CN111088352B - 一种多基因肝癌预后分级体系的建立方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种多基因肝癌预后分级体系的建立方法及应用，可用于预测肝癌患者手术后生存期与复发概率，与患者的年龄、肿瘤大小无关。样本来源于浙江大学医学院某附属医院2012‑2018年共378例临床肝癌手术患者，样本经过严格质控后通过多基因定量即时聚合酶链锁反应(Quantitative real time polymerase chain reaction，qRT‑PCR)，进一步分析各基因与生存期相关性，最终筛选出与临床肝癌手术患者预后相关的高危基因，构建预后分级体系。本发明专利技术有益效果：本发明构建了一种可预测临床肝癌患者术后生存期与复发概率的预后分级体系，而与患者年龄、肿瘤大小无关。可用于肝癌手术患者术后生存期评估，辅助制定患者术后治疗方案。

Description

一种多基因肝癌预后分级体系的建立方法及应用
技术领域
本发明涉及临床肝癌手术患者预后分级体系领域，主要是一种多基因肝癌预后分级体系的建立方法及应用。
背景技术
我国肝癌发患者数占全球的一半以上，肝癌恶性程度高，预后差，目前肝癌5年生存率仅16.8％[1,2]。手术切除仍然是治疗肝癌的主要手段[3]。不同肝癌患者中肿瘤存在明显异质性，因此手术切除是否可以让患者从中获益仍是一个未知数，目前发现了的一系列可用于预测个体复发和预后危险度的分级体系大多与肝癌临床特征如肝功能分级，AFP，肿瘤大小，部位相关，但由于患者个体信息复杂，且随访数据存在人为误差，大大降低了预测分级体系的可靠性。因此目前迫切需要一种简易、容易获取的客观分级体系对手术切除肝癌患者进行术后风险评估。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种多基因肝癌预后分级体系的建立方法及应用，可用于预测肝癌患者手术后生存期是否得益，与患者的年龄、肿瘤大小无关。
本发明的目的是通过如下技术方案来完成的。一种多基因肝癌预后分级体系的建立方法，样本经过严格质控后通过多基因定量即时聚合酶链锁反应，进一步分析各基因与生存期相关性，最终筛选出与临床肝癌手术患者预后相关的高危基因，基因组合包含MKI67，AR，PLG，DNASE1L3，PTTG1，PPP1R1A，TR这7个基因，构建预后分级体系；数据经过统计学方法校验，预后分级体系经过临床样本验证，具有良好的临床预测能力。
更进一步的，检测数据来源于一个肝癌-癌旁组织配对cDNA芯片，具备经过质控的完整临床资料及随访信息，cDNA终浓度均为1000ng/ul。
更进一步的，具体构建方法如下：根据7个基因生存曲线风险比值，对样本队列通过R语言进行COX回归分析得到各个患者单基因HR值，最后加权计算得到每个患者总的HR得分；根据HR得分对临床肝癌患者分组。
本发明同时公开了一种由MKI67，AR，PLG，DNASE1L3，PTTG1，PPP1R1A，TTR这7个基因构成的基于HR分级模式的分级体系在肝癌患者中的应用。
多基因表达检测是通过构建组织cDNA芯片，在RNA表达层面对多基因进行半定量检测。基于多基因表达检测形成的多基因联合风险预后分级体系在乳腺癌中具有重要的临床应用。为了对大样本量组织进行单个或多个基因的定量检测，我们首先建立了一个包含186对癌-癌旁组织来源cDNA的分子库，并设计为384孔板cDNA阵列。我们借助该cDNA芯片进行了多个基因的表达检测，并构建了一种与患者的年龄、肿瘤大小无关的可用于预测肝癌患者术后生存期的预后分级体系。可用于肝癌手术患者术后生存期评估，辅助制定术后治疗方案。
本发明的有益效果为：本发明构建了一种可预测临床肝癌患者术后生存期与复发概率的预后分级体系，而与患者年龄、肿瘤大小无关。可用于肝癌手术患者术后生存期评估，辅助制定患者术后治疗方案。
附图说明
图1为本发明经质控的cDNA芯片进行qRT-PCR反应后的熔解曲线及扩增曲线示意图1。
图2为本发明经质控的cDNA芯片进行qRT-PCR反应后的熔解曲线及扩增曲线示意图2。
图3为本发明筛选用于预测分级体系的基因都与生存期有明显相关性示意图。
图4为HR得分不同，患者预后有显著差异性示意图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明做详细的介绍：
本发明公开了一种多基因肝癌预后分级体系的建立方法，取浙江大学医学院某附属医院2012-2018年期间的378对肝癌-癌旁组织标本进行如下处理，分级体系体系构建方法为：
