CN102298053A

CN102298053A - 原发性肝细胞肝癌术后复发风险评估的组合抗体试剂盒

Info

Publication number: CN102298053A
Application number: CN2011101325416A
Authority: CN
Inventors: 郑利民; 许静; 丁童; 何琪; 余杏娟; 贾卫华; 石明
Original assignee: TUMOR PREVENTION AND THERAPY CENTER ZHONGSHAN UNIV
Current assignee: TUMOR PREVENTION AND THERAPY CENTER ZHONGSHAN UNIV
Priority date: 2011-05-20
Filing date: 2011-05-20
Publication date: 2011-12-28
Anticipated expiration: 2031-05-20
Also published as: CN102298053B

Abstract

本发明公开一种用于评估肝细胞肝癌患者接受切除术后复发风险的多抗体检测试剂盒，包括8种用于石蜡切片的免疫组化抗体。本发明还公开了一种利用此试剂盒判断肝癌患者术后复发风险的方法。本发明的预测效果优于现有临床指标，并具有客观准确、简便、直观、易于重复等特点。本发明可用于临床肝癌手术切除后复发和死亡的预测。本发明旨在筛选术后具有高复发风险的肝癌患者，从而帮助指导恰当的辅助治疗并有效降低复发率和延长患者生存时间。

Description

原发性肝细胞肝癌术后复发风险评估的组合抗体试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一个用于评估肝细胞肝癌患者接受切除术后复发风险的检测试剂盒。

背景技术

原发性肝细胞肝癌(简称肝癌)是一种常见的恶性肿瘤，发病率和死亡率分居第六和第三位，而中国是肝癌高发区。近年来肝癌发病率有明显上升的趋势，严重危害人类的健康与生命安全。肝癌易发生血管侵犯和转移，是导致其复发率高和预后差的主要原因。因此，有效预测患者术后复发将可以帮助选择合适的治疗人群和方式，为有效诊治提供有力的支持。由于传统临床病理诊断或单一的分子标记物对患者术后预后判断的效力较低，因此多分子标记物联合使用的试剂盒将是新的研发方向。

免疫组化利用抗原和抗体特异性结合的原理，通过化学反应使显色剂显色来检测组织标本中抗原的存在，并可以进行定位、定量分析。目前免疫组化已经广泛应用于临床病理诊断，是一种直观、可靠的检测手段。不仅如此，随着数字图像分析技术的飞速发展，计算机辅助的病理诊断和分析逐渐受到重视和应用，并具有高效、客观、准确等优点。

由于肝癌组织具有很大程度的异质性，而且临近癌旁组织中活跃的免疫反应也与疾病进展密切相关。因此，分子标记物检测所采用组织的取材位置是非常重要的。传统方法往往仅检测肿瘤组织本身，大样本量的研究结果表明癌旁组织中的免疫相关分子标记物也具有重要的预测肝癌术后复发的效力。因此，将取材部位确定为肿瘤组织与癌旁组织交界部位将具有以下优点：1)对取材的位置标准化，避免所检测的组织由于肿瘤大小不同等原因而产生取材深度的差异；2)可以同时检测肿瘤组织和癌旁良性组织中相关标记物的表达水平。

发明内容

本发明目的在于，提供一种用于评估肝癌患者接受切除术后复发风险的多抗体组合试剂盒。

为了达到上述目的，本发明提供了一种检测肝细胞肝癌患者接受切除术后复发风险的多抗体试剂盒，所述试剂盒具有8个可分别单独用于免疫组化检测的第一抗体，所述的8个第一抗体所检测的蛋白分子分别为：CD80(细胞分化抗原80；或淋巴细胞活化抗原B7-1)，B7-DC(或PD-L2，程序性死亡因子配体2)，HLA-DR(人白细胞DR抗原)，FasL(凋亡相关因子配体；或CD95L)，Bcl-2(B细胞淋巴瘤-2)，CK19(细胞角蛋白19)，Ki-67(增殖细胞核抗原)和Cyclin D1(细胞周期蛋白D1)。

