambion公司；qRT-PCR反转录试剂盒购自Fermentas公司；SYBR system Mix购自TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司；384孔板及膜购自罗氏公司。
实施例一 新生儿肠外营养相关性肝病人lncRNA RP11-372K14.2的表达量发生了显著性的上调表达
PNALD患儿30例，正常对照组新生儿30例，分别收集外周血3ml，提取血浆中的总RNA，进行qRT-PCR验证。设计及检测结果如下。
本研究经苏州大学附属儿童医院医学伦理委员会批准，PNALD的诊断标准如下:(1)PN持续时间大于等于14天;(2)临床表现为皮肤暗黄并进行性加重、和/或肝脾肿大、大便发白等不能用原发病解释;(3)直接胆红素(DB)>34.2umol/L (2mg/dL)与DB胆汁淤积反应。(4)排除消化道畸形、遗传性代谢性疾病、先天性病毒感染等明确原因引起的胆汁淤积。正常对照组为健康新生儿，无任何肝相关疾病。
qRT-PCR引物为：
Figure 531292DEST_PATH_IMAGE001
以内参β-actin在新生儿肠外营养相关性肝病患者全血样本中扩增为例，观察扩增情况，扩增曲线平滑且随着循环数的增加，荧光信号具有明显的对数期，而空白对照无连续曲线生成，说明扩增情况良好。对扩增的lncRNA产物做溶解曲线，有且只有一个明显的单峰，而无模板对照无明显波峰出现，说明经扩增后产物是特异的lncRNA，即此定量无污染，准确，可靠。
所有血样采用一次性真空EDTA抗凝采血管抽取，采集外周血3.0 mL，颠倒混匀；加入 3 倍体积红细胞裂解液（300μL血液加入 900 μL红细胞裂解液），颠倒混匀，室温放5min，期间颠倒几次； 3000 rpm 离心5分钟，弃上清。用1 mL的红细胞裂解液，轻轻悬浮；3000 rpm 离心 2 min，弃上清；用1 mL的TRIzol Reagent，轻轻悬浮，-80℃冰箱保存。
将新生儿肠外营养相关性肝病患者和健康对照者含有白细胞的TRIzol Reagent样本于-80 ℃中取出，待4 ℃自然溶解；加入等体积酚氯仿，最大转速室温离心 5 min。取上清；加1.25倍体积 100%乙醇；将混合液加入柱子中，室温，13000 rpm，30 s，弃流过液；加350 μL miRNA Wash Solution 1 (mirVana™ miRNA ISOlation Kit，Ambion-1561) 到离心柱中，13000 rpm，30 s。弃流过液，将离心柱重新放置到收集管中；混合10 μL DNase I和 70 μL Buffer RDD QIAGEN (#79254) 总体积：80 μL，加到离心柱中的膜上，室温放置15 min；加350 μL miRNA Wash Solution 1 到离心柱中，13000 rpm，30 s。弃流过液，将离心柱重新放置到收集管中；500 μL Wash Solution 2/3 过柱两次，13000 rpm，30 s。弃流过液，将离心柱重新放置到收集管中；空柱离心 1 min，将离心柱放置到新的收集管中，柱中心加 100 μL 95℃预热的Elution Solution，放置 2 min，室温最高转速离心 20-30秒，收集管中的液体即为提取的总 RNA，放置在-80℃保存。
取新生儿肠外营养相关性肝病患者和健康对照者总RNA样本1.0 μL，经安捷伦生物分析仪器nanodrop-2000检测OD值，在紫外分光光度计上测定A260/A280数值，测定结果总RNA浓度在5～10ng/μL之间，A260/A280数值在1.2～1.9之间，表示总RNA的纯度较好，无蛋白或者时其他有机物的污染亦无总RNA降解。
新生儿肠外营养相关性肝病诊断试剂盒qRT-PCR新生儿肠外营养相关性肝病相关的特异性lncRNA
用Fermentas反转录试剂盒进行反转录，反转录反应体系：总RNA 2.5 μL，RNase 抑制剂RRI 0.25 μL，dNTP（10mM each）0.5 μL，5×M-MuLV buffer 1.0 μL，随机引物（2 µM）0.5μL，M-MuLV反转录酶0.25 μL，总体积5 μL。分两步方法进行，第一步：65℃，5 min；冰上，10min；第二步：42℃，60 min；70℃，15 min；反应完毕后，保存于-80℃冰箱。
QRT-PCR体系：ddH2O 7 μL，SYBR system Mix 10 μL，50*ROX refenence dye 0.4μL，上游引物（10 µM）/ 下游引物（10µM）0.8 μL，模板cDNA1 μL，总体积20 μL；混匀后离心，在ABI 7500中进行荧光定量PCR反应，反应参数设置为：95 ℃ 30 s，然后95 ℃5 s，60 ℃31 s，共40个循环。
