CN108728534B

CN108728534B - 4-LncRNA分子标签用于肝癌预后评估的试剂盒

Info

Publication number: CN108728534B
Application number: CN201810503020.9A
Authority: CN
Inventors: 王辉云; 徐睿; 张美殷; 买世娟
Original assignee: Sun Yat Sen University Cancer Center
Current assignee: Sun Yat Sen University Cancer Center
Priority date: 2018-05-23
Filing date: 2018-05-23
Publication date: 2021-10-15
Anticipated expiration: 2038-05-23
Also published as: CN108728534A

Abstract

本发明公开了4‑LncRNA分子标签在肝癌预后评估中的应用。本发明通过4‑LncRNA分子标签评估肝癌患者的总生存时间和无病生存时间，发现高风险组患者的总生存时间和无病生存时间比低风险组患者显著缩短。此外，4‑LncRNA分子标签可提高肝癌临床分期系统的预后评估价值，即评估预测同一临床分期的患者，发现低风险组与高风险患者在生存时间上有明显差异。说明本发明4‑LncRNA分子标签可作为肝癌预后评估的检测标记物，可为肝癌患者提供预后效果评价、观察和监测以及用于判断患者预后状况等，具有快速性、客观性和准确性等优点。

Description

4-LncRNA分子标签用于肝癌预后评估的试剂盒

技术领域

本发明涉及生物标志物在制备肿瘤患者预后评估试剂盒生产的应用领域，具体涉及4-LncRNA分子标签在评估肿瘤患者预后特别是肝癌患者和产生肿瘤预后评估中的应用。

背景技术

肝细胞癌(简称肝癌)是我国最常见的恶性肿瘤之一，研究显示，近二十年来肝癌的发病率在我国呈上升趋势，其在九大恶性肿瘤死亡率的排名中已从第三位上升到第二位。肝癌的临床研究在近十多年中已取得了较大的进展，但肝癌五年生存率仍非常低而且复发率高。由此可见，单靠临床研究来提高肝癌病人的生存率和降低复发率是不够的。由于分子生物技术的迅猛发展，科学界对肿瘤发生发展过程中的生物大分子的变化及其作用有了较深入的了解，这为开发肿瘤包括肝癌等的基因诊断、基因治疗和预后评估提供了崭新的方法和手段，同时也将最终阐明肿瘤的发病机理。如果能够找出在肝癌发生发展中起关键作用的相关基因特别是肿瘤抑制基因，根据其在肝癌中的作用和变化可设计出新的基因治疗和药物治疗等方法以及开发出新的分子诊断、预后评估、复发预测等手段，从而可望提高肝癌病人的生存率。

长链非编码RNA(LncRNA)是一类长度超过200个核苷酸的非编码RNA，其异常表达参与了许多疾病过程。研究发现，LncRNA的异常表达参与了肿瘤的发生发展过程。例如，LncRNA PCGEM1在前列腺癌中过量表达可导致肿瘤细胞的增殖和克隆形成，MALAT-1RNA的高表达与胰腺癌、结肠癌、前列腺癌、肝癌、乳腺癌等肿瘤的恶性化程度密切相关。根据LncRNA在肿瘤发生发展中的作用，大致可分为癌基因样作用的LncRNA，如HOX转录反RNA(HOTAIR)可以促进恶性肿瘤的侵袭和转移；抑癌基因样作用的LncRNA，如母系表达基因3(MEG3)和CDKN2B-AS1等。在肝癌中，也有不少LncRNA相关的研究出现，如高表达的HEIH和HULC等。LncRNA用于癌症诊断及预后预测标志物的研究也日益成为热点。

到目前为止，已经发现超过10000条LncRNA，尽管已有一些与肝癌相关的研究出现，但是目前仍没有由LncRNA组成的分子标签帮助评估预测肝癌患者的预后，联合多个LncRNA的分子标签的评估效力优于单一的RNA分子标志物。因此，目前临床上急需开发出一种用于评估肝癌患者预后的LncRNA分子标签试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于提供定量检测4-LncRNA(RP11-134021.1、XLOC_012786、XLOC_000917和XLOC_010457)的试剂在制备评估或辅助评估肝癌预后产品中的应用。

本发明所采取的技术方案是：

定量检测LncRNA的试剂在制备评估或辅助评估肝癌预后产品中的应用；所述LncRNA选自RP11-134021.1、XLOC_012786、XLOC_000917、XLOC_010457这4种长链非编码RNA中的任何一个或者二个以上的组合。

进一步的，所述定量检测LncRNA的试剂为能够定量检测RP11-134021.1、XLOC_012786、XLOC_000917、XLOC_010457这4种长链非编码RNA中的任何一个或者二个以上的组合的引物或探针。