优选的，所述的试剂盒还具有辣根过氧化物酶标记的第二抗体。

其次，为了达到上述目的，本发明还提供了一种针对上述检测试剂盒的结果分析方法，通过综合分析上述8种第一抗体所特异性标记的抗原在肝癌标本中的表达水平，达到评估患者接受手术切除肿瘤后复发风险的目的。

本发明所采用的原理如下：

首先，利用免疫组化的方法检测32种分子标记物在151例接受根治性切除的肝癌石蜡切片(同时包括癌巢和临近癌旁组织)中的表达，并利用专业图像软件分析不同分子分别在癌组织和癌旁实质中的阳性比率。利用支持向量机和交叉验证的方法对获得49个分子指标进行分类器的建立。由于肝癌的预后均较差，所以将分类器的金标准定义为是否在1年内发生复发。最终获得一个由8个分子指标组成的分类器，其交叉验证的敏感性为0.768，特异性为0.866，ROC曲线下面积为0.844。生存分析表明利用分类器获得的两组患者的无瘤生存率和总体生存率均有显著差异(P＜0.001)。多因素分析中，该分类器可以作为独立预测早期复发、无瘤生存、总体生存的因素(P＜0.001)。所以上述8个分子指标(CD80、B7-DC、HLA-DR、FasL、Bcl-2、CK19、Ki-67和Cyclin D1)可以有效用于肝癌术后复发风险的预测。

其次，为了简化试剂盒的使用，利用上述8个分子指标进行患者术后复发的COX比例风险模型分析，并获得用于计算患者复发风险值的计算式：即患者复发风险值＝-0.118×B7-DC(T)-0.130×CD80(T)-0.347×HLA-DR(P)+0.472×FasL(P)-0.780×Bcl-2(T)+0.566×CK19(T)-0.362×CyclinD1(T)+0.722×Ki67(T)；其中T代表部位是癌巢，P代表部位是癌旁。根据ROC曲线选取分界值为0.1530，将患者分为复发风险高和低两组。预测1年内复发的敏感性为0.696，特异性为0.854，AUC为0.775(如图2所示)。生存分析表明两组患者的无瘤生存率和总体生存率均有显著差异(P＜0.001；如图3所示)。多因素COX分析中，患者复发风险值可以作为独立预测早期复发(如表1所示)、无复发生存、总体生存的因素(P＜0.001)。

表1多因素分析与复发相关的因素(训练组N＝151)

注：COX比例风险回归模型；单因素分析中具有显著差异(P＜0.05)的指

标纳入多因素分析；HR，风险比；CI，置信区间。

本发明的主要优点是：1)实验方法非常成熟，检测过程简便、直观、易于重复，由普通的技术员均可以完成；2)采用人工辅助的半自动图像定量分析，结果客观准确，优于人工半定量分析。

下面将结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

附图说明

图1为本发明试剂盒包括的8种第一抗体在肝癌中的免疫组化染色结果；

图2为本发明一个实施例在训练组151例肝癌患者中预测术后1年内复发的ROC曲线；

图3为本发明一个实施例在训练组151例肝癌患者中预测术后无复发生存和整体生存曲线；

图4为本发明一个实施例在验证组71例肝癌患者中预测术后1年内复发的ROC曲线；

图5为本发明一个实施例在验证组71例肝癌患者中预测术后无复发生存和整体生存曲线。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1：

一种原发性肝细胞肝癌术后复发风险评估的组合抗体试剂盒，其中包括的8个第一抗体所检测的蛋白分子分别为：CD80，B7-DC，HLA-DR，FasL，Bcl-2，CK19，Ki-67和Cyclin D1，利用8种第一抗体均可以在肝癌组织石蜡切片中检测到清晰的阳性信号(如图1所示)，具体使用步骤包括以下3个部分：

