MX2014014275A - Genes nano46 y metodos para predecir el resultado del cancer de mama. - Google Patents

Abstract

La presente invención provee métodos para clasificar y para evaluar el pronóstico de un sujeto que tiene cáncer de mama; los métodos incluyen la predicción del subtipo de cáncer de mama usando un algoritmo supervisado para estratificar sujetos con la base del subtipo intrínseco de cáncer de mama; el modelo de predicción se basa en el perfil de expresión genes de los genes intrínsecos enlistados en el Cuadro 1; se proveen además composiciones y métodos para predecir el resultado o la respuesta a la terapia de un sujeto diagnosticado con o que se sospecha que tiene cáncer de mama; estos métodos son útiles para guiar o determinar las opciones de tratamiento para un sujeto afligido con cáncer de mama; los métodos de la invención incluyen además medios para evaluar los perfiles de expresión de genes, incluyendo microdisposiciones y pruebas de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa, así como kits que comprenden reactivos para poner en práctica los métodos de la invención.

Description

GENES NAN046Y MÉTODOS PARA PREDECIR ELRESULTADO DEL CÁNCER DE MAMA REFERENCIA RECÍPROCA A LAS SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama el beneficio de la solicitud provisional de los Estados Unidos presentada en Mayo 22 de y la solicitud provisional de los Estados Unidos presentada en Enero 17 de El contenido de cada una de estas solicitudes se incorpora en su totalidad en la presente como CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta descripción se refiere generalmente al campo de la biología del y a los campos de detección e identificación de fenotipos específicos de las celulas y su correlación con terapias ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los procedimientos actuales para tratar el cáncer de mama incluyendo la terapia han mejorado por supuesto la supervivencia y reducido la Sin el riesgo de recidiva puede estar inestimado en algunos pero sobrestimado en Mientras que el riesgo de recidiva disminuye algo con el se ha observado riesgo en curso en muchos algunos de ellos implicando decenas de miles de pacientes con cáncer de De algunos de los pacientes que experimentaron recidiva despues de cinco años en estos estudios habían sido considerados previamente como de por su cáncer no se había extendido hacia los nodulos linfáticos al momento de su diagnóstico o su estado del receptor de estrógeno era En uno de estos un número sustancial de recidivas ocurrió más de cinco años De esta existe la necesidad en la téenica por determinar el riesgo de recidiva y determinar terapias que reduzcan el riesgo y mejoren la supervivencia BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención provee un método para predecir el resultado en un sujeto que tiene cáncer de que proveer una muestra de tumor del determinar la expresión de los genes en la lista de genes intrínsecos NAN046 del cuadro 1 en la muestra de medir la similitud de la muestra de tumor con un subtipo intrínseco con base en la expresión de los genes en la lista de genes intrínsecos en donde el subtipo intrínseco consiste de por lo menos el tipo Luminal Luminal B o enriquecido con determinar una puntuación de proliferación basada en la expresión de un subgrupo de genes de proliferación en la lista de genes intrínsecos determinar el tamaño del calculando una puntuación de riesgo de recidiva usando una suma ponderada de dicho subtipo puntuación de proliferación y tamaño del y determinar si el sujeto tiene un bajo o alto riesgo de recidiva con base en la puntuación de En una una baja puntuación indica un resultado más y una alta puntuación indica un resultado menos Los metodos de la presente invención pueden incluir determinar la expresión de por lo menos uno una combinación o cada uno los genes intrínsecos NAN046 citados en el cuadro En algunas los métodos de la presente invención pueden incluir determinar la expresión de por lo menos uno una combinación o cada uno los genes intrínsecos NAN046 seleccionados de UBE2C La expresión de los miembros de la lista de genes intrínsecos NAN046 puede determinarse usando el sistema codificador de análisis Los métodos de la presente invención pueden incluir determinar por lo menos uno una combinación o cada uno los tamaño del grado del estado subtipo expresión del receptor de expresión del receptor de progesterona y expresión de La muestra puede ser un muestreo de celulas o La muestra puede ser un El tejido puede obtenerse de una La muestra puede ser un muestreo de fluidos El fluido corporal puede ser saliva o aspirado del Mientras que la descripción se ha descrito en conjunto con la descripción detallada de la se pretende que la descripción anterior ilustre y no limite el alcance de la la cual es definida por el alcance de las reivindicaciones Otros ventajas y modificaciones están dentro del alcance de las reivindicaciones La literatura científica y de patentes referida en la establece el conocimiento que está disponible para los expertos en la Todas las patentes de los Estados Unidos y las solicitudes de patente de los Estados Unidos publicadas o no publicadas citadas en la se incorporan en la presente como Todas las solicitudes de patente y patentes extranjeras publicadas citadas en la se incorporan de esta manera en la presente como Las presentaciones del Genbank y el NCBI indicadas por el número de acceso citado en la se incorporan de esta manera en la presente como Todas las demás referencias manuscritos y literatura científica citados en la se incorporan de esta manera en la presente como Mientras que esta descripción se ha mostrado y descrito particularmente con relación a las modalidades preferidas de la los expertos en la entenderán que pueden hacerse varios cambios en la forma y los detalles en la sin que se aparten del alcance de la descripción abarcada por las reivindicaciones BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 es un mapa térmico de los subtipos intrínsecos del cáncer de mama y los genes intrínsecos del cuadro La figura 2 muestra las curvas de supervivencia de Kaplan Meier de un grupo de pacientes con cáncer de mama no La figura 3 muestra las curvas de supervivencia de Kaplan Meier de un grupo de pacientes con cáncer de mama positivos para ER y negativos para nodulos tratados con La figura 4 muestra una probabilidad de eventos en 10 años como una función de la puntuación de ROR en pacientes con cáncer de mama negativos para nodulos linfáticos y positivos para tratados con La gráfica muestra la subpoblación subtipificada como Luminal A o B dentro de esta RFS supervivencia libre de DSS supervivencia específica de La figura 5 es un esquema de la prueba de subtipificación intrínseca de cáncer de La figura 6 es un esquema del proceso del La figura 7 es una ilustración que muestra la hibridación del CodeSet para La figura 8 es una ilustración que muestra la remoción del exceso de La figura 9 es una ilustración que muestra la unión de los indicadores a la superficie de un La figura 10 es una ilustración que muestra la inmovilización y alineación de un figura 11 es una ilustración de la colecta de La figura 12 es una ilustración del procedimiento de prueba de la prueba de cáncer de mama del sistema de análisis La figura 13 es una ilustración de la Prep Station de La figura 14 es una ilustración del analizador digital de DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La descripción presenta un para predecir el resultado en un sujeto que tiene cáncer de que proveer una muestra de tumor del determinar la expresión de los genes en la lista de genes intrínsecos NAN046 del cuadro 1 en la muestra de determinar el subtipo intrínseco de la muestra de tumor con base en la expresión de los genes en la lista de genes intrínsecos en donde el subtipo intrínseco consiste de por lo menos el tipo Luminal Luminal B o enriquecido con determinar una puntuación de proliferación basada en la expresión de un subgrupo de genes de proliferación en la lista de genes intrínsecos determinar el tamaño del calculando una puntuación de riesgo de recidiva usando una suma ponderada de dicho subtipo puntuación de proliferación y tamaño del y determinar si el sujeto tiene un bajo o alto riesgo de recidiva con base en la puntuación de En una una baja puntuación indica un resultado más y una alta puntuación indica un resultado menos Los genes intrínsecos se seleccionan estadísticamente por tener baja variación en la expresión entre las replicas de la muestra biológica del mismo individuo y alta variación en la expresión a través de las muestras de diferentes De esta se usan genes intrínsecos como genes clasificadores para la clasificación del cáncer de Aunque no se usó la información clínica para derivar los subtipos intrínsecos del cáncer de esta clasificación ha demostrado tener significancia de Puede usarse el tramado de los genes intrínsecos para clasificar los cánceres de mama en cinco subtipos moleculares intrínsecos Luminal A Luminal B enriquecido con HER2 tipo basal y tipo normal et Sorlie et Una prueba de la expresión de los genes como se describe en la puede identificar el subtipo intrínseco de una muestra por un tejido tumoral estándar fijado en formalina e incluido en Los metodos utilizan un algoritmo supervisado para clasificar las muestras del sujeto de acuerdo con el subtipo intrínseco de cáncer de Este referido en la presente como el modelo de clasificación se basa en el perfil de la expresión de los genes de un subgrupo definido de genes intrínsecos que han sido identificados en la presente como superiores para clasificar los subtipos intrínsecos de cáncer de El subgrupo de junto con las secuencias de los iniciadores específicas del objetivo usadas para su se proveen en el cuadro El cuadro 1A provee las secuencias de las secuencias de la sonda específicas del objetivo para detectar cada gen utilizado el cuadro Las secuencias provistas en el cuadro 1A son meramente representativas y no significa que limitan la El experto en la téenica puede utilizar cualquier sonda específica de la secuencia objetivo para detectar cualquiera cada de los genes en el cuadro CUADRO 1 CUADRO 1 CUADRO 1 CUADRO 1 CUADRO 1A Sondas para detectar los genes NANQ46 CUADRO A CUADRO 1A CUADRO CUADRO 1 A CUADRO El cuadro 2 provee secuencias seleccionadas para los genes NAN046 del cuadro 1 CUADRO 2 CUADRO 2 CUADRO 2 CUADRO 2 CUADRO 2 CUADRO 2 CUADRO 2 i CUADRO 2 CUADRO 2 CUADRO 2 CUADRO 2 í i i j CUADRO 2 CUADRO 2 CUADRO 2 I i CUADRO 2 CUADRO 2 i CUADRO 2 i s CUADRO 2 1 CUADRO 2 i Í un LO o CUADRO 2 CUADRO 2 CUADRO 2 l CUADRO 2 i i CUADRO 2 r CUADRO 2 CUADRO 2 i i i CUADRO 2 i 1 CUADRO 2 CUADRO 2 CUADRO 2 O l CUADRO 2 CUADRO 2 CUADRO 2 CUADRO 2 CUADRO 2 CUADRO 2 Por lo menos por lo menos por lo menos por lo menos por lo menos por lo menos 46 o los 46 genes en el cuadro 1 pueden usarse en los métodos de la presente De la expresión de cada uno de los 46 genes se determina en una muestra Los perfiles prototípicos de la expresión de los genes de los cuatro subtipos fueron predefinidos a partir de una serie de formación de muestras de tumores de mama FFPE usando el análisis de la agrupación jerárquica de los datos de la expresión de los Un mapa térmico de los perfiles prototípicos de la expresión de los genes de estos cuatro subtipos se muestra en la figura 1 en donde el nivel de expresión es por el mapa El cuadro 3 muestra los valores CUADRO 3 l Despues de que se realiza la prueba de subtipificación intrínseca de cáncer de mama con una muestra de tumor de cáncer de mama de prueba y la muestra de referencia provista como parte del kit de un algoritmo computacional basado en una correlación de Pearson compara el perfil de la expresión de los genes normalizado y escalado de la serie de genes intrínsecos NAN046 de la muestra de con las firmas prototípicas de la expresión de los cuatro subtipos intrínsecos de cáncer de El análisis de los subtipos intrínsecos se determina determinando la expresión de una serie de genes NANO50 cual está determinando la expresión de la serie de genes NAN046 e incluye además la determinación de la expresión de GRB7 y y el riesgo de recidiva se determina usando la serie de genes el subtipo intrínseco se identifica comparando la expresión de la serie de genes NANO50 en la muestra con los perfiles de expresión esperados para los cuatro subtipos El subtipo con el perfil de expresión más similar se asigna a la muestra La puntuación de ROR es un valor entero en una escala de 0 a 100 que se relaciona con la probabilidad de un paciente individual de recidiva distante dentro de 10 años para la población de uso deseada La puntuación de ROR se calcula comparando los perfiles de expresión de los genes NAN046 en la muestra biológica con los perfiles esperados para los cuatro subtipos como se describió para calcular cuatro diferentes valores de Estos valores de correlación se combinan entonces con una puntuación de proliferación opcionalmente una o más variables tales como el tamaño del para calcular la puntuación de De la puntuación de ROR se calcula comparando sólo los perfiles de expresión de los genes La figura 6 provee un esquema de las transformaciones específicas del La muestra de tumor se asigna al subtipo con la correlación positiva más grande para la Las curvas de supervivencia de Kaplan Meier generadas a partir de una serie de formación de pacientes con cáncer de mama no demuestran que los subtipos intrínsecos son un indicador de pronóstico de supervivencia libre de recidiva en esta población de la cual incluye pacientes para receptor de estrógeno y pacientes para véase la figura Pruebas independientes en un grupo de pacientes tratados con positivos para receptor de estrógeno y negativos para nodulos muestran predominantemente pacientes con los subtipos Luminal A y Luminal exhibiendo los pacientes con el subtipo Luminal A mejor resultado que los pacientes con el subtipo Luminal véase la figura Se espera que el resultado de los pacientes con el subtipo Lumlnal A mejore aún más usando especímenes de prueba clínicos que usan regímenes de tratamiento más modernos inhibidores de y tengan mejor adherencia a la terapia que mejorará el La serie de formación de las muestras de tumores de mama la cual tuvo características clínicas y datos de resultado clínico bien se usó para establecer una puntuación continua de riesgo de recidiva La puntuación se calcula usando coeficientes de un modelo de Cox que incluye correlación con cada subtipo una puntuación de proliferación media de los genes de un subgrupo de 18 de los 46 y tamaño del el cuadro CUADRO 4 Coeficientes para calcular Variables de prueba Coeficient C elación de Pearson tipo basal ación de Pearson enriquecida con Her2 ación de Pearson para Luminal A ación de Pearson para Luminal B untuación de proliferación Tamaño del tumor Las variables de prueba en el cuadro 4 se multiplican por los coeficientes y se suman para producir una puntuación de riesgo Ecuación de En estudios la puntuación de ROR proveyó una estimación continua del riesgo de recidiva para pacientes negativos para nodulos linfáticos y positivos para quienes fueron tratados con tamoxifeno por 5 años et Cáncer Este resultado se verificó en pacientes negativos para nodulos linfáticos y positivos para ER del mismo la figura La puntuación de ROR exhibió también una mejora estadísticamente significativa sobre un modelo clínico basado en la determinación de la RFS dentro de esta población de proveyendo más evidencia de la precisión mejorada de esta herramienta de toma de decisiones cuando se compara con las medidas clinicopatológicas tradicionales et Cáncer La serie de genes contiene muchos genes que son marcadores conocidos para