CN106148511B - 一种肝癌患者接受切除术后复发风险的预测标志物及试剂盒 - Google Patents
一种肝癌患者接受切除术后复发风险的预测标志物及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种肝癌患者接受切除术后复发风险的预测标志物以及含有这些标志物组合的试剂盒。所述标志物包括分别编码以下LncRNAs的核酸分子中的一种或几种：AK026286、AK091204、AK094613、CV403656、NR_004855、uc001gji、uc001mjl和或uc003fpg。本发明能够筛选术后高复发风险的肝癌患者，并采取重点监测，延长高风险患者的术后存活时间，减少低风险患者的过度治疗。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种肝癌患者接受切除术后复发风险的预测标志物及试剂盒。
背景技术
肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是全球最常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率分居第五和第二。据统计，我国每年肝癌的发病人数及肝癌导致的死亡人数均超过全球发病及死亡人数的50％。目前以肝切除术为代表的外科治疗仍然是肝癌的首选治疗方法，然而术后5年内的复发率高达60％-70％，5年内的死亡率高达30％-40％。术后的高复发率尤其是早期复发是导致患者远期疗效差的主要原因。寻找能够准确预测患者术后复发的标记物，对患者复发风险进行评估，有助于筛选出高复发风险患者，重点监督并采取积极治疗措施，延长患者生存时间。虽然目前已有很多研究致力于寻找能良好预测患者预后的方法，包括蛋白质、核酸分子及现有临床参数(瘤大小、数目、TNM分期及BCLC分期等)等，其中一些预后标记物的预测功效已在临床应用中得到证实，但这些预后预测因子的预测效果仍然有待提升。因而仍迫切的需要筛选预测效果更加优良的预后标志物。
长非编码RNAs(long noncoding RNA,LncRNAs)是一类核苷酸数超过200nt的非编码RNA，在结构上类似于mRNAs，但其不存在开放阅读框(open reading frame，ORF)。LncRNAs可参与到表观遗传的调控，转录水平上的调控，小RNA的加工过程以及其它的调控过程。已知晓的LncRNAs的功能可概括为调控信号通路、引导作用以及作为脚手架。越来越多的证据表明LncRNAs表达水平的失调与肿瘤的发生密切相关。LncRNAs在正常组织和肿瘤组织中的差异性表达，可以作为预防和治疗以及衡量肿瘤预后的指标。
近年来已有大量报道证明了LncRNAs在HCC的发生发展过程中发挥重要作用，从而影响患者的预后。H19是由H19基因编码的长度为2.3kb的LncRNAs，对生长发育中的基因组印迹发挥重要作用。近期的研究表明H19在肝癌组织中的表达异常，H19的表达水平肿瘤/癌旁比值越低，预后越差。此外，还有研究表明H19促进细胞增殖，抑制肝癌发展和转移。HOTAIR(HOX antisense intergenic RNA)转录自HOXC基因，在肝癌组织和肝癌细胞系中显著高表达。下调HOTAIR可以抑制基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和血管内皮生长因子表达，从而影响细胞的侵袭和转移。因此，HOTAIR的上调可能作为肝癌的转移潜在标志物。MALAT1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1)首先在非小细胞肺癌中发现， 其在肝癌中的高表达与肝癌的高转移风险和不良预后密切相关。有研究发现MALAT1高表达的患者，接受肝移植后更易复发，MALAT1可作为监测肝移植后肿瘤复发的生物标记。HULC(highly up-regulated in liver cancer)是肝癌中升高最显著的基因并且特异的在肝癌组织和肝癌病人的血液中高表达。HULC可抑制抑癌基因p18表达而促进肝癌细胞增殖。在肝癌病人的血清中也可以检测出HULC，这为肝癌的预后判断提供了新途径。HEIH(HighExpression in HCC)在肝癌组织中表达水平较高，而在合并肝硬化的肝癌中表达更高，其表达水平与HBV相关的肝癌术后复发密切相关，是预测HBV相关肝癌患者术后总生存期的一个独立指标。