进一步的，能够定量检测RP11-134021.1、XLOC_012786、XLOC_000917和XLOC_010457的引物分别为：

RP11-134021.1：

正向引物1-1：ACAGTTTGAGCTCCTGTCTGAAG(SEQ ID NO：1)；

反向引物1-2：GCTGCATGGGAGTCATAATATCT(SEQ ID NO：2)；

XLOC_012786：

正向引物2-1：ATTTAGCTATTAAGGGCCAAGATGT(SEQ ID NO：3)；

反向引物2-2：GAATTTCTTTATCGGGATTTGAGAG(SEQ ID NO：4)；

XLOC_000917：

正向引物3-1：CACTTGGGGCTTCTGAGAGA(SEQ ID NO：5)；

反向引物3-2：CCAAAGTTTCCTTCGCACGA(SEQ ID NO：6)；

XLOC_010457：

正向引物4-1：TGGGAGCGTGTTATAGCTGT(SEQ ID NO：7)；

反向引物4-2：CCAGACTCAGCCTCACAGAT(SEQ ID NO：8)。

进一步的，能够定量检测RP11-134021.1、XLOC_012786、XLOC_000917和XLOC_010457的探针分别为：

RP11-134021.1探针P1：

AAGACATTGATGCCCATGAAAGACCAAAAGTAACAAAACAACAACAGAAAACCAGGGG(SEQ ID NO：9)；

XLOC_012786探针P2：

TTTCCCTCCCTGCTTCTCCCGTGGCCGCTTTAAACCAAATAAATTTAGCTATTAAGG(SEQ ID NO：10)；

XLOC_000917探针P3：

GATTCGTGGAAATGGATGGAGGCTGCTGAGTTGAGAGACTGAGAAGTGGAGGTAC(SEQ ID NO：11)；

XLOC_010457探针P4：

CTTGTCTGGGTTTACAATGGGAGAATGTGTGCTGATTGGTCCATAGGTGTTCTTTGA(SEQ ID NO：12)。

进一步的，所述肝癌预后产品包括肝癌预后试剂盒或芯片。

一种用于评估或辅助评估肝癌预后的产品，该产品中含有定量检测LncRNA的试剂，所述LncRNA为RP11-134021.1、XLOC_012786、XLOC_000917、XLOC_010457这4种长链非编码RNA中的任何一个或者二个以上的组合。

进一步的，所述产品包括试剂盒或芯片。

进一步的，能够定量检测RP11-134021.1、XLOC_012786、XLOC_000917和XLOC_010457的引物如上所述。

进一步的，能够定量检测RP11-134021.1、XLOC_012786、XLOC_000917和XLOC_010457的探针如上所述。

本发明的有益效果是：

本发明提供了一种可以有效改善肝癌患者预后评估准确性的LncRNA分子标签(RP11-134021.1、XLOC_012786、XLOC_000917和XLOC_010457这4种长链非编码RNA)，可以有效评估预测肝癌患者的预后，可为肝癌患者提供预后效果评价、观察和监测以及用于判断患者预后状况等作用。

本发明通过检测肝癌患者肝癌组织中4-LncRNA(RP11-134021.1、XLOC_012786、XLOC_000917和XLOC_010457这4种长链非编码RNA)分子标签的表达，建立风险分数模型，通过4-LncRNA分子标签评估肝癌患者的总生存时间和无病生存时间，发现高风险组患者的总生存时间和无病生存时间比低风险组患者显著缩短。此外，4-LncRNA分子标签可提高肝癌临床分期系统的预后评估价值，即评估预测同一临床分期(TNM分期或者BCLC分期)的患者，发现两组患者在生存时间上有明显差异。再者，结合4-LncRNA分子标签和临床分期系统组成联合预测之后，可将肝癌患者分为高、中、低风险三组，三组患者在生存时间上均具有明显差异。说明本发明4-LncRNA分子标签可作为肝癌预后评估的检测标记物，可为肝癌患者提供预后效果评价、观察和监测以及用于判断患者预后状况等，具有快速性、客观性和准确性等优点。

图1在检验组，验证组和独立验证组中根据4-LncRNA区分的高/低风险组患者的K-M生存曲线分析；其中：Discovery Cohort,检验组；Validate Cohort,验证组；IndependentCohort,独立验证组；Overall Survival,总生存率；Disease free Survival,无瘤生存率；Months,月份；Low Risk,低风险；High Risk，高风险；Number at Risk，人数；p，概率。

图2不同临床分期的患者根据4-LncRNA区分为高/低风险组患者的K-M生存曲线分析；其中：Clinical Stage I,临床分期I；Clinical Stage II,临床分期II；ClinicalStage III,临床分期III；Overall Survival,总生存率；Disease free Survival,无瘤生存率；Months,月份；Low Risk,低风险；High Risk，高风险；Number at Risk，人数；p，概率。

图3三组病例中根据单独TNM分期对患者进行K-M生存分析；其中：DiscoveryCohort,检验组；Validate Cohort,验证组；Independent Cohort,独立验证组；OverallSurvival,总生存率；Disease free Survival,无瘤生存率；Months,月份；Clinical StageI,临床分期I；Clinical Stage II,临床分期II；Clinical Stage III,临床分期III；Number at stage，人数；p，概率；vs.,比。

图4三组病例中根据单独BCLC分期对患者进行K-M生存分析；其中：DiscoveryCohort,检验组；Validate Cohort,验证组；Independent Cohort,独立验证组；OverallSurvival,总生存率；Disease free Survival,无瘤生存率；Months,月份；Stage 0～A,BCLC分期0～A期；Stage B,BCLC分期B期；Stage C,BCLC分期C期；Number at stage，人数；p，概率；vs.,比。

图5三组病例中根据4-LncRNA分子标签和TNM分期把患者分为高、中和低风险组并进行K-M生存分析；其中：Discovery Cohort,检验组；Validate Cohort,验证组；Independent Cohort,独立验证组；Overall Survival,总生存率；Disease freeSurvival,无瘤生存率；Months,月份；Low Risk,低风险；Median Risk，中度风险，HighRisk，高风险；Number at Risk，人数；p，概率；vs.,比。

图6三组病例中根据4-LncRNA分子标签和BCLC分期把患者分为高、中和低风险组并进行K-M生存分析；其中：Discovery Cohort,检验组；Validate Cohort,验证组；Independent Cohort,独立验证组；Overall Survival,总生存率；Disease freeSurvival,无瘤生存率；Months,月份；Low Risk,低风险；Median Risk，中度风险，HighRisk，高风险；Number at Risk，人数；p，概率；vs.,比。

图7采用ROC曲线分析4-LncRNA，TNM分期和联合该2项指标预测患者生存的敏感性和特异性；其中：Discovery Cohort,检验组；Validate Cohort,验证组；IndependentCohort,独立验证组；OS，Overall Survival,总生存率；DFS,Disease free Survival,无瘤生存率；Sensitivity,敏感度；Specificity，特异度；Signature+TNM,LncRNA分子标签+TNM分期；Signature,LncRNA分子标签；TNM,TNM分期；AUC,ROC曲线下面积；95％confidenceinterval，95％置信区间；p，概率。