Los métodos de la presente invención proveen la determinación de subgrupos de genes que proveen una firma de Los métodos de la presente invención pueden incluir determinar la expresión de por lo menos uno una combinación o cada uno un subgrupo de 18 genes de los genes intrínsecos NAN046 seleccionados de UBE2C De la expresión del subgrupo de cada uno de los 18 genes de la serie de genes NAN046 se determina para proveer una puntuación de Puede determinarse la expresión de uno o más de estos y puede generarse un índice de firma de promediando las estimaciones de expresión normalizadas de uno o más de estos genes en una A la muestra se le puede asignar una firma de alta una firma de proliferación una firma de baja proliferación o una firma de ultra baja Los metodos para determinar una firma de proliferación a partir de una muestra son como se describen en Nielsen et Cáncer y material en línea complementario documentos se incorporan en su totalidad en la presente como Descripción de la biología de los subtipos intrínsecos Subtipos Los subtipos más comunes de cáncer de mama son los subtipos Luminal A y Luminal Estudios previos sugieren que Luminal A comprende aproximadamente a y Luminal B aproximadamente de todos los cánceres de pero representan más de de los cánceres de mama positivos para receptor de hormona et Cáncer El patrón de expresión de los genes de estos subtipos se asemeja al componente epitelial luminal de la Estos tumores se caracterizan por alta expresión del receptor de estrógeno receptor de progesterona y genes asociados con la activación del tales como GATA3 y cielina así como la expresión de las citoqueratinas luminales 8 y 18 y Charles Perou Gene and Therapeutic Jay Harris et Diseases of the breast Lippincott Williams Luminal Los cánceres de mama Luminal A exhiben baja expresión de genes asociados con la activación del ciclo celular y el grupo ERBB2 que resulta en un mejor pronóstico que Luminal El subgrupo Luminal A tiene el pronóstico más favorable de todos los y es enriquecido para los tumores sensibles a la terapia Luminal Los cánceres de mama Luminal B expresan tambien genes de ER y genes asociados con Los genes asociados con la activación del ciclo celular son altamente y este tipo de tumor puede ser o El pronóstico es desfavorable pesar de la expresión del y la sensibilidad a la terapia endocrina es generalmente disminuida respecto a Enriquecido con El subtipo enriquecido con HER2 es generalmente negativo para ER y es positivo para HER2 en la mayoría de los casos con alta expresión del grupo incluyendo ERBB2 y Los genes asociados con la activación del ciclo celular son altamente y estos tumores tienen un mal Tipo El subtipo tipo basal es generalmente negativo para es casi siempre clínicamente negativo para y expresa una serie de biomarcadores que incluyen las citoqueratinas epiteliales básales y el receptor del factor de crecimiento epidermico Los genes asociados con la activación del ciclo celular son altamente Variables clínicas El modelo de clasificación NAN046 descrito en la presente puede combinarse adicionalmente con información sobre variables clínicas para generar un mecanismo de predicción continuo de riesgo de recidiva Como se describe en la muchos factores clínicos y de pronóstico de cáncer de mama se conocen en la téenica y se usan para predecir el resultado del tratamiento y la probabilidad de recidiva de la Dichos factores por envolvimiento de los nodulos tamaño del grado estado de los receptores de las hormonas estrógeno y niveles de y ploidía del En una se provee la puntuación de riesgo de recidiva para un sujeto diagnosticado o que se sospecha cáncer de Esta puntuación usa el modelo de clasificación NAN046 en combinación con factores clínicos del estado de los nodulos linfáticos y el tamaño del tumor La evaluación de las variables clínicas se basa en el sistema estandarizado del American Joint Committee on Cáncer para la estad ificación del cáncer de En este el tamaño del tumor primario se clasifica sobre una escala de 0 a 4 sin evidencia de tumor 2 2 cm 5 5 tumor de cualquier tamaño con diseminación directa hacia la pared del tórax o la El estado de los nodulos linfáticos se clasifica como los nodulos linfáticos regionales están libres de metástasis hacia los nodulos linfáticos axilares del mismo lado metástasis hacia los nodulos linfáticos del mismo lado fijados a algún otro o a otras metástasis hacia los nodulos linfáticos del mismo lado bajo el Los metodos para identificar a los pacientes con cáncer de mama y estad ificar la enfermedad son bien y pueden incluir examen revisión de la historia del paciente de su y téenicas de formación de tales como formación de imágenes de resonancia magnética y tomografía de emisión de positrones Fuente de la muestra En una modalidad de la presente el subtipo de cáncer de mama se evalúa a través de la evaluación de los patrones de o de los genes intrínsecos enlistados en el cuadro en una o más muestras del Para el propósito de el término o muestra del se refiere a un individuo sin tener en cuenta la salud el estado de Un sujeto puede ser un un participante de un sujeto un sujeto de o cualquier otra clase de individuo de quien se obtiene una muestra y se evalúa en el contexto de la Por un sujeto puede ser diagnosticado con cáncer de puede presentar uno o más síntomas de cáncer de o un factor de tal como un factor familiar o de historia médica para cáncer de puede estar sufriendo tratamiento o terapia para cáncer de o En forma un sujeto puede estar sano con respecto a cualquiera de los factores o criterios mencionados Se apreciará que el término como se usa en la es respecto al estado del cáncer de puesto que no puede definirse que el término corresponde a alguna evaluación o estado De esta un individuo definido como sano con relación a alguna enfermedad o criterio de enfermedad puede ser diagnosticado de hecho con cualquier otra de una o más o puede exhibir cualquier otro de uno o más criterios de que incluyen uno o más cánceres diferentes del cáncer de Sin los controles sanos están de preferencia libres de cualquier En modalidades los métodos para predecir los subtipos intrínsecos de cáncer de mama incluyen colectar una muestra biológica que comprende una célula o tejido tal como una muestra de tejido de mama o una muestra de tejido de tumor de mama Por el término se entiende cualquier muestreo de tejidos o fluidos corporales en los cuales la expresión de un gen intrínseco puede ser Ejemplos de dichas muestras biológicas pero no están limitados biopsias y Los fluidos corporales útiles en la presente descripción incluyen aspirados de fluidos o cualquier otra secreción corporal o derivado de la La sangre puede incluir sangre o cualquier derivado de En algunas la muestra biológica incluye celulas de en particular tejido de una biopsia de tal como una muestra de tejido de tumor de Las muestras biológicas pueden obtenerse de un sujeto mediante una variedad de téenicas que por mediante raspadura o hisopado de un usando una aguja para aspirar las células o los fluidos o removiendo una muestra de tejido Métodos para colectar varias muestras biológicas son bien conocidos en la En algunas una muestra de tejido de mama se por mediante biopsia por aspiración con aguja biopsia por aspiración con aguja gruesa o biopsia por Pueden aplicarse soluciones fijadoras y colorantes a las células o los tejidos para preservar el espécimen y para facilitar el Las muestras en particular las muestras de tejido de pueden ser transferidas a un portaobjetos para observación bajo En una la muestra biológica es una muestra de tejido de mama incluida en parafina y fijada en en particular una muestra de tumor de mama En varias la muestra de tejido se obtiene de una muestra del centro del tejido guiada por un Análisis de la expresión En varias la presente descripción provee métodos para pronosticar o monitorear cáncer de mama en En esta los datos obtenidos del análisis de la expresión de los genes intrínsecos se evalúan usando uno o más algoritmos de reconocimiento del Dichos métodos de análisis pueden usarse para formar un modelo el cual puede usarse para clasificar los datos de Por un método de clasificación conveniente y particularmente efectivo usa el modelado de análisis estadístico primero para formar un modelo matemático usando datos del de muestras de subtipo conocido de sujetos que se sabe tienen un subtipo intrínseco de cáncer de mama tipo enriquecido con HER2 o tipo y segundo para clasificar una muestra desconocida de de acuerdo con el Se han usado ampliamente métodos de reconocimiento del patrón para caracterizar muchos diferentes tipos de problemas que por sobre química y En el contexto de los métodos descritos en la el reconocimiento del patrón es el uso de estadística tanto paramétrica como no para analizar y por lo tanto para clasificar muestras y para predecir el valor de alguna variable dependiente con base en una escala de mediciones Existen dos procedimientos Una serie de métodos se denomina y éstos simplemente reducen la complejidad de los datos de una manera y producen también gráficas de visualización que pueden ser interpretadas por el ojo Sin este tipo de procedimiento puede no ser adecuado para desarrollar una prueba clínica que puede usarse para clasificar muestras derivadas de sujetos independientes de la población de muestra inicial usada para formar el algoritmo de El otro procedimiento se denomina por el cual una serie de formación de muestras con clase o resultado conocido se usa para producir un modelo matemático el cual se evalúa entonces con series de datos de validación una de de datos de la expresión de los genes intrínsecos se usa para construir un modelo estadístico que predice correctamente el de cada Esta serie de formación se pone a prueba entonces con datos independientes como una serie de prueba o para determinar la robustez del modelo basado en Estos modelos se denominan a veces pero pueden basarse en una gama de diferentes procedimientos Los métodos supervisados pueden usar una serie de datos con dimensionalidad reducida los primeros pocos componentes pero usan típicamente datos no con toda la En todos los los métodos permiten la descripción cuantitativa de los límites multivariables que caracterizan y separan a cada subtipo en términos de su perfil de expresión de los genes Es también posible obtener límites de confianza sobre cualquier por un nivel de probabilidad que se pondrá sobre la bondad del La robustez de los modelos profeticos puede verificarse también usando validación dejando fuera muestras seleccionadas del El modelo de clasificación NAN046 descrito en la presente se basa en el perfil de expresión de los genes para una pluralidad de muestras del sujeto usando los genes intrínsecos enlistados en el cuadro La pluralidad de muestras incluye un número suficiente de muestras derivadas de sujetos que pertenecen a cada clase de Por o en este contexto se entiende una cantidad de muestras derivadas de cada subtipo que es suficiente para construir un modelo de clasificación que puede distinguir confiablemente cada subtipo de los demás en el Se desarrolla un algoritmo de predicción supervisado basado en los perfiles de muestras prototipo objetivamente seleccionadas para el Las muestras se seleccionan y se subtipifican usando una serie expandida de genes intrínsecos de acuerdo con los métodos descritos en la patente internacional publicación WO y la patente de los Estados Unidos publicación las cuales se incorporan enteramente en la presente como En forma las muestras pueden ser subtipificadas de acuerdo con cualquier prueba conocida para clasificar los subtipos de cáncer de Después de que se estratifican las muestras de formación de acuerdo con el un algoritmo de predicción basado en centroides se usa para construir los centroides con base en el perfil de expresión de la serie de genes intrínsecos descrita en el cuadro En una el algoritmo de predicción es la metodología de centroides más cercanos relacionada con la descrita en Narashiman y Chu PNAS cita que se incorpora en su totalidad en la presente como En la presente el calcula un centroide estandarizado para cada Este centroide es la expresión de los genes promedio para cada gen en cada subtipo dividida entre la desviación estándar dentro de la clase para ese La clasificación de centroides más cercanos toma el perfil de expresión de los genes de una nueva y lo compara con cada uno de estos centroides de la La predicción del subtipo se hace calculando la correlación de rangos de Spearman de cada caso de prueba para los cinco y asignando una muestra a un subtipo con base en el centroide más Detección de la expresión de los genes intrínsecos Cualquier método disponible en la téenica para detectar la expresión de los genes intrínsecos enlistados en el cuadro es abarcado en la Por la se entiende determinar la cantidad o la presencia de un transcrito de o su producto de expresión de un gen Los métodos para detectar la expresión de los genes intrínsecos de la es el análisis de la expresión de los incluyen métodos basados en el análisis de la hibridación de métodos basados en la secuenciación de metodos de inmunohistoquímica y métodos basados en Los métodos detectan generalmente los productos de expresión de los genes intrínsecos enlistados en el cuadro En modalidades se usan métodos basados en tales como transcripción inversa PCR et TIG y métodos basados en tales como microdisposiciones et Science Por se entiende una disposición ordenada de elementos hibridables de la disposición tales por sondas de sobre un El término se refiere a cualquier molécula que es capaz de unirse selectivamente a una biomolécula objetivo específicamente por un transcrito de nucleótido o una proteína codificada por o que corresponde a un gen Las sondas pueden ser sintetizadas por el experto en la o pueden derivarse de preparaciones biológicas Las sondas pueden ser diseñadas específicamente para ser Ejemplos de moléculas que pueden utilizarse como sondas pero no están limitados anticuerpos y moléculas Muchos métodos de detección de la expresión usan ARN El material de partida es típicamente ARN total aislado de una muestra tal como un tumor o línea de células y que corresponde a un tejido o línea de células Si la fuente de ARN es un tumor el ARN puede ser por de muestras de tejido congeladas o archivadas incluidas en parafina y fijadas fijadas en muestras del centro de un tejido obtenidas por un Los metodos generales para la extracción de ARN son bien conocidos en la téenica y se describen en libros de texto estándar de biología que incluyen Ausubel et Current Protocols in Molecular John New York Métodos para la extracción de ARN de tejidos incluidos en parafina se por en Rupp y Lab A67 y en De Andrés et Biotechniques En el aislamiento de ARN puede llevarse a cabo usando un kit de una serie de reguladores de pH y proteasa de fabricantes tales como Qiagen de acuerdo con las instrucciones del Por el ARN total de células en cultivo puede aislarse usando minicolumnas RNeasy de Otros kits para el aislamiento de ARN disponibles comercialmente incluyen el kit de purificación de ARN y ADN completo y el kit para el aislamiento de ARN de bloques de parafina El ARN total de muestras de tejido puede ser por usando RNA El ARN total de FFPE puede ser por usando el microkit para ARN FFPE High de catálogo 04823125001 Applied El ARN preparado de un tumor puede por mediante centrifugación por gradiente de densidad de cloruro de grandes números de muestras de tejido pueden ser procesadas fácilmente usando bien conocidas por los expertos en la técnica tales por el procedimiento de aislamiento de ARN de un sólo paso de Chomczynski de los Estados Unidos El ARN aislado puede