lncRNA荧光定量数据分析以β-actin为内参基因，对目标基因进行归一化处理，已确保相等数量的样品中比较目标基因的量。lncRNA表达倍数的变化公式为RQ = 2-△△CT，其中△△CT =（CTlncRNA-CTβ-actin）OC-（CTlncRNA-CTβ-actin）Mean ON。RQ代表相对表达变化量，CTlncRNA 和CTβ-actin分别代表同个样本中目标lncRNA和内参基因β-actin的Ct值，OC代表新生儿肠外营养相关性肝病患者，ON代表健康对照者，Mean ON代表所有正常对照组中的平均值。实验设立阴性对照和重复实验，阴性对照为反应体系中不加cDNA模板，以ddH2O代替，所有荧光定量PCR均做3次重复。lncRNA相对表达量分析采用GraphPad Prism 5软件，采用软件中单样本T检验和独立样本T检验。P < 0.05时，认为结果在统计学上具有显著性差异，P< 0.01时，结果在统计学上具有极显著性差异，差异表达的lncRNA数据处理结果以平均值±标准差表示，绘制柱状图。
分别在30例PNALD病人和30例正常健康新生儿中检测lncRNA RP11-372K14.2的表达量，结果显示在PNALD病人中lncRNA RP11-372K14.2发生了显著性的上调表达，见附图1，表达差异在10倍以上；P < 0.001。30例PNALD病人和30例正常健康新生儿中lncRNA RP11-372K14.2的相对表达量如下：
Figure 448433DEST_PATH_IMAGE002
实施例二 验证lncRNA RP11-372K14.2的表达特异性
经苏州大学附属儿童医院医学伦理委员会批准，收集30例临床确诊的新生儿高胆红素血症患儿，明确为非PNALD患者。根据实施例一同样的方法检测外周血以分析lncRNA RP11-372K14.2在该病的表达情况，结果表明，与对照组（正常健康）相比，lncRNA RP11-372K14.2在新生儿高胆红素血症患儿血浆中表达量无明显差异，差异无统计学意义；P > 0.05，见图2，正常对照组为健康新生儿，无任何肝相关疾病。30例非PNALD新生儿高胆红素血症患儿和30例正常健康新生儿中lncRNA RP11-372K14.2的相对表达量如下：
Figure 759328DEST_PATH_IMAGE004
实施例三 验证lncRNA RP11-372K14.2的表达特异性
经苏州大学附属儿童医院医学伦理委员会批准，收集30例临床确诊脂肪肝患儿（0-14岁），明确为非PNALD患者。根据实施例一同样的方法检测外周血以分析lncRNA RP11-372K14.2在该病的表达情况，结果表明，与对照组（正常健康）相比，lncRNA RP11-372K14.2在脂肪肝患儿血浆中表达量无明显差异，差异无统计学意义；P > 0.05，见图3，正常对照组为健康新生儿，无任何肝相关疾病。30例非PNALD脂肪肝患儿和30例正常健康新生儿中lncRNA RP11-372K14.2的相对表达量如下：
Figure 154537DEST_PATH_IMAGE006
本发明公开的新生儿肠外营养相关性肝病特异性lncRNA，利用设计的引物对进行qRT-PCR方法验证得到差异表达量，获得新生儿肠外营养相关性肝病特异性lncRNA标志物，对PNALD的诊断上具有较高的应用价值。
序列表
<110> 苏州大学附属儿童医院
<120> lncRNA作为新生儿肠外营养相关性肝病特异性标志物的应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1113
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agccaaacaa gggaattatt atcaagttga agaagaatgt gtccttgcta agggaggatg 60
aaaatctcaa ttaaaatatc ccccagtatg ttttcttttt gcttttttaa gctgagagag 120
taaaacaaaa gggaactgtt tatttatttt gaaacagtat ctattctacc ccaaagtagt 180
ggtttttgac ctctttccct ttcaaggata gctttttcct taaaactgtg atcaagacag 240
agtcttaaaa gttgtgtctt tattaggatg ggaaaagaag aaagttctat gatttatgct 300
cttgcctttt gtaatgaaag gagctaatga ctttcaacag aagtataatt cacaaaaagt 360
aaaatccatt tcatttatta ccacttaact aagtgctttt tctaatttga aagcaatgct 420