尽管LncRNAs数量庞大，但是LncRNAs的研究目前还处于早期阶段。LncRNAs与肝癌预后的相关性仍然需要进一步探索。在正常情况下LncRNAs的组织表达特异性甚至高于mRNA，若从转录水平系统的筛选可能与患者预后相关的LncRNAs，同时考虑在肝癌的发生发展过程中LncRNAs发挥的作用，将有助于找到预测效果更加优异的预后标记物。
发明内容
本发明目的是针对以上所要解决的技术问题，提供一种用于评估肝癌患者接受切除术后复发风险的预测标志物及多基因组合试剂盒。
为实现上述技术目的，本发明提供了一种肝癌患者接受切除术后复发风险的预测标志物，包括分别编码以下LncRNAs的核酸分子中的一种或几种：AK026286、AK091204、AK094613、CV403656、NR_004855、uc001gji、uc001mjl或uc003fpg。
在一个优选的实施方案中，所述LncRNAs在肝癌患者的肿瘤组织中水平高于或低于相应的癌旁组织；AK091204、AK094613、NR_004855、uc001gji、uc001mjl及uc003fpg在肿瘤组织中水平高于相应的癌旁组织，AK026286及CV403656在肿瘤组织中水平低于相应的癌旁组织。优选地，所述肝癌为原发性肝细胞肝癌。
另一方面，本发明还提供了一种用于肝癌患者接受切除术后复发风险的预测LncRNAs分子组合，包括AK026286、AK091204、AK094613、CV403656、NR_004855、uc001gji、uc001mjl及uc003fpg。
在一个优选的实施方案中，所述AK091204、AK094613、NR_004855、uc001gji、uc001mjl及uc003fpg在肝癌组织中的表达水平相对于癌旁组织上调，所述AK026286及CV403656在肝癌组织中的表对水平相对于癌旁组织下调。优选地，所述肝癌为原发性肝细胞肝癌。
具体而言，本发明通过以下步骤得到了上述由8个组织LncRNAs组成的肝癌术后复发风险评估组合：
1.通过分析芯片数据及查阅文献得到可能与肝癌术后复发相关的候选LncRNAs；
2.肝癌及其对应癌旁组织中采用实时荧光定量PCR验证候选LncRNAs的表达差异；
3.在由156例肝癌患者组成的训练组中确立可区分肝癌患者术后是否发生早期复发的组织LncRNAs组合；
4.在由174例肝癌患者组成的验证组中验证步骤3确立的组织LncRNAs组合预测肝癌患者术后早期复发情况的能力；
5.比较步骤3确立的组织LncRNAs组合与肿瘤直径、肿瘤数目及BCLC分期对肝癌患者早期复发情况的预测效果；
6.分析步骤3确立的组织LncRNAs组合在小肝癌、单个肿瘤、无门静脉癌栓及BCLC分期0/A期的肝癌患者中的预测效果
7.分析步骤3确立的组织LncRNAs组合是否可以独立预测肝癌术后复发。
对实验结果进行分析及相关统计显示：上述步骤1中，发明人通过分析基因芯片及查阅文献确定了31个候选LncRNAs，步骤2中验证确定了在肝癌及其对应癌旁组织中表达差异显著的20个候选LncRNAs。由于早期复发是影响患者术后生存期短的主要原因，防止复发的关键时间在于术后第一年内。所以本发明将1年，即早期复发作为预测目标。进一步在训练组标本中检测候选LncRNAs的表达水平，并确立了可区分肝癌患者是否发生术后早期复发的、由8个LncRNAs构成的最优组合：AK026286、AK091204、AK094613、CV403656、NR_004855、uc001gji、uc001mjl及uc003fpg。进一步，在独立的验证组中验证了该组织LncRNAs组合能够区分发生早期复发的肝癌患者与早期无复发患者。与此同时，发明人发现相较临床常用的预后手段，如肿瘤直径、肿瘤数目及BCLC分期等，该组织LncRNAs组合具有更好的预测预后的效果。在小肝癌、单个肿瘤、无门静脉癌栓及BCLC 0/A期的肝癌患者中，该组织LncRNAs组合预测出的高复发风险患者早期复发风险高于低风险患者。多因素分析中，该组织LncRNAs组合可作为独立预测肝癌患者术后早期复发的指标。
在另一个方面，本发明还公开了一种肝癌患者接受切除术后复发风险的预测试剂盒，包含用于检测以下8个LncRNAs分子在肝癌患者肿瘤组织中表达水平的试剂：AK026286、AK091204、AK094613、CV403656、NR_004855、uc001gji、uc001mjl及uc003fpg；所述用于检测LncRNAs分子在肿瘤组织中表达水平的试剂为实时荧光定量PCR相关试剂。