usarse en pruebas de hibridación o amplificación que pero no están limitadas análisis por PCR y disposiciones de Un método para la detección de los niveles de ARN implica poner en contacto el ARN aislado con una molécula de ácido nucleico que puede hibridar con el ARNm codificado por el gen que está siendo La sonda de ácido nucleico puede por un ADNc de longitud o una porción del tal como un oligonucleótido de por lo menos 250 o 500 nucleótidos de longitud y suficiente para hibridar específicamente usando condiciones severas con un gen intrínseco de la presente o cualquier ARN o ADN La hibridación de un ARNm con la sonda indica que el gen intrínseco en cuestión está siendo En una el ARNm es inmovilizado sobre una superficie sólida y puesto en contacto con una por haciendo correr el ARNm aislado sobre un gel de y transfiriendo el ARNm del gel a una tal como En una modalidad las sondas son inmovilizadas sobre una superficie y el ARNm es puesto en contacto con las por en una disposición de chips de genes El experto en la técnica puede adaptar fácilmente los métodos de detección de ARNm conocidos para su uso en la detección del nivel de expresión de los genes intrínsecos de la presente Un metodo alternativo para determinar el nivel del producto de expresión de los genes intrínsecos en una implica el procedimiento de amplificación de ácidos por mediante de los Estados Unidos reacción en cadena de ligasa PNAS USA replicación de secuencias et Sci USA sistema de amplificación por transcripción et Sci USA Replicasa et 1197 replicación del círculo rodante de los Estados Unidos o cualquier otro método de amplificación de ácidos seguido de la detección de las moléculas amplificadas usando téenicas bien conocidas por los expertos en la Estos esquemas de detección son especialmente útiles para la detección de moléculas de ácido si dichas moléculas están presentes en números muy En aspectos particulares de la la expresión de los genes intrínsecos se evalúa mediante Numerosos protocolos de PCR o QPCR diferentes se conocen en la técnica y se ejemplifican en la presente más y pueden ser aplicados y adaptados directamente para su uso en las composiciones actualmente descritas para la detección cuantificación de los genes intrínsecos enlistados en el cuadro En en la una secuencia de polinucleótidos objetivo es amplificada mediante reacción con por lo menos un iniciador de oligonucleótidos o par de iniciadores de Los iniciadores hibridan con una región complementaria del ácido nucleico y la ADN polimerasa extiende los iniciadores para amplificar la secuencia Bajo condiciones suficientes para proveer productos de amplificación de ácido nucleico basados en un fragmento de ácido nucleico de un tamaño domina los productos de reacción secuencia de polinucleótidos objetivo que es el producto de El ciclo de amplificación se repite para incrementar la concentración de la secuencia de polinucleótidos objetivo La reacción puede llevarse a cabo en cualquier termociclizador usado comúnmente para la Sin preferidos son los ciclizadores con capacidades de medición de fluorescencia en tiempo por ABI PRISM Foster Diagnostics y La En otra modalidad de la se usan microdisposiciones para el análisis de la Las microdisposiciones son particularmente bien adecuadas para este propósito debido a la reproducibilidad entre los diferentes Las microdisposiciones de ADN proveen un metodo para la medición simultánea de los niveles de expresión de grandes números de Cada disposición consiste de un patrón reproducible de sondas de captura unidas a un soporte El ARN o ADN marcado es hibridado con sondas complementarias en la y detectado entonces mediante exploración con rayo Las intensidades de hibridación para cada sonda en la disposición son determinadas y convertidas a un valor cuantitativo que representa los niveles relativos de expresión de los por las patentes de los Estados Unidos y y Las disposiciones de oligonucleótidos de alta densidad son particularmente útiles para determinar el perfil de expresión de los genes para un gran número de moléculas de ARN en una En una modalidad se usa el sistema de análisis para detectar la expresión de los genes La base del sistema de análisis es el código único asignado a cada ácido nucleico objetivo que será puesto a prueba la solicitud de patente internacional publicación WO la patente de los Estados Unidos y Geiss et Nature 2008 cuyo contenido se incorpora enteramente en la presente como El código está compuesto de una serie ordenada de manchas fluorescentes coloreadas que crean un código de barras único para cada objetivo que será puesto a Un par de sondas se diseña para cada objetivo de ARN o una sonda de captura biotinilada y una sonda indicadora que posee el código de barras Este sistema es referido en la como el sistema codificador Sondas de captura e indicadora específicas se sintetizan para cada En sondas de oligonucleótidos de ADN específicas de la secuencia son unidas a moléculas indicadoras específicas del De cada sonda indicadora específica de la secuencia comprende una secuencia específica del objetivo capaz de hibridar con no más de un gen NAN046 del cuadro 1 y opcionalmente comprende por lo menos por lo menos o por lo menos cuatro regiones de unión del dichas regiones de unión comprendiendo uno o más monómeros del marcador que emiten Las sondas de captura se obtienen ligando un segundo oligonucleótido de ADN específico de la secuencia para cada objetivo con un oligonucleótido universal que contiene Las sondas de captura e indicadora son agrupadas en una mezcla de hibridación la de De la colección de sondas comprende un par de sondas sonda de captura e para cada uno de los genes NAN046 en el cuadro La abundancia relativa de cada objetivo se mide en una reacción de hibridación multiplexada El método comprende poner en contacto una muestra biológica con una colección de la colección comprendiendo un par de sondas para los genes NAN046 en el cuadro 1 de modo que la presencia del objetivo en la muestra cree un complejo de objetivo par de El complejo es entonces Más la muestra se combina con la colección de y la hibridación ocurre en Después de la los complejos hibridados tripartitas de sondas y se purifican en un procedimiento de dos pasos usando perlas magneticas enlazadas a oligonucleótidos complementarios para secuencias universales presentes en las sondas indicadora y de Este procedimiento de doble purificación permite que la reacción de hibridación sea llevada a término con un gran exceso de sondas específicas del ya que son finalmente removidas de esta no interfieren con la unión y la formación de imágenes de la Todos los pasos son manejados robóticamente en un robot personalizado para el manejo de líquidos NanoString Las reacciones purificadas son depositadas por la Prep Station en células de flujo individuales de un cartucho de unidas a una superficie revestida de estreptavidina por medio de la sonda de sometidas a electroforesis para alargar las sondas e Después del el cartucho de muestras es transferido a un dispositivo de colecta de datos y de formación de imágenes completamente automatizado NanoString El nivel de expresión de un objetivo se mide mediante la formación de imágenes de cada muestra y contando el número de veces que el código para ese objetivo es Los datos se generan en formato de hoja de cálculo simple que enlista el número de conteos por por Este sistema puede usarse junto con Descripción adicional respecto a puede encontrarse en la publicación internacional WO y WO y en la patente de los Estados Unidos publicación y cuyo contenido se incorpora en su totalidad en la presente como el termino y sondas de ácido nucleico puede incluir las secuencias racionalmente diseñadas secuencias descritas en la publicación internacional WO y en la patente de los Estados Unidos publicación incorporadas en su totalidad en la presente como Procesamiento de datos Con frecuencia es útil los datos de la expresión de los por consignando datos cambio de Métodos de proyección tales como el análisis de componentes principales y el análisis parcial de mínimos cuadrados se denominan también métodos sensibles de cambio de Mediante el uso del conocimiento y la experiencia previos acerca del tipo de datos la calidad de los datos antes del modelado multivariable puede mejorarse mediante el cambio de escala la El cambio de escala la ponderación adecuados pueden revelar la variación importante e interesante oculta dentro de los y por lo tanto hacen que el modelado multivariable subsiguiente sea más Pueden usarse el cambio de escala y la ponderación para poner los datos en la métrica con base en el conocimiento y la experiencia del sistema y por lo tanto revelan patrones ya presentes inherentemente en los Si es deben evitarse los datos por los espacios intermedios en los valores de las Sin si es dichos datos faltantes pueden ser reemplazados o por el valor medio de una columna un valor aleatorio o un valor basado en un análisis de componentes principales de componentes La de los ejes de las coordenadas del descriptor puede ser Ejemplos de dicha traslación incluyen normalización y centrado a la Puede usarse la para remover la variación de muestra a Para los datos de las el procedimiento de normalización pretende remover los errores sistemáticos balanceando las intensidades de fluorescencia de los dos colorantes de La propensión por el colorante puede provenir de varias fuentes que incluyen diferencias en las eficiencias de marcación del sensibilidades al calor y la así como las configuraciones del explorador para explorar dos Algunos metodos usados comúnmente para calcular el factor de normalización normalización global que usa todos los genes en la normalización de los genes de mantenimiento que usa genes mantenimiento expresados y normalización de los controles internos que usa la cantidad conocida de los genes control exógenos añadidos durante la hibridación 32 En una los genes intrínsecos descritos en la presente pueden ser normalizados para controlar a los genes de Por los genes de mantenimiento descritos en la patente de los Estados Unidos publicación la cual se incorpora en su totalidad en la presente como pueden usarse para la Ejemplos de genes de mantenimiento incluyen RPLPO y Los expertos en la entenderán que los métodos descritos en la presente no son unidos por normalización a algún gen de mantenimiento y que puede usarse cualquier gen de mantenimiento adecuado conocido en la Muchos procedimientos de normalización son y pueden aplicarse con frecuencia en cualquiera de varios puntos en el En una los datos de las microdisposiciones son normalizados usando el método el cual es una función de normalización suavizada global de gráfica de dispersión localmente En otra los datos de qPCR son normalizados a la media geométrica de la serie de genes de mantenimiento Puede usarse también el a la para simplificar la para cada se resta el valor promedio de ese descriptor para todas las De esta la media de un descriptor coincide con el y todos los descriptores son a En el de escala de la variancia los datos pueden ser escalados a igual el valor de cada descriptor es escalado por en donde StDev es la desviación estándar para ese descriptor para todas las El de escala de en cierto intermedio entre el centrado a la mitad y el cambio de escala de la variancia En el cambio de escala de el valor de cada descriptor es escalado por en donde StDev es la desviación estándar para ese descriptor para todas las De esta cada descriptor tiene una variancia numericamente igual a su desviación estándar El cambio de escala de Pareto puede llevarse a por en datos sin elaborar o datos del centrado a la El de escala puede usarse para facilitar la interpretación cuando los datos tienen un sesgo positivo cuando los datos abarcan una gran por varios órdenes de para cada el valor es reemplazado por el logaritmo de ese En el de escala de igual cada descriptor es dividido entre la escala de ese descriptor para todas las De esta todos los descriptores tienen la misma es Sin este método es sensible a la presencia de puntos En el de cada vector de datos es centrado a la y la variancia unitaria Esta téenica es muy útil debido a que cada descriptor es entonces igualmente y los grandes y pequeños valores se tratan con igual Esto puede ser importante para los genes expresados a niveles muy pero aún En una los datos se colectan para una o más muestras de prueba y se clasifican usando el modelo de clasificación NAN046 descrito en la Cuando se comparan los datos de análisis múltiples comparando los perfiles de expresión para una o más muestras de prueba con los centroides construidos de muestras colectadas y analizadas en un estudio será necesario normalizar los datos a de estas series de En una se usa la discriminación ponderada por la distancia para combinar juntas estas series de datos et Bioinformatics cita incorporada en su totalidad en la presente como DWD es una herramienta de análisis multivariable que es capaz de identificar las propensiones sistemáticas presentes en series de datos y hace entonces un ajuste global para compensar estas en cada serie de datos separada es una nube de puntos de datos y DWD toma dos nubes de puntos y cambia de modo que traslapa más óptimamente la Los métodos descritos en la presente pueden ser implementados los resultados registrados usando cualquier dispositivo capaz de implementar los métodos de registrar los Ejemplos de dispositivos que pueden usarse pero no están limitados dispositivos computacionales que incluyen computadoras de todos los Cuando los métodos descritos en la presente son implementados registrados en una el programa informático que puede usarse para configurar la computadora para llevar a cabo los pasos de los métodos puede ser contenida en cualquier medio legible en computadora capaz de contener el programa Ejemplos del medio legible en computadora que pueden usarse pero no están limitados y otros dispositivos de almacenamiento de cómputo y de El programa informático que puede usarse para configurar la computadora para llevar a cabo los pasos de los métodos para registrar los resultados puede proveerse también sobre una red por sobre la una intranet u otra Cálculo del riesgo de recidiva Provistos en la son métodos para predecir el resultado de cáncer de mama dentro del contexto del subtipo intrínseco y opcionalmente otras variables El resultado puede referirse a la supervivencia general o específica de la supervivencia libre de o resultado en respuesta a un tratamiento o terapia En los métodos pueden usarse para predecir la probabilidad de supervivencia a largo plazo libre de Se pretende que la de la probabilidad de supervivencia de un paciente con cáncer de evalúe el riesgo de que un paciente muera como resultado del cáncer de mama Se pretende que la a largo plazo libre de signifique que el paciente no muere de o sufre una recidiva del cáncer de mama subyacente dentro de un período de por lo menos cinco o por lo menos diez o más después del diagnóstico o tratamiento En una el resultado se predice con base en la clasificación de un sujeto de acuerdo con el Además de que se provee una asignación del el modelo de bioinformática NAN046 provee una medición de la similitud de una muestra de prueba con los cuatro subtipos que es trasladada en una puntuación de riesgo de recidiva que puede usarse en cualquier población de pacientes sin tener en cuenta el estado de enfermedad y las opciones de Los subtipos intrínsecos y ROR tienen tambien valor en la predicción de la respuesta completa patológica en mujeres tratadas por taxano neoadyuvante y quimioterapia con antracielina et J Clin Oncol cita incorporada en su totalidad en la presente como De esta en varias