(1)挑选出在肝癌中具有明显表达差异的基因及内参基因，经过多环节质量控制后，最后筛选得到其中186对样本利用384孔板制成cDNA芯片。
增殖相关基因 激素相关基因 侵袭相关基因 其他基因 内参基因
MKI67 PLG MMP7 UBE2S GAPDH
IGF1 PIGU ACTB
AR DTYMK
CYB5A
PPP1R1A
ADAR2B
TTR
DNASE1L3
CDC20
PTTG1
注：MKI67(marker of proliferation Ki-67),MMP7(matrix metallopeptidase7)，IGF1(insulin like growth factor 1),AR(androgen receptor),PLG(plasminogen),DNASE1L3(deoxyribonuclease 1like3),PTTG1(PTTG1 regulator of sister chromatidseparation,securin),CDC20(cell division cycle20),UBE2S(ubiquitin conjugatingenzyme E2 S),PIGU(phosphatidylinositol glycan anchor biosynthesis class U),DTYMK(deoxythymidylate kinase),CYB5A(cytochrome b5 type A),PPP1R1A(proteinphosphatase 1regulatory inhibitor subunit 1A),ADAR2B(adenosine deaminase RNAspecific2b),TTR(transthyretin),GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase),ACTB(actin beta)。
(2)对(1)中基因进行qRT-PCR反应，通过qRT-PCR反应特异性扩增17个由TCGA数据库筛选得到的候选基因；经质控的cDNA芯片进行qRT-PCR反应后的熔解曲线及扩增曲线都表现良好，如图1所示。
(3)各个基因根据内参基因标准化后得到表达水平，将患者分为高低两组并进行生存曲线差异分析，最终筛选出具有统计学差异的7个基因，包括MKI67，AR，PLG，DNASE1L3，PTTG1，PPP1R1A，TTR。
(4)根据各个基因生存曲线风险比(Hazard Ratio，HR)值，对样本队列通过R语言进行COX回归分析得到各个患者单基因HR值，最后加权计算得到每个患者总的HR得分(范围为1～13)。
(5)根据HR得分对临床肝癌患者分组：
分组 HR得分 人数 所占百分比
Low-risk <5 15 12％
Intermediate-risk 5～9 78 60％
High-risk >9 36 28％
(6)三组患者生存曲线分析具有显著统计学差异P＝0.0016，三组患者的3年肝癌复发率分别为27％、37％、38％，通过生存曲线验证预后分级体系的科学性和可靠性。
本专利适用于由MKI67，AR，PLG，DNASE1L3，PTTG1，PPP1R1A，TTR等7个基因构成的基于HR分级或类似模式的分级体系在肝癌患者中的应用，包括但不限于：用于评估患者生存期；用于评估患者复发风险；用于指导后续治疗决策。
可以理解的是，对本领域技术人员来说，对本发明的技术方案及发明构思加以等同替换或改变都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims (3)

1.一种多基因肝癌预后分级体系的建立方法，其特征在于：样本经过严格质控后通过多基因定量即时聚合酶链锁反应，进一步分析各基因与生存期相关性，最终筛选出与临床肝癌手术患者预后相关的高危基因，基因组合为MKI67，AR，PLG，DNASE1L3，PTTG1，PPP1R1A，TTR这7个基因，构建预后分级体系。
2.根据权利要求1所述的多基因肝癌预后分级体系的建立方法，其特征在于：检测数据来源于一个肝癌-癌旁组织配对cDNA芯片，具备经过质控的完整临床资料及随访信息，cDNA终浓度均为1000ng/ul。
3.根据权利要求1所述的多基因肝癌预后分级体系的建立方法，其特征在于：具体构建方法如下：根据7个基因生存曲线风险比值，对样本队列通过R语言进行COX回归分析得到各个患者单基因HR值，最后加权计算得到每个患者总的HR得分；根据HR得分对临床肝癌患者分组。
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