acctcccatg cctggtctgc attttgtatt taatctgaat ggtttattca acagtagttc 480
taaataaatt agcaaaaaga atctaacatt ctctatccat ctagccaaat gccgagattg 540
gccagaggat aaggcaaagc tgaagagcga cctcttctta ttgactagca attgttattc 600
ttagtttctt tatatcaaga gacaggctta tcctcatcat catcaaatcc cactgaagga 660
tattatttgg agttataact taacactctt caacactggc aagcctgtga aataaataaa 720
ggcagatttt tgtgcccttt cttgtctctt cacctcctct aataactctt gtccccttag 780
agacgtcctg acacatctat acctctgccc ttcccctggc catgatgcac caggctgatt 840
gcagcgcact gtgaatgatg gtccactttc tccatttcaa ccctgcagca cctttgctga 900
gatcttttct aaatctcagc tgctctttca accaaaatgc acctgcagaa acaaaacttt 960
cattctctca agttaggtaa actgaaatat aacttaagac tctaatggct aatgtagctt 1020
actatattag cttactaaga agaccctaac attttttcat ggactgctta atgcttttct 1080
ctaaataaat gaacaatatg gaaatttcat gaa 1113
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtggccgagg actttgattg 20
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cctgtaacaa cgcatctcat att 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cacatctata cctctgccct tcc 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaagtggacc atcattcaca gtg 23

Claims (10)

1.lncRNA作为新生儿肠外营养相关性肝病特异性标志物的应用；所述lncRNA为lncRNARP11-372K14.2。
2.lncRNA在制备新生儿肠外营养相关性肝病特异性标志物中的应用；所述lncRNA为lncRNA RP11-372K14.2。
3.lncRNA在制备新生儿肠外营养相关性肝病特异性诊断试剂中的应用；所述lncRNA为lncRNA RP11-372K14.2。
4.新生儿肠外营养相关性肝病诊断试剂盒，所述试剂盒含有能够对lncRNA的表达量进行定量的试剂，所述lncRNA为lncRNA RP11-372K14.2。
5.根据权利要求4所述新生儿肠外营养相关性肝病诊断试剂盒，其特征在于，所述能够对lncRNA的表达量进行定量的试剂包括qRT-PCR引物对；所述qRT-PCR引物对的序列为SEQID NO：1、SEQ ID NO：2。
6.根据权利要求4所述新生儿肠外营养相关性肝病诊断试剂盒，其特征在于，所述lncRNA RP11-372K14.2的序列为SEQ ID NO：3。
7.权利要求4所述新生儿肠外营养相关性肝病诊断试剂盒在制备新生儿肠外营养相关性肝病诊断试剂中的应用。
8.能够对lncRNA的表达量进行定量的试剂在制备新生儿肠外营养相关性肝病诊断试剂盒中的应用或者能够对lncRNA的表达量进行定量的试剂在制备新生儿肠外营养相关性肝病诊断试剂中的应用，所述lncRNA为lncRNA RP11-372K14.2。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述能够对lncRNA的表达量进行定量的试剂包括qRT-PCR引物对；所述QRT-PCR引物对的序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2。
10.根据权利要求1、2、3、7或者8所述的应用，其特征在于，所述lncRNA RP11-372K14.2的序列为SEQ ID NO：3。
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