modalidades de la presente se usa un modelo de riesgo de recidiva para predecir el Mediante el uso de estos modelos de los sujetos pueden ser estratificados en grupos de mediano y alto riesgo de El cálculo de ROR puede proveer información de pronóstico para guiar las decisiones de tratamiento monitorear la respuesta a la En algunas modalidades descritas en la el desempeño de pronóstico de los subtipos intrínsecos definidos por NAN046 otros parámetros clínicos se evalúa usando un análisis del modelo de riesgos proporcional de el cual es un método de regresión para datos de supervivencia que provee una estimación de la relación de riesgos y su intervalo de El modelo de Cox es una téenica estadística bien reconocida para explorar la relación entre la supervivencia de un paciente y variables Este método estadístico permite la estimación del peligro de los individuos dadas sus variables de pronóstico perfil de expresión de genes intrínsecos con o sin factores clínicos como se describe en la La de es el riesgo de muerte en cualquier punto de tiempo dado para los pacientes que exhiben variables de pronóstico en Spruance et Agents El modelo de clasificación NAN046 descrito en la presente puede ser formado para riesgo de recidiva usando distancias de subtipos o usando distancias de subtipos con variables clínicas como se discutió En una la puntuación de riesgo para una muestra de prueba se calcula usando las distancias de subtipos intrínsecos solos usando la siguiente ROR en donde las variables y son las distancias al centroide para cada clasificador respectivo cuando el perfil de expresión de una muestra de prueba se compara con los centroides construidos usando los datos de la expresión de los genes depositados con el Gene Expression Omnibus La puntuación de riesgo puede calcularse también usando una combinación del subtipo de cáncer de mama y las variables clínicas tamaño del tumor y estado de los nodulos linfáticos usando la siguiente ROR de nuevo cuando se comparan los perfiles de expresión de la prueba con los centroides construidos usando los datos de la expresión de los genes depositados con GEO como número de acceso En otra la puntuación de riesgo para una muestra de prueba se calcula usando las distancias de subtipos intrínsecos solos usando la siguiente en donde las variables y son como se describieron y los perfiles de expresión de la prueba se comparan con los centroides construidos usando los datos de la expresión de los genes depositados con GEO como número de acceso En otra la puntuación de riesgo puede calcularse también usando una combinación del subtipo de cáncer de mama y la variable clínica tamaño del tumor usando la siguiente ecuación donde las variables son como se describieron En otra la puntuación de riesgo para una muestra de prueba se calcula usando las distancias de los subtipos intrínsecos en combinación con la firma de proliferación usando la siguiente en donde las variables y son como se describieron y los perfiles de expresión de la prueba se comparan con los centroides construidos usando los datos de la expresión de los genes depositados con GEO como número de acceso En otra la puntuación de riesgo puede calcularse tambien usando una combinación del subtipo de cáncer de la firma de proliferación y la variable clínica tamaño del tumor usando el descrito en conjunto con el cuadro 3 citado Detección de los subtipos Se llevó a cabo concurrentemente inmunohistoquímica para estrógeno progesterona HER2 y Ki67 en secciones en serie con el método estándar de complejo de con diaminobencidina como el La tinción para la interpretación de PgR y HER2 puede llevarse a cabo como se describió previamente et Clin Cáncer sin puede usarse cualquier método conocido en la Por un anticuerpo puede aplicarse a una dilución por 32 siguiendo el protocolo del inmunocolorante automatizado Benchmark Ventana Tucson acondicionador de células 1 un regulador de pH a por 30 Un anticuerpo de ER ThermoFisher Fremont puede usarse a una dilución con incubación por 10 minutos después de una recuperación del antígeno en microondas por 8 minutos en citrato de sodio 10 mM Puede usarse el anticuerpo de PR listo para usarse siguiendo el protocolo de CC1 como se hizo Puede llevarse a cabo la tinción de HER2 con un anticuerpo SP3 a una dilución despues de la recuperación del antígeno en regulador de pH de Tris M con calentamiento a en una marmita al vacío por 30 Para la prueba de hibridación in situ fluorescente de los portaobjetos pueden ser hibridados con sondas para el LSI específico de y con el centrómero 17 mediante el uso del kit de sonda de ADN para PathVysion Abbott de acuerdo con las instrucciones del con modificaciones al pretratamiento e hibridación como se describió anteriormente Irving Parker et Amplification of a novel oncogene on 11 q in high grade ovarían surface epithelial Gynecol Los portaobjetos pueden ser contrateñidos entonces con el material teñido visualizado en un microscopio epifluorescente Axioplan y las señales analizadas con el sistema de adquisición de imágenes Metafer La expresión de los biomarcadores a partir de las pruebas de inmunohistoquímica puede ser calificada entonces por dos quienes son ajenos a las características clinicopatológicas y el y quienes usan criterios previamente establecidos y publicados para los niveles de expresión de los biomarcadores que se habían desarrollado en otros grupos con cáncer de Los tumores eran considerados como positivos para ER o si la inmunotinción se observaba en más de de los núcleos de los como se describió Los tumores eran considerados como positivos para si la inmunotinción era calificada como de acuerdo con los criterios de con una relación de amplificación para hibridación in situ fluorescente de o más siendo el valor límite que se usó para segregar los tumores equívocos de inmunohistoquímica como et fue calificado visualmente por dos patólogos para el porcentaje de núcleos de las células tumorales con inmunotinción positiva arriba del nivel de Otros métodos pueden usarse también para detectar los Estas téenicas incluyen Western Northern blots o análisis por Kits La presente descripción describe también kits útiles para clasificar los subtipos intrínsecos de cáncer de mama para proveer información de pronóstico para identificar el riesgo de Estos kits comprenden una serie de sondas de captura iniciadores específicos para los genes intrínsecos enlistados en el cuadro El kit puede comprender además un medio legible en En una modalidad de la presente las sondas de captura son inmovilizadas sobre una Por se entiende un soporte sólido o un substrato con sondas de peptidos o ácido nucleico unidas al soporte o Las disposiciones comprenden típicamente una pluralidad de diferentes sondas de captura que son acopladas a una superficie de un substrato en sitios conocidos Las disposiciones de la descripción comprenden un substrato que tiene una pluralidad de sondas de captura que pueden unirse específicamente a un producto de la expresión de los genes El número de sondas de captura en el substrato varía con el propósito para el cual se usa la Las disposiciones pueden ser disposiciones de baja densidad o disposiciones de alta y pueden contener 4 o 8 o 12 o 16 o 32 o más pero comprenderán como mínimo sondas de captura para los 46 genes intrínsecos enlistados en el cuadro Téenicas para la síntesis de estas disposiciones usando métodos de síntesis mecánicos se por en la patente de los Estados Unidos incorporada en su totalidad en la presente como referencia para todos los La disposición puede fabricarse sobre una superficie de virtualmente cualquier forma o incluso una multiplicidad de Las disposiciones pueden ser sondas sondas de unión a ácido sobre superficies fibras tales como fibra vidrio o cualquier otro substrato véase las patentes de los Estados Unidos y cada una de las cuales se incorpora en su totalidad en la presente como referencia para todos los Las disposiciones pueden ser empacadas de tal manera para permitir el diagnóstico u otra manipulación en el por las patentes de los Estados Unidos y incorporadas en la presente como En otra el kit comprende una serie de oligonucleótidos iniciadores suficientes para la detección cuantificación de cada uno de los genes intrínsecos enlistados en el cuadro Los oligonucleótidos iniciadores pueden proveerse en una forma liofilizada o o pueden proveerse como una serie de secuencias de En una los iniciadores se proveen en un formato de en donde cada serie de iniciadores ocupa una cavidad cavidades como en el caso de en la La microplaca puede comprender además iniciadores suficientes para la detección de uno o más genes de mantenimiento como se discutió El kit puede comprender además reactivos e instrucciones suficientes para la amplificación de los productos de expresión de los genes enlistados en el cuadro Para facilitar el acceso por para recuperación las firmas de expresión se registran típicamente en una base de Más la base de datos es una base de datos correlativa accesible mediante un dispositivo aunque pueden usarse otros por archivos indexados manualmente accesibles de perfiles de expresión como lecturas de salida de formación de imágenes análoga o hojas de Sin tener en cuenta si los patrones de expresión registrados inicialmente son análogos o digitales en los patrones de los perfiles de expresión de expresión y las firmas moleculares de expresión son almacenados digitalmente y accedidos por medio de una base de la base de datos es compilada y mantenida en una instalación estando disponible el acceso localmente Dispositivos v pruebas Generalidades El sistema de análisis nCounter NanoString provee mediciones multiplexadas directas de la expresión de los genes a traves de lecturas de salida digitales de la abundancia relativa de cientos de transcritos de El sistema de análisis nCounter usa pares de sondas específicas de genes que se mezclan juntas para formar un reactivo individual denominado un Los pares de sondas hibridan directamente con la muestra de ARNm en eliminando cualquier reacción enzimática que pudiera introducir propensión en los Después de la todos los pasos del procesamiento de las muestras son automatizados en la Prep Station de el exceso de la sonda indicadora y de captura es removido seguido de unión a los complejos de hacia sitios aleatorios sobre la superficie del cartucho nCounter por medio de un enlace de biotina Por los complejos de son alineados e inmovilizados en el cartucho La sonda indicadora lleva la señal la sonda de captura permite que el complejo sea inmovilizado para la colecta de Hasta 800 pares de cada uno específico para un gen pueden combinarse con una serie de controles internos para formar un Despues de que el procesamiento de la muestra ha los cartuchos se ponen en el analizador digital nCounter para la colecta de Cada molécula objetivo de interés es identificada por el de generado por seis manchas fluorescentes ordenadas presentes sobre la sonda Las sondas indicadoras sobre la superficie del cartucho se cuentan entonces y se tabulan por cada molécula objetivo Reactivos y componentes de la prueba La prueba de cáncer de mama medirá simultáneamente los niveles de expresión de NAN046 más ocho genes de mantenimiento en una reacción de hibridación individual usando un CodeSet de nCounter diseñado específicamente para esos Cada prueba incluye también controles de prueba positivos que comprenden una titulación lineal de los transcritos de ARN transcritos in vitro y sondas y una serie de sondas sin homología de secuencia con las secuencias de ARN de humano que se usan como controles Cada ciclo de prueba incluye una muestra de referencia que consiste de moleculas de ARN transcritas in vitro de los objetivos y los genes de mantenimiento para propósitos de El perfil de expresión de los genes normalizados de una muestra de tumor de mama se correlaciona con los perfiles prototípicos de expresión de los genes de los cuatro subtipos intrínsecos de cáncer de mama Luminal enriquecido con HER2 o tipo que se identificaron a partir de una serie de formación de tumores de El perfil de expresión de los en combinación con las variables clínicas se usa como parte de un algoritmo formado como un indicador de pronóstico de riesgo de recidiva distante de cáncer de La figura 12 esboza los procedimientos de prueba asociados con la prueba de cáncer de mama del sistema de análisis Extracción de tejido FFPE La prueba de cáncer de mama usará ARN extraído de tejido fijado en formalina e incluido en parafina que ha sido diagnosticado como carcinoma invasivo de la Un patólogo realiza primero una tinción con hematoxilina y eosina de una sección de tumor montada sobre un para identificar la región de carcinoma de mama invasivo viable que contiene un contenido de tumor arriba de un umbral El patólogo cerca la región en el portaobjetos teñida con hematoxilina y El patólogo monta entonces las secciones de tejido no teñidas sobre y marca el área de los portaobjetos que contiene al tumor Para tumores más grandes 100 mm2 de carcinoma invasivo viable sobre el portaobjetos teñido con hematoxilina y la prueba requiere sólo una sección de 10 Para tumores más pequeños 100 la prueba requiere 3 La región identificada de carcinoma de mama invasivo viable que contiene un contenido de tumor suficiente sobre los es antes de la extracción del Los procedimientos para el envío de los portaobjetos con tejido FFPE del sitio de colecta a un sitio de serán definidos como parte del Después de la extracción del ARN total y la remoción del ADN se mide la densidad óptica a longitudes de onda de 260 nm y 280 nm para determinar el rendimiento y la El procedimiento de prueba requiere una escala de entrada de 125 a 500 ng de ARN total para el paso de hibridación Los planes NanoString para validar esta escala de entrada de ARN son suficientes para realizar reproduciblemente la prueba en el sistema de análisis la calidad del ARN será medida usando una lectura de DO con una relación objetivo de no menos de con un límite superior de Los procedimientos para almacenar el ARN serán provistos para el usuario de modo que el procesamiento corriente abajo pueda llevarse a cabo en un punto de tiempo si se Requerimientos para el espectrofotómetro que mide el rendimiento y la pureza del ARN Los aislamientos del ARN de la muestra FFPE dan como resultado un volumen de muestra final de 30 Este volumen es demasiado bajo para la cuantificación de la abundancia del ácido nucleico usando las mediciones de absorbancia en un espectrofotómetro de tipo recipiente de por lo el protocolo de NanoString incluye un paso de cuantificación del ARN total usando un espectrofotómetro de bajo tal como el espectrofotómetro NanoString definirá las especificaciones de desempeño para el de modo que la escala de entrada del ARN recomendada para la prueba esté arriba del límite de detección del espectrofotómetro de bajo y es reproduciblemente Hibridación Para cada serie de hasta 10 muestras de el usuario pipeteará la cantidad especificada de ARN en tubos separados dentro de un tubo de destilación de 12 y añadirá el CodeSet y el regulador de pH de Una muestra de referencia es pipeteada en los dos tubos restantes con CodeSet y regulador de pH de El CodeSet consiste de sondas para cada gen que es elegido como sondas adicionales para los genes de normalización y controles positivos y A las sondas dentro del CodeSet que pertenecen a cada uno de estos genes dentro de los cuatro grupos genes de mantenimiento y controles positivos y se les asigna un código y son por lo tanto individualmente identificables dentro de cada La muestra de referencia consiste de ARN transcrito in vitro para los genes elegidos como objetivo y genes de Una vez que los reactivos