图8基于检验组、验证组的数据采用列线图显示预测肝癌患者的3年和5年生存率的概率。其中，Nomograms Prediction of OS，总生存预测列线图；Points,分值；TNMStage，TNM分期；LncRNA Signature，LncRNA分子标签；Total Points，总分值，3-yearsSurvival Probability，3年生存率，5-years Survival Probability，5年生存率；Nomograms Prediction of DFS，无瘤生存预测列线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

发明人利用LncRNA芯片分析检验组127例样品对肝癌组织及配对癌旁组织中的LncRNA表达谱，发现在肝癌及癌旁组织中共有218个差异表达倍数超过1.25倍的LncRNA，其中85个LncRNA在肝癌组织中上调，133个在肝癌组织中下调。单因素COX回归分析17个LncRNA与验证组肝癌患者的预后明显相关，然后通过风险分数模型筛选出一组包含4个LncRNA的分子标签。该模型可计算每位患者的风险分数，并以总体风险分数的中位值为分界将患者分为高风险组和低风险组，最后K-M生存分析表明高风险组患者的总生存时间和无病生存时间比低风险组患者均显著缩短。4-LncRNA分子标签可提高肝癌临床分期系统的预后评估价值。

为了验证该结果，申请者采用qRT-PCR法在验证组128例患者中检测4-LncRNA分子标签的表达情况。结果发现4-LncRNA在验证组中具有和检验组一致的相对变化趋势。单因素COX回归分析表明4-LncRNA和肝癌预后相关。在验证组中，建立风险分数模型，根据总体的风险分数中位值作为临界点，分为高风险组和低风险组，K-M生存分析显示高风险组病例的总生存时间和无病生存时间比低风险组病例明显缩短。

为了进一步验证以上结果，申请者再采用qRT-PCR法在独立验证组145例患者中检测4-LncRNA分子标签的表达，以验证组中位值为分界点，将独立验证组分为高低风险两组，K-M生存分析显示高风险组病例的总生存时间和无病生存时间比低风险组病例明显缩短。结果和检验组、验证组一致。

1.实验材料及方法：

1.1 样品

255例病例随机分为检验组和验证组，145例病例为独立验证组。

1.2 设备

抽提RNA的试剂盒购自Invitrogen公司。所需的探针、引物由life公司合成。qRT-PCR试剂盒购自Promega公司。所需的Cyanine-5-dUTP购自Enzo Life Sciences。DMSO购自Sigma-Aldrich USA；杂交液：10×Denhart's solution，10×SSC，1.0％SDS。

1.3 数据分析软件及网址

探针同源性比对：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST

探针杂交信号量化：GenePix Pro 6.0

芯片数据提取、去背景、标准化：GPR

差异表达基因筛选：SAM(Significance Analysis of Microarrays)

统计学分析：SPSS20.0

统计作图：GraphPad.Prism

1.4 标本

用Trizol试剂提取组织RNA，参照Invitrogen Trizol说明书

1.5 LncRNA芯片探针设计

从LncRNA数据库(Noncode、Genecode、LncRNA、Refseq)中筛选恶性肿瘤相关LncRNA，共筛选出2412个LncRNA转录本，并利用Array Designer 4.4软件设计针对每个转录本特异性的寡核苷酸探针，并交由Invitrogen公司合成。

RP11-134021.1的碱基序列为：

TCCTTCTGATGTTCGGATGTGTTCGGAGTTTCTTCCTTCTGGTGGGTTCGTGGTCTCGCTGGCTCGGGAGTGAAGCTGCAGACGTTTGCGGAACTCGTGAGTTATGACAAAAAGATATTATGACTCCCATGCAGCGGATGAAGACATTGATGCCCATGAAAGACCAAAAGTAACAAAACAACAACACAAAACCAGGGGGGGCGCGGTCACGCCTGTAATCCCGGCACTTTGGGAGGCCAAGGTAATTCAGTTCCAACCCCTTCAGTGACAGCAGAGAGACCCAGGCCACCTTCCTTGAGGATTTCGGAGCTGCAGCCCACAGCCAGGGCCAGAGTGGACTCAGCTCTCCAACCCACGCCCATGAATCTCTGCGACTAAAGATTTCCCCACACGCTCCCAGGTTCAGCCCCTTCAGAAACCTGTGACTTCCTGAGTCCTAAGTCTTCAGCAGAAACAGCAGCTGCCCCACGCCTTGAGCGGCAGCAGGACCCTTTCTGCCCTGATCT(SEQ ID NO：13)；

XLOC_012786的碱基序列为：

CCGGCCGACCCCCGTGCGCCGCCGGCGGCCGCCAGCACGGCGCGGAGGTGGGCTAGCGGCGGCGGCGCACGAAAGGTCACCGCGGTGGCATTCCTCTCCGCGCTGTTTACGTGACTTAATGTACTCGCTGCGCCGCGGCCTGTTATCTAGGCCACCCAATGACCGACGAAAGATTTTCCCTCCCTGCTTCTCCCGTGGCCGCTTTAAACCAAATAAATTTAGCTATTAAGGGCCAAGATGTCTGACAAAAGATCGAAAGGTGTCTTTCCGTGATCGCTTAAAGAAGCGAAGGAGAAGCTTGCGGCTCTCAAATCCCGATAAAGAAATTCCGCGCCGGCGCCGGCCTCCCTCCCCGCGGCCTGGTTGCTCCCTGACGCCCTGAGACCCCGA(SEQ ID NO：14)；