在一个优选的实施方案中，包括检测LncRNAs基因表达水平的特异性引物对：检测AK026286的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，检测AK091204的SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，检测AK094613的SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，检测CV403656的SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，检测NR_004855的SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10，检测uc001gji的SEQ ID NO:11 和SEQ IDNO:12，检测uc001mjl的SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14，检测uc003fpg的SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16。
进一步，计算肝癌患者复发风险值的计算公式为：Logit[p＝Recurrence]＝-0.379-1.16*AK091204-0.712*AK094613+1.296*CV403656-0.861*NR_004855-0.786*uc001gji-0.493*uc001mjl+1.428*uc003fpg，其中AK026286、AK091204、AK094613、CV403656、NR_004855、uc001gji、uc001mjl及uc003fpg为相应组织LncRNAs检测水平离散化后的数值，风险值以-0.655为预测阈值，大于-0.655则预测为高复发风险，小于等于-0.655则预测为低复发风险。由此，所述的预测试剂盒可应用于肝癌术后复发风险预警。
进一步，所述肝癌为原发性肝细胞肝癌。
相对于现有技术，组织LncRNAs组合用于肝癌患者术后复发风险预测的优越性在于：第一，患者的肿瘤组织标本易于获得，且RT-qPCR检测手段所需组织量极少，少量组织标本可用于多次检测。第二，组织LncRNAs组合中各基因表达丰度较高且稳定性好，检测便利。第三，实验方法非常成熟，检测过程简便、易于重复，由普通的技术员均可以完成。第四，本发明从基因芯片及文献中筛选目标基因，并在验证组验证，对组织LncRNAs组合以及试剂盒的预测效果进行了全面评估，以上方法和策略的应用保证了本发明在肝癌临床预后预测中的潜在应用价值，并为其它疾病生物标志物的研制提供可借鉴的方法策略。第五，组织LncRNAs预测肝癌复发试剂盒能准确评估单个肝癌患者术后复发风险，并对高风险患者进行预警，便于临床医生及时采取个性化的预防复发的方案，同时避免低风险患者的过度治疗。
为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。
附图说明
图1是本发明实施例4、5中的ROC曲线图。训练组(A)、验证组(B)中组织LncRNAs组合预测肝癌患者术后1年内复发的ROC曲线。
图2为本发明实施例6在训练组、验证组中的ROC曲线图。训练组(A)、验证组(B)中组织LncRNAs组合、肿瘤直径、肿瘤数目及BCLC分期预测肝癌患者术后1年内复发的ROC曲线。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面结合附图和具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围；所描述的附图也仅是示意性的，被认为是非限制性的。
实施例1：肿瘤组织标本的采集及制备
发明人采集了于2001年1月至2013年11月间接受肝癌切除术的肝癌患者(HCC)的肿瘤组织标本，这些人群满足以下入组标准，并根据性别、年龄匹配的原则，设定肝癌及其对照组标本。入组标准：(1)原发性肝癌，初治且行根治性手术切除；(2)年龄在18—80岁之间；(3)确诊时无伴随肝外转移；(4)术前未患其他恶性疾病，且或术后复发前无抗癌治疗；(5)术后未出现任何器官严重失调症状。