de hibridación se añaden a los tubos el usuario transfiere el tubo de destilación en un bloque térmico con tapa calentada por un período especificado a una temperatura Requerimiento para el bloque termico con tapa calentada para el paso de hibridación La prueba nCounter incluye una hibridación la noche anterior bajo condiciones Debido a que la hibridación la noche anterior se lleva a cabo en un volumen pequeño a temperatura debe tenerse cuidado de evitar la Muchos termocielizadores de PCR comerciales están equipados con tapas calentadas que evitarán la evaporación de pequeños volúmenes de Debido a que la prueba no requiere control fino alguno del ascenso de cualquier bloque térmico con una tapa calentada programable y un bloque con dimensiones que se ajustan a los tubos funcionará con la prueba Los planes de NanoString proveen especificaciones para los bloques de calor que satisfacen los requerimientos de la Purificación y unión en la Prep Station Una vez que concluye la el usuario transferirá entonces el tubo de destilación que contiene a la serie de 10 pruebas y 2 muestras de referencia en la Prep Station de nCounter junto con los reactivos preempacados requeridos y desechables descritos en el cuadro Las Prep Plates contienen los reactivos necesarios para la purificación del exceso de sondas y la unión al cartucho la sección NIC más adelante para la descripción detallada del procedimiento de Las Prep Plates se centrifugan en una centrífuga de cubo oscilante antes de la colocación en la plataforma de la Prep Un procedimiento de purificación automatizado remueve entonces el exceso de la sonda indicadora y de captura a través de dos pasos de captura sucesivos de perlas magneticas dirigidos por la La Prep Station de nCounter transfiere entonces los complejos de purificado en un cartucho nCounter para captura a un Después de que concluye el el usuario remueve el cartucho de la Prep Station y lo sella con una película Formación de imágenes y análisis en el analizador digital El cartucho sellado es insertado entonces en el analizador digital el cual hace el conteo del número de sondas capturadas sobre el portaobjetos para cada que corresponde a la cantidad de objetivo en El software automatizado verifica entonces los umbrales para los genes de muestra de referencia y controles positivo y para calificar cada prueba y asegurar que el procedimiento fuese realizado Los genes de mantenimiento proveen una medida de la integridad del y los umbrales indican cuándo una muestra de ARN puesta a prueba es demasiado degradada para ser analizada por la prueba debido al manejo o el almacenamiento inadecuados de tejido o ARN fijación incorrecta del almacenamiento del bloque almacenamiento del manejo del ARN que introduce Los controles de prueba positivo y negativo indican una falla del procedimiento de prueba error en el establecimiento de la prueba tal como mezclado de la muestra con o procesamiento de la muestra tal como Las señales de cada muestra son normalizadas a continuación usando los genes de mantenimiento para controlar la calidad de la muestra de Las señales son entonces normalizadas a la muestra de referencia dentro de cada ciclo para controlar las variaciones de ciclo a Los datos normalizados resultantes son ingresados en el algoritmo de subtipificación intrínseca de cáncer de mama para determinar el subtipo intrínseco del la puntuación de riesgo de recidiva y la clasificación de Instrumentación El sistema de análisis nCounter comprende dos la Prep Station de nCounter usada para el procesamiento y el analizador digital usado para la colecta y el análisis de Prep Station de nCounter La Prep Station de nCounter es un robot automatizado para el manejo de fluidos que procesa las muestras para prepararlas para la colecta de datos en el analizador digital Antes del procesamiento en la Prep el ARN total extraído de las muestras de tejido FFPE en incluidas en es hibridado son las sondas indicadoras y sondas de captura de acuerdo con el protocolo nCounter descrito La hibridación con el ARN objetivo es dirigida por el exceso de sondas Para analizar con precisión estas moleculas son primero purificadas del exceso de sondas restantes en la reacción de La Prep Station aísla las moléculas de ARNm hibridadas del exceso de las sondas de captura e indicadora usando dos pasos de purificación secuenciales de perlas Estas purificaciones por afinidad usan perlas magnéticas personalizadas modificadas con oligonucleótidos que retienen sólo los complejos tripartitas de las moléculas de ARNm que son unidos a una sonda de captura y una sonda esta solución de complejos tripartitas se lava a través de una célula de flujo en el cartucho de muestras Una superficie de esta célula de flujo es revestida con un hidrogel de polietilenglicol que está densamente impregnado con estreptavidina covalentemente Conforme la solución pasa a través de la célula de los complejos tripartitas son unidos a la estreptavidina en el hidrogel a través de las moléculas de biotina que son incorporadas en cada sonda de El hidrogel de PEG actúa no sólo para proveer una superficie densa de estreptavidina sobre la cual los complejos tripartitas pueden ser unidos sino inhibe también la unión no específica de cualquier exceso restante de sondas Después de que los complejos son unidos a la superficie de la célula de un campo eléctrico se aplica a lo largo de la longitud de cada célula de flujo del cartucho de muestras para facilitar la identificación óptica y el orden de las manchas fluorescentes que forman cada sonda Debido a que las sondas indicadoras son ácidos nucleicos el voltaje aplicado imparte una fuerza sobre ellas que uniformemente las estira y las orienta a lo largo del campo Mientras que el voltaje se la Prep Station añade un reactivo de inmovilización que asegura los indicadores en la configuración alargada despues de que se remueve el Una vez que los indicadores son el cartucho puede ser transferido al analizador digital nCounter para la colecta de Todos los componentes consumibles y reactivos requeridos para el procesamiento de muestras en la Prep Station se proveen en el kit maestro Estos reactivos están listos para ser cargados sobre la plataforma de la Prep Station de nCounter que puede procesar hasta 10 muestras y 2 muestras de referencia por ciclo en aproximadamente Analizador digital nCounter El analizador digital nCounter colecta los datos tomando imágenes de los indicadores fluorescentes inmovilizados en el cartucho de muestras con una cámara CCD a través de una lente objetivo de Debido a que las sondas indicadoras fluorescentes son códigos de barras de moléculas individuales con características más pequeñas que la longitud de onda de la luz el analizador digital usa formación de imágenes de alto aumento limitada por la difracción para resolver la secuencia de las manchas en los códigos de barras El analizador digital captura cientos de campos de visión consecutivos que pueden contener cada uno cientos o miles de sondas indicadoras Cada FOV es una combinación de cuatro imágenes monocromáticas capturadas a diferentes longitudes de La superposición resultante puede considerarse como una imagen de cuatro colores en amarillo y Cada FOV de 4 colores es procesado en tiempo real para proveer un por cada código de barras fluorescente en la Debido a que cada código de barras identifica específicamente una molecula de ARNm los datos resultantes del analizador digital son una medida precisa de la abundancia relativa de cada ARNm de interés en una muestra Software La Prep Station y el analizador digital son unidades autónomas que no requieren conexión a una PC pero deben ser conectados en red a alguna otra usando una red de área local El software del sistema nCounter maneja de manera segura las operaciones a través de los permisos y cuentas del Ambos instrumentos usan procesos y asistentes de instalación en una interfaz del usuario de pantalla táctil embebida que guía al usuario a través de los pasos de procesamiento de las muestras y colecta de datos de la El usuario es llevado a través del procedimiento por instrucciones paso a paso en la Prep Station y el analizador La pantalla táctil del instrumento usa un método sensible a la presión para el control de las y permite que el usuario interactúe con el sistema tocando una selección en la Debido a que la pantalla táctil provee una interfaz humana limitada para el ingreso de el sistema aloja también una aplicación basada en la red para el manejo de las cuentas del la definición de lotes de muestras y el seguimiento del estado de las Cuando las muestras son el software del sistema sigue la cuenta del usuario y lotes de reactivos para cada muestra en un repositorio de datos Despues de que los datos de expresión para una muestra son adquiridos por el analizador son primero analizados para asegurar que toda la métrica del control de calidad especificada sea Los datos calificados son entonces procesados a través de un algoritmo de PAM50 bloqueado que genera un reporte que contiene la puntuación de los subtipos intrínsecos y el riesgo de recidiva El reporte de muestras es transferido al repositorio en donde puede ser accedido de manera segura para descarga por un usuario con los permisos Algoritmo de subtipificación intrínseca de cáncer de mama El sistema nCounter se usará para identificar el subtipo intrínseco de un carcinoma invasivo extirpado de la mama usando un algoritmo clasificador de 50 genes nombrado originalmente PAM50 et Supervised Risk Predictor of Breast Cáncer Based on Intrinsic Journal of Clinical El perfil de expresión de los genes asignará un cáncer de mama a una de cuatro clases moleculares o subtipos tipo Luminal Luminal B y enriquecido con Una breve descripción de cada subtipo se provee a Subtipos Los subtipos más comunes de cáncer de mama son los subtipos luminales en la población positiva para el receptor de Luminal A y Luminal Estudios previos sugieren que luminal A comprende aproximadamente a y Luminal B aproximadamente de los cánceres de mama y más de de los cánceres de mama positivos para el receptor de El patrón de expresión de los genes de estos subtipos asemeja el componente epitelial luminal de la mama TO et A comparison of PAM50 intrinsic subtyping with immunohistochemistry and clinical prognostic factors in estrogen receptor positive breast Clinical Cáncer 5232 Estos tumores se caracterizan por la alta expresión del receptor de estrógeno receptor de progesterona y genes asociados con la activación del tales como GATA3 y cielina así como la expresión de las citoqueratinas luminales 8 y Luminal Los cánceres de mama Luminal A exhiben baja expresión de genes asociados con la activación del ciclo celular y el grupo resultando en un mejor pronóstico que luminal El subgrupo Luminal A tiene el pronóstico más favorable de todos los y es enriquecido para tumores sensibles a la terapia Luminal Los cánceres de mama Luminal B expresan ER y genes asociados con pero a un menor grado que Los genes asociados con la activación del ciclo celular son altamente y este tipo de tumor puede ser o El pronóstico es desfavorable pesar de la expresión del y la sensibilidad a la terapia endocrina es generalmente disminuida respecto a Tipo El subtipo tipo basal es generalmente negativo para es casi siempre clínicamente negativo para y expresa una serie de biomarcadores que incluyen a las citoqueratinas epiteliales básales y al receptor del factor de crecimiento epidermico Los genes asociados con la activación del ciclo celular son altamente Enriquecido con El subtipo enriquecido con HER2 es generalmente negativo para y es positivo para HER2 en la mayoría de los casos con alta expresión del grupo incluyendo ERBB2 y Los genes asociados con la activación del ciclo celular son altamente y estos tumores tienen un mal Los límites para el algoritmo de subtipificación intrínseca son predefinidos a partir de las series de formación que definieron lo centroides de subtipos intrínsecos el perfil prototípico de expresión de genes para cada coeficientes para puntuación de riesgo de recidiva y clasificación de riesgo Los centroides de los subtipos intrínsecos Luminal enriquecido con tipo fueron formados usando una serie clínicamente representativa de especímenes de tumores de mama FFPE archivados colectados de sitios El análisis de la agrupación jerárquica de los datos de la expresión de los genes de las muestras de tumores de mama FFPE se combinó con la biología de los tumores de mama expresión de genes de subtipos intrínsecos previamente que definen el perfil de expresión prototípico de cada Un algoritmo computacional correlaciona el perfil de expresión normalizado de 50 genes de una muestra desconocida de tumor de cáncer de mama para cada una de las firmas de expresión prototípicas de los cuatro subtipos intrínsecos de cáncer de A la muestra de tumor se le asigna el subtipo con la correlación positiva más grande para la Se usaron 304 muestras de tumores únicas con características clínicas bien definidas y datos de resultados clínicos para establecer la puntuación de La puntuación de ROR se calcula usando los coeficientes de un modelo de Cox que incluye la correlación de Pearson para cada subtipo una puntuación de proliferación y tamaño del tumor como se muestra en la siguiente ROR aRLumA dRbasal bR fT Para clasificar las muestras de tumores en grupos de riesgo específicos riesgo basados en su puntuación de ROR se establecieron límites con base en la probabilidad de supervivencia libre de recidiva en una población de pacientes que consiste de pacientes positivas para el receptor de hormonas tratadas sólo con terapia Uso anticipado de la prueba de cáncer de mama NanoString en la práctica clínica Los oncólogos usan actualmente una serie de pruebas para desarrollar un protocolo de tratamiento para pacientes con cáncer de Incluidas en estas son las pruebas de tales como IHC y HER2 y la prueba Agendia y la prueba Genomic Health Oncotype Estas pruebas le ofrecen al oncólogo información adicional respecto al pronóstico del paciente y regímenes de tratamiento Sin estas pruebas tienen La prueba de PgR y Her2 es hecha localmente por patólogos y laboratorios de pero los retos con la estandarización extendida de la prueba de IHC y FISH están bien documentados J et Assessment of Tissue Estrogen and Progesterone Receptor A Survey of Current and Quantitation The Breast A et American Society of Clinical of American Pathologists Guideline Recommendations for Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 Testing in Breast Archives of Pathology and Laboratory La prueba MammaPrint es aprobada por la FDA para uso sólo con muestras de tejido congeladas o preservadas en sin la mayoría de las muestras de tumores colectadas en los Estados Unidos son FFPE más que congeladas en Esta prueba es tambien no distribuida y está sólo disponible a través de los laboratorios de referencia La prueba Oncotype Dx puede usarse para predecir el riesgo de recidiva para pacientes positivos para el receptor de negativos para nodulos linfáticos de etapa que reciben terapia adyuvante con así como la respuesta a la quimioterapia con Sin esta prueba es sólo ofrecida como una prueba desarrollada en el laboratorio a través del laboratorio CLIA de Genomic y no es aprobada por la FDA para uso de o aprobada por la FDA para predecir la respuesta a la NanoString un modelo que habría usado la prueba de cáncer de mama en conjunto con otras fuentes de datos clínicos actualmente disponibles para oncólogos para el pronóstico de cáncer de mama en segmentos de pacientes La prueba de cáncer de mama sería una fuente adicional de información de pronóstico que añade valor significativo a los parámetros clínicos establecidos tamaño del