XLOC_000917的碱基序列为：

GCATCATCAAAAAGAAGTCAGTCATTCTAGCCTGGAGCTTTAGAAGACGAAGTAAAAAAGAAGTCAGACAGTCCTAGCTTTGAATCCTGGCCCAGCCACTTACTAGGTGGGAGACCTTGGGAGCGAGTCCAGCGGATTCGTGGAAATGGATGGAGGCTGCTGAGTTGAGAGACTGAGAAGTGGAGGTACCTAGGAAGGTCCTCCCTGAAAATACATCGGGTTGTAAAACCTGGAAAGAAATACCTCCATTTGTCAGGCACTCACAGGGCGCTCTCCTCTGGCAGCTCCCATGTTGAGCGCCCAGGGCAGCGACCAGACGGCGTCCTGTCCTCCTGCACGGGGCCAGAACTGGATGGTCCCGCGACACATCGTGTCTGCAGCTTTAGAGGCCTCCCCAGGAGTGCTACCGCGGTCATTTCTGCCCAGCTGTAAAATAACACCCAATCAGCGAGCCGCCAGCTGCAAACTGTTCCGACCTACTCCTCCCTCCCCGGCTTAATTCCCACCTATACCAAAGTGGCCCCACGCGGGCAGAAGCGAAAGACGGAAATGAGGGGAGGCCAACTACTCGAGATCTGCGCCCGAAGCAGATTTTCCACGCGCTCAGAGTAGGGTCGGGGAAAGGCCCACTTGGGGCTTCTGAGAGAGAGGGAAGGGCAGGGAAAGGGCTGCCCCCCAGCAAGACACAGTTGGGTGAACAACTGAGTCTTTGCCTCGTTGACAAAGGAGAATGAGGGACTCGCGCCAGGCTGGCTTGAACTGACTGGAGAAAAGCGACTTCTGTAATTCAGGGCCCTCCTCGTGCGAAGGAAACTTTGGCAAAGCAGAAAGACAGGCATGCAGTTTCCAGGCGGAAAAACGTGAACCATGGGACATGATGGGCTCCAGGGCCGTGGATGCAGTTGCCCGAGGCCCCAGGGCCGCCCCCGGAAGGCCGGGACTGCCAGGGACTCGGCGTGGGGGTGCTGACTGCCGCTCCAGGCCTCGGGGTTCAAGCACTCCAGCAGCATCCGCTCACCACGCTCCCCGCCCACTTCCATGATCACGAGGGGGCAAGGCTAGCCAATCCGGGGTGGCCACTGCCCGGCCCTGCGAGGACTCGAGGCGCACTGGGAAACTGCGCGGTGCCTAGAGGTACAAAGAACAGGTCCTGGGAGGGTAGTAGGAGGGGACCTTAGCACAGCCTATGTCAGTTTGTCAACAAGGATTTGCTGAGAAGTCGCACTGTGCTCAGCATAGCGGCACTGCCTACCTAATGGGCTTTGGGGCATAGACAGTGAATAACCTGGCAGTGATAATAGTGTGCTGAAAGAAAGGCCAGCCCCAACAGCCACTACAGGAACCTCAGAAAGGAGGGGGCGTCCCTGTTAGTGGCTGATACTGGATTTCTCTCATTGTGTTCGTGGCTGGCGCCAAACCAGAGATCATAATGTATAACAAATAAATGTGAAGTTTCTTACATCCAAGTGGCCAGGGAAAACCTATACTAATTACATGGTACAAACCCGCTGTGATCAGGTGCTAAATTGGGTGGCAGTCAGAGTACAGCTGTAGAGATATCTCTGAGGGCCAGAGTGATCAGGAAAAGCTTTGTGGAAGAGGAAGAACTGGAGTTAGGTGCTGAATGACGGGCAGGATATGGACAAGCAGAGGAAAGTGGGAAGGCGTTCCAGGAGGGAAGGGGCAGCATAGCCAAAGCCCGGGGGATGAGCATGGTGGGTTTATGGGGTTTTAGAGGGATTAGCCTGTTTGGAGTGTAGCAGGTGCTCTGAAGAGCATGGGACAGAAGAGAGCACAGGCAGCTGGAGGGTAGAGATGGGGGCTAATTGCAGAATCCCACAGTGCCTAGGAAGGTCTCAGCTGTCAGGGTCTTCTCCTGAGACTCATTCTCAGCTCCTTTTGGGGTTTAGGAAAGATCTTTCATGAGAGTTCCAAACATTTTAGTTAATGTTTAATTCCTTCTCACTGAATCCCCATGGAAGGGGGCAAAAAGCAAGTGCTACTCCTCCAAGGTACTAAAACCCTGGTGCTGAGGATGAGGCTGCTCCAGAGGGA(SEQ ID NO：15)；

XLOC_010457的碱基序列为：

CAGCTCTTTACTCTCGTAGCTCAGCCAGTGGGAGCGTGTTATAGCTGTCTTTCTCCTGTAGTCCGGTGAGCAGGAATGTGTTATAGCTCTTTCATTCCAGCCGCCCACAGCTGAGTGAGTTCCAAGTTCTTGTCCTGTGACCAAGAGGAATAAGGTGTGTGGACACTGGAGAGTAAGTAAGGCAGAGAAGAATTTTATTGAGCGACAGAAGGAAAGCCCTCAACTGTGAAAAGGGACCCTGAAAGTGGGTTGTCATCTGTGAGGCTGAGTCTGGGCTTGTCTGGGTTTACAATGGGAGAATGTGTGCTGATTGGTCCATAGGTGTTCTTTGAAAAAATCACCATCCAATTGGTTAAAAAGCATCATCCGGAAGGAACCAATCAAGAGAGAGAAGGTGTTTCCTCAAGATTCTTTTGATCATCTAATGTTAG(SEQ ID NO：16)。

其中，芯片检测RP11-134021.1，XLOC_012786，XLOC_000917，XLOC_010457的探针分别为：

RP11-134021.1探针P1：

AAGACATTGATGCCCATGAAAGACCAAAAGTAACAAAACAACAACAGAAAACCAGGGG(SEQ ID NO：9)；

XLOC_012786探针P2：

TTTCCCTCCCTGCTTCTCCCGTGGCCGCTTTAAACCAAATAAATTTAGCTATTAAGG(SEQ ID NO：10)；

XLOC_000917探针P3：

GATTCGTGGAAATGGATGGAGGCTGCTGAGTTGAGAGACTGAGAAGTGGAGGTAC(SEQ ID NO：11)；

XLOC_010457探针P4：

CTTGTCTGGGTTTACAATGGGAGAATGTGTGCTGATTGGTCCATAGGTGTTCTTTGA(SEQ ID NO：12)。

1.6 芯片点制

(1)玻片的清洗

(2)芯片的点制

按照前述方法设计好的LncRNA探针和本实验室发明的点样液混合均匀后，放置于384孔板中，再用本实验室的北京博奥Smart Arrayer TM 136printer点样仪将探针点在按照前述方法清洗好的玻片上，温度控制在23℃～24℃之间，湿度控制在33％～35％之间。每一个探针点制两个重复点，一张玻片可点制两个相同的矩阵。