训练组：2001年1月至2009年12月间接受肝癌切除术的HCC肿瘤组织标本156例。
验证组：2006年1月至2013年11月间接受肝癌切除术的HCC肿瘤组织标本174例。
上述参与人群的临床特征见表1。
切除术后获得HCC肿瘤组织，立即冻存于液氮或使用RNALater处理，保存于超低温冰箱(-80℃)。
表1训练组及验证组参与者的临床病理特征
实施例2：基因芯片及其数据分析
本发明从GEO数据库中下载HCC Array数据(GEO ID：GSE54238；Title：LncRNAsand mRNAs expression profile in liver diseases including HCC)，并从中筛选出的可能影响预后的基因，其组成如下：(1)在NL(正常肝组织)、IL(炎症肝组织)、CL(肝硬化组织)、eHCC(早期肝癌组织)及aHCC(晚期肝癌组织)组中表达水平变化依次升高或降低的LncRNAs，去掉低表达的LncRNA，得到候选LncRNAs 636个；(2)为了筛选出不受HBV影响但可能与预后相关的基因，我们去掉芯片中感染HBV的病人样本后，按照(1)中筛选方法，得到候选基因236个。(3)结合文献报道，筛选出在HCC发生发展中发挥功能的LncRNAs 12个。
通过生物信息学方法对上述候选LncRNAs基因进行序列及表达特征分析(UCSC：http://genome.ucsc.edu/人类基因组数据库，version 19)，去掉无法在基因组准确定位的LncRNAs，无转录活性标记(H3K4me3，H3K27Ac)的LncRNAs，无特异性扩增引物的LncRNAs基因。剩下符合条件的LncRNAs 74条。针对这些LncRNAs设计引物qPCR引物，并在6份等比例混合的HCC肿瘤组织cDNA中检测各基因的表达水平，去除表达水平Ct值大于30及无法设计出特异引物的LncRNAs，得到LncRNAs基因共31个。在20对N/T(肝癌组织及对应癌旁组织)组织中检测这些基因的表达水平，以U6为内参进行校准，得到20个差异显著并用于后续验证的候选LncRNAs：BC020899、AF339810、AK026286、CV403656、NR_003605、NR_015366、uc001gji、uc001bqo、uc001nvt、NR_002599、uc003fpg、uc001mjl、AK091204、NR_103844.1、NR_002819、NR_002766、AK094613、NR_003367、NR_045680及NR_004855。
实施例3：实时荧光定量PCR检测训练组标本LncRNAs表达水平
1、组织RNA提取
本发明采用Trizol试剂提取，具体步骤如下：(1)对于RNALater或液氮中保存的组织，按每50mg组织加入1ml Trizol的比例裂解细胞；(2)转移Trizol裂解液到1.5ml的Rnasefree EP管中振荡混匀，室温放置5min后加入1/5裂解液体积的氯仿，振荡混匀，4℃、12000g离心15min；吸上清，加入等体积异丙醇，室温放置10min，于4℃、12000g离心30min；(3)弃上清，用70％乙醇洗涤沉淀两次，小心倾倒上清，待酒精挥发尽后加入适量DEPC水溶解RNA，-80℃保存备用。
表2本发明采用的候选LncRNAs及内源参照的引物序列
2、实时荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)
本发明优选地采用MMLV反转录试剂盒(Promega)对等量的组织RNA进行逆转录。进一步优选地采用SYBR Green qPCR master mix试剂盒(life)，以上述cDNA为模板，DNA寡核苷酸引物(由英骏公司合成，引物信息见表2)进行RT-qPCR检测。
通过内源参照U6校准，得到目标LncRNAs的表达值2-ΔCt(ΔCt＝Cttaget-Ctreference)。
实施例4：训练组中确定最优组织LncRNAs组合