estado usados por los oncólogos en el manejo de un paciente con cáncer de pruebas kits Los pruebas y kits para la presente invención incluyen una serie de métricas de control de calidad que se aplican automáticamente a cada muestra durante el Estas métricas evalúan el desempeño de la prueba para determinar si los resultados están dentro de los valores Tras el análisis exitoso de estas métricas de control de la prueba da los siguientes Subtipos intrínsecos Se ha mostrado que el subtipo intrínseco de un tumor de cáncer de mama se relacionará con el pronóstico en cáncer de mama de etapa En los pacientes con un tumor Luminal A tienen significativamente mejores resultados que los pacientes con los tumores Luminal enriquecido con HER2 o tipo El subtipo intrínseco se identifica comparando el perfil de expresión de los de 50 genes en una muestra desconocida con los perfiles de expresión esperados para los cuatro subtipos El subtipo con el perfil más se asigna a la muestra Los subtipos más comunes de cáncer de mama son los subtipos Luminal A y Luminal B Estudios previos sugieren que Luminal A comprende aproximadamente a y Luminal B aproximadamente de los cánceres de Sin más de de los pacientes positivos para el receptor de hormonas tienen tumores El patrón de la expresión de los genes de estos subtipos asemeja el componente epitelial luminal del tejido de Estos tumores se caracterizan por la alta expresión del receptor de estrógeno receptor de progesterona y genes asociados con la activación del tales como GATA3 y cielina así como la expresión de las citoqueratinas luminales 8 y Los cánceres de mama Luminal A exhiben menor expresión de los genes asociados con la activación del ciclo celular cuando se comparan con los cánceres de mama Luminal B dando como resultado un mejor Estudios previos sugieren que el subtipo enriquecido con HER2 comprende aproximadamente de los cánceres de Sin los tumores enriquecidos con HER2 son generalmente negativos para el de modo que se encontró que sólo de la población de pacientes positivos para el ER puestos a prueba tienen cáncer de mama enriquecido con Sin tener en cuenta el estado del los tumores enriquecidos con HER2 son positivos para HER2 en la mayoría de los casos con alta expresión del grupo incluyendo ERBB2 y Los genes asociados con la activación del ciclo celular son también altamente Los datos publicados sugieren que el subtipo tipo basal comprende aproximadamente de los cánceres de Sin los tumores tipo basal son generalmente negativos para el de modo que sólo 1 de los pacientes positivos para el receptor de hormonas tienen cáncer de mama tipo El subtipo tipo basal es casi siempre clínicamente negativo para y expresa una serie de biomarcadores que incluyen las citoqueratinas epiteliales básales y el receptor del factor de crecimiento epidérmico Los genes asociados con la activación del ciclo celular son altamente Puntuación de ROR La puntuación de ROR es un valor entero sobre una escala de 0 a 100 que está relacionado con la probabilidad de un paciente individual de recidiva distante dentro de 10 años para la población de uso deseada La puntuación de ROR se calcula comparando los perfiles de expresión de 46 genes en una muestra desconocida con los perfiles esperados para los cuatro subtipos como se describió para calcular cuatro diferentes valores de Estos valores de correlación se combinan entonces con una puntuación de proliferación y el tamaño del tumor para calcular la puntuación de Probabilidad de recidiva distante de 10 años Las puntuaciones de ROR para un grupo de mujeres menopáusicas con cáncer de mama de etapa temprana positivo para el receptor de se compararon con la supervivencia libre de recidiva distante despues de cirugía y tratamiento con 5 años de terapia endocrina adyuvante seguida de 5 años de Este estudio dio como resultado un modelo que relaciona la puntuación de ROR con la probabilidad de recidiva distante en esta población de pacientes puesta a prueba incluyendo un intervalo de confianza de Clasificación del riesgo Se provee tambien la clasificación del riesgo que permite la interpretación de la puntuación de ROR usando límites relacionados con el resultado clínico en las poblaciones de pacientes puestos a Clasificación del riesgo mediante la escala de ROR v el estado nodal Control de calidad Cada lote de los componentes de la prueba se pone a prueba usando especificaciones Todos los ítems a nivel de kit son seguidos por y los componentes críticos contenidos dentro de cada kit se ponen a prueba y son liberados como un lote El kit de prueba incluye una serie de controles internos que se usan para evaluar la calidad de cada serie de ciclos como un y cada muestra Estos controles se enlistan a Serie de control de Muestra de referencia de ARN transcrito in vitro Una muestra de referencia de ARN sintetico se incluye como un control dentro del kit de La muestra de referencia comprende objetivos de ARN transcrito in vitro de los 50 genes del algoritmo y los 8 genes de La muestra de referencia se procesa por duplicado en cada ciclo de prueba junto con una serie de hasta 10 muestras de ARN desconocidas de tumor de mama en un tubo de destilación de 12 La señal de la muestra de referencia se analiza contra los umbrales predefinidos para calificar el La señal de cada uno de los 50 genes del algoritmo de la muestra de ARN de tumor de mama es normalizada a los genes correspondientes de la muestra de Serie de control Objetivos de ARN transcrito in vitro sondas de captura e indicadora correspondientes Objetivos de ARN sintéticos se usan como controles positivos para la Las secuencias objetivo PC se derivan de la colección de secuencias de ADN del consorcio de control de ARN externo Los objetivos de ARN se transcriben in vitro a partir de plásmidos de Seis objetivos de ARN se incluyen dentro del kit de prueba en una serie de titulación de 4 veces final de 128 fM en la reacción de junto con las sondas indicadora y de captura Los PCs se añaden a cada muestra de ARN de tumor de y la muestra de ARN de referencia se pone a prueba con la prueba Una muestra será descalificada del análisis adicional si las intensidades de la señal de los PCs no satisfacen los umbrales Serie de control Sondas exóqenas sin objetivos Las secuencias objetivo de control negativo se derivan de la colección de secuencias de ADN Las sondas diseñadas para detectar estas secuencias objetivo se incluyen como parte del kit de prueba sin la secuencia objetivo Los controles negativos se añaden a cada muestra de ARN de tumor de y la muestra de referencia puesta a prueba con la prueba Prosigna como una medida de control de La muestra será descalificada del análisis adicional si las intensidades de la señal de los NCs no satisfacen los umbrales Serie de control de integridad del Genes de mantenimiento Sondas indicadora y de captura diseñadas para detectar 8 genes de mantenimiento y 50 genes del se incluyen como parte del Los niveles de expresión de los 8 genes de mantenimiento se analizan para determinar la calidad del ARN extraído de la muestra de tejido y se ingresan en la La muestra será descalificada del análisis adicional si el nivel de expresión de los genes de mantenimiento está abajo de los umbrales Los genes de mantenimiento se usan también para normalizar cualquier diferencia en la cantidad de ARN intacto en una muestra antes de la normalización de la muestra de Definiciones Para los propósitos de la presente el de por aquellas condiciones clasificadas mediante biopsia o histología como patología La delineación clínica de los diagnósticos de cáncer de mama es bien conocida en las téenicas El experto en la técnica apreciará que el cáncer de mama se refiere a cualquier malignidad del tejido de la mama por carcinomas y Modalidades particulares de cáncer de mama incluyen carcinoma ductal in situ carcinoma lobular in situ o carcinoma El cáncer de mama se refiere también a carcinoma ductal infiltrante o carcinoma lobular infiltrante En la mayoría de las modalidades de la el sujeto de interés es un paciente humano que se sospecha o es diagnosticado realmente cáncer de Los artículos y se usan en la presente para referirse a uno o más de uno a por lo menos del objeto gramatical del A manera de significa uno o más A lo largo de la se entenderá que el término o variaciones tales como o implica la inclusión de un entero o paso o grupo de enteros o pero no la exclusión de algún otro entero o o grupo de enteros o EJEMPLOS EJEMPLO 1 Prueba de subtipificación de NANQ46 La figura 5 esboza los procedimientos de prueba asociados con la prueba de subtipificación intrínseca de cáncer de Despues del aislamiento del la prueba medirá simultáneamente los niveles de expresión de 46 genes objetivo más 8 genes de mantenimiento en una sola reacción de hibridación usando un CodeSet nCounter diseñado específicamente para esos Por los genes de mantenimiento descritos en la patente de los Estados Unidos publicación la cual se incorpora en su totalidad en la presente como pueden usarse para la Ejemplos de genes de mantenimiento incluyen PUM1 RPLP0 y Los genes de mantenimiento se usan para normalizar la expresión de la muestra del Cada ciclo de prueba incluye también una muestra de referencia que consiste de moléculas de ARN transcritas in vitro de los 58 objetivos para propósitos de de tejido FFPE y extracción de La prueba de subtipificación intrínseca de cáncer de mama usará ARN extraído de tejido fijado en formalina e incluido en parafina que ha sido diagnosticado como carcinoma invasivo de la Un patólogo revisa un portaobjetos teñido con hematoxilina y eosina para identificar el área de tejido que contiene un contenido suficiente de tejido tumoral para la Las secciones de tejido no teñidas montadas en portaobjetos se procesan disectando el área identificada del tumor en cada para remover cualquier tejido normal El ARN se aísla entonces del tejido y el ADN se remueve de la Establecimiento de la prueba e inicio de la Para cada lote de hasta 10 muestras de ARN aisladas de un tumor de el usuario establecerá un ciclo usando el software del sistema Analysis x5 el cual realiza el seguimiento del procesamiento de las los lotes de reactivos y los resultados para cada Para iniciar la el usuario pipeteará la cantidad especificada de ARN en tubos separados dentro de un tubo de destilación de 12 y añadirá el CodeSet y el regulador de pH de Una muestra de referencia se pipetea en los dos tubos restantes con CodeSet y regulador de pH de El CodeSet consiste de sondas para cada gen que es elegido como sondas adicionales para genes de normalización y controles positivos y negativos que son descartados en la La muestra de referencia consiste de ARN transcrito in vitro para los genes elegidos como objetivo y los genes de Una vez que se añaden los reactivos de hibridación a los tubos el usuario transfiere el tubo de destilación en un bloque térmico con tapa calentada por un período especificado a una temperatura Purificación y unión en la Prep Una vez que concluye la el usuario transferirá el tubo de destilación que contiene a la serie de 10 pruebas y 2 muestras de referencia en la Prep Station de nCounter junto con los reactivos preempacados requeridos y Un procedimiento de purificación automatizado remueve entonces el exceso de la sonda indicadora y de captura a través de dos pasos de captura sucesivos de perlas magnéticas dirigidos por la La Prep Station de nCounter transfiere entonces los complejos de purificado en un cartucho nCounter para captura a un Después de que concluye el el usuario remueve el cartucho de la Prep Station y lo sella con una película Formación de imágenes y análisis en el analizador El cartucho es entonces sellado e insertado en el analizador digital el cual hace el conteo del número de sondas capturadas sobre el portaobjetos para cada que corresponde a la cantidad de objetivo en El software automatizado verifica entonces los umbrales para los genes de muestra de referencia y controles positivo y para calificar cada prueba y asegurar que el procedimiento fuese realizado Las señales de cada muestra son normalizadas a continuación usando los genes de mantenimiento para controlar la calidad de la muestra de Las señales son entonces normalizadas a la muestra de referencia dentro de cada ciclo para controlar las variaciones de ciclo a Los datos normalizados resultantes son ingresados en el algoritmo de subtipificación intrínseca de cáncer de mama para determinar el subtipo intrínseco del tumor y la puntuación de riesgo de EJEMPLO 2 Validación clínica de la puntuación de riesgo de recidiva de NANQ46 para predecir el riesgo residual de recidiva distante después de la terapia endocrina en mujeres con cáncer de mama temprano positivo para Un estudio ABSCSG El propósito del estudio es evaluar el desempeño de la puntuación de ROR para predecir la recidiva distal para mujeres menopáusicas con cáncer de mama temprano positivo para el receptor de hormonas tratadas con tamoxifeno o tamoxifeno seguido de cuando la prueba NAN046 se lleva a cabo en un laboratorio de patología de rutina de un puntuación de ROR añade información de pronóstico más allá de la puntuación de tratamiento clínico en todos los pacientes CTS tamaño del grupos de riesgo basados en el ROR en la información de pronóstico están más allá de la puntuación de tratamiento clínico en todos los Visión general del pacientes fueron enrolados en una Los pacientes eran mujeres con EBC y positivas para nodulos grado uno o sin tratamiento pacientes para seguimiento a largo o son El seguimiento medio fue de 11 Se colectaron bloques de 25 tuvieron cáncer insuficiente en el bloque en la 73 tuvieron ARN insuficiente 44 fallaron los aspectos del control de calidad para el dispositivo y pacientes pasaron el análisis Tres secciones de 10 mieras no teñidas y un portaobjetos teñido con hematoxilina y eosina por cada paciente se enviaron a un laboratorio de patología académica independiente en en donde se llevaron a cabo la revisión del la microdisección manual y la extracción de El análisis NAN046 se llevó a cabo entonces en 250 ng del ARN extraído usando el sistema de análisis NanoString se calcularon la puntuación de ROR y los subtipos La puntuación de ROR añade información de pronóstico estadísticamente significativa más allá de la CTS en todos los pacientes de relación de probabilidad p Los grupos de riesgo basados en el ROR añaden información de pronóstico estadísticamente significativa más allá de la CTS en todos los pacientes de relación de probabilidad p La diferenciación entre Luminal A y Luminal B añade información de pronóstico estadísticamente significativa más allá de la CTS en todos los pacientes B contra intervalo de confianza de p Los resultados en los subgrupos negativos para nodulos linfáticos y positivos para nodulos linfáticos son similares a los resultados para todos los pacientes que se reportan en el Los resultados muestran que la puntuación de ROR y los grupos de riesgo basados en el ROR añaden información de pronóstico estadísticamente significativa más allá de la puntuación de tratamiento Los resultados demuestran que una prueba de expresión de genes múltiples compleja puede llevarse a cabo en el laboratorio de patología de un hospital y satisfacer las mismas metricas de calidad que un laboratorio de referencia Los resultados de los estudios TransATAC y ABCSG8 proveen en conjunto evidencia de primer nivel para la validez clínica de la prueba NAN046 para predecir el riesgo de recidiva distante en mujeres con EBC tratadas con terapia endocrina Los resultados muestran también que los subtipos Luminal A tienen mejores resultados que los subtipos Luminal B en mujeres con EBC tratadas con terapia endocrina insufficientOCRQuality