具体步骤如下：

A.取200μmol/L LncRNA探针2μl与8μl点样液混合均匀，放置于384孔板内，使得探针的最终浓度为40μmol/L。

B.将玻片和上述384孔板放置于点样仪的相应位置，并将点样针置于点样仪相应的位置。

C.开启点样仪以及电脑，启动Smart Arrayer软件。

D.在Smart Arrayer软件中进行设定点片的参数，设定后运行软件，等待点样仪开始运行，取样和点样。待点片结束后，将芯片置于同样温度和湿度条件下过夜。第二天将其储存于玻片盒中，密闭真空保存待用。接下来根据点样顺序和芯片位置生成.gal文件，以便于进行芯片实验后的数据提取工作。

1.7 LncRNA标记

(1)将肝癌或癌旁组织样品RNA经过反转录产生荧光标记的cDNA，具体反应体系如下：

冰上配置：

RNA 2μg

Random Primer 1μl

Rnase Free Water补至5μl，70℃孵育5min立即置于冰上5min，离心10s；

冰上配置：

然后将反应体系放于PCR仪中，退火25℃5min，延伸42℃60min，灭活转录酶70℃15min，完成后置于冰上保存。

(2)反转录cDNA纯化、干燥，

将柱子Micro Bio-Spin Chromatography Columns底部的阻塞胶块掰断，并将柱子放入配套的离心管中，使柱子内部的缓冲液慢慢滴至离心管中，最后弃置缓冲液。柱子和离心管置于离心机中，1000g离心2min，注意观察柱子内部是否变干，然后将离心管弃置。将去掉缓冲液的柱子放置于另一个EP管中。将标记了荧光的cDNA加入柱子中，1000g离心4min，过滤出来的溶液就是被纯化的荧光标记cDNA。然后将EP管中的液体真空干燥，20min后，待液体彻底挥发干燥后加入15μl DEPC水。

1.8 LncRNA芯片杂交

(1)将芯片用蒸馏水浸泡1min，后低速甩干。

(2)将芯片放置于杂交盒中，然后在盒子两边底部分别加入30μL蒸馏水，以便保持盒内的湿度。

(3)芯片阵列两边贴上胶条，放上盖玻片。

(4)加入等体积的2×Hybridization Buffer在上述纯化后的荧光标记cDNA样品中，混匀后加到阵列上。

(5)封装好杂交盒。然后置于预热好的杂交炉中，45℃过夜。

(6)拿出芯片后，待冷却，然后放置于1×SSC和0.1％SDS的混合溶液中振荡清洗10min，再放置于另一同样的洗液中浸泡10min，以便充分去掉残余的未结合上的cDNA。