绘制训练组中每个LncRNA基因表达水平预测患者术后一年内复发的ROC曲线，取其ROC曲线上最靠近左上角的点作为最优分界点，该点满足(1-sensitivity)2+(1-specificity)2值最小，而该点对应的基因表达水平数值则为分界值(训练组中每个基因分界值将直接用于验证组)，若患者该基因表达水平大于分界值，则病人该基因的表达值赋为1，小于等于分界值则赋值为0。对每个病人采用上述方法赋值后，我们得到病人所有基因表达量为1或0的离 散化数值，用于下一步的模型构建。本发明采用的LncRNAs离散化阈值(表3)将用于训练组、验证组中相应LncRNA数据的离散化，从而将连续变量转变为二分类变量。利用支持向量机和交叉验证的方法对获得的20个LncRNAs进行分类器的建立，最终获得一个由8个LncRNAs分子组成的组合，可有效地预测肝癌病人术后1年内复发的风险。为了简化试剂盒的使用，利用上述8个分子指标构建了预测患者术后早期复发的logistic回归模型分析，并获得用于计算患者复发风险值的计算式：即患者复发风险值Logit[p＝Recurrence]＝-0.379-1.16*AK091204-0.712*AK094613+1.296*CV403656-0.861*NR_004855-0.786*uc001gji-0.493*uc001mjl+1.428*uc003fpg，其中LncRNAs基因AK026286、AK091204、AK094613、CV403656、NR_004855、uc001gji、uc001mjl及uc003fpg为相应组织LncRNAs检测水平离散化后的数值，风险值以-0.655为预测阈值，大于-0.655则预测为高复发风险，小于等于-0.655则预测为低复发风险。
表3本发明采用的LncRNAs的引物信息及离散化阈值
该LncRNAs组合在训练组中可区分肝癌患者术后1年内复发与未复发人群，能有效地预测肝癌患者是否发生1年内复发(AUC为0.765，图1A)，且预测效果优于肿瘤直径、肿瘤数目及BCLC分期，该LncRNAs组合的AUC大于其它指标(图2A)。
实施例5：验证组中验证组织LncRNAs组合预测肝癌患者术后早期复发风险的效果
将训练组中确立的组织LncRNAs组合用于验证组预测肝癌患者复发情况。同样地，采用Trizol提取以及实时荧光定量PCR检测方法进行实验。所述组合在验证组中仍可区分术后1年内复发与未复发的肝癌患者，能有效地预测肝癌患者术后1年内是否复发(AUC为0.677，图1B)，对肝癌患者发生1年内复发的预测效果优于肿瘤直径、肿瘤数目及BCLC分期，该LncRNAs组合的AUC大于其它指标(图2B)。
实施例6：组织LncRNAs组合在肿瘤直径、肿瘤数目、无门静脉癌栓及BCLC分期0/A期肝癌患者中的预测效果
本发明进一步证明了组织LncRNAs组合，在肿瘤直径小于5cm、肿瘤数目为单个、无门静脉癌栓及BCLC分期0/A期的肝癌患者中预测患者术后1年内复发的可能(表4)。具体表现为，该LncRNAs组合预测的高风险的患者，术后1年内复发的可能性显著高于预测的低风险患者(p<0.05)。
表4验证组中组织LncRNAs组合评估小肝癌、单个肿瘤、无门静脉癌栓及BCLC分期为0/A期的肝癌患者术后复发风险
实施例7：单因素及多因素分析与复发相关的因素：组织LncRNAs组合、肿瘤直径、肿瘤数目及BCLC分期
本发明通过logistic回归分析了组织LncRNAs组合与患者术后早期复发的相关性。将年龄、性别、BCLC分期及其它与BCLC分期信息无重叠的临床指标一起纳入多因素logistic分析，结果表明，组织LncRNAs组合可以作为独立预测(P<0.0001)肝癌患者术后早期复发的指标(表5)。
表5验证组中单因素及多因素logistic回归分析与术后早期复发相关的指标
P*:经过年龄、性别等因素校正。
实施例8：组织LncRNAs试剂盒的制作
本发明试剂盒用于评估肝细胞肝癌患者接受切除术后复发风险，由组织LncRNAs提取系统、反转录系统、实时荧光定量PCR系统、引物系统以及用于评估是否罹患肝癌的logistic回归分析方法组成。
所述试剂盒的组织RNA提取系统中，发明人优选地采用Trizol试剂提取获得组织RNA。发明人采用MMLV反转录试剂盒(Promega)进行逆转录，进一步优选地采用SYBR GreenqPCR master mix(life)试剂盒，运用RT-qPCR技术检测以下分子：AK026286、AK091204、AK094613、CV403656、NR_004855、uc001gji、uc001mjl及uc003fpg，引物由英俊公司合成，内源参照为U6。具体引物序列见表3。即患者复发风险值Logit[p＝Recurrence]＝-0.379-1.16*AK091204-0.712*AK094613+1.296*CV403656-0.861*NR_004855-0.786*uc001gji-0.493*uc001mjl+1.428*uc003fpg，其中AK026286、AK091204、AK094613、CV403656、NR_004855、uc001gji、uc001mjl及uc003fpg为相应组织LncRNAs检测水平离散化后的数值，风险值以-0.655为预测阈值，大于-0.655则预测为高复发风险，小于等于-0.655则预测为低复发风险。