Claims (15)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1 Un metodo para predecir el resultado en un sujeto que tiene cáncer de mama, que comprende; determinar la expresión de por lo menos cuarenta de los genes en la lista de genes intrínsecos, la cual incluye ACTR3B, ANLN, BAG1, BCL2, BLVRA, CCNE1, CDC20, CDC6, CDCA1, CDH3, CENPF, CEP55, CXXC5, EGFR, ERBB2, ESR1, EX01, FGFR4, FOXA1, FOXC1, GPR160, HSPC150 (UBE2T), KIF2C, KNTC2, KRT14, KRT17, KRT5, MAPT, MDM2, MELK, MIA, MKI67, MLPH, MMP11, MYC, NAT1, ORC6L, PGR, PHGDH, PTTG1, RRM2, SFRP1, SLC39A6, TMEM45B, TYMS, y UBE2C en una muestra de tumor de un sujeto; determinar el subtipo intrínseco de la muestra de tumor, en donde el subtipo intrínseco se selecciona del grupo que consiste de por lo menos el tipo basal, Luminal A, Luminal B y enriquecido con HER2; determinar una puntuación de proliferación basada en la expresión de un subgrupo de genes de proliferación en la lista de genes intrínsecos; calcular una puntuación de riesgo de recidiva usando una suma ponderada de dicho subtipo intrínseco, puntuación de proliferación y opcionalmente una o más variables clinicopatológicas seleccionadas de tamaño del tumor, estado nodal y grado histológico; y determinar si el sujeto tiene un bajo o alto riesgo de recidiva basado en la puntuación de riesgo de recidiva.