(7)最后放置于0.5×SSC溶液和0.1×SSC溶液中再各清洗1min。

(8)然后1min，1000rpm离心，甩干芯片上残余液体，最后准备扫片。

1.9 LncRNA芯片扫描

LncRNA芯片扫描过程具体步骤如下：

(1)打开扫描仪电源，开启电脑。打开软件界面，预热程序，待扫描。

(2)点击软件弹出扫描仪的托盘。

(3)将上述清洗后的芯片放置于托盘内，关闭托盘返回扫描仪内。

(4)为了确定阵列位置及具体扫片的强度，首先进行预扫程序。

(5)根据预扫后所得图像，将阵列所在区域仔细框出，然后选择适当PMT值和强度进行扫描。

(6)采用Genepix 6.0软件采集所得芯片杂交扫描图的数据信息，获得每个杂交图像各个点杂交信号的中位置。

1.10 数据分析方法

(1)通过Quantile标准化方法归一化双通道的芯片数据，即得所检测目标LncRNA的表达值。

(2)采用Kapan-Meier生存分析LncRNA与肝癌患者预后的关系；

(3)采用卡方检验、t检验以及Fisher精确概率法比较不同实验组数据之间的差异。

1.11 实时荧光定量RT-PCR

(1)RNA反转录

将RT primer(5μM)稀释为浓度500nM。

将试剂放置于冰上融化，分别加入以下试剂：

Total RNA 200ng

RT Primer 1μL

DEPC H₂O 补至5μl

瞬时离心，70℃孵育10分钟，立即放进冰浴；

瞬时离心，分别加入以下试剂：

42℃孵育60分钟；70℃孵育10分钟；4℃放置，终止反应。

(2)实时定量PCR扩增

配置15μl的qPCR反应体系：

瞬时离心。

其中，检测RP11-134021.1，XLOC_012786，XLOC_000917，XLOC_010457的qRT-PCR引物分别为：

RP11-134021.1：

正向引物1-1：ACAGTTTGAGCTCCTGTCTGAAG(SEQ ID NO：1)；

反向引物1-2：GCTGCATGGGAGTCATAATATCT(SEQ ID NO：2)；

XLOC_012786：

正向引物2-1：ATTTAGCTATTAAGGGCCAAGATGT(SEQ ID NO：3)；

反向引物2-2：GAATTTCTTTATCGGGATTTGAGAG(SEQ ID NO：4)；

XLOC_000917：

正向引物3-1：CACTTGGGGCTTCTGAGAGA(SEQ ID NO：5)；

反向引物3-2：CCAAAGTTTCCTTCGCACGA(SEQ ID NO：6)；

XLOC_010457：

正向引物4-1：TGGGAGCGTGTTATAGCTGT(SEQ ID NO：7)；

反向引物4-2：CCAGACTCAGCCTCACAGAT(SEQ ID NO：8)。

(3)PCR扩增反应程序：

95℃/10min，然后95℃/15s，60℃/60s，扩增45个循环。

(4)以GAPDH作为内参，以Threshold cycle(CT)法进行表达水平的比较分析，以2^-△△Ct方法计算相对定量。

2.结果

(1)评估肝癌预后的标志物的筛选与鉴定

发明人利用LncRNA芯片分析检验组127对肝癌组织及配对癌旁组织中的LncRNA表达谱，发现在肝癌及癌旁组织中共有218个差异表达倍数超过1.25倍的LncRNA，其中85个LncRNA在肝癌组织中上调，133个在肝癌组织中下调。单因素COX回归分析，发现17个LncRNA与验证组肝癌患者的预后明显相关；其中，RP11-134021.1，XLOC_012786，XLOC_000917，XLOC_010457这4个LncRNA与肝癌患者的预后明显相关；且RP11-134021.1的上调表达预示肝癌患者预后较差，是风险性LncRNA，XLOC_012786，XLOC_000917，XLOC_010457的上调表达预示肝癌患者预后较好，是保护性LncRNA(见表1)。

表1.与肝癌患者的预后明显相关的17个LncRNA

P值是应用χ2检验或Fisher’s确切概率法检验计算得到。

注：HR,hazard ratio，风险比；95％CI,95％confidence interval，95％置信区间；P值，P value，概率。

然后，发明人在验证组里，通过风险分数模型筛选出RP11-134021.1，XLOC_012786，XLOC_000917，XLOC_010457这4个LncRNA(以下简称4-LncRNA)的分子标签，计算“风险分数＝(1.035×RP11-134021.1的表达值)+(-0.631×XLOC_012786的表达值)+(-0.457×XLOC_000917的表达值)+(-0.660×XLOC_010457的表达值)”，通过该公式可计算每位患者的风险分数，并以总体风险分数的中位值为分界将患者分为高风险组和低风险组，其中风险分数高于中位值的判为高风险组，低于及等于中位值的判为低风险组；最后，Kapan–Meier生存分析(简称K-M生存分析)表明高风险组患者的总生存时间和无病生存时间较低风险组患者均显著缩短(图1)。另外，分析本发明4个LncRNA分子标签和临床特征的关系，发现本发明4个LncRNA分子标签仅仅和TNM分期有关，而与其他临床特征无明显关系(表2)。

为了验证4-LncRNA分子标签，采用qRT-PCR检测了4个LncRNA在验证组和独立验证组的表达情况，根据验证组的风险分数得到计算公式Risk Score＝(1.210×RP11-134021.1的表达值)+(-4.616×XLOC_012786的表达值)+(-1.811×XLOC_000917的表达值)+(-0.660×XLOC_010457的表达值)，通过该公式可计算每位患者的风险分数，并以总体风险分数的中位值为分界将患者分为高风险组和低风险组；最后，Kapan–Meier生存分析表明高风险组患者的总生存时间和无病生存时间较低风险组患者均显著缩短(图1)。另外，分析LncRNA分子标签和临床特征的关系发现LncRNA分子标签仅仅和HBV DNA有关，而与其他临床特征无明显关系(表2)。

以验证组的中位值为分界点，将独立验证组病例分为了高低风险两组，其中高风险组88例，低风险组57例。Kaplan–Meier生存分析(患者生存率随时间变化的特征)(表2三组病例中标签风险值和临床病理特征之间的相关性分析)显示高风险组病例的总生存时间和无病生存时间较低风险组病例明显缩短(图1)，这个结果和检验组及验证组的结果保持一致。另外，分析LncRNA分子标签和临床特征的关系发现LncRNA分子标签仅仅和HBs Ag阳性有关，而与其他临床特征无明显关系(表2)。

表2.本发明4个LncRNA分子标签的风险分数结果和临床病理特征之间的相关性分析

P值是应用χ2检验或Fisher’s确切概率法检验计算得到，*Log-rank检验法。

注：HR,hazard ratio，风险比；95％CI,95％confidence interval，95％置信区间；P值，P value，概率；HBV：hepatitis B virus，乙型肝炎病毒；HBsAg：hepatitis Bvirus surface antigen，乙肝表面抗原；AFP,alpha-fetoprotein，甲胎蛋白；TNM：tumor-node-metastasis；CPT评分：Child-Pugh-Turcotte评分。

(2)单因素COX回归和多因素COX回归分析4-LncRNA分子标签为肝癌患者预后的因素

采用单因素COX回归和多因素COX回归分析4-LncRNA分子标签及各个临床特征与肝癌患者预后的关系，结果显示，在检验组、验证组和独立验证组中4-LncRNA分子标签和TNM分期均是肝癌患者的独立预后因素(表3，4)，其中表3为三组肝癌患者总生存率与4-lncRNA标签相关的单因素和多因素分析；表4为三组肝癌患者无疾病生存率与4-lncRNA标签相关的单因素和多因素分析。

表3.三组肝癌患者总生存率与4-lncRNA标签相关的单因素和多因素分析

表4.三组肝癌患者无疾病生存率与4-lncRNA标签相关的单因素和多因素分析

(3)4-LncRNA分子标签对不同临床分期肝癌患者的预后评估

现行的肝癌常用的临床分期系统包括TNM分期和BCLC分期，目前一般认为处于同一临床分期的患者之间生存时间上的差异不会很大。本部分根据本申请4-LncRNA分子标签的风险分数结果，将同一临床分期的病例分为高低风险之后，采用Kaplan-Meier生存分析分析高低风险组之间生存时间上的差别，结果显示在同一临床分期内，高风险组病例的总生存时间和无病生存时间较低风险组病例明显缩短(图2)。