本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变形不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变形属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图 包含这些改动和变形。
Claims (5)
1.一种用于肝癌患者接受切除术后复发风险的预测LncRNAs分子组合，其特征在于：
所述分子组合为AK026286、AK091204、AK094613、CV403656、NR_004855、uc001gji、uc001mjl及uc003fpg的核酸分子组合；
所述AK091204、AK094613、NR_004855、uc001gji、uc001mjl及uc003fpg在肝癌组织中的表达水平相对于癌旁组织上调，所述AK026286及CV403656在肝癌组织中的表对水平相对于癌旁组织下调。
2.根据权利要求1所述的LncRNAs分子组合，其特征在于：所述肝癌为原发性肝细胞肝癌。
3.一种肝癌患者接受切除术后复发风险的预测试剂盒，其特征在于：是由用于检测以下8个LncRNAs分子在肝癌患者肿瘤组织中表达水平的试剂所组成：
AK026286、AK091204、AK094613、CV403656、NR_004855、uc001gji、uc001mjl及uc003fpg；所述用于检测LncRNAs分子在肿瘤组织中表达水平的试剂为实时荧光定量PCR相关试剂，其包括检测LncRNAs基因表达水平的特异性引物对：
检测AK026286的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，检测AK091204的SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4，检测AK094613的SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，检测CV403656的SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:8，检测NR_004855的SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10，检测uc001gji的SEQ ID NO:11和SEQID NO:12，检测uc001mjl的SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14，检测uc003fpg的SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16。
4.根据权利要求3所述的肝癌患者接受切除术后复发风险的预测试剂盒，其特征在于：计算肝癌患者复发风险值的计算公式为：
Logit[p＝Recurrence]＝-0.379-1.16*AK091204-0.712*AK094613+1.296*CV403656-0.861*NR_004855-0.786*uc001gji-0.493*uc001mjl+1.428*uc003fpg，其中AK026286、AK091204、AK094613、CV403656、NR_004855、uc001gji、uc001mjl及uc003fpg为相应组织LncRNAs检测水平离散化后的数值，风险值以-0.655为预测阈值，大于-0.655则预测为高复发风险，小于等于-0.655则预测为低复发风险。
5.根据权利要求3所述的肝癌患者接受切除术后复发风险的预测试剂盒，其特征在于：所述肝癌为原发性肝细胞肝癌。
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