2.- El metodo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el subgrupo de genes de proliferación en la lista de genes intrínsecos comprende cada uno ANLN, CCNE1 , CDC20, CDC6, CDCA1 , CENPF, CEP55, EX01 , KIF2C, KNTC2, MELK, MKI67, ORC6L, PTTG1 , RRM2, TYMS, UBE2C y UBE2T.

3.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende adicionalmente determinar por lo menos uno de los siguientes: grado del tumor, ploidía del tumor, estado nodal, expresión del receptor de estrógeno, expresión del receptor de progesterona y expresión de HER2/ERBB2.

4 - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende adicionalmente determinar por lo menos cada uno de los siguientes: grado del tumor, ploidía del tumor, estado nodal, expresión del receptor de estrógeno, expresión del receptor de progesterona y expresión de HER2/ERBB2.

5.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la puntuación de riesgo de recidiva se calcula usando la siguiente ecuación: ROR-PT = -0.0067*Basal + 0.4317*Her2 + -0.3172*LumA + 0.4894*LumB + 0.1981*puntuación de proliferación + 0.1133*tamaño del tumor.

6.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el resultado es supervivencia específica del cáncer de mama, supervivencia libre de eventos, o respuesta a la terapia.

7.- El metodo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque la expresión de los genes en la lista de genes intrínsecos se determina usando el sistema codificador nano-indicador (sistema de análisis nCounter®).

8.- Un kit que comprende una pluralidad de sondas para determinar la expresión de por lo menos cuarenta de los genes en la lista de genes intrínsecos en una muestra de tumor para usarse en un método para predecir el resultado en un sujeto que tiene cáncer de mama, en donde la lista de genes intrínsecos incluye ACTR3B, ANLN, BAG1, BCL2, BLVRA, CCNE1, CDC20, CDC6, CDCA1, CDH3, CENPF, CEP55, CXXC5, EGFR, ERBB2, ESR1, EX01, FGFR4, FOXA1, FOXC1, GPR160, HSPC150 (UBE2T), KIF2C, KNTC2, KRT14, KRT17, KRT5, MAPT, MDM2, MELK, MIA, MKI67, MLPH, MMP11, MYC, NAT1 , ORC6L, PGR, PHGDH, PTTG1, RRM2, SFRP1, SLC39A6, TMEM45B, TYMS, y UBE2C.

9.- El kit de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque el kit comprende una pluralidad de sondas seleccionadas de SEQ ID Nos: 140 a 185.

10.- El kit de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque el kit comprende cada una de las sondas de SEQ ID Nos: 140 a 185.

11.- El kit de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque los al menos cuarenta de los genes en la lista de genes intrínsecos comprende ANLN, CCNE1, CDC20, CDC6, CDCA1, CENPF, CEP55, EX01, KIF2C, KNTC2, MELK, MKI67, 0RC6L, PTTG1, RRM2, TYMS, UBE2C y UBE2T.

12.- El kit de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque cada sonda en la pluralidad de sondas comprende una secuencia específica del objetivo capaz de hibridar con no más de un gen intrínseco en la lista de genes intrínsecos y opcionalmente comprende por lo menos dos regiones de unión al marcador, dichas regiones de unión al marcador comprendiendo uno o más monómeros de marcador que emiten luz.

13.- El kit de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque la pluralidad de sondas comprende un par de sondas que detectan los genes en la lista de genes intrínsecos, en donde cada sonda en el par de sondas comprende una secuencia específica del objetivo capaz de hibridar con no más de un gen en la lista de genes intrínsecos, y en donde las secuencias específicas del objetivo se unen a diferentes regiones del mismo gen intrínseco.

14.- El kit de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque una sonda del par de sondas comprende además por lo menos dos regiones de unión al marcador, dichas regiones de unión al marcador comprendiendo uno o más monómeros de marcador que emiten luz.

15.- El kit de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque comprende adicionalmente uno o más reactivos para determinar una o más variables clinicopatológicas de la muestra de tumor, tales como tamaño del tumor, grado del tumor, ploidía del tumor, estado nodal, expresión del receptor de estrógeno, expresión del receptor de progesterona y expresión de HER2/ERBB2.