Kaplan-Meier生存分析结果显示单独的TNM分期或者BCLC分期并不能准确预测肝癌患者的总生存时间或者无病生存时间(图3、4)。但是，结合4-LncRNA分子标签和TNM分期或者BCLC分期组成联合预测模型之后计算肝癌患者的风险分数，即将4-LncRNA分子标签计算得出的风险分数(低风险＝0分，高风险＝1分)和TNM分期风险分数(I期＝1分，II期＝2分，III期＝3分)或者BCLC分期风险分数(最早期～早期＝1分，中期＝2分，晚期＝3分)相加，可将肝癌病例分为低风险组(1分)，中风险组(2-3分)，高风险组(4分)。接着，采用Kapan-Meier生存分析分析三组之间总生存时间和无病生存时间之间的差异。结果显示高、中、低风险的肝癌病例在总生存时间和无病生存时间之间存在明显的差别(图5、6)。

采用ROC曲线更直观的评价联合预测模型(4-LncRNA分子标签+TNM分期)的预后评估效力是否由优于单独的TNM分期，结果显示联合预测模型预测总生存(简称OS)的ROC曲线下面积(AUC)为0.850-0.864，预测无病生存(简称DFS)的ROC曲线下面积(AUC)为0.778-0.795，明显优于单独TNM分期或者单独4-LncRNA分子标签(图7)。进一步，采用列线图(nomograms)的方式将联合模型(4-LncRNA分子标签+TNM分期)的预测效率以数字化的形式展示(图8)，其中图8-A为对总生存时间(简称OS)的预测评估，图8-B为对无病生存生存时间(简称DFS)的预测评估。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 王, 辉云

<120> 4-LncRNA分子标签用于肝癌预后评估的试剂盒

<130>

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

acagtttgag ctcctgtctg aag 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gctgcatggg agtcataata tct 23

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atttagctat taagggccaa gatgt 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gaatttcttt atcgggattt gagag 25

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cacttggggc ttctgagaga 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccaaagtttc cttcgcacga 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tgggagcgtg ttatagctgt 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ccagactcag cctcacagat 20

<210> 9

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

aagacattga tgcccatgaa agaccaaaag taacaaaaca acaacagaaa accagggg 58

<210> 10

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tttccctccc tgcttctccc gtggccgctt taaaccaaat aaatttagct attaagg 57

<210> 11

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gattcgtgga aatggatgga ggctgctgag ttgagagact gagaagtgga ggtac 55

<210> 12

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cttgtctggg tttacaatgg gagaatgtgt gctgattggt ccataggtgt tctttga 57

<210> 13

<211> 506

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tccttctgat gttcggatgt gttcggagtt tcttccttct ggtgggttcg tggtctcgct 60

ggctcgggag tgaagctgca gacgtttgcg gaactcgtga gttatgacaa aaagatatta 120

tgactcccat gcagcggatg aagacattga tgcccatgaa agaccaaaag taacaaaaca 180

acaacacaaa accagggggg gcgcggtcac gcctgtaatc ccggcacttt gggaggccaa 240

ggtaattcag ttccaacccc ttcagtgaca gcagagagac ccaggccacc ttccttgagg 300

atttcggagc tgcagcccac agccagggcc agagtggact cagctctcca acccacgccc 360

atgaatctct gcgactaaag atttccccac acgctcccag gttcagcccc ttcagaaacc 420

tgtgacttcc tgagtcctaa gtcttcagca gaaacagcag ctgccccacg ccttgagcgg 480

cagcaggacc ctttctgccc tgatct 506

<210> 14

<211> 390

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ccggccgacc cccgtgcgcc gccggcggcc gccagcacgg cgcggaggtg ggctagcggc 60

ggcggcgcac gaaaggtcac cgcggtggca ttcctctccg cgctgtttac gtgacttaat 120

gtactcgctg cgccgcggcc tgttatctag gccacccaat gaccgacgaa agattttccc 180

tccctgcttc tcccgtggcc gctttaaacc aaataaattt agctattaag ggccaagatg 240

tctgacaaaa gatcgaaagg tgtctttccg tgatcgctta aagaagcgaa ggagaagctt 300

gcggctctca aatcccgata aagaaattcc gcgccggcgc cggcctccct ccccgcggcc 360

tggttgctcc ctgacgccct gagaccccga 390

<210> 15

<211> 2055

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gcatcatcaa aaagaagtca gtcattctag cctggagctt tagaagacga agtaaaaaag 60