(一)标本检测

1.选取71例包含肿瘤区域和癌旁区域的肝癌组织蜡块，并确保无大片坏死；

2.获取4μm的石蜡切片8片，在60℃烤片2小时，取出，略冷；

3.室温下用二甲苯脱蜡2次，每次10分钟；

4.在100％乙醇中洗去二甲苯，再依次经过95％酒精、80％酒精、70％酒精，每次5分钟；

5.双蒸水中洗5分钟；

6.用0.3％H₂O₂封闭内源性过氧化物酶活性，室温10分钟；

7.双蒸水中洗4次，每次5分钟；

8.抗原修复：不同抗原的修复条件如表2所示

表2不同抗体的来源和具体实验条件

CB，柠檬酸缓冲液

9.室温自然冷却30分钟；

10.PBS缓冲液中洗4次，每次3分钟；

11.将第一抗体(详见表2)分别滴加在8张组织切片上，4℃孵育12小时；

12.PBS缓冲液冼4次，每次5分钟；

13.滴加辣根过氧化物酶标记的第二抗体，37℃孵育30分钟；包括2种第二抗体，分别是山羊抗鼠/兔IgG的多克隆抗体(与除B7-DC之外的其它7种第一抗体配合使用；购自Dako公司，货号为K5007)和驴抗山羊IgG的多克隆抗体(与B7-DC的第一抗体配合使用；购自Santa Cruz公司，货号为sc-2020)。

14.PBS洗4次，每次5分钟；

15.滴加DAB显色剂，室温，具体时间如表2所示；

16.双蒸水洗4次，每次5分钟；

17.苏木素复染，室温2分钟；

18.双蒸水洗4次，每次5分钟；

19.PBS缓冲液中洗3分钟；

20.自来水冲洗3分钟；

21.晾干，封片。

(二)图像分析

1.在低倍视野(100倍)下分别获取癌巢区域和癌旁区域的图片各2张，分辨率为2560×1920；

2.采用分析软件识别阳性信号(棕色)、阴性细胞核(蓝色)、空白区域(白色)；

3.手动画出需要分析的区域(region of interest，ROI)；

4.分析细胞浆和细胞膜信号的阳性比例：包括CD80(T)，B7-DC(T)，HLA-DR(P)，Fas-L(P)，Bcl-2(T)，CK19(T)，Cyclin D1(T)；

5.细胞浆和细胞膜阳性比例的计算方法：ROI区域中阳性区域的面积/ROI区域总面积；

6.分析细胞核信号的阳性比例：包括Ki-67(T)；

7.细胞核阳性比例的计算方法：ROI区域中阳性区域的面积/ROI区域中阳性信号和阴性细胞核的总面积；

8.最终结果为多张照片的平均值。

(三)结果分析

1.将阳性比例的结果分为低表达和高表达两种，分别用数字1和2表示。

2.计算患者复发风险值＝-0.118×B7-DC(T)-0.130×CD80(T)-0.347×HLA-DR(P)+0.472×Fas-L(P)-0.780×Bcl-2(T)+0.566×CK19(T)-0.362×Cyclin D1(T)+0.722×Ki-67(T)；其中T代表部位是癌巢，P代表部位是癌旁；

表3多因素分析与复发相关的因素(验证组N＝71)

注：COX比例风险回归模型；单因素分析中具有显著差异(P＜0.05)的指标纳入多因素分析；HR，风险比；CI，置信区间。

3.判断患者复发风险：当患者复发风险≤0.1530时，认为患者属于低复发风险组；患者复发风险＞0.1530时，认为患者属于高复发风险组。

结果表明：在该组患者中，预测1年内复发的敏感性为0.654，特异性为0.889，AUC为0.771(如图4所示)。生存分析表明两组患者的无瘤生存率和总体生存率均有显著差异(P＜0.001；如图5所示)。多因素COX分析中，患者复发风险值可以作为独立预测早期复发(如表3所示)、无瘤生存、总体生存的指标(P＜0.001)。

Claims

1.一种检测肝细胞肝癌患者接受切除术后复发风险的多抗体试剂盒，其特征在于，所述试剂盒具有8个可分别单独用于免疫组化检测的第一抗体，所述的8个第一抗体所检测的蛋白分子分别为：CD80，B7-DC，HLA-DR，FasL，Bcl-2，CK19，Ki-67和Cyclin D1。

2.根据权利要求1所述的检测肝细胞肝癌患者接受切除术后复发风险的多抗体试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还具有辣根过氧化物酶标记的第二抗体。