aagtcagaca gtcctagctt tgaatcctgg cccagccact tactaggtgg gagaccttgg 120

gagcgagtcc agcggattcg tggaaatgga tggaggctgc tgagttgaga gactgagaag 180

tggaggtacc taggaaggtc ctccctgaaa atacatcggg ttgtaaaacc tggaaagaaa 240

tacctccatt tgtcaggcac tcacagggcg ctctcctctg gcagctccca tgttgagcgc 300

ccagggcagc gaccagacgg cgtcctgtcc tcctgcacgg ggccagaact ggatggtccc 360

gcgacacatc gtgtctgcag ctttagaggc ctccccagga gtgctaccgc ggtcatttct 420

gcccagctgt aaaataacac ccaatcagcg agccgccagc tgcaaactgt tccgacctac 480

tcctccctcc ccggcttaat tcccacctat accaaagtgg ccccacgcgg gcagaagcga 540

aagacggaaa tgaggggagg ccaactactc gagatctgcg cccgaagcag attttccacg 600

cgctcagagt agggtcgggg aaaggcccac ttggggcttc tgagagagag ggaagggcag 660

ggaaagggct gccccccagc aagacacagt tgggtgaaca actgagtctt tgcctcgttg 720

acaaaggaga atgagggact cgcgccaggc tggcttgaac tgactggaga aaagcgactt 780

ctgtaattca gggccctcct cgtgcgaagg aaactttggc aaagcagaaa gacaggcatg 840

cagtttccag gcggaaaaac gtgaaccatg ggacatgatg ggctccaggg ccgtggatgc 900

agttgcccga ggccccaggg ccgcccccgg aaggccggga ctgccaggga ctcggcgtgg 960

gggtgctgac tgccgctcca ggcctcgggg ttcaagcact ccagcagcat ccgctcacca 1020

cgctccccgc ccacttccat gatcacgagg gggcaaggct agccaatccg gggtggccac 1080

tgcccggccc tgcgaggact cgaggcgcac tgggaaactg cgcggtgcct agaggtacaa 1140

agaacaggtc ctgggagggt agtaggaggg gaccttagca cagcctatgt cagtttgtca 1200

acaaggattt gctgagaagt cgcactgtgc tcagcatagc ggcactgcct acctaatggg 1260

ctttggggca tagacagtga ataacctggc agtgataata gtgtgctgaa agaaaggcca 1320

gccccaacag ccactacagg aacctcagaa aggagggggc gtccctgtta gtggctgata 1380

ctggatttct ctcattgtgt tcgtggctgg cgccaaacca gagatcataa tgtataacaa 1440

ataaatgtga agtttcttac atccaagtgg ccagggaaaa cctatactaa ttacatggta 1500

caaacccgct gtgatcaggt gctaaattgg gtggcagtca gagtacagct gtagagatat 1560

ctctgagggc cagagtgatc aggaaaagct ttgtggaaga ggaagaactg gagttaggtg 1620

ctgaatgacg ggcaggatat ggacaagcag aggaaagtgg gaaggcgttc caggagggaa 1680

ggggcagcat agccaaagcc cgggggatga gcatggtggg tttatggggt tttagaggga 1740

ttagcctgtt tggagtgtag caggtgctct gaagagcatg ggacagaaga gagcacaggc 1800

agctggaggg tagagatggg ggctaattgc agaatcccac agtgcctagg aaggtctcag 1860

ctgtcagggt cttctcctga gactcattct cagctccttt tggggtttag gaaagatctt 1920

tcatgagagt tccaaacatt ttagttaatg tttaattcct tctcactgaa tccccatgga 1980

agggggcaaa aagcaagtgc tactcctcca aggtactaaa accctggtgc tgaggatgag 2040

gctgctccag aggga 2055

<210> 16

<211> 431

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

cagctcttta ctctcgtagc tcagccagtg ggagcgtgtt atagctgtct ttctcctgta 60

gtccggtgag caggaatgtg ttatagctct ttcattccag ccgcccacag ctgagtgagt 120

tccaagttct tgtcctgtga ccaagaggaa taaggtgtgt ggacactgga gagtaagtaa 180

ggcagagaag aattttattg agcgacagaa ggaaagccct caactgtgaa aagggaccct 240

gaaagtgggt tgtcatctgt gaggctgagt ctgggcttgt ctgggtttac aatgggagaa 300

tgtgtgctga ttggtccata ggtgttcttt gaaaaaatca ccatccaatt ggttaaaaag 360

catcatccgg aaggaaccaa tcaagagaga gaaggtgttt cctcaagatt cttttgatca 420

tctaatgtta g 431

Claims

1.定量检测LncRNA的试剂在制备评估或辅助评估肝癌预后产品中的应用；所述LncRNA选自RP11-134021.1、XLOC_012786、XLOC_000917、XLOC_010457这4种长链非编码RNA的组合。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述定量检测LncRNA的试剂为能够定量检测RP11-134021.1、XLOC_012786、XLOC_000917、XLOC_010457这4种长链非编码RNA的组合的引物或探针。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，能够定量检测RP11-134021.1、XLOC_012786、XLOC_000917和XLOC_010457的引物分别为：

RP11-134021.1：

正向引物1-1：ACAGTTTGAGCTCCTGTCTGAAG(SEQ ID NO：1)；

反向引物1-2：GCTGCATGGGAGTCATAATATCT(SEQ ID NO：2)；

XLOC_012786：

正向引物2-1：ATTTAGCTATTAAGGGCCAAGATGT(SEQ ID NO：3)；

反向引物2-2：GAATTTCTTTATCGGGATTTGAGAG(SEQ ID NO：4)；

XLOC_000917：

正向引物3-1：CACTTGGGGCTTCTGAGAGA(SEQ ID NO：5)；

反向引物3-2：CCAAAGTTTCCTTCGCACGA(SEQ ID NO：6)；

XLOC_010457：

正向引物4-1：TGGGAGCGTGTTATAGCTGT(SEQ ID NO：7)；

反向引物4-2：CCAGACTCAGCCTCACAGAT(SEQ ID NO：8)。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，能够定量检测RP11-134021.1、XLOC_012786、XLOC_000917和XLOC_010457的探针分别为：

RP11-134021.1探针P1：AAGACATTGATGCCCATGAAAGACCAAAAGTAACAAAACAACAACAGAAAACCAGGGG(SEQ ID NO：9)；

XLOC_012786探针P2：TTTCCCTCCCTGCTTCTCCCGTGGCCGCTTTAAACCAAATAAATTTAGCTATTAAGG(SEQ ID NO：10)；

XLOC_000917探针P3：GATTCGTGGAAATGGATGGAGGCTGCTGAGTTGAGAGACTGAGAAGTGGAGGTAC(SEQ ID NO：11)；

XLOC_010457探针P4：CTTGTCTGGGTTTACAATGGGAGAATGTGTGCTGATTGGTCCATAGGTGTTCTTTGA(SEQ ID NO：12)。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肝癌预后产品包括肝癌预后试剂盒或芯片。

6.一种用于评估或辅助评估肝癌预后的产品，其特征在于，该产品中含有定量检测LncRNA的试剂，所述LncRNA为RP11-134021.1、XLOC_012786、XLOC_000917、XLOC_010457这4个长链非编码RNA的组合。

7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述产品包括试剂盒或芯片。

8.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述定量检测LncRNA的试剂为能够定量检测RP11-134021.1、XLOC_012786、XLOC_000917、XLOC_010457这4个长链非编码RNA的组合的引物或探针。

9.根据权利要求8所述的产品，其特征在于，能够定量检测RP11-134021.1、XLOC_012786、XLOC_000917和XLOC_010457的引物如权利要求3所述。

10.根据权利要求8所述的产品，其特征在于，能够定量检测RP11-134021.1、XLOC_012786、XLOC_000917和XLOC_010457的探针